CN110257312B

CN110257312B - 一种重组基因工程菌及其发酵产香兰素的应用

Info

Publication number: CN110257312B
Application number: CN201910372305.8A
Authority: CN
Inventors: 嘉晓勤; 刘昌东; 侯强波; 郑王建; 燕化远; 陈小龙
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2019-05-06
Filing date: 2019-05-06
Publication date: 2021-04-06
Anticipated expiration: 2039-05-06
Also published as: CN110257312A

Abstract

本发明公开了一种重组基因工程菌及其发酵产香兰素的应用，所述重组基因工程菌是由耐受香兰素或阿魏酸的基因导入宿主菌构建而成，所述耐受香兰素或阿魏酸的基因包括周质膜融合蛋白AcrA基因、内膜转运蛋白AcrB基因或外膜蛋白TolC基因中的一种或多种；所述宿主包括含ech基因和fcs基因的大肠杆菌。本发明所述重组基因工程菌E.coli BW25113::PegYB::pACYCDuet‑acrAB‑tolC可利用阿魏酸为底物生产香兰素，香兰素最高产量为2335mg/L。采用本发明的方法发酵产生的发酵液中含有更高的香兰素，具有很好的应用前景。

Description

一种重组基因工程菌及其发酵产香兰素的应用

(一)技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体地说涉及一种重组工程菌及其生产香兰素的方法，尤其是一种耐受阿魏酸和香兰素的重组工程菌及其构建方法，以及利用该菌株以阿魏酸为底物生产香兰素的方法。

(二)背景技术

香兰素(Vanillin)，又名香草醛，化学名为3-甲氧基-4-羟基苯甲醛，是人们普遍喜爱的奶油香草香精的主要成分。香兰素是目前全球用量最大的香料，消费者尤其欢迎利用生物技术获得的天然香兰素。从植物中提取的天然香兰素产量少、价格贵，利用微生物发酵是生产天然香兰素的一种重要方法。

近年来，一些研究者尝试利用重组大肠杆菌转化阿魏酸生产天然香兰素，并且取得了一定的进展，但距离工业化生产仍面临一些需要解决的问题。如：阿魏酸和香兰素都对大肠杆菌具有毒害作用，高浓度条件下会抑制菌株的生长和代谢，并导致细胞自溶。虽然Lee等人在发酵液中添加XAD-2树脂可以提高香兰素的产量，但树脂容易破碎并不适合工业化生产的要求。因此，提高重组菌对阿魏酸和香兰素的耐受性是现阶段生产天然香兰素研究的瓶颈，亟待突破。

外排泵是一种存在于细菌细胞内膜并依赖消耗能量的外排作用系统，通过主动运输，将对细胞有害的物质从胞内排出，使胞内有害物质浓度降低，减缓有害物质对细胞生长和代谢的抑制作用。在大肠杆菌中，AcrAB-TolC外排泵由跨越细胞膜的多种蛋白质组成，包括外膜蛋白TolC，周质膜融合蛋白AcrA和内膜转运蛋白AcrB。该外排泵能将多种药物主动排出细胞，从而使细菌对多种抗生素具有耐药性。目前，尚无AcrAB-TolC外排泵与大肠杆菌耐受阿魏酸和香兰素的相关报道；也无利用过表达AcrAB-TolC外排泵相关基因，提高重组大肠杆菌制备香兰素的生产效率的相关报道。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种耐受高浓度阿魏酸和香兰素的重组工程菌，在以阿魏酸为底物发酵生产香兰素的过程中提高细胞的浓度，从而获得更高产量的香兰素。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种重组基因工程菌，所述重组基因工程菌是由耐受香兰素或阿魏酸的基因导入宿主菌构建而成，所述耐受香兰素或阿魏酸的基因包括周质膜融合蛋白AcrA基因、内膜转运蛋白AcrB基因或外膜蛋白TolC基因中的一种或多种；所述宿主包括含ech基因(GeneBank序列号KC847406.1)和fcs基因(GeneBank序列号KC847405.1)的大肠杆菌。

进一步，所述耐受香兰素或阿魏酸的基因源自大肠杆菌，所述周质膜融合蛋白AcrA基因核苷酸序列为SEQ ID NO.1(1-1394)所示(编码酶氨基酸序列为SEQ ID NO.2(1-397)所示)、内膜转运蛋白AcrB基因核苷酸序列为SEQ ID NO.1(1395-4744)所示(编码酶氨基酸序列为SEQ ID NO.2(398-1446)所示)或外膜蛋白TolC基因核苷酸序列为SEQ ID NO.1(4745-6426)所示(编码酶氨基酸序列为SEQ ID NO.2(1447-1939)所示)。

进一步，优选所述耐受香兰素或阿魏酸的基因由周质膜融合蛋白AcrA基因、内膜转运蛋白AcrB基因和外膜蛋白TolC基因组成，核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示、编码酶氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

进一步，所述宿主菌构建方法为：将ech基因(GeneBank序列号KC847406.1)和fcs基因(GeneBank序列号KC847405.1)导入表达载体pTrc99a构建重组载体PegYB，转入受体菌E.coli BW25113中，挑选阳性克隆，获得重组受体菌E.coli BW25113::PegYB。

进一步，所述重组基因工程菌是将SEQ ID NO.1所示基因转入重组受体菌E.coliBW25113::PegYB获得的，即重组基因工程菌E.coli BW25113::PegYB::pACYCDuet-acrAB-tolC，记为Escherichia coli JH1，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为2019年4月1日，保藏编号为：CCTCC NO：M 2019222，保藏地址为：中国武汉武汉大学，邮编430072。

本发明还提供一种所述重组基因工程菌在发酵生产香兰素中的应用，所述应用为：将重组基因工程菌接种至发酵培养基，添加终浓度1-5g/L阿魏酸为底物，再加入IPTG至终浓度0.2mM，37℃培养48小时，得到含香兰素的发酵液，发酵液离心，取上清液分离纯化获得香兰素；所述发酵培养基为2YT培养基，组成为：胰蛋白胨16g/L，酵母提取物10g/L，NaCl5g/L，溶剂为水，pH值自然。

进一步，所述重组基因工程菌在接种前先进行活化和扩大培养，再将种子液以体积浓度1％的接种量，接种至LB液体培养基：活化培养：将重组基因工程菌接种于含有100μg/mL氨苄霉素和25μg/mL氯霉素的LB固体培养基，37℃培养过夜，获得活化菌株；种子培养：将活化菌株接种至LB液体培养基中，37℃培养过夜，获得种子液；LB液体培养基配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为水，pH自然；LB固体培养基是在LB液体培养基中添加质量浓度2％琼脂。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明对宿主菌株的阿魏酸和香兰素耐受性进行改造，增加了周质膜融合蛋白AcrA，内膜转运蛋白AcrB和外膜蛋白TolC，宿主菌导入了转化阿魏酸生产香兰素的载体，提供了一种可以耐受高浓度的阿魏酸和香兰素的重组基因工程菌及其构建方法与发酵法生产香兰素的应用，改造后的菌株比改造前菌株增加发酵液中菌株的浓度(以OD600为标准)，进而提高菌株发酵产香兰素的能力，增强了耐受性。实验表明本发明所述重组基因工程菌E.coli BW25113::PegYB::pACYCDuet-acrAB-tolC可利用阿魏酸为底物生产香兰素，经48小时发酵，以1g/L、2g/L、3g/L、4g/L或5g/L阿魏酸为底物，香兰素产量分别为910mg/L，1571mg/L，2335mg/L，1793mg/L，1152mg/L。重组受体菌E.coli BW25113::PegYB，香兰素最高产量为1242mg/L；而过表达外排泵相关基因的重组菌E.coli BW25113::PegYB::pACYCDuet-acrAB-tolC，香兰素最高产量为2335mg/L。采用本发明的方法发酵产生的发酵液中含有更高的香兰素，具有很好的应用前景。

(四)附图说明

图1为实施例9原受体菌BW25113与重组工程菌在LB培养液中细胞生长浓度的变化。

图2为实施例9原受体菌BW25113与重组工程菌在含不同浓度阿魏酸的LB培养液中细胞生长浓度的变化。

图3为实施例9原受体菌BW25113与重组工程菌在含不同浓度香兰素的LB培养液中细胞生长浓度的变化。

图4为原受体菌BW25113::PegYB与重组工程菌在含不同浓度阿魏酸的2YT培养液中将阿魏酸转化为香兰素比率的变化。

图5为原受体菌BW25113::PegYB与重组工程菌在含不同浓度阿魏酸的2YT培养液中香兰素产量的变化。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

LB液体培养基配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为水，pH自然；LB固体培养基是在LB液体培养基中添加质量浓度2％琼脂；在使用前进行高压蒸汽灭菌，121℃，20min。

内切酶为Nco I和Hind III(Thermo Scientific)，T4DNA连接酶(Takara)，基因片段酶切产物利用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒(上海生工生物工程有限公司)回收。

实施例1周质膜融合蛋白AcrA氨基酸序列、核酸序列的获得

利用NCBI数据库对周质膜融合蛋白基因序列进行筛选，得到一个周质膜融合蛋白基因。该段序列来源于大肠杆菌(E.coli)，根据克隆载体pACYCDuet的特点设计了限制性内切酶Nco I和Hind III的酶切位点，以大肠杆菌MG1655菌株基因组为模板，利用引物acrA-u、acrA-d进行PCR扩增，获得周质膜融合蛋白AcrA基因(SEQ ID NO.1(1-1394)所示)，编码酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2(1-397)所示。引物序列如下：

acrA-u：5′-taataaggagatataccatggGAATGTATGTACCATAGCACGACGA-3′；

acrA-d：5′-gcattatgcggccgcaagcttCGCCAGCCCCCCTGCCAA-3′。

实施例2重组载体pACYCDuet-acrA的构建以及工程菌的构建

利用限制性内切酶Nco I和Hind III对实施例1克隆的周质膜融合蛋白AcrA基因片段进行双酶切以及回收处理，并利用T4DNA连接酶将该片段同用相同的限制性内切酶处理的克隆载体pACYCDuet在22℃下进行连接2h，从而构建得到重组载体pACYCDuet-acrA。

将构建的重组载体pACYCDuet-acrA转化至受体菌E.coli BW25113中，涂布于LB固体平板(含100μg/mL氨苄青霉素)，37℃培养。平板上长出的菌落中随机挑取克隆并抽提质粒进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，筛选获得工程菌E.coli BW25113/pACYCDuet-acrA。

实施例3内膜转运蛋白AcrB氨基酸序列、核酸序列的获得

利用NCBI数据库对内膜转运蛋白基因序列进行筛选，得到一个内膜转运蛋白基因。该段序列来源于大肠杆菌(E.coli)，根据克隆载体pACYCDuet的特点设计了限制性内切酶Nco I和Hind III的酶切位点，以大肠杆菌MG1655菌株基因组为模板，利用引物acrB-u、acrB-d进行PCR扩增，获得内膜转运蛋白AcrB基因(SEQ ID NO.1(1395-4744)所示)，编码酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2(398-1446)所示。引物序列如下：

acrB-u：5′-taataaggagatataccatggGTAAAAGCACAAGAAGTTACCGCTG-3′；

acrB-d：5′-gcattatgcggccgcaagcttTTCGTATGAGATCCTGAGTTGGTG-3′。

实施例4重组载体pACYCDuet-acrB的构建以及工程菌的构建

利用限制性内切酶Nco I和Hind III对实施例3克隆的内膜转运蛋白AcrB基因片段进行双酶切以及回收处理，并利用T4DNA连接酶(Takara)将该片段同用相同的限制性内切酶处理的克隆载体pACYCDuet在22℃下进行连接2h，从而构建得到重组载体pACYCDuet-acrB。

将构建的重组载体pACYCDuet-acrB转化至受体菌E.coli BW25113中，涂布于LB固体平板(含100μg/mL氨苄青霉素)，37℃培养。平板上长出的菌落中随机挑取克隆并抽提质粒进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，筛选获得工程菌E.coli BW25113::pACYCDuet-acrB。

实施例5外膜蛋白TolC氨基酸序列、核酸序列的获得

利用NCBI数据库对外膜蛋白基因序列进行筛选，得到一个外膜蛋白基因。该段序列来源于大肠杆菌(E.coli)，根据克隆载体pACYCDuet的特点设计了限制性内切酶Nco I和Hind III的酶切位点，以大肠杆菌MG1655菌株基因组为模板，利用引物tolC-u、tolC-d进行PCR扩增，获得外膜蛋白TolC基因(SEQ ID NO.1(4745-6426)所示)，编码酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2(1447-1939)所示。引物序列如下：

tolC-u：5′-taataaggagatataccatggGCACGTAACGCCAACCTTTT-3′；

tolC-d：5′-gcattatgcggccgcaagcttGCTGGTCGAAATTGAAGCGA-3′。

实施例6重组载体pACYCDuet-tolC的构建以及重组工程菌的构建

利用限制性内切酶Nco I和Hind III对实施例5克隆的外膜蛋白TolC基因片段进行双酶切以及回收处理，并利用T4DNA连接酶将该片段同用相同的限制性内切酶处理的克隆载体pACYCDuet在22℃下进行连接2h，从而构建得到重组载体pACYCDuet-tolC。

将构建的重组载体pACYCDuet-tolC转化至受体菌E.coli BW25113中，涂布于LB固体平板(含100μg/mL氨苄青霉素)，37℃培养。平板上长出的菌落中随机挑取克隆并抽提质粒进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，筛选获得工程菌E.coli BW25113::pACYCDuet-tolC。

实施例7外排泵蛋白AcrAB-TolC核酸序列的获得

利用PCR技术，以大肠杆菌MG1655菌株基因组为模板，分别利用引物对acrA-u2和acrA-d2，acrB-u2和acrB-d2，tolC-u2和tolC-d2进行PCR扩增周质膜融合蛋白AcrA基因片段、内膜转运蛋白AcrB基因片段、外膜蛋白TolC基因片段，将三个片段通过重叠PCR扩增获得外排泵蛋白AcrAB-TolC基因片段(SEQ ID NO.1所示)，编码酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。引物序列如下：

acrA-u2：5′-taataaggagatataccatggGAATGTATGTACCATAGCACGACGA-3′；

acrA-d2：5′-tcttgtgcttttacCGCCAGCCCCCCTGCCAA-3′；

acrB-u2：5′-ctggcgGTAAAAGCACAAGAAGTTACCGCTG-3′；

acrB-d2：5′-cgttacgtgcTTCGTATGAGATCCTGAGTTGGTG-3′；

tolC-u2：5′-ctcatacgaaGCACGTAACGCCAACCTTTT-3′；

tolC-d2：5′-gcattatgcggccgcaagcttGCTGGTCGAAATTGAAGCGA-3′。

实施例8重组载体pACYCDuet-acrAB-tolC的构建以及重组工程菌的构建

利用限制性内切酶Nco I和Hind III对实施例7克隆的外排泵AcrAB-TolC核酸片段进行双酶切以及回收处理，并利用T4DNA连接酶将该片段同用相同的限制性内切酶处理的克隆载体pACYCDuet在22℃下进行连接2h，从而构建得到重组载体pACYCDuet-acrAB-tolC。

将构建的重组载体pACYCDuet-acrAB-tolC转化至受体菌E.coli BW25113中，涂布于LB固体平板(含100μg/mL氨苄青霉素)，37℃培养。平板上长出的菌落中随机挑取克隆并抽提质粒进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，筛选获得工程菌E.coli BW25113::pACYCDuet-acrAB-tolC。

实施例9重组载体影响菌株阿魏酸和香兰素耐受性的分析

1、将实施例2、4、6和8得到的工程菌E.coli BW25113::pACYCDuet-acrA，E.coliBW25113::pACYCDuet-acrB，E coli BW25113::pACYCDuet-tolC，E.coli BW25113::pACYCDuet-acrAB-tolC，以及原受体菌E.coli BW25113接种于LB固体培养基，37℃培养过夜，挑取单菌落接种于LB液体培养基，测定培养液600nm处吸光度(OD600)，绘制各菌株的生长曲线，结果如图1所示。结果表明工程菌的细胞浓度均比原受体菌高，高出2％-74％。

2、将工程菌E.coli BW25113::pACYCDuet-acrA，E.coli BW25113::pACYCDuet-acrB，E.coli BW25113::pACYCDuet-tolC，E.coli BW25113::pACYCDuet-acrAB-tolC，以及原受体菌E.coli BW25113接种于LB固体培养基，37℃培养过夜，挑取单菌落分别接种于含终浓度1g/L，2g/L，3g/L，4g/L，5g/L阿魏酸的LB液体培养基，37℃培养20h后，测定培养液的OD600，绘制细胞生长浓度对比图，结果如图2和表1所示。结果表明工程菌对阿魏酸的耐受性均比原受体菌高，高出8％-54％。

表1不同菌株在不同浓度阿魏酸培养条件下的OD₆₀₀值

注：不同菌株在不同浓度阿魏酸培养条件下的OD₆₀₀值，其中BW25113菌株为对照菌株。

3、将工程菌E.coli BW25113::pACYCDuet-acrA，E.coli BW25113::pACYCDuet-acrB，E.coli BW25113::pACYCDuet-tolC，E.coli BW25113::pACYCDuet-acrAB-tolC，以及原受体菌E.coli BW25113接种于LB固体培养基，37℃培养过夜，挑取单菌落分别接种于含1g/L，2g/L，3g/L，4g/L，5g/L香兰素的LB液体培养基，37℃培养20h后，测定培养液的OD600，绘制细胞生长浓度对比图，结果如图3和表2所示。结果表明工程菌对香兰素的耐受性均比原受体菌高，高出5％-50％。

表2不同菌株在不同浓度香兰素培养条件下的OD₆₀₀值

注：不同菌株在不同浓度香兰素培养条件下的OD₆₀₀值，其中BW25113菌株为对照菌株。

图2和图3，说明重组载体pACYCDuet-acrAB-tolC可以显著提高受体菌对阿魏酸和香兰素的耐受性，在1～5g/L阿魏酸存在条件下，工程菌的细胞浓度(OD600)均比原受体菌高，高出8％-54％；在1～5g/L香兰素存在条件下，工程菌的细胞浓度(OD600)均比原受体菌高，高出5％-50％。

实施例1-9构建的工程菌都只含有1个重组载体，即含有外排泵基因(增加耐受性)，但是不含有香兰素生产基因，所以实施例2、4、6、8构建的工程菌不能转化阿魏酸生产香兰素，只是为了测试在高浓度的阿魏酸或香兰素情况下，细胞是否生长得更好，细胞浓度是否更高(分析OD600，数值高，则说明细胞浓度高，耐受性好)。将验证过的、耐受性增加的载体进一步做转化生产香兰素的实验，增加了1个转化阿魏酸生产香兰素的载体。

实施例10受体菌BW25113::PegYB的构建

利用NCBI数据库对香兰素合成酶基因序列进行筛选，得到一个阿魏酰辅酶A水合酶/醛缩酶基因ech(GeneBank序列号KC847406.1)和一个烯酰辅酶A水合酶基因fcs(GeneBank序列号KC847405.1)，以全合成的方法合成了ech基因和fcs基因的片段，记为SsEF基因片段，根据表达载体pTrc99a的特点设计了限制性内切酶Nco I和BamH I的酶切位点。

利用限制性内切酶Nco I和BamH I对合成的SsEF基因片段进行双酶切以及回收处理，并利用Ligation high Ver.2试剂盒将该片段同用相同的限制性内切酶处理的表达载体pTrc99a在16℃下进行连接1h，从而构建得到重组载体pegYB。将构建的重组载体pegYB转化至受体菌E.coli BW25113中，涂布于LB固体平板(含100μg/mL氨苄青霉素)，37℃培养。平板上长出的菌落中随机挑取克隆并抽提质粒进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，筛选获得重组受体菌BW25113::PegYB。

实施例11：重组基因工程菌的构建

将实施例1得到的重组载体pACYCDuet-acrA，实施例3得到的重组载体pACYCDuet-acrB，实施例5得到的重组载体pACYCDuet-tolC，以及实施例7得到的重组载体pACYCDuet-acrAB-tolC分别转化至实施例10得到重组受体菌E.coli BW25113::PegYB中，涂布于LB固体平板(含100μg/mL氨苄霉素、25μg/mL氯霉素)，37℃培养。平板上长出的菌落中随机挑取克隆并抽提质粒进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，筛选获得重组基因工程菌E.coliBW25113::PegYB::pACYCDuet-acrA，E.coli BW25113::PegYB::pACYCDuet-acrB，E.coliBW25113::PegYB::pACYCDuet-tolC和E.coli BW25113::PegYB::pACYCDuet-acrAB-tolC，E.coliBW25113::PegYB::pACYCDuet-acrAB-tolC记为Escherichia coli JH1，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为2019年4月1日，保藏编号为：CCTCC NO：M 2019222，保藏地址为：中国武汉武汉大学，邮编430072。

实施例12：重组基因工程菌的转化底物效率分析

(1)平板培养：将实施例2、4、6、8得到的工程菌E.coli BW25113/pACYCDuet-acrA，E.coli BW25113/pACYCDuet-acrB，E.coli BW25113::pACYCDuet-tolC，E.coliBW25113::pACYCDuet-acrAB-tolC接种于含有100μg/mL氨苄霉素的LB固体培养基，37℃培养过夜；将实施例10得到的重组受体菌E.coli BW25113::PegYB接种于含有25μg/mL氯霉素的LB固体培养基，37℃培养过夜；将实施例11得到的重组基因工程菌E.coliBW25113::PegYB::pACYCDuet-acrA，E.coli BW25113::PegYB::pACYCDuet-acrB，E.coliBW25113::PegYB::pACYCDuet-tolC，E.coli BW25113::PegYB::pACYCDuet-acrAB-tolC，接种于含有100μg/mL氨苄霉素和25μg/mL氯霉素的LB固体培养基，37℃培养过夜；

(2)种子培养：将步骤(1)培养的菌株接种至LB液体培养基中，37℃培养过夜；

(3)发酵培养：将步骤(2)中得到的种子液以体积浓度1％的接种量接种到发酵培养基中，分别加入终浓度1、2、3、4、5g/L阿魏酸，再添加IPTG至终浓度0.2mM，37℃培养48小时，得到含香兰素的发酵液；发酵培养基组成为：胰蛋白胨16g/L，酵母提取物10g/L，NaCl5g/L，溶剂为水，pH值自然。

(4)HPLC检测发酵液中香兰素的浓度：取发酵液1mL，12000rpm离心10min后取上清，经0.22μm过滤膜过滤至液相样品瓶。使用高效液相色谱仪(Agilent Technologies1290Infinity)进行香兰素浓度的测定。采用Agilent Eclipse Plus C18RRHD(2.1*50mm)色谱柱进行液相分离，流动相A为0.1％乙酸水溶液，流动相B为甲醇。流速为0.5mL/min，梯度洗脱程序为，0min90％A+10％B，1.3min 90％A+10％B，1.7min，60％A+40％B，2.5min60％A+40％B，2.8min 90％A+10％B，3.5min90％A+10％B。紫外检测器波长为280nm，柱温为30℃，香兰素出峰时间为2.3min。

结果见图4、图5和表3，表3实验表明本发明所述重组基因工程菌E.coliBW25113::PegYB::pACYCDuet-acrAB-tolC可利用阿魏酸为底物生产香兰素，经48小时发酵，添加1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L阿魏酸为底物，产生的香兰素分别为910mg/L，1571mg/L，2335mg/L，1793mg/L，1152mg/L。发酵液中香兰素最高产量为2335mg/L，其转化效率为76.67％。图4表明重组基因工程菌对底物的转化效率均比重组受体菌高出5％-71％，图5表明重组受体菌的产量为0.4g/L-1.24g/L，重组基因工程菌的香兰素产量为0.66-2.35g/L，重组基因工程菌的产量均比重组受体菌高，高出65％-89％。而实施例2、4、6、8得到的工程菌E.coliBW25113/pACYCDuet-acrA，E.coli BW25113/pACYCDuet-acrB，E.coli BW25113::pACYCDuet-tolC，E.coliBW25113::pACYCDuet-acrAB-tolC在上述发酵条件下，香兰素的产量均为0g/L。

表3不同菌株在不同浓度阿魏酸培养条件下的香兰素产量(mg/L)

注：发酵菌株在不同浓度阿魏酸培养条件下的香兰素产量。其中BW25113::pegYB为对照菌株。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种重组基因工程菌及其发酵产香兰素的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6426

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

gaatgtatgt accatagcac gacgataata taaacgcagc aatgggttta ttaacttttg 60

accattgacc aatttgaaat cggacactcg aggtttacat atgaacaaaa acagagggtt 120

tacgcctctg gcggtcgttc tgatgctctc aggcagctta gccctaacag gatgtgacga 180

caaacaggcc caacaaggtg gccagcagat gcccgccgtt ggcgtagtaa cagtcaaaac 240

tgaacctctg cagatcacaa ccgagcttcc gggtcgcacc agtgcctacc ggatcgcaga 300

agttcgtcct caagttagcg ggattatcct gaagcgtaat ttcaaagaag gtagcgacat 360

cgaagcaggt gtctctctct atcagattga tcctgcgacc tatcaggcga catacgacag 420

tgcgaaaggt gatctggcga aagcccaggc tgcagccaat atcgcgcaat tgacggtgaa 480

tcgttatcag aaactgctcg gtactcagta catcagtaag caagagtacg atcaggctct 540

ggctgatgcg caacaggcga atgctgcggt aactgcggcg aaagctgccg ttgaaactgc 600

gcggatcaat ctggcttaca ccaaagtcac ctctccgatt agcggtcgca ttggtaagtc 660

gaacgtgacg gaaggcgcat tggtacagaa cggtcaggcg actgcgctgg caaccgtgca 720

gcaacttgat ccgatctacg ttgatgtgac ccagtccagc aacgacttcc tgcgcctgaa 780

acaggaactg gcgaatggca cgctgaaaca agagaacggc aaagccaaag tgtcactgat 840

caccagtgac ggcattaagt tcccgcagga cggtacgctg gaattctctg acgttaccgt 900

tgatcagacc actgggtcta tcaccctacg cgctatcttc ccgaacccgg atcacactct 960

gctgccgggt atgttcgtgc gcgcacgtct ggaagaaggg cttaatccaa acgctatttt 1020

agtcccgcaa cagggcgtaa cccgtacgcc gcgtggcgat gccaccgtac tggtagttgg 1080

cgcggatgac aaagtggaaa cccgtccgat cgttgcaagc caggctattg gcgataagtg 1140

gctggtgaca gaaggtctga aagcaggcga tcgcgtagta ataagtgggc tgcagaaagt 1200

gcgtcctggt gtccaggtaa aagcacaaga agttaccgct gataataacc agcaagccgc 1260

aagcggtgct cagcctgaac agtccaagtc ttaacttaaa caggagccgt taagacatgc 1320

ctaatttctt tatcgatcgc ccgatttttg cgtgggtgat cgccattatc atcatgttgg 1380

caggggggct ggcggtaaaa gcacaagaag ttaccgctga taataaccag caagccgcaa 1440

gcggtgctca gcctgaacag tccaagtctt aacttaaaca ggagccgtta agacatgcct 1500

aatttcttta tcgatcgccc gatttttgcg tgggtgatcg ccattatcat catgttggca 1560

ggggggctgg cgatcctcaa actgccggtg gcgcaatatc ctacgattgc accgccggca 1620

gtaacgatct ccgcctccta ccccggcgct gatgcgaaaa cagtgcagga cacggtgaca 1680

caggttatcg aacagaatat gaacggtatc gataacctga tgtacatgtc ctctaacagt 1740

gactccacgg gtaccgtgca gatcaccctg acctttgagt ctggtactga tgcggatatc 1800

gcgcaggttc aggtgcagaa caaactgcag ctggcgatgc cgttgctgcc gcaagaagtt 1860

cagcagcaag gggtgagcgt tgagaaatca tccagcagct tcctgatggt tgtcggcgtt 1920

atcaacaccg atggcaccat gacgcaggag gatatctccg actacgtggc ggcgaatatg 1980

aaagatgcca tcagccgtac gtcgggcgtg ggtgatgttc agttgttcgg ttcacagtac 2040

gcgatgcgta tctggatgaa cccgaatgag ctgaacaaat tccagctaac gccggttgat 2100

gtcattaccg ccatcaaagc gcagaacgcc caggttgcgg cgggtcagct cggtggtacg 2160

ccgccggtga aaggccaaca gcttaacgcc tctattattg ctcagacgcg tctgacctct 2220

actgaagagt tcggcaaaat cctgctgaaa gtgaatcagg atggttcccg cgtgctgctg 2280

cgtgacgtcg cgaagattga gctgggtggt gagaactacg acatcatcgc agagtttaac 2340

ggccaaccgg cttccggtct ggggatcaag ctggcgaccg gtgcaaacgc gctggatacc 2400

gctgcggcaa tccgtgctga actggcgaag atggaaccgt tcttcccgtc gggtctgaaa 2460

attgtttacc catacgacac cacgccgttc gtgaaaatct ctattcacga agtggttaaa 2520

acgctggtcg aagcgatcat cctcgtgttc ctggttatgt atctgttcct gcagaacttc 2580

cgcgcgacgt tgattccgac cattgccgta ccggtggtat tgctcgggac ctttgccgtc 2640

cttgccgcct ttggcttctc gataaacacg ctaacaatgt tcgggatggt gctcgccatc 2700

ggcctgttgg tggatgacgc catcgttgtg gtagaaaacg ttgagcgtgt tatggcggaa 2760

gaaggtttgc cgccaaaaga agctacccgt aagtcgatgg ggcagattca gggcgctctg 2820

gtcggtatcg cgatggtact gtcggcggta ttcgtaccga tggccttctt tggcggttct 2880

actggtgcta tctatcgtca gttctctatt accattgttt cagcaatggc gctgtcggta 2940

ctggtggcgt tgatcctgac tccagctctt tgtgccacca tgctgaaacc gattgccaaa 3000

ggcgatcacg gggaaggtaa aaaaggcttc ttcggctggt ttaaccgcat gttcgagaag 3060

agcacgcacc actacaccga cagcgtaggc ggtattctgc gcagtacggg gcgttacctg 3120

gtgctgtatc tgatcatcgt ggtcggcatg gcctatctgt tcgtgcgtct gccaagctcc 3180

ttcttgccag atgaggacca gggcgtgttt atgaccatgg ttcagctgcc agcaggtgca 3240

acgcaggaac gtacacagaa agtgctcaat gaggtaacgc attactatct gaccaaagaa 3300

aagaacaacg ttgagtcggt gttcgccgtt aacggcttcg gctttgcggg acgtggtcag 3360

aataccggta ttgcgttcgt ttccttgaag gactgggccg atcgtccggg cgaagaaaac 3420

aaagttgaag cgattaccat gcgtgcaaca cgcgctttct cgcaaatcaa agatgcgatg 3480

gttttcgcct ttaacctgcc cgcaatcgtg gaactgggta ctgcaaccgg ctttgacttt 3540

gagctgattg accaggctgg ccttggtcac gaaaaactga ctcaggcgcg taaccagttg 3600

cttgcagaag cagcgaagca ccctgatatg ttgaccagcg tacgtccaaa cggtctggaa 3660

gataccccgc agtttaagat tgatatcgac caggaaaaag cgcaggcgct gggtgtttct 3720

atcaacgaca ttaacaccac tctgggcgct gcatggggcg gcagctatgt gaacgacttt 3780

atcgaccgcg gtcgtgtgaa gaaagtttat gtcatgtcag aagcgaaata ccgtatgctg 3840

ccggatgata tcggcgactg gtatgttcgt gctgctgatg gtcagatggt gccattctcg 3900

gcgttctcct cttctcgttg ggagtacggt tcgccgcgtc tggaacgtta caacggcctg 3960

ccatccatgg aaatcttagg ccaggcggca ccgggtaaaa gtaccggtga agcaatggag 4020

ctgatggaac aactggcgag caaactgcct accggtgttg gctatgactg gacggggatg 4080

tcctatcagg aacgtctctc cggcaaccag gcaccttcac tgtacgcgat ttcgttgatt 4140

gtcgtgttcc tgtgtctggc ggcgctgtac gagagctggt cgattccgtt ctccgttatg 4200

ctggtcgttc cgctgggggt tatcggtgcg ttgctggctg ccaccttccg tggcctgacc 4260

aatgacgttt acttccaggt aggcctgctc acaaccattg ggttgtcggc gaagaacgcg 4320

atccttatcg tcgaattcgc caaagacttg atggataaag aaggtaaagg tctgattgaa 4380

gcgacgcttg atgcggtgcg gatgcgttta cgtccgatcc tgatgacctc gctggcgttt 4440

atcctcggcg ttatgccgct ggttatcagt actggtgctg gttccggcgc gcagaacgca 4500

gtaggtaccg gtgtaatggg cgggatggtg accgcaacgg tactggcaat cttcttcgtt 4560

ccggtattct ttgtggtggt tcgccgccgc tttagccgca agaatgaaga tatcgagcac 4620

agccatactg tcgatcatca ttgatacaac gtgtaatcac taaggccgcg taagcggcct 4680

tttttatgca taacctacga acattaagga gtaattgaac caccaactca ggatctcata 4740

cgaagcacgt aacgccaacc ttttgcggta gcggcttctg ctagaatccg caataatttt 4800

acagtttgat cgcgctaaat actgcttcac cacaaggaat gcaaatgaag aaattgctcc 4860

ccattcttat cggcctgagc ctttctgggt tcagttcgtt gagccaggcc gagaacctga 4920

tgcaagttta tcagcaagca cgccttagta acccggaatt gcgtaagtct gccgccgatc 4980

gtgatgctgc ctttgaaaaa attaatgaag cgcgcagtcc attactgcca cagctaggtt 5040

taggtgcaga ttacacctat agcaacggct accgcgacgc gaacggcatc aactctaacg 5100

cgaccagtgc gtccttgcag ttaactcaat ccatttttga tatgtcgaaa tggcgtgcgt 5160

taacgctgca ggaaaaagca gcagggattc aggacgtcac gtatcagacc gatcagcaaa 5220

ccttgatcct caacaccgcg accgcttatt tcaacgtgtt gaatgctatt gacgttcttt 5280

cctatacaca ggcacaaaaa gaagcgatct accgtcaatt agatcaaacc acccaacgtt 5340

ttaacgtggg cctggtagcg atcaccgacg tgcagaacgc ccgcgcacag tacgataccg 5400

tgctggcgaa cgaagtgacc gcacgtaata accttgataa cgcggtagag cagctgcgcc 5460

agatcaccgg taactactat ccggaactgg ctgcgctgaa tgtcgaaaac tttaaaaccg 5520

acaaaccaca gccggttaac gcgctgctga aagaagccga aaaacgcaac ctgtcgctgt 5580

tacaggcacg cttgagccag gacctggcgc gcgagcaaat tcgccaggcg caggatggtc 5640

acttaccgac tctggattta acggcttcta ccgggatttc tgacacctct tatagcggtt 5700

cgaaaacccg tggtgccgct ggtacccagt atgacgatag caatatgggc cagaacaaag 5760

ttggcctgag cttctcgctg ccgatttatc agggcggaat ggttaactcg caggtgaaac 5820

aggcacagta caactttgtc ggtgccagcg agcaactgga aagtgcccat cgtagcgtcg 5880

tgcagaccgt gcgttcctcc ttcaacaaca ttaatgcatc tatcagtagc attaacgcct 5940

acaaacaagc cgtagtttcc gctcaaagct cattagacgc gatggaagcg ggctactcgg 6000

tcggtacgcg taccattgtt gatgtgttgg atgcgaccac cacgttgtac aacgccaagc 6060

aagagctggc gaatgcgcgt tataactacc tgattaatca gctgaatatt aagtcagctc 6120

tgggtacgtt gaacgagcag gatctgctgg cactgaacaa tgcgctgagc aaaccggttt 6180

ccactaatcc ggaaaacgtt gcaccgcaaa cgccggaaca gaatgctatt gctgatggtt 6240

atgcgcctga tagcccggca ccagtcgttc agcaaacatc cgcacgcact accaccagta 6300

acggtcataa ccctttccgt aactgatgac gacgacgggg cttcggcccc gtctgaacgt 6360

aaggcaacgt aaagatacgg gttatctgcc gcattcttcc cccttctcgc ttcaatttcg 6420

accagc 6426

<210> 2

<211> 1939

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

Met Asn Lys Asn Arg Gly Phe Thr Pro Leu Ala Val Val Leu Met Leu

1 5 10 15

Ser Gly Ser Leu Ala Leu Thr Gly Cys Asp Asp Lys Gln Ala Gln Gln

20 25 30

Gly Gly Gln Gln Met Pro Ala Val Gly Val Val Thr Val Lys Thr Glu

35 40 45

Pro Leu Gln Ile Thr Thr Glu Leu Pro Gly Arg Thr Ser Ala Tyr Arg

50 55 60

Ile Ala Glu Val Arg Pro Gln Val Ser Gly Ile Ile Leu Lys Arg Asn

65 70 75 80

Phe Lys Glu Gly Ser Asp Ile Glu Ala Gly Val Ser Leu Tyr Gln Ile

85 90 95

Asp Pro Ala Thr Tyr Gln Ala Thr Tyr Asp Ser Ala Lys Gly Asp Leu

100 105 110

Ala Lys Ala Gln Ala Ala Ala Asn Ile Ala Gln Leu Thr Val Asn Arg

115 120 125

Tyr Gln Lys Leu Leu Gly Thr Gln Tyr Ile Ser Lys Gln Glu Tyr Asp

130 135 140

Gln Ala Leu Ala Asp Ala Gln Gln Ala Asn Ala Ala Val Thr Ala Ala

145 150 155 160

Lys Ala Ala Val Glu Thr Ala Arg Ile Asn Leu Ala Tyr Thr Lys Val

165 170 175

Thr Ser Pro Ile Ser Gly Arg Ile Gly Lys Ser Asn Val Thr Glu Gly

180 185 190

Ala Leu Val Gln Asn Gly Gln Ala Thr Ala Leu Ala Thr Val Gln Gln

195 200 205

Leu Asp Pro Ile Tyr Val Asp Val Thr Gln Ser Ser Asn Asp Phe Leu

210 215 220

Arg Leu Lys Gln Glu Leu Ala Asn Gly Thr Leu Lys Gln Glu Asn Gly

225 230 235 240

Lys Ala Lys Val Ser Leu Ile Thr Ser Asp Gly Ile Lys Phe Pro Gln

245 250 255

Asp Gly Thr Leu Glu Phe Ser Asp Val Thr Val Asp Gln Thr Thr Gly

260 265 270

Ser Ile Thr Leu Arg Ala Ile Phe Pro Asn Pro Asp His Thr Leu Leu

275 280 285

Pro Gly Met Phe Val Arg Ala Arg Leu Glu Glu Gly Leu Asn Pro Asn

290 295 300

Ala Ile Leu Val Pro Gln Gln Gly Val Thr Arg Thr Pro Arg Gly Asp

305 310 315 320

Ala Thr Val Leu Val Val Gly Ala Asp Asp Lys Val Glu Thr Arg Pro

325 330 335

Ile Val Ala Ser Gln Ala Ile Gly Asp Lys Trp Leu Val Thr Glu Gly

340 345 350

Leu Lys Ala Gly Asp Arg Val Val Ile Ser Gly Leu Gln Lys Val Arg

355 360 365

Pro Gly Val Gln Val Lys Ala Gln Glu Val Thr Ala Asp Asn Asn Gln

370 375 380

Gln Ala Ala Ser Gly Ala Gln Pro Glu Gln Ser Lys Ser Met Pro Asn

385 390 395 400

Phe Phe Ile Asp Arg Pro Ile Phe Ala Trp Val Ile Ala Ile Ile Ile

405 410 415

Met Leu Ala Gly Gly Leu Ala Ile Leu Lys Leu Pro Val Ala Gln Tyr

420 425 430

Pro Thr Ile Ala Pro Pro Ala Val Thr Ile Ser Ala Ser Tyr Pro Gly

435 440 445

Ala Asp Ala Lys Thr Val Gln Asp Thr Val Thr Gln Val Ile Glu Gln

450 455 460

Asn Met Asn Gly Ile Asp Asn Leu Met Tyr Met Ser Ser Asn Ser Asp

465 470 475 480

Ser Thr Gly Thr Val Gln Ile Thr Leu Thr Phe Glu Ser Gly Thr Asp

485 490 495

Ala Asp Ile Ala Gln Val Gln Val Gln Asn Lys Leu Gln Leu Ala Met

500 505 510

Pro Leu Leu Pro Gln Glu Val Gln Gln Gln Gly Val Ser Val Glu Lys

515 520 525

Ser Ser Ser Ser Phe Leu Met Val Val Gly Val Ile Asn Thr Asp Gly

530 535 540

Thr Met Thr Gln Glu Asp Ile Ser Asp Tyr Val Ala Ala Asn Met Lys

545 550 555 560

Asp Ala Ile Ser Arg Thr Ser Gly Val Gly Asp Val Gln Leu Phe Gly

565 570 575

Ser Gln Tyr Ala Met Arg Ile Trp Met Asn Pro Asn Glu Leu Asn Lys

580 585 590

Phe Gln Leu Thr Pro Val Asp Val Ile Thr Ala Ile Lys Ala Gln Asn

595 600 605

Ala Gln Val Ala Ala Gly Gln Leu Gly Gly Thr Pro Pro Val Lys Gly

610 615 620

Gln Gln Leu Asn Ala Ser Ile Ile Ala Gln Thr Arg Leu Thr Ser Thr

625 630 635 640

Glu Glu Phe Gly Lys Ile Leu Leu Lys Val Asn Gln Asp Gly Ser Arg

645 650 655

Val Leu Leu Arg Asp Val Ala Lys Ile Glu Leu Gly Gly Glu Asn Tyr

660 665 670

Asp Ile Ile Ala Glu Phe Asn Gly Gln Pro Ala Ser Gly Leu Gly Ile

675 680 685

Lys Leu Ala Thr Gly Ala Asn Ala Leu Asp Thr Ala Ala Ala Ile Arg

690 695 700

Ala Glu Leu Ala Lys Met Glu Pro Phe Phe Pro Ser Gly Leu Lys Ile

705 710 715 720

Val Tyr Pro Tyr Asp Thr Thr Pro Phe Val Lys Ile Ser Ile His Glu

725 730 735

Val Val Lys Thr Leu Val Glu Ala Ile Ile Leu Val Phe Leu Val Met

740 745 750

Tyr Leu Phe Leu Gln Asn Phe Arg Ala Thr Leu Ile Pro Thr Ile Ala

755 760 765

Val Pro Val Val Leu Leu Gly Thr Phe Ala Val Leu Ala Ala Phe Gly

770 775 780

Phe Ser Ile Asn Thr Leu Thr Met Phe Gly Met Val Leu Ala Ile Gly

785 790 795 800

Leu Leu Val Asp Asp Ala Ile Val Val Val Glu Asn Val Glu Arg Val

805 810 815

Met Ala Glu Glu Gly Leu Pro Pro Lys Glu Ala Thr Arg Lys Ser Met

820 825 830

Gly Gln Ile Gln Gly Ala Leu Val Gly Ile Ala Met Val Leu Ser Ala

835 840 845

Val Phe Val Pro Met Ala Phe Phe Gly Gly Ser Thr Gly Ala Ile Tyr

850 855 860

Arg Gln Phe Ser Ile Thr Ile Val Ser Ala Met Ala Leu Ser Val Leu

865 870 875 880

Val Ala Leu Ile Leu Thr Pro Ala Leu Cys Ala Thr Met Leu Lys Pro

885 890 895

Ile Ala Lys Gly Asp His Gly Glu Gly Lys Lys Gly Phe Phe Gly Trp

900 905 910

Phe Asn Arg Met Phe Glu Lys Ser Thr His His Tyr Thr Asp Ser Val

915 920 925

Gly Gly Ile Leu Arg Ser Thr Gly Arg Tyr Leu Val Leu Tyr Leu Ile

930 935 940

Ile Val Val Gly Met Ala Tyr Leu Phe Val Arg Leu Pro Ser Ser Phe

945 950 955 960

Leu Pro Asp Glu Asp Gln Gly Val Phe Met Thr Met Val Gln Leu Pro

965 970 975

Ala Gly Ala Thr Gln Glu Arg Thr Gln Lys Val Leu Asn Glu Val Thr

980 985 990

His Tyr Tyr Leu Thr Lys Glu Lys Asn Asn Val Glu Ser Val Phe Ala

995 1000 1005

Val Asn Gly Phe Gly Phe Ala Gly Arg Gly Gln Asn Thr Gly Ile Ala

1010 1015 1020

Phe Val Ser Leu Lys Asp Trp Ala Asp Arg Pro Gly Glu Glu Asn Lys

1025 1030 1035 1040

Val Glu Ala Ile Thr Met Arg Ala Thr Arg Ala Phe Ser Gln Ile Lys

1045 1050 1055

Asp Ala Met Val Phe Ala Phe Asn Leu Pro Ala Ile Val Glu Leu Gly

1060 1065 1070

Thr Ala Thr Gly Phe Asp Phe Glu Leu Ile Asp Gln Ala Gly Leu Gly

1075 1080 1085

His Glu Lys Leu Thr Gln Ala Arg Asn Gln Leu Leu Ala Glu Ala Ala

1090 1095 1100

Lys His Pro Asp Met Leu Thr Ser Val Arg Pro Asn Gly Leu Glu Asp

1105 1110 1115 1120

Thr Pro Gln Phe Lys Ile Asp Ile Asp Gln Glu Lys Ala Gln Ala Leu

1125 1130 1135

Gly Val Ser Ile Asn Asp Ile Asn Thr Thr Leu Gly Ala Ala Trp Gly

1140 1145 1150

Gly Ser Tyr Val Asn Asp Phe Ile Asp Arg Gly Arg Val Lys Lys Val

1155 1160 1165

Tyr Val Met Ser Glu Ala Lys Tyr Arg Met Leu Pro Asp Asp Ile Gly

1170 1175 1180

Asp Trp Tyr Val Arg Ala Ala Asp Gly Gln Met Val Pro Phe Ser Ala

1185 1190 1195 1200

Phe Ser Ser Ser Arg Trp Glu Tyr Gly Ser Pro Arg Leu Glu Arg Tyr

1205 1210 1215

Asn Gly Leu Pro Ser Met Glu Ile Leu Gly Gln Ala Ala Pro Gly Lys

1220 1225 1230

Ser Thr Gly Glu Ala Met Glu Leu Met Glu Gln Leu Ala Ser Lys Leu

1235 1240 1245

Pro Thr Gly Val Gly Tyr Asp Trp Thr Gly Met Ser Tyr Gln Glu Arg

1250 1255 1260

Leu Ser Gly Asn Gln Ala Pro Ser Leu Tyr Ala Ile Ser Leu Ile Val

1265 1270 1275 1280

Val Phe Leu Cys Leu Ala Ala Leu Tyr Glu Ser Trp Ser Ile Pro Phe

1285 1290 1295

Ser Val Met Leu Val Val Pro Leu Gly Val Ile Gly Ala Leu Leu Ala

1300 1305 1310

Ala Thr Phe Arg Gly Leu Thr Asn Asp Val Tyr Phe Gln Val Gly Leu

1315 1320 1325

Leu Thr Thr Ile Gly Leu Ser Ala Lys Asn Ala Ile Leu Ile Val Glu

1330 1335 1340

Phe Ala Lys Asp Leu Met Asp Lys Glu Gly Lys Gly Leu Ile Glu Ala

1345 1350 1355 1360

Thr Leu Asp Ala Val Arg Met Arg Leu Arg Pro Ile Leu Met Thr Ser

1365 1370 1375

Leu Ala Phe Ile Leu Gly Val Met Pro Leu Val Ile Ser Thr Gly Ala

1380 1385 1390

Gly Ser Gly Ala Gln Asn Ala Val Gly Thr Gly Val Met Gly Gly Met

1395 1400 1405

Val Thr Ala Thr Val Leu Ala Ile Phe Phe Val Pro Val Phe Phe Val

1410 1415 1420

Val Val Arg Arg Arg Phe Ser Arg Lys Asn Glu Asp Ile Glu His Ser

1425 1430 1435 1440

His Thr Val Asp His His Met Lys Lys Leu Leu Pro Ile Leu Ile Gly

1445 1450 1455

Leu Ser Leu Ser Gly Phe Ser Ser Leu Ser Gln Ala Glu Asn Leu Met

1460 1465 1470

Gln Val Tyr Gln Gln Ala Arg Leu Ser Asn Pro Glu Leu Arg Lys Ser

1475 1480 1485

Ala Ala Asp Arg Asp Ala Ala Phe Glu Lys Ile Asn Glu Ala Arg Ser

1490 1495 1500

Pro Leu Leu Pro Gln Leu Gly Leu Gly Ala Asp Tyr Thr Tyr Ser Asn

1505 1510 1515 1520

Gly Tyr Arg Asp Ala Asn Gly Ile Asn Ser Asn Ala Thr Ser Ala Ser

1525 1530 1535

Leu Gln Leu Thr Gln Ser Ile Phe Asp Met Ser Lys Trp Arg Ala Leu

1540 1545 1550

Thr Leu Gln Glu Lys Ala Ala Gly Ile Gln Asp Val Thr Tyr Gln Thr

1555 1560 1565

Asp Gln Gln Thr Leu Ile Leu Asn Thr Ala Thr Ala Tyr Phe Asn Val

1570 1575 1580

Leu Asn Ala Ile Asp Val Leu Ser Tyr Thr Gln Ala Gln Lys Glu Ala

1585 1590 1595 1600

Ile Tyr Arg Gln Leu Asp Gln Thr Thr Gln Arg Phe Asn Val Gly Leu

1605 1610 1615

Val Ala Ile Thr Asp Val Gln Asn Ala Arg Ala Gln Tyr Asp Thr Val

1620 1625 1630

Leu Ala Asn Glu Val Thr Ala Arg Asn Asn Leu Asp Asn Ala Val Glu

1635 1640 1645

Gln Leu Arg Gln Ile Thr Gly Asn Tyr Tyr Pro Glu Leu Ala Ala Leu

1650 1655 1660

Asn Val Glu Asn Phe Lys Thr Asp Lys Pro Gln Pro Val Asn Ala Leu

1665 1670 1675 1680

Leu Lys Glu Ala Glu Lys Arg Asn Leu Ser Leu Leu Gln Ala Arg Leu

1685 1690 1695

Ser Gln Asp Leu Ala Arg Glu Gln Ile Arg Gln Ala Gln Asp Gly His

1700 1705 1710

Leu Pro Thr Leu Asp Leu Thr Ala Ser Thr Gly Ile Ser Asp Thr Ser

1715 1720 1725

Tyr Ser Gly Ser Lys Thr Arg Gly Ala Ala Gly Thr Gln Tyr Asp Asp

1730 1735 1740

Ser Asn Met Gly Gln Asn Lys Val Gly Leu Ser Phe Ser Leu Pro Ile

1745 1750 1755 1760

Tyr Gln Gly Gly Met Val Asn Ser Gln Val Lys Gln Ala Gln Tyr Asn

1765 1770 1775

Phe Val Gly Ala Ser Glu Gln Leu Glu Ser Ala His Arg Ser Val Val

1780 1785 1790

Gln Thr Val Arg Ser Ser Phe Asn Asn Ile Asn Ala Ser Ile Ser Ser

1795 1800 1805

Ile Asn Ala Tyr Lys Gln Ala Val Val Ser Ala Gln Ser Ser Leu Asp

1810 1815 1820

Ala Met Glu Ala Gly Tyr Ser Val Gly Thr Arg Thr Ile Val Asp Val

1825 1830 1835 1840

Leu Asp Ala Thr Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Lys Gln Glu Leu Ala Asn

1845 1850 1855

Ala Arg Tyr Asn Tyr Leu Ile Asn Gln Leu Asn Ile Lys Ser Ala Leu

1860 1865 1870

Gly Thr Leu Asn Glu Gln Asp Leu Leu Ala Leu Asn Asn Ala Leu Ser

1875 1880 1885

Lys Pro Val Ser Thr Asn Pro Glu Asn Val Ala Pro Gln Thr Pro Glu

1890 1895 1900

Gln Asn Ala Ile Ala Asp Gly Tyr Ala Pro Asp Ser Pro Ala Pro Val

1905 1910 1915 1920

Val Gln Gln Thr Ser Ala Arg Thr Thr Thr Ser Asn Gly His Asn Pro

1925 1930 1935

Phe Arg Asn

Claims

1.一种重组基因工程菌，其特征在于所述重组基因工程菌Escherichia coli JH1是由耐受香兰素和阿魏酸的基因导入宿主菌构建而成，所述耐受香兰素和阿魏酸的基因由周质膜融合蛋白AcrA基因、内膜转运蛋白AcrB基因和外膜蛋白TolC基因组成，核苷酸序列为SEQID NO.1所示；所述宿主菌构建方法为：将ech基因和fcs基因导入表达载体pTrc99a构建重组载体PegYB，转入受体菌E.coli BW25113中，挑选阳性克隆，获得重组受体菌E.coliBW25113::PegYB；所述重组基因工程菌Escherichia coli JH1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2019年4月1日，保藏编号为：CCTCC NO：M 2019222，保藏地址为：中国武汉武汉大学，邮编430072。

2.一种权利要求1所述重组基因工程菌在发酵生产香兰素中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用为：将重组基因工程菌接种至发酵培养基，以阿魏酸为底物，再加入IPTG至终浓度0.2mM，37℃培养48小时，得到含香兰素的发酵液，发酵液离心，取上清液分离纯化获得香兰素；所述发酵培养基为2YT培养基。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于阿魏酸添加终浓度为1-5g/L。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述重组基因工程菌在接种前先进行活化和扩大培养，再将种子液以体积浓度1％的接种量，接种至LB液体培养基：

活化培养：将重组基因工程菌接种于含有100μg/mL氨苄霉素和25μg/mL氯霉素的LB固体培养基，37℃培养过夜，获得活化菌株；

种子培养：将活化菌株接种至LB液体培养基中，37℃培养过夜，获得种子液；LB液体培养基配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为水，pH自然；LB固体培养基是在LB液体培养基中添加质量浓度2％琼脂。