CN111197020A

CN111197020A - 一种生产米尔贝霉素的重组菌及其构建方法与应用

Info

Publication number: CN111197020A
Application number: CN202010032599.2A
Authority: CN
Inventors: 向文胜; 成旭; 王海燕; 刘雨晴; 王相晶
Original assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-01-13
Filing date: 2020-01-13
Publication date: 2020-05-26
Anticipated expiration: 2040-01-13
Also published as: CN111197020B

Abstract

本发明公开了一种生产米尔贝霉素的重组菌及其构建方法与应用，属于分子生物学技术领域。为了提高米尔贝霉素A3/A4的提取纯度及效价，本发明提供了一种生产米尔贝霉素的重组菌，所述重组菌的出发菌株为冰城链霉菌(Streptomyces bingchengsis)X‑7(菌种保藏编号为CGMCC 1734)，是通过将出发菌株中cyp41基因敲除使其失活后获得的，利用本发明制备的重组菌生产米尔贝霉素A3/A4时米尔贝霉素α9/α10组分减少或失活，不仅简化了米尔贝霉素A3/A4的纯化过程，同时米尔贝霉素A3+A4效价提高，降低米尔贝霉素生产成本。

Description

一种生产米尔贝霉素的重组菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明公开了一种生产米尔贝霉素的重组菌及其构建方法与应用，属于分子生物学技术领域。

背景技术

米尔贝霉素是一种十六元大环内脂类抗生素，米尔贝霉素A3/A4因对环境非常友好，已作为生态友好型农药被商业化应用于多种农作物、经济作物及花卉的害虫防治。尽管米尔贝霉素与阿维菌素相比具有更高活性和更低毒性，但其昂贵价格限制了米尔贝霉素的广泛应用。

冰城链霉菌(Streptomyces bingchengsis)是本实验室具有独立知识产权，能够生物合成商业化应用的米尔贝霉素A3/A4的工业化链霉菌。冰城链霉菌能够产生多种次级代谢产物，虽然米尔贝霉素A3(α1)和A4(α3)是冰城链霉菌中最重要的次级代谢产物，但是米尔贝霉素其他衍生物、大环内酯类和聚醚类化合物南昌霉素以及环五肽等其他次级代谢产物常伴随产生。其中副产物以米尔贝霉素衍生物为主，因该类化合物与米尔贝霉素A3/A4化学结构和性质相似，故该类副产物不仅造成目标化合物米尔贝霉素A3+A4的效价降低，而且为其分离带来了困难。

发明内容

为了提高米尔贝霉素A3/A4的提取纯度，本发明提供了一种生产米尔贝霉素的重组菌，所述重组菌是通过将出发菌株中cyp41基因敲除使其失活后获得的，所述出发菌株为冰城链霉菌(Streptomyces bingchengsis)X-7，菌种保藏编号为CGMCC 1734；所述cyp41基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，所述cyp41基因中被敲除的序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了上述重组菌的构建方法，步骤如下：

1)cyp41基因敲除载体构建：

用冰城链霉菌(Streptomyces bingchengsis)X-7全基因组序列为模板设计引物，经PCR扩增获得cyp41基因上游序列cyp41up和下游序列cyp41down；经PCR扩增得到卡那抗性基因片段cyp41neo；将cyp41up、cyp41down和cyp41neo进行融合PCR得到片段cyp41-up-neo-down，将所述cyp41-up-neo-down片段插入到载体pKC1139中，获得敲除cyp41基因的质粒pKCcyp41neo；

2)cyp41基因敲除重组冰城链霉菌的获得：

将所述质粒pKCcyp41neo导入到大肠杆菌ET12567(pUZ8002)中，然后通过接合转移法导入到所述冰城链霉菌(Streptomyces bingchengsis)X-7中，获得重组菌BCDP。

进一步地限定，步骤1)中所述的上游序列cyp41up扩增所用的引物为：cyp41up-F：CCCAAGCTTCAGGATGAGGAACGACAGGA；cyp41up-R：CAGGGGATCCCAGCAACCTCCCCTCCAC。

进一步地限定，步骤1)中所述的下游序列cyp41down扩增所用的引物为：cyp41down-F：TTCACTGGCCTTTCACGCCGCACGCTT；cyp41down-R：GCTCTAGAATTCCGCAGGAGAACAGATGA。

进一步地限定，步骤1)中所述的cyp41neo扩增以PUC119质粒为模板；所用的引物为：cyp41neo-F：GAGGTTGCTGGGATCCCCTGGATACC；cyp41neo-R：CGGCGTGAAAGGCCAGTGAATTCGAG。

本发明还提供了上述重组菌在发酵生产米尔贝霉素中的应用。

进一步地限定，所述发酵生产米尔贝霉素的方法为：将重组菌株在SKYM固体培养基上培养后，接种到种子培养基培养，再接种到发酵培养基进行培养。

进一步地限定，每100mL种子培养基中含有蔗糖1.0g，脱脂奶粉0.1g，酵母膏0.5g，蛋白胨0.35g，K₂HPO₄ 0.05g，余量为水，PH＝7.2；培养条件为28℃，250rpm培养46h。

进一步地限定，每100mL发酵培养基中含有蔗糖8.0g，脱脂奶粉0.1g，黄豆饼粉2.0g，FeSO₄ 0.01g，K₂HPO₄ 0.1g，CaCO₃ 0.3g，余量为水，PH＝7.2；培养条件为28℃，250rpm培养9天。

有益效果

对冰城链霉菌及已报道冰城链霉菌突变株代谢产物分析发现，副产物米尔贝霉素α9/α10与米尔贝霉素A3/A4始终伴随产生，要想理性消除冰城链霉菌中米尔贝霉素α9/α10对米尔贝霉素A3/A4的影响，明确其生物合成过程至关重要，本发明通过敲除冰城链霉菌中cyp41基因，构建了基因敲除的链霉菌重组菌，解析了冰城链霉菌中米尔贝霉素A3/A4到米尔贝霉素α9/α10形成过程，明确了冰城链霉菌中本发明所述基因编码的蛋白质Cyp41的功能。本发明的重组菌生产米尔贝霉素时米尔贝霉素α9/α10组分减少或失活，不仅简化了米尔贝霉素A3/A4的纯化过程，同时米尔贝霉素A3+A4效价提高，降低米尔贝霉素生产成本。

本发明实施例中例举的技术方案为敲除cyp41基因大部分序列致该基因功能失活，并进一步构建cyp41基因失活的重组菌，并获得了上述有益的技术效果，本领域的技术人员能够理解，敲除cyp41基因的完整编码区(SEQ ID No.1)也同样能够实现本发明所述的技术效果。

附图说明

图1：米尔贝霉素α9/α10质谱检测图；图中分别可见α9质谱检测图和α10质谱检测图；

图2：用于构建基因敲除重组菌株的载体pKCcyp41neo简图；

图3：菌株发酵产物的HPLC检测图谱；(a)：重组冰城链霉菌HPLC检测图；(b)：BCWT和BCDP的米尔贝霉素A3+A4效价比较。

具体实施方式

本发明利用冰城链霉菌(Streptomyces bingchengsis)X-7(CGMCC 1734)基因组构建质粒文库。利用融合PCR及加载抗性基因构建cyp41基因的敲除载体，通过接合转移导入菌株X-7中，通过同源重组原理敲除cyp41基因，阻断副产物米尔贝霉素α9/α10的合成。

本发明还利用冰城链霉菌(Streptomyces bingchengsis)X-7(CGMCC 1734)基因组构建质粒。利用Gibson组装及不同启动子构建cyp41基因的回补载体，通过接合转移导入重组菌株BCDP中，恢复副产物米尔贝霉素α9/α10的合成。

本发明利用天蓝链霉菌M1146作为体外寄主，通过接合转移将本发明中构建的pIJ10500::P_hrdBcyp41质粒导入M1146中得到重组天蓝链霉菌M1146-cyp41，通过在液体培养重组菌株时添加米尔贝霉素A3/A4，HPLC检测其发酵液中化合物组分的变化，确定冰城链霉菌中本发明所述基因编码的蛋白Cyp41的功能，并解析冰城链霉菌中米尔贝霉素α9/α10的合成过程。所述天蓝链霉菌M1146，记载在Gomez-Escribano JP,Bibb MJ.EngineeringStreptomyces coelicolor for heterologous expression of secondary metabolitegene clusters.Microb Biotechnol.2011；4(2):207-215.doi:10.1111/j.1751-7915.2010.00219.x。

所述冰城链霉菌(Streptomyces bingchengsis)X-7，于2006年06月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市海淀区中关村北一条13号中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号为CGMCC 1734。

pIJ10500，该载体记载在：Zhang et al.Microb Cell Fact(2016)15:152DOI10.1186/s12934-016-0552-1。

Streptomyces coelicolor A3(2)记载在：Zhang et al.Microb Cell Fact(2016)15:152DOI10.1186/s12934-016-0552-1，此菌用于后面hrdBp启动子的扩增。

上述材料公众可通过中国农业科学院植物保护研究所获得。

在本发明中，所述野生型冰城链霉菌是指天然环境中存在的、并未进行任何人工操作的冰城链霉菌，即本发明中所用的出发菌株冰城链霉菌(Streptomycesbingchengsis)X-7。

在本发明中，产生所述重组链霉菌的起始链霉菌是指对其进行本发明所示遗传操作例如基因敲除的链霉菌。也可以是具有其它遗传修饰但是不具有本发明所述遗传修饰的链霉菌如回补株和重组的1146链霉菌。本文所用“重组”是指由于有意人为干预所获得的具有所需修饰的菌株，例如与相应天然(非重组)菌株相比，重组菌株不表达或者恢复表达天然基因活性。

在本发明中，术语“删除”或“敲除”是指与野生型菌株相比，重组菌株经本发明所示遗传操作删除掉部分或全部目标基因基因编码区序列，使重组菌株不能产生具有相应活性的蛋白质、或者产生的蛋白质的量或其活性与未进行所述失活操作的基因翻译的蛋白质的量或活性相比是降低的或者被消除。敲除可以通过例如靶向载体、穿梭载体同源重组或随机插入基因捕获载体等方法使目标基因功能完全或部分丧失。

在本发明中，“回补”是指在敲除目标基因的菌株中，通过整合型载体将删除掉目标基因基因编码区序列全部克隆到敲除重组菌株中，使重组菌株能产生具有相应活性的蛋白质、或者产生的蛋白质的量或其活性与进行所述失活操作的基因翻译的蛋白质的量或活性相比是上升的或者提高的。

SKYM固体培养基(每100mL)：蔗糖0.4g，脱脂奶粉0.1g，酵母浸粉0.2g，麦芽浸粉0.5g，蒸馏水100ml，琼脂粉2.0g，PH＝7.2。

种子培养基(每100mL)：蔗糖1.0g，脱脂奶粉0.1g，酵母膏0.5g，蛋白胨0.35g，K₂HPO₄0.05g，蒸馏水100ml，PH＝7.2。

发酵培养基(每100mL)：蔗糖8.0g，脱脂奶粉0.1g，黄豆饼粉2.0g，FeSO₄ 0.01g，K₂HPO₄ 0.1g，CaCO₃ 0.3g，蒸馏水100ml，PH＝7.2。

本领域技术人员可以借鉴本文内容，本发明的方法及应用已经通过实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动和调整来实现和应用本发明。

本发明采用的试剂皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明，为方便描述，下述实施例中所述的BCWT也代表冰城链霉菌(Streptomyces bingchengsis)X-7。

实施例1：生产米尔贝霉素的重组菌的构建方法。

一、cyp41基因删除载体构建：

用米尔贝霉素生产菌冰城链霉菌(Streptomyces bingchengsis)X-7(菌种保藏编号为CGMCC 1734)全基因组序列为模板设计引物：

cyp41up-F/R(CCCAAGCTTCAGGATGAGGAACGACAGGA(HindIII)/CAGGGGATCCCAGCAACCTCCCCTCCAC)；

cyp41down-F/R(TTCACTGGCCTTTCACGCCGCACGCTT/GCTCTAGAATTCCGCAGGAGAACAGATGA(XbaI))，用KOD高保真酶体系PCR得到1.4kb cyp41上游序列cyp41up和1.6kb cyp41下游序列cyp41down，利用KOD高保真酶体系、PUC119质粒为模板、cyp41neo-F/R(GAGGTTGCTGGGATCCCCTGGATACC/CGGCGTGAAAGGCCAGTGAATTCGAG)为引物PCR得到neo(卡那抗性基因)片段。

利用Q5高保真酶对cyp41up、cyp41down、cyp41neo进行融合PCR得到片段cyp41-up-neo-down，将载体pKC1139用HindIII、XbaI进行双酶切后与cyp41-up-neo-down用T₄连接酶反应，反应结束后转化，挑取单克隆培养并用质粒试剂盒提取质粒，电泳检测后测序验证，得到敲除cyp41基因的质粒pKCcyp41neo，载体图如图2所示。

融合PCR第1步：(体系)cyp41up、cyp41down、cyp41neo片段各30ng，4μL 5×Q5reaction buffer，4μL 5×Q5GC buffer，0.8μL 10mM dNTP，0.5μL Q5High-fidelityDNA polymerase，ddH₂O to 20μL。

(程序)step198℃3min，step298℃30s，step355℃20s，step472℃2min，step5Goto 2×15，step672℃10min，step74℃forever。

融合PCR第2步：(体系)融合PCR1反应产物2μL，cyp41up-F 2.5μL，cyp41down-R2.5μL，10μL 5×Q5reaction buffer，10μL 5×Q5GC buffer，3μL 10mM Dntp，0.5μL Q5High-fidelity DNA polymerase，ddH₂O to 50μL。

(程序)step198℃3min，step298℃10s，step3依引物定30s，step472℃2min，step5Goto 2×35，step672℃10min，step74℃forever。

二、cyp41基因删除重组冰城链霉菌的获得：

将步骤一中构建的质粒pKCcyp41neo导入ET12567(pUZ8002)中，通过接合转移方法(参照Zhang Y,He H,Liu H,Wang H,Wang X,Xiang W.Characterization ofapathway-specificactivator ofmilbemycinbiosynthesis and improved milbemycin productionby its overexpression in Streptomyces bingchengsis.Microb CellFact.2016；15(1):152.doi:10.1186/s12934-016-0552-1)导入到冰城链霉菌BCWT中，接合子长出后挑到含安普霉素(Apr)和萘啶酮酸(Nal)的SKYM培养基上，9天后将菌株置于37℃培养进行单交换，培养7d后在无抗SKYM培养基上培养3代后挑Apr^SKan^R(安普霉素敏感，卡那霉素抗性)的菌株。将挑到的Apr^SKan^R菌株在种子培养基培养菌丝，得到菌丝后提基因组，用3对引物：

cyp41up-F/R(CCCAAGCTTCAGGATGAGGAACGACAGGA/CCCAATAGCAGCCAGTCCCT)cyp41down-F/R(TAGCGTTGGCTACCCGTGATAT/GCTCTAGAATTCCGCAGGAGAACAGATGA)；cyp41-F/R(ATGGATGCCCCACGCGCCGTCC/TGGATGCTGAGGGTGATGAAGGCC)进行PCR验证双交换的位置是否正确，获得重组冰城链霉菌BCDP。

对比例1：cyp41基因回补质粒构建。

用KOD高保真酶体系、BCWT(CGMCC：1734)全基因组序列为模板、cyp41-F/R(CAGGAAACAGCTATGACATGATTACGAATTCGGATGCTGAGGGTGATGAAGGC/GGCTGCAGGTCGACTCTAGACTGTCAGTTCCCTCTTGTTACC)为引物获得包含cyp41上游启动子和编码区长为1.7kb的片段，将此PCR片段通过ClonExpress MultiS试剂盒克隆到EcoRI-和XbaI-双酶切过的载体pSET152上得到质粒pSET152::cyp41。

同时cyp41的编码区和hrdB启动子分别用cyp41_hrdB-F/R(TCGTGGTCCTTGTAGTCCTCGAGAGCGTGCGGCGTGAAAC/GTTCCGAGAGGTTGTTCATGGATGCCCCACGCGC)和hrdB_cyp41-F/R(GCGCGTGGGGCATCCATGAACAACCTCTCGGAAC/AATCGTTAGTTAGGCTAACTAGTTCTAGACCGCCTTCCGC)引物获得，cyp41的编码区扩增模板为BCWT(CGMCC：1734)全基因组序列，hrdB启动子扩增模板为Streptomyces coelicolorA3(2)基因组，将cyp41编码区和hrdB启动子片段通过ClonExpress MultiS试剂盒克隆到SpeI和XhoI双酶切过的载体pIJ10500上得到质粒pIJ10500::P_hrdBcyp41。

对比例2：在敲除cyp41基因重组冰城链霉菌中回补cyp41基因。

将对比例1中构建的质粒pSET152::cyp41、pIJ10500::P_hrdBcyp41分别导入ET12567(pUZ8002)中，通过接合转移方法导入到重组冰城链霉菌BCDP中，利用同实施例1相同的方法分别得到重组冰城链霉菌BCDP的回补菌株BCDSP、BCDHP。回补载体导入本发明获得的敲除重组冰城链霉菌中使得蛋白Cyp41在本发明获得的敲除重组冰城链霉菌中发挥功能，该方法进一步验证了cyp41功能。

实施例2：发酵验证。

将上述制备的各重组菌株以及原始菌株BCWT(CGMCC：1734)在SKYM(蔗糖0.4g，脱脂奶粉0.1g，酵母浸粉0.2g，麦芽浸粉0.5g，蒸馏水补齐至100ml，琼脂粉2.0g，PH＝7.2)固体培养基上28℃培养9天后，进冰城链霉菌种子培养基(蔗糖1.0g，脱脂奶粉0.1g，酵母膏0.5g，蛋白胨0.35g，K₂HPO₄0.05g，蒸馏水补齐至100ml，PH＝7.2)，28℃250rpm 46h培养后以6％的接种量进冰城链霉菌发酵培养基(蔗糖8.0g，脱脂奶粉0.1g，黄豆饼粉2.0g，FeSO₄0.01g，K₂HPO₄ 0.1g，CaCO₃ 0.3g，蒸馏水补齐至100ml，PH＝7.2)，28℃250rpm培养9天后取0.5ml发酵液，用1.5ml乙醇浸泡旋转过夜，离心取上清进行HPLC检测。HPLC分析条件，色谱柱：绿百草SB-C18柱(4.6mm×250mm,5μm)；流动相B在15min内以1.0ml/min流速从0到100％梯度变化(流动相A：乙腈-水-甲醇(350：50：100，v/v/v)；流动相B：甲醇)；吸收波长242nm。

HPLC检测结果如图3所示，图中a为：HPLC检测结果：依次为野生型冰城链霉菌BCWT发酵样品；重组菌株BCDP发酵样品；重组菌株BCDHP发酵样品；重组菌株BCDSP发酵样品。图中b为：BCWT、BCDP的A3+A4效价比较。结果表明，本发明获得的cyp41基因失活重组冰城链霉菌株与回补重组菌株和野生型菌株相比较，副产物组分米尔贝霉素α9/α10消失(图3中a)，且本发明获得的cyp41基因失活重组冰城链霉菌株米尔贝霉素A3+A4的效价相较野生型菌株提高19.5％(图3中b)。

实施例3：体外投喂。

将对比例1中构建的质粒pIJ10500::PhrdBcyp41导入ET12567(pUZ8002)中，通过接合转移方法导入到天蓝链霉菌M1146中，利用同实施例1相同的方法得到重组天蓝链霉菌M1146-cyp41。重组菌株M1146-cyp41以及原始菌株M1146分别在TSB(胰蛋白胨大豆肉汤3g，100ml蒸馏水)液体培养基中30℃250rpm培养48h后，加入终浓度为1mg/ml的溶于DMSO(v/v，1：1000)的米尔贝霉素A3/A4标品，30℃250rpm培养24h后用等体积乙酸乙酯萃取，12000rpm4℃离心15min后，吸取上清于新试管中并用真空旋转蒸干仪蒸干，然后用100ml甲醇溶解并进行LC-MS检测。

LC-MS检测结果表明，Cyp41可以催化米尔贝霉素A3/A4形成米尔贝霉素α26/α27，而α26/α27可进一步生成米尔贝霉素α9/α10，即Cyp41参与了米尔贝霉素α9/α10生物合成。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

核苷酸序列表

<110> 中国农业科学院植物保护研究所

<120> 一种生产米尔贝霉素的重组菌及其构建方法与应用

<130>

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1326

<212> DNA

<213> cyp41 全核苷酸序列

<400> 1

atggatgccc cacgcgccgt ccacgccggt gagaagcgct atgactccgt ggacctgtcg 60

tccctggcct tctggtcgca gaccgccgag gagcgggagc ggtccttcgc cctgctgcgc 120

gccgagcggc cggtgtcctg gcaccggccg gtggagggga ggttgctgcc ggacccggac 180

gacacgggct tttgggccgt cgtccggcat gaggacatca tgacggtcag ccgccgcacc 240

gatctgttcg cctcgtccgc cggtgtgctg ctcgagaaca tccccgaggg tctgctcgaa 300

ggctcgcagt ccctgctcgc catggacccg ccccggcaca ccaagatcag gcggctggtc 360

agcggcgcct tcaccccgcg gcacatcctt gggatgcgaa agcggatcga ggcccacgcg 420

cggcggatcg tcggcgagtt ggcccgccgc cccgacggca gggccgactt catgcgggac 480

tgcgcatcgc tgctgcccat gcgcgtgatc tccgatgtga tgggcatccc ccgcgaatgg 540

caggacaccg tggccgcgac ggtctcccag agcatcagcg gcagcggcac ggacggggag 600

gacggggagg gcggggagcg cggggagcgc ggggagggcg gggacgagca gagcccgttg 660

gagcttctga tcgagggcaa tcgcagactg cgcgccatgg cgctgaatct ggccgggtta 720

cggcgtggcc gcccggctca ggacctgatg accgtcctgg tccaggccga ggtcgacggg 780

gaccggctga ccgacgacga catcgccgac ttcttcctgc tgctgtgcct ggcgggcaac 840

gacagtacga cgcagaccat cggccacggg ctcagactgc tcaccgacct gcccgagcaa 900

cgcgcctggc tgctggccgg cctcgacggc cggatcggcc ccgccgtgga ggagatcctg 960

cgctacgcca cacccgtgct gaccttccgc cgtacggcgg tggcccccac ccggctcggc 1020

ggccggcaca tctcggcagg ggacaaggtg gtgatgttct acgcctcggg caaccgcgac 1080

gcggccgtct tccgcgaacc gggacgtttt gacctcgccc gcgatcccaa cccccagctg 1140

tccttcggcg gtggcggtgc gcactactgc ctggccgccc agctcgccag ggcgcagctg 1200

agaatcctct tccgggaact gctgcggatg ctgcccgata tcgaggcggg tgagcccgag 1260

tttgtgaccg ggacgtccat ccacggaatg acgcggctgc cctgccgttt cacgccgcac 1320

gcttga

<210> 2

<211> 1139

<212> DNA

<213> cyp41基因敲除的序列

<400> 2

ccggacccgg acgacacggg cttttgggcc gtcgtccggc atgaggacat catgacggtc 60

agccgccgca ccgatctgtt cgcctcgtcc gccggtgtgc tgctcgagaa catccccgag 120

ggtctgctcg aaggctcgca gtccctgctc gccatggacc cgccccggca caccaagatc 180

aggcggctgg tcagcggcgc cttcaccccg cggcacatcc ttgggatgcg aaagcggatc 240

gaggcccacg cgcggcggat cgtcggcgag ttggcccgcc gccccgacgg cagggccgac 300

ttcatgcggg actgcgcatc gctgctgccc atgcgcgtga tctccgatgt gatgggcatc 360

ccccgcgaat ggcaggacac cgtggccgcg acggtctccc agagcatcag cggcagcggc 420

acggacgggg aggacgggga gggcggggag cgcggggagc gcggggaggg cggggacgag 480

cagagcccgt tggagcttct gatcgagggc aatcgcagac tgcgcgccat ggcgctgaat 540

ctggccgggt tacggcgtgg ccgcccggct caggacctga tgaccgtcct ggtccaggcc 600

gaggtcgacg gggaccggct gaccgacgac gacatcgccg acttcttcct gctgctgtgc 660

ctggcgggca acgacagtac gacgcagacc atcggccacg ggctcagact gctcaccgac 720

ctgcccgagc aacgcgcctg gctgctggcc ggcctcgacg gccggatcgg ccccgccgtg 780

gaggagatcc tgcgctacgc cacacccgtg ctgaccttcc gccgtacggc ggtggccccc 840

acccggctcg gcggccggca catctcggca ggggacaagg tggtgatgtt ctacgcctcg 900

ggcaaccgcg acgcggccgt cttccgcgaa ccgggacgtt ttgacctcgc ccgcgatccc 960

aacccccagc tgtccttcgg cggtggcggt gcgcactact gcctggccgc ccagctcgcc 1020

agggcgcagc tgagaatcct cttccgggaa ctgctgcgga tgctgcccga tatcgaggcg 1080

ggtgagcccg agtttgtgac cgggacgtcc atccacggaa tgacgcggct gccctgccg 1139

<210> 3

<211> 441

<212> PRT

<213> cyp41基因编码的氨基酸序列

<400> 3

Met Asp Ala Pro Arg Ala Val His Ala Gly Glu Lys Arg Tyr Asp Ser

1 5 10 15

Val Asp Leu Ser Ser Leu Ala Phe Trp Ser Gln Thr Ala Glu Glu Arg

20 25 30

Glu Arg Ser Phe Ala Leu Leu Arg Ala Glu Arg Pro Val Ser Trp His

35 40 45

Arg Pro Val Glu Gly Arg Leu Leu Pro Asp Pro Asp Asp Thr Gly Phe

50 55 60

Trp Ala Val Val Arg His Glu Asp Ile Met Thr Val Ser Arg Arg Thr

65 70 75 80

Asp Leu Phe Ala Ser Ser Ala Gly Val Leu Leu Glu Asn Ile Pro Glu

85 90 95

Gly Leu Leu Glu Gly Ser Gln Ser Leu Leu Ala Met Asp Pro Pro Arg

100 105 110

His Thr Lys Ile Arg Arg Leu Val Ser Gly Ala Phe Thr Pro Arg His

115 120 125

Ile Leu Gly Met Arg Lys Arg Ile Glu Ala His Ala Arg Arg Ile Val

130 135 140

Gly Glu Leu Ala Arg Arg Pro Asp Gly Arg Ala Asp Phe Met Arg Asp

145 150 155 160

Cys Ala Ser Leu Leu Pro Met Arg Val Ile Ser Asp Val Met Gly Ile

165 170 175

Pro Arg Glu Trp Gln Asp Thr Val Ala Ala Thr Val Ser Gln Ser Ile

180 185 190

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Gly Glu Asp Gly Glu Gly Gly Glu Arg Gly

195 200 205

Glu Arg Gly Glu Gly Gly Asp Glu Gln Ser Pro Leu Glu Leu Leu Ile

210 215 220

Glu Gly Asn Arg Arg Leu Arg Ala Met Ala Leu Asn Leu Ala Gly Leu

225 230 235 240

Arg Arg Gly Arg Pro Ala Gln Asp Leu Met Thr Val Leu Val Gln Ala

245 250 255

Glu Val Asp Gly Asp Arg Leu Thr Asp Asp Asp Ile Ala Asp Phe Phe

260 265 270

Leu Leu Leu Cys Leu Ala Gly Asn Asp Ser Thr Thr Gln Thr Ile Gly

275 280 285

His Gly Leu Arg Leu Leu Thr Asp Leu Pro Glu Gln Arg Ala Trp Leu

290 295 300

Leu Ala Gly Leu Asp Gly Arg Ile Gly Pro Ala Val Glu Glu Ile Leu

305 310 315 320

Arg Tyr Ala Thr Pro Val Leu Thr Phe Arg Arg Thr Ala Val Ala Pro

325 330 335

Thr Arg Leu Gly Gly Arg His Ile Ser Ala Gly Asp Lys Val Val Met

340 345 350

Phe Tyr Ala Ser Gly Asn Arg Asp Ala Ala Val Phe Arg Glu Pro Gly

355 360 365

Arg Phe Asp Leu Ala Arg Asp Pro Asn Pro Gln Leu Ser Phe Gly Gly

370 375 380

Gly Gly Ala His Tyr Cys Leu Ala Ala Gln Leu Ala Arg Ala Gln Leu

385 390 395 400

Arg Ile Leu Phe Arg Glu Leu Leu Arg Met Leu Pro Asp Ile Glu Ala

405 410 415

Gly Glu Pro Glu Phe Val Thr Gly Thr Ser Ile His Gly Met Thr Arg

420 425 430

Leu Pro Cys Arg Phe Thr Pro His Ala

435 440

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> cyp41up-F

<400> 4

cccaagcttc aggatgagga acgacagga 29

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> cyp41up-R

<400> 5

caggggatcc cagcaacctc ccctccac 28

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> cyp41down-F

<400> 6

ttcactggcc tttcacgccg cacgctt 27

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> cyp41down-R

<400> 7

gctctagaat tccgcaggag aacagatga 29

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> cyp41neo-F

<400> 8

gaggttgctg ggatcccctg gatacc 26

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> cyp41neo-R

<400> 9

cggcgtgaaa ggccagtgaa ttcgag 26

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> cyp41up-R

<400> 10

cccaatagca gccagtccct 20

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> cyp41down-F

<400> 11

tagcgttggc tacccgtgat at 22

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> cyp41-F

<400> 12

atggatgccc cacgcgccgt cc 22

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> cyp41-R

<400> 13

tggatgctga gggtgatgaa ggcc 24

<210> 14

<211> 53

<212> DNA

<213> cyp41-F

<400> 14

caggaaacag ctatgacatg attacgaatt cggatgctga gggtgatgaa ggc 53

<210> 15

<211> 42

<212> DNA

<213> cyp41-R

<400> 15

ggctgcaggt cgactctaga ctgtcagttc cctcttgtta cc 42

<210> 16

<211> 40

<212> DNA

<213> cyp41hrdB-F

<400> 16

tcgtggtcct tgtagtcctc gagagcgtgc ggcgtgaaac 40

<210> 17

<211> 34

<212> DNA

<213> cyp41hrdB-R

<400> 17

gttccgagag gttgttcatg gatgccccac gcgc 34

<210> 18

<211> 34

<212> DNA

<213> hrdBcyp41-F

<400> 18

gcgcgtgggg catccatgaa caacctctcg gaac 34

<210> 19

<211> 40

<212> DNA

<213> hrdBcyp41-R

<400> 19

aatcgttagt taggctaact agttctagac cgccttccgc 40

Claims

1.一种生产米尔贝霉素的重组菌，其特征在于，所述重组菌是通过将出发菌株中cyp41基因敲除使其失活后获得的，所述出发菌株为冰城链霉菌(Streptomyces bingchengsis)X-7，菌种保藏编号为CGMCC 1734；所述cyp41基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述cyp41基因中被敲除的序列如SEQID NO.2所示。

3.权利要求1或2所述的重组菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：

1)cyp41基因敲除载体构建：

2)cyp41基因敲除重组冰城链霉菌的获得：

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤1)中所述的上游序列cyp41up扩增所用的引物为：cyp41up-F：CCCAAGCTTCAGGATGAGGAACGACAGGA；cyp41up-R：CAGGGGATCCCAGCAACCTCCCCTCCAC。

5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤1)中所述的下游序列cyp41down扩增所用的引物为：cyp41down-F：TTCACTGGCCTTTCACGCCGCACGCTT；cyp41down-R：GCTCTAGAATTCCGCAGGAGAACAGATGA。

6.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤1)中所述的cyp41neo扩增以PUC119质粒为模板；所用的引物为：cyp41neo-F：GAGGTTGCTGGGATCCCCTGGATACC；cyp41neo-R：CGGCGTGAAAGGCCAGTGAATTCGAG。

7.权利要求1或2所述的重组菌在发酵生产米尔贝霉素中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述发酵生产米尔贝霉素的方法为：将重组菌株在SKYM固体培养基上培养后，接种到种子培养基培养，再接种到发酵培养基进行培养。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，每100mL种子培养基中含有蔗糖1.0g，脱脂奶粉0.1g，酵母膏0.5g，蛋白胨0.35g，K₂HPO₄0.05g，余量为水，PH＝7.2；培养条件为28℃，250rpm培养46h。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，每100mL发酵培养基中含有蔗糖8.0g，脱脂奶粉0.1g，黄豆饼粉2.0g，FeSO₄0.01g，K₂HPO₄0.1g，CaCO₃0.3g，余量为水，PH＝7.2；培养条件为28℃，250rpm培养9天。