CN105602914B - 一种来源于马克斯克鲁维酵母的烷基过氧化物还原酶和硫氧还蛋白还原酶及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医学技术领域，涉及一种来源于马克斯克鲁维酵母的烷基过氧化物还原酶和硫氧还蛋白还原酶及其在提高胁迫耐受性方面的应用。烷基过氧化物还原酶基因KmTPX1基因含有594个核苷酸，编码197个氨基酸；KmTrxR基因含有960个核苷酸，编码319个氨基酸。同时，本发明所示的KmTPX1基因和KmTrxR基因能够提高酵母细胞对于多种抑制物或胁迫因子的耐受能力，如过氧化氢、甲酸、乙酸、糠醛、乙醇、氯化钠、苯酚、愈创木酚中的一种或几种。对于甲酸、乙酸、糠醛、乙醇以及盐离子浓度耐受能力的提高，使得烷基过氧化物还原酶基因和硫氧还蛋白还原酶基因在构建优良的纤维素乙醇发酵菌株方面具有至关重要的作用。

Description

一种来源于马克斯克鲁维酵母的烷基过氧化物还原酶和硫氧 还蛋白还原酶及其应用
技术领域
本发明属于微生物基因工程应用领域，具体涉及包含提供来源于马克斯克鲁维酵母的烷基过氧化物还原酶KmTPX1的基因和氨基酸序列，以及硫氧还蛋白还原酶KmTrxR的基因和氨基酸序列。同时本发明也涉及了上述两种酶在提高酿酒酵母胁迫耐受性方面的应用。
背景技术
酵母长期以来一直就是被人们广泛关注的微生物，它可以广泛应用与食品、医药、酿酒等多种工业领域。特别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，因其在最初在酿酒工业的重要应用，一直以来都是研究最为广泛的酵母之一，无论是传统的酿酒工业，还是新兴的生物乙醇，甚至是基因工程领域，酿酒酵母的应用研究都取得了了巨大的进展。近年来，一种非传统酵母，马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)越来越受到人们的关注，因为它具有耐高温条件、生长速率较快、利用底物种类广泛等诸多优势有望广泛应用于工业生物技术领域。尽管K.marxianus研究的较晚，而且许多问题仍待于进一步的理论研究来解决，但是随着基因组学和转录组学技术的不断完善，越来越多来源于马克斯克鲁维酵母的新基因或者新酶被报道(Lertwattanasakul et al.Biotechnol Biofuels.2015，8：1-14.)，为其进一步的研究与利用奠定了基础。
生物乙醇是目前为止研究最早、技术最为成熟的生物质能源产品，被公认为最有可能替代化石能源的生物质能源之一。而纤维素乙醇以其广泛的原料来源是国内外燃料乙醇研发的重点。但是，纤维素结构复杂，需要对纤维素原料进行预处理和水解将其转化成酵母可直接利用的单糖。然而，当前高效的纤维素预处理方法(如蒸汽爆破法，酸法，碱法等)在处理过程中都会产生多种抑制物，影响酵母菌的后续发酵过程，成为纤维素质能源工业化生产的重要挑战(Palmqvis et al.Bioresource Technol.2000，74，25-33.)。
纤维素水解液中的抑制物主要包括三类：弱酸(如甲酸、乙酸等)，呋喃醛类(如糠醛，5-羟甲基糠醛等)，酚类化合物(如4-水杨酸，苯酚等)(Palmqvis et al.BioresourceTechnol.2000，74，25-33.)。纤维素水解液中的多种抑制物对细胞的毒害作用机理是非常复杂的，尽管可以通过一些技术对纤维素水解液进行脱毒反应(Lee et al.J Ind EngChem.2013，19，2010-2015.)，但随之导致的糖损失和成本增加使得脱毒并不是一种理想之选。因此，探索不同的抑制物胁迫因子对细胞产生毒害的机理，从而获得一些耐受性提高的发酵菌株将是解决纤维素乙醇瓶颈问题的关键。
酵母细胞生长需要氧，但是过量的通气会产生对细胞有害的物质，被称为活性氧(ROS)，包括超氧化物、过氧化物以及氢氧自由基等(Arellano-Plaza，et al.World JMicrobiol Biotechnol.2013，29：1279-1287.)。因此，为了防御活性氧的伤害，细胞具有一套完善的防御机制，其中主要涉及一些氧化还原的酶类。之前的一些报道表明，细胞内活性氧的水平或者一些氧化还原酶的表达与细胞对纤维素水解液中抑制物的耐受能力有关(Kumar，et al.PloS one，2015，10(10)：e0139129.)。但是，目前关于马克斯克鲁维酵母来源的氧化还原酶的报道十分有限，关于其功能的研究更少。本发明提供了两种马克斯克鲁维酵母来源的氧化还原酶，烷基过氧化物还原酶KmTPX1和硫氧还蛋白还原酶KmTrxR。
KmTPX1属于过氧化物还原酶(Peroxiredoxins，Prx)家族，根据序列比对发现这种酶与酿酒酵母中的硫醇特异的抗氧化蛋白(Tsa1)同源性达到90％(Wong et al.J BiolChem.2004，279：23207-23213.)，在细胞内的含量是最大的(Tachibana et al.J BiolChem.2009；284：4464-72.)；KmTrxR与硫氧还蛋白KmTrx在细胞内成对出现，Trx-TrxR系统广泛存在于酵母细胞的线粒体中，能够保护细胞免受ROS的损伤。本发明提供的这两种酶是马克斯克鲁维酵母细胞内防御ROS的关键酶，同时也能够有效地提高对多种抑制物或胁迫因子的耐受能力。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种来源于马克斯克鲁维酵母的烷基过氧化物还原酶KmTPX1的基因和氨基酸序列。
本发明的目的之二是提供一种来源于马克斯克鲁维酵母的硫氧还蛋白还原酶KmTrxR的基因和氨基酸序列。
本发明的目的之三是提供一株过表达KmTpX1基因的酿酒酵母。
本发明的目的之四是提供一株过表达KmTrxR基因的酿酒酵母。
本发明的目的之五是证明烷基过氧化物还原酶KmTPX1和硫氧还蛋白还原酶KmTrxR能够提高酿酒酵母细胞对一种或多种抑制物或胁迫因子的耐受性，包括过氧化氢、甲酸、乙酸、糠醛、乙醇、苯酚、愈创木酚、氯化钠等。
本发明的技术方案：
一种来源于马克斯克鲁维酵母的烷基过氧化物还原酶KmTPX1，该烷基过氧化物还原酶KmTPX1的核苷酸序列为：
1 ATGGTTGCCC AAGTCCAAAA GCCAGCCCCA GAGTTCAAGA AGACCGCTGT
51 CATTGACGGT GTTTTCGACG AAGTTTCCCT AGAAAAATAC AAGGGTAAGT
101 ACGTTGTCTT GGCCTTCATT CCATTGGCCT TCACCTTCGT GTGCCCAACT
151 GAAATCATTG CCTTCTCTGA AGCTGCCAAG AAGTTCGAAG AAATTGGTGC
201 TCAAGTTTTG TTCGCTTCCA CTGACTCCGA ATACTCCTTG TTGGCATGGA
251 CCAACGTTGC TAGAAAGGAC GGTGGTCTAG GTCCAGTCAA CATTCCATTG
301 ATTGCTGACA CCAACCACTC CTTGTCCAGA GACTACGGTG TCTTGATCGA
351 AGAAGAAGGT ATTGCCTTGA GAGGTTTGTT CTTGATCGAT CCAAAGGGTA
401 TTGTGAGACA CATCACCATC AACGACTTGC CAGTCGGTAG AAACGTTGAA
451 GAAGCTTTGA GATTGGTCGA AGGTTTCCAA TGGACCGACA AGAACGGTAC
501 CGTCTTGCCA TGTAACTGGA CTCCAGGTTC CGCTACCATC AAGCCAGACG
551 TCGAAGCTTC TAAGGAATAC TTCGCTGCCG CTAACAAGGA ATAA
该核苷酸序列中含有594个核苷酸，编码197个氨基酸。
一种来源于马克斯克鲁维酵母的硫氧还蛋白还原酶KmTrxR，该硫氧还蛋白还原酶KmTrxR的核苷酸序列为：
1 ATGGTTCATC ACAAGGTAAC AATTATTGGT TCCGGCCCAG CAGCCCACAC
51 CGCCGCCATT TACTTGGCTA GAGCAGAAAT CAAGCCTACC CTATACGAAG
101 GTTTCATGGC TAATGGTATC GCCGCCGGTG GTCAACTAAC AACCACCACT
151 GAAATCGAAA ACTTCCCAGG TTTCCCAGAA GGTTTGACCG GTAGTGAATT
201 GATGGATAAG ATGAAGGCTC AATCTGTCAA GTTTGGTACC GAGGTGATTA
251 CCGAAACCGT TGCAAAGGTG GACTTGTCTA GCAAGCCATT CAAGTTCTGG
301 ACCGAATTCA ACGAGGACCA AGAACCAGAA ACTACCGATG CCATTATCTT
351 GGCTACCGGT GCCTCCGCTA AGCGTCTACA CTTGCCAGGT GAAGAGAAGT
401 ACTGGCAACA GGGTATCTCC GCCTGTGCCG TTTGTGACGG TGCAGTGCCA
451 ATCTTCAGAA ACAAGCCATT GGCTGTCATC GGTGGTGGTG ACTCTGCCTG
501 TGAAGAAGCA CAATTTTTGA CCAAGTACGG TTCCAAGGTG TACATGCTTG
551 TCAGAAAGGA CCACTTGCGT GCCTCTCAAA TCATGCAAAG ACGTGCTGAA
601 CAAAACGAAA AGATCGAAAT CTTGTACAAC CACGTCACCT TGGAAGCCAA
651 GGGTGACGAC AAGTACTTGA ATGCATTGAA GGTCAAGAAC GTAAAGACCA
701 ATGAAGAATA CGACTTGCCA GTTAACGGAT TATTCTACGC CATTGGTCAC
751 TCCCCAGCTA CCAAAATTGT TGCTGGACAA GTCGATCTTG ACGATGCTGG
801 CTACGTTAAG ACCGTCCCAG GCTCCTCTTT GACTAGCGTC CCAGGTGTTT
851 TCGCTGCTGG TGATGTCCAA GATTCTAGAT ACAGACAAGC TATCACTTCC
901 GCTGGCTCTG GTTGTATGGC CGCTTTGGAT GCTGAAAAGT ACCTAACTGA
951 ATTGGAATAA
该核苷酸序列中含有960个核苷酸，编码319个氨基酸。
烷基过氧化物还原酶KmTPX1的应用，步骤如下：
(1)烷基过氧化物还原酶KmTPX1基因的克隆
所述的烷基过氧化物还原酶KmTPX1来源于马克斯克鲁维酵母，以其基因组为模板，上游引物TPX1-F，5’-CTTGAGCTCAATGTCTCGTCTCGTCTCGT-3’和下游引物TPX1-R，5’-TCCCCGCGGGGCTAAGCCAATAACTTATT-3’，通过聚合酶链式反应扩增方式获得；烷基过氧化物还原酶KmTPX1编码区为594bp编码序列，编码197个氨基酸；
(2)含有目的基因过表达载体的构建以及酵母转化
以酿酒酵母多拷贝质粒pRS423为基本骨架，根据其酶切位点特性，选择SacI和SacII酶切位点插入KmTPX1基因片段，KmTPX1基因片段来源于步骤(1)经过PCR得到的纯化产物；经过酶切后对相应DNA片段进行回收纯化，用T4连接酶进行连接，转化大肠杆菌DH5α，重组质粒经过酶切验证后命名为pRS423-TPX1；
将构建好的重组质粒和空载质粒分别按照LiAc/PEG方法转化入S.cerevisiae280中，以营养缺陷型的筛选标记进行转化子的筛选，获得的转化子经验证后即为所述的实现提高胁迫因子耐受性的重组酵母菌株；
(3)功能分析与验证
将过表达烷基过氧化物还原酶KmTPX1的重组酵母菌株命名为TPX1，含有空载质粒pRS423的重组酵母菌株命名为423；TPX1以423作为对照，在缺少组氨酸的SD培养基中进行活化；
经活化后的TPX1和423两种酵母菌分别按照v/v 1％的接种量接种至含有1mM H2O2的SD培养基中，30℃，150rpm培养16-18后成为种子液；将种子液OD620调成一致，10倍梯度稀释，点样于缺乏相应氨基酸的SD固体检测平板；平板中分别添加不同的抑制物或者胁迫因子通过观察菌体生长状况来表征不同菌株对于不同抑制物或胁迫因子的耐受能力；所述的抑制物或者胁迫因子包括过氧化氢、甲酸、乙酸、糠醛、乙醇、苯酚、愈创木酚和氯化钠。
硫氧还蛋白还原酶KmTrxR的应用，步骤如下：
所述的硫氧还蛋白还原酶KmTrxR来源于马克斯克鲁维酵母，以其基因组为模板，上游引物TrxR-F，5’-TCCGAGCTCCCCATGTCAAATGATGAAACG-3’和下游引物TrxR-R，5’-TCCCCGCGGACGAGGAACCAACCTTTATT-3’，通过聚合酶链式反应扩增方式获得；硫氧还蛋白还原酶KmTrxR编码区长度为960bp编码序列，编码319个氨基酸；
以酿酒酵母多拷贝质粒pRS425为基本骨架，根据其酶切位点特性，选择SacI和SacII酶切位点插入KmTrxR基因片段，KmTxrR片段来源于步骤(1)经过PCR得到的纯化产物；经过酶切后对相应DNA片段进行回收纯化，用T4连接酶进行连接，转化大肠杆菌DH5α，重组质粒经过酶切验证后命名为pRS425-TrxR；
将构建好的重组质粒和空载质粒分别按照LiAc/PEG方法转化入S.cerevisiae280中，以营养缺陷型的筛选标记进行转化子的筛选，获得的转化子经验证后即为本发明所述的能够实现提高胁迫因子耐受性的重组酵母菌株；
(3)功能分析与验证
将过表达硫氧还蛋白还原酶KmTrxR的重组酵母菌株命名为TrxR，含有空载质粒pRS425的重组酵母菌株命名为425；TrxR以425作为对照，在缺少亮氨酸的SD培养基中进行活化培养；
经活化后的TrxR和425两种酵母菌分别按照v/v 1％的接种量接种至含有1mM H2O2的SD培养基中，30℃，150rpm培养16-18h后成为种子液；将种子液OD620调成一致，10倍梯度稀释，点样于缺乏相应氨基酸的SD固体检测平板；平板中分别添加不同的抑制物或者胁迫因子通过观察菌体生长状况来表征不同菌株对于不同抑制物或胁迫因子的耐受能力；所述的抑制物或者胁迫因子包括过氧化氢、甲酸、乙酸、糠醛、乙醇、苯酚、愈创木酚和氯化钠。
本发明的有益成果表现为两种新的氧化还原类酶的发现，同时这两种酶均表现为能够提高酿酒酵母对于不同的抑制物或者胁迫因子的耐受能力。与现有的成果相比，本发明提供的烷基过氧化物还原酶KmTPX1和硫氧还蛋白还原酶KmTrxR具有更加广泛的作用效果和应用前景。
附图说明
图1是含有KmTPX1基因的过表达载体构建示意图。
图2是KmTPX1基因的PCR克隆和重组质粒的酶切验证电泳图。
图3是含有KmTrxR基因的过表达载体构建示意图。
图4是KmTrxR基因的PCR克隆和重组质粒的酶切验证电泳图。
图5a是KmTPX1基因实时定量PCR验证结果。
图5b是KmTrxR基因实时定量PCR验证结果。
图6是过表达KmTPX1对不同抑制物或胁迫因子的耐受能力比较。
图7是过表达KmTrxR对不同抑制物或胁迫因子的耐受能力比较。
具体实施实式
以下结合附图和技术方案，进一步说明本发明的具体实施方式。
实施例1过表达烷基过氧化物还原酶KmTPX1的酿酒酵母菌株的构建
1.KmTPX1基因的克隆
采用Primer Premier 5.0引物设计软件，根据K.marxianus的烷基过氧化物还原酶KmTPX1基因全序列(转录组测序获得)为依据设计上游引物TPX1-F，5’-CTTGAGCTCAATGTCTCGTCTCGTCTCGT-3’和下游引物TPX1-R，5’-TCCCCGCGGGGCTAAGCCAATAACTTATT-3’，分别在5′端引入SacI酶切位点和3′端引入SacII酶切位点。以K.cicerisporus CBS4857基因组为模板，进行PCR扩增反应。其中，PCR反应体系(50μL)：
PCR反应条件：
PCR反应结束后，取2μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，产物共含有1093个核苷酸，其中含有478bp的启动子，和594bp编码序列。同时利用PCR产物纯化试剂盒(OMEGA，USA)对扩增得到的PCR产物进行纯化后保存于-20℃冰箱中备用。
2.含有KmTPX1基因的酿酒酵母过表达载体的构建
按照质粒提取试剂盒(OMEGA，USA)中的操作步骤，提取酿酒酵母多拷贝载体pRS423(图1)，取2μL质粒进行琼脂糖凝胶电泳检测，确认无误后，与之前纯化后的KmTPX1基因的PCR片段进行酶切反应，反应体系(50μL)如下：
37℃反应4h。凝胶回收试剂盒(OMEGA，USA)纯化目的片段或质粒后保存于-20℃冰箱中备用。
将酶切纯化后的目的片段与质粒进行连接，反应体系(10μL)如下：
16℃过夜连接后直接用于大肠转化。
E.coli DH5α感受态细胞的制备以及转化方法参见文献。(Cohen etal.Sciences，1972，69(8)，2110-2114.)。在添加100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养基(10g/L胰蛋白胨，10g/L氯化钠和5g/L酵母粉)中进行转化子的筛选。获得的转化子先经过菌液PCR验证，提取验证正确的转化子的质粒(OMEGA，USA)，并进行酶切验证，最终验证无误的重组质粒命名为pRS423-TPX1。
3.含有KmTPX1基因的酵母菌转化
3.1酵母感受态的制备
选取S.cerevisiae 280作为KmTPX1基因的过表达宿主。S.cerevisiae 280是酿酒酵母的一种单倍体模式菌株，并且是组氨酸、亮氨酸和尿嘧啶的营养缺陷型，方便后续的转化子筛选。将构建好的重组质粒以电转化的方式转化到S.cerevisiae 280中，实现KmTPX1基因的过表达。S.cerevisiae 280感受态细胞的制备过程如下：
(1)从斜面试管取菌接于50mLYPD液体培养基中，30℃，150rpm，培养24h。
(2)将活化后的菌液转接至新的100mL YPD液体培养基中，培养至其D620到1.0-1.5左右，冰浴，放置15min，使培养物冷却至0℃
(3)摇匀培养瓶中的菌液，分装至无菌的50mL离心管中，4℃，3000g，离心5min，收集细胞。去上清，将管倒置1min，使培养液流尽，放置冰上。
(4)用等体积预冷的40mL灭菌超纯水重悬细胞沉淀。4℃，3000g，离心5min，收集细胞。
(5)去上清，再用1/2体积的灭菌超纯水重复清洗细胞一次。
(6)离心后去上清，留菌体，用预冷的40ml的1M山梨醇重悬细胞。
(7)4℃，3000g，离心5min，收集细胞。
(8)重复(6)和(7)。
(9)去上清，用适量的1M山梨醇重悬细胞团。
3.2酵母电转化
具体步骤如下：
(1)取1.5ml EP灭菌离心管(放冰上)，先将感受态细胞分装至1.5mL EP离心管中，再加入2μL质粒，然后用手指温柔轻弹混匀，放置冰上。
(2)将80μL感受态细胞和质粒(重组质粒pRS423-TPX1和空载质粒pRS423)混合液分别加入0.4em的电转杯中，冰浴后放置在电转仪上。
(3)在1.5kV 25μF，500Ω的条件下进行电极转化。
(4)加入1ml冰浴的山梨醇，用枪轻轻吹打，再温和转移至1.5ml灭菌离心管中，30℃静置，孵育5-7h.
(5)3000g离心5min。
(6)将孵育后的转化子浓缩至200μL左右，涂至选择培养基。
3.3转化子的筛选与验证
转化后的酵母菌在缺少组氨酸的SD培养基(0.67％酵母氮碱，2％葡萄糖，3％琼脂粉和其他必须的氨基酸营养成分)中培养2～3天。挑取单菌落于液体组氨酸的SD培养基中，培养16～18h。
提取酵母转化子质粒(OMEGA，USA)，将其按照上述方法转化进入E.coli DH5α中进行PCR验证，酶切验证。验证确认后的转化子即为过表达KmTPX1基因的酿酒酵母菌株。
实施例2过表达硫氧还蛋白还原酶KmTrxR的酿酒酵母菌株的构建
同样，采用Primer Premier 5.0引物设计软件，根据K.marxianus的硫氧还蛋白还原酶KmTrxR全序列(转录组测序获得)为依据设计上游引物TrxR-F，5’-TCCGAGCTCCCCATGTCAAATGATGAAACG-3’和下游引物TrxR-R，5’-TCCCCGCGGACGAGGAACCAACCTTTATT-3’，分别在5’端引入SacI酶切位点和3′端引入SacII酶切位点。以K.cicerisporus CBS4857基因组为模板，进行PCR扩增反应。PCR的反应体系与反应条件与实施例1中相同，获得的PCR产物共含有1472个核苷酸，其中含有497bp长的其自身启动子和960bp编码序列。
纯化后的PCR产物与酿酒酵母多拷贝载体pRS425(图2)进行连接反应，随后转化到E.coli DH5α中，实验方法与实施例1中完全一致。确认无误的重组质粒命名为pRS425-TrxR。
依旧选取S.cerevisiae 280作为KmTrxR基因的过表达宿主。按照实施例1中的方法制备感受态细胞并进行电转化。转化后的细胞在缺少亮氨酸的SD培养基中进行筛选。将获得的转化子经过验证确认后即为过表达KmTrxR基因的酿酒酵母菌株。
实施例3实时定量PCR验证KmTPX1基因和KmTrxR基因的表达强度
为了确认实施例1和2中构建的含有KmTPX1基因和KmTrxR基因的重组质粒能够在酿酒酵母中成功进行转录，我们采用实时定量PCR的方式验证这两个基因的表达强度。
首先，验证KmTPX1基因的表达情况。将过表达的KmTPX1酿酒酵母菌株(命名为TPX1)和含有空载质粒pRS423的对照酵母菌株(命名为423)均在缺少组氨酸的SD培养基(0.67％酵母氮碱，2％葡萄糖和其他必须的氨基酸营养成分，SD-His)中进行培养。经活化后的两种酵母菌分别按照1％(v/v)的接种量接种至SD-His培养基中，30℃，150rpm培养至对数生长期(16-18h)。收集细胞，用于总RNA的提取。RNA提取过程采用液氮冷冻研磨的方式破碎酵母细胞壁，之后利用RNAsimple总RNA提取试剂盒(天根，中国)提取细胞内的总RNA，具体操作步骤可参见说明书。获得的总RNA样品经测定浓度和纯度后用于后续的反转录和实时定量PCR的实验操作。反转录和实时定量PCR的具体操作步骤详见TaKaRaPrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒(Takara，Japan)和Premix Ex TaqTMII试剂盒(Takara，Japan)说明书。PCR反应中所用引物为TPX1-F(5’-CTCAAGTTTTGTTCGCTTCCAC-3’)和TPX1-R(5’-AAGTCGTTGATGGTGATGTGTCT-3’)。同时，利用Actin作为管家基因，引物序列为ACT1-F(5′-ACCATGTTCCCAGGTATTGC-3’)和ACT1-R(5′-TGGACCACTTTCGTCGTATTC-3′)。将获得的数据进行基因相对表达量分析，实验结果如图5A所示。实验结果表明，实施例1中构建的含有KmTPX1基因的重组质粒能够在酿酒酵母内正常转录，并且其较大的转录活性能够证实KmTPX1基因过表达过程的实现，在正常的翻译以及翻译后修饰过程后能够实现蛋白的较高的表达量，后续将进一步验证其功能。
同时，我们也验证了KmTrxR基因的表达情况。同样，将过表达的KmTrxR酿酒酵母菌株(命名为TrxR)和含有空载质粒pRS425的对照酵母菌株(命名为425)均在缺少亮氨酸(Leucine，Leu)SD培养基(SD-Leu)中进行培养。总RNA的提取、反转录和实时定量PCR的过程与上述完全一致。所用引物为TrxR-F(5’-GCGTGCCTCTCAAATCATGC-3’)和TrxR-R(5’-AACGTAGCCAGCATCGTCAA-3’)，同样以Actin为管家基因。实验结果如图5B所示，与KmTPX1基因相似，KmTrxR基因也能够在酿酒酵母正常转录并实现较高的表达量，其功能有待于进一步的实验进行验证。
实施例4烷基过氧化物还原酶KmTPX1对不同胁迫因子耐受性检测
为了验证KmTPX1的功能，将过表达的KmTPX1酿酒酵母菌株(命名为TPX1)和含有空载质粒pRS423的对照酵母菌株(命名为423)均在缺少组氨酸(Histidine，His)的SD培养基(0.67％酵母氮碱，2％葡萄糖和其他必须的氨基酸营养成分，SD-His)中进行培养。经活化后的两种酵母菌分别按照1％(v/v)的接种量接种至含有1mM H2O2的SD-His培养基中，30℃，150rpm培养16-18h。将种子液OD620调成一致(10左右)，10倍梯度稀释，取10μl点样于SD-His固体检测平板。平板中事先添加不同的抑制物或者胁迫因子，包括2mM过氧化氢、0.3g/L甲酸、1.5g/L乙酸、1.0g/L糠醛、5％乙醇、0.23g/L苯酚、0.3g/L愈创木酚、3M氯化钠、高温(42℃)和FAF混合物(甲酸0.2g/L，乙酸1.5g/L和糠醛0.6g/L)。通过观察菌体生长状况来表征不同菌株对于不同抑制物或胁迫因子的耐受能力。
实验结果如图6所示，过表达KmTPX1酿酒酵母菌株对大部分抑制物或者胁迫因子的抗性均有不同程度的提高。在不添加任何抑制物的平板上，过表达KmTPX1酿酒酵母菌株与对照菌的生长没有显著差别，说明KmTPX1过表达不会影响细胞生长；在含有2mM H2O2、0.3g/L甲酸、1.5g/L乙酸或1.0g/L糠醛培养基中，不含有KmTPX1的菌株的生长受到了较为明显的抑制作用，其在点板实验中的生长比实验菌少1～2个梯度。同样，在含有FAF的混合抑制物的条件下，TPX1菌株的耐受性也得到了明显的提高；与我们之前的推测一致，过表达KmTPX1能够提高菌株对于乙醇的耐受性，使其生长比对照菌提高了一个梯度；意料之外的是，KmTPX1能够提高细胞对高浓度盐的耐受能力，使其生长提高2个梯度；此外，我们还试验了KmTPX1对两种常见的环境污染物，苯酚和愈创木酚的耐受能力。尽管KmTPX1对愈创木酚的耐受能力有一定的提高，但对于苯酚而言的效果不是十分明显。因此，KmTPX1对这两种污染物的效应还有待于进一步的验证；但是，KmTPX1对提高酿酒酵母的耐高温能力没有作用。
实施例5硫氧还蛋白还原酶KmTrxR对不同胁迫因子耐受性检测
同样，为了验证KmTrxR的功能，将过表达的KmTrxR酿酒酵母菌株(命名为TrxR)和含有空载质粒pRS425的对照酵母菌株(命名为425)均在缺少亮氨酸(Leucine，Leu)SD培养基(SD-Leu)中进行培养。实验方法与2.2.1中相同，添加的抑制物为3mM过氧化氢、0.4g/L甲酸、3g/L乙酸、1.0g/L糠醛、5％乙醇、0.8g/L苯酚、0.8g/L愈创木酚、3M氯化钠、高温(42℃)和FAF混合物(甲酸0.3g/L，乙酸1.2g/L和糠醛0.5g/L)。通过观察菌体生长状况来表征不同菌株对于不同抑制物或胁迫因子的耐受能力。
实验结果如图7所示，出发菌株425在SD-Leu培养基中对大部分抑制物或者胁迫因子的抗性高于在SD-His培养基中。过表达KmTrxR酿酒酵母菌株对某些抑制物或者胁迫因子也得到了较为明显的提高。在不添加任何抑制物的平板上，过表达KmTrxR酿酒酵母菌株与对照菌的生长没有显著差别，说明的KmTrxR过表达同样不会影响细胞生长；过表达KmTrxR能够提高细胞对H2O2、甲酸和乙酸的耐受能力，使其生长提高1～2个梯度。但是，在含有1.0g/L的糠醛和FAF的混合抑制物的条件下，TrxR菌株的生长与对照菌没有显著差别，说明过表达KmTrxR对糠醛和混合抑制物耐受性的提高无关；而且，过表达KmTrxR对提高菌株对于乙醇、苯酚和愈创木酚的耐受性也没有显著作用；与KmTPX1一致，过表达KmTrxR同样能够提高细胞对高浓度盐的耐受能力，使其生长提高2个梯度；最后，KmTrxR对提高酿酒酵母的耐高温能力也没有作用。
序列表
SEQ ID NO. 1
LENGTH: 594
TYPE: DNA
ORGANISM: Kluyveromyces marxianus
SEQUENCE: 1
1 ATGGTTGCCC AAGTCCAAAA GCCAGCCCCA GAGTTCAAGA AGACCGCTGT
51 CATTGACGGT GTTTTCGACG AAGTTTCCCT AGAAAAATAC AAGGGTAAGT
101 ACGTTGTCTT GGCCTTCATT CCATTGGCCT TCACCTTCGT GTGCCCAACT
151 GAAATCATTG CCTTCTCTGA AGCTGCCAAG AAGTTCGAAG AAATTGGTGC
201 TCAAGTTTTG TTCGCTTCCA CTGACTCCGA ATACTCCTTG TTGGCATGGA
251 CCAACGTTGC TAGAAAGGAC GGTGGTCTAG GTCCAGTCAA CATTCCATTG
301 ATTGCTGACA CCAACCACTC CTTGTCCAGA GACTACGGTG TCTTGATCGA
351 AGAAGAAGGT ATTGCCTTGA GAGGTTTGTT CTTGATCGAT CCAAAGGGTA
401 TTGTGAGACA CATCACCATC AACGACTTGC CAGTCGGTAG AAACGTTGAA
451 GAAGCTTTGA GATTGGTCGA AGGTTTCCAA TGGACCGACA AGAACGGTAC
501 CGTCTTGCCA TGTAACTGGA CTCCAGGTTC CGCTACCATC AAGCCAGACG
551 TCGAAGCTTC TAAGGAATAC TTCGCTGCCG CTAACAAGGA ATAA
SEQ ID NO. 2
LENGTH: 960
TYPE: DNA
ORGANISM: Kluyveromyces marxianus
SEQUENCE: 2
1 ATGGTTCATC ACAAGGTAAC AATTATTGGT TCCGGCCCAG CAGCCCACAC
51 CGCCGCCATT TACTTGGCTA GAGCAGAAAT CAAGCCTACC CTATACGAAG
101 GTTTCATGGC TAATGGTATC GCCGCCGGTG GTCAACTAAC AACCACCACT
151 GAAATCGAAA ACTTCCCAGG TTTCCCAGAA GGTTTGACCG GTAGTGAATT
201 GATGGATAAG ATGAAGGCTC AATCTGTCAA GTTTGGTACC GAGGTGATTA
251 CCGAAACCGT TGCAAAGGTG GACTTGTCTA GCAAGCCATT CAAGTTCTGG
301 ACCGAATTCA ACGAGGACCA AGAACCAGAA ACTACCGATG CCATTATCTT
351 GGCTACCGGT GCCTCCGCTA AGCGTCTACA CTTGCCAGGT GAAGAGAAGT
401 ACTGGCAACA GGGTATCTCC GCCTGTGCCG TTTGTGACGG TGCAGTGCCA
451 ATCTTCAGAA ACAAGCCATT GGCTGTCATC GGTGGTGGTG ACTCTGCCTG
501 TGAAGAAGCA CAATTTTTGA CCAAGTACGG TTCCAAGGTG TACATGCTTG
551 TCAGAAAGGA CCACTTGCGT GCCTCTCAAA TCATGCAAAG ACGTGCTGAA
601 CAAAACGAAA AGATCGAAAT CTTGTACAAC CACGTCACCT TGGAAGCCAA
651 GGGTGACGAC AAGTACTTGA ATGCATTGAA GGTCAAGAAC GTAAAGACCA
701 ATGAAGAATA CGACTTGCCA GTTAACGGAT TATTCTACGC CATTGGTCAC
751 TCCCCAGCTA CCAAAATTGT TGCTGGACAA GTCGATCTTG ACGATGCTGG
801 CTACGTTAAG ACCGTCCCAG GCTCCTCTTT GACTAGCGTC CCAGGTGTTT
851 TCGCTGCTGG TGATGTCCAA GATTCTAGAT ACAGACAAGC TATCACTTCC
901 GCTGGCTCTG GTTGTATGGC CGCTTTGGAT GCTGAAAAGT ACCTAACTGA
951 ATTGGAATAA

Claims (1)

1.一种硫氧还蛋白还原酶KmTrxR在提高酵母对甲酸或乙酸耐受能力中的应用，其特征在于，该硫氧还蛋白还原酶KmTrxR的核苷酸序列为：
1 ATGGTTCATC ACAAGGTAAC AATTATTGGT TCCGGCCCAG CAGCCCACAC
51 CGCCGCCATT TACTTGGCTA GAGCAGAAAT CAAGCCTACC CTATACGAAG
101 GTTTCATGGC TAATGGTATC GCCGCCGGTG GTCAACTAAC AACCACCACT
151 GAAATCGAAA ACTTCCCAGG TTTCCCAGAA GGTTTGACCG GTAGTGAATT
201 GATGGATAAG ATGAAGGCTC AATCTGTCAA GTTTGGTACC GAGGTGATTA
251 CCGAAACCGT TGCAAAGGTG GACTTGTCTA GCAAGCCATT CAAGTTCTGG
301 ACCGAATTCA ACGAGGACCA AGAACCAGAA ACTACCGATG CCATTATCTT
351 GGCTACCGGT GCCTCCGCTA AGCGTCTACA CTTGCCAGGT GAAGAGAAGT
401 ACTGGCAACA GGGTATCTCC GCCTGTGCCG TTTGTGACGG TGCAGTGCCA
451 ATCTTCAGAA ACAAGCCATT GGCTGTCATC GGTGGTGGTG ACTCTGCCTG
501 TGAAGAAGCA CAATTTTTGA CCAAGTACGG TTCCAAGGTG TACATGCTTG
551 TCAGAAAGGA CCACTTGCGT GCCTCTCAAA TCATGCAAAG ACGTGCTGAA
601 CAAAACGAAA AGATCGAAAT CTTGTACAAC CACGTCACCT TGGAAGCCAA
651 GGGTGACGAC AAGTACTTGA ATGCATTGAA GGTCAAGAAC GTAAAGACCA
701 ATGAAGAATA CGACTTGCCA GTTAACGGAT TATTCTACGC CATTGGTCAC
751 TCCCCAGCTA CCAAAATTGT TGCTGGACAA GTCGATCTTG ACGATGCTGG
801 CTACGTTAAG ACCGTCCCAG GCTCCTCTTT GACTAGCGTC CCAGGTGTTT
851 TCGCTGCTGG TGATGTCCAA GATTCTAGAT ACAGACAAGC TATCACTTCC
901 GCTGGCTCTG GTTGTATGGC CGCTTTGGAT GCTGAAAAGT ACCTAACTGA
951 ATTGGAATAA
该核苷酸序列中含有960个核苷酸，编码319个氨基酸；
所述的硫氧还蛋白还原酶KmTrxR来源于马克斯克鲁维酵母，以其基因组为模板，上游引物TrxR-F, 5’-TCCGAGCTCCCCATGTCAAATGATGAAACG-3’和下游引物TrxR-R, 5’-TCCCCGCGGACGAGGAACCAACCTTTATT-3’，通过聚合酶链式反应扩增方式获得所述的硫氧还蛋白还原酶KmTrxR；硫氧还蛋白还原酶KmTrxR编码区长度为960 bp编码序列，编码319个氨基酸；
以酿酒酵母多拷贝质粒pRS425为基本骨架，根据其酶切位点特性，选择SacI和SacII酶切位点插入KmTrxR基因片段，KmTxrR片段来源于前述经过PCR得到的纯化产物；经过酶切后对相应DNA片段进行回收纯化，用T4连接酶进行连接，转化大肠杆菌DH5α，重组质粒经过酶切验证后命名为pRS425-TrxR；
将构建好的重组质粒和空载质粒分别按照LiAc/PEG方法转化入S. cerevisiae280中，以营养缺陷型的筛选标记进行转化子的筛选，获得的转化子经验证后即为能够实现提高胁迫因子耐受性的重组酵母菌株；
功能分析与验证
将过表达硫氧还蛋白还原酶KmTrxR的重组酵母菌株命名为TrxR，含有空载质粒pRS425的重组酵母菌株命名为425；TrxR以425作为对照，在缺少亮氨酸的SD培养基中进行活化培养；
经活化后的TrxR和425两种酵母菌分别按照v/v 1%的接种量接种至含有1 mM H2O2的SD培养基中，30oC，150 rpm培养16-18 h后成为种子液；将种子液OD620调成一致，10倍梯度稀释，点样于缺乏相应氨基酸的SD固体检测平板；平板中分别添加不同的抑制物或者胁迫因子通过观察菌体生长状况来表征不同菌株对于不同抑制物或胁迫因子的耐受能力；所述的抑制物或者胁迫因子为甲酸或乙酸。
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怪柳硫氧还蛋白过氧化物酶（ThPrx1）基因转入酵母的抗逆能力分析;贺琳等;《东北林业大学学报》;20110430;第39卷(第4期);第101-104页
甜菜Ｍ14品系硫氧还蛋白过氧化物酶（BvM14-Tpx）基因在原核及真核细胞中的抗氧化及抗盐能力分析;赵晨曦等;《黑龙江大学工程学报》;20150930;第6卷(第3期);第62-67页
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萝卜过氧化物酶基因RsPr姐在毕赤酵母中的表达及其抗性;李芳军等;《中国蔬菜》;20100131;第1卷(第2期);第33-37页

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