CN114561301B - 重组裂殖壶菌及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种重组裂殖壶菌及其构建方法和应用，该重组裂殖壶菌的基因组包括角鲨烯合成酶基因erg9和甲羟戊酸途径的还原酶基因tHMG1，它是构建过表达载体pNeoR‑PG6DPH‑erg9和pbleR‑PG6DPH‑tHMG1后，经线性化，转化入裂殖壶菌即构建完成。本发明的构建方法操作简单，构建得到的重组裂殖壶菌应用于高效、稳定地发酵生产角鲨烯，产率较野生型裂殖壶菌提高26.67倍。

Description

重组裂殖壶菌及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种重组裂殖壶菌，具体地说是重组裂殖壶菌及其构建方法和应用。
背景技术
角鲨烯(squalene)又名三十碳六烯(C30H50)，为一种天然抗氧化剂，可保护细胞免受自由基和活性氧的侵害，由于其具有防护辐射、降低血脂、增强免疫以及延缓衰老等功效，被广泛应用于食品、化妆品和医药行业。
当前角鲨烯主要是从深海鲨鱼或植物种子中提取，产量受地域和季节变化影响严重，且原料的持续供应和未来可用性存在不确定性。相比之下，利用发酵工艺大规模生产角鲨烯更能持续稳定地带来良好的经济效益。但目前通过基因工程改造后的酿酒酵母，角鲨烯产量仅能达到11.00g/L，存在极大地提升空间。
裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)为破囊壶菌属的一种海洋真菌，其油脂含量占细胞干重的50％以上，具有生长速率快，发酵步骤简便等特点。在裂殖壶菌代谢过程中，乙酰CoA是油脂合成的最主要前体物质，这使得裂殖壶菌在产生自身所需油脂时，也会产生角鲨烯等萜类化合物，但直接利用野生型裂殖壶菌生产角鲨烯，生产效率低，且产量不稳定。
发明内容
本发明的一个目的，是要提供一种重组裂殖壶菌及其构建方法，通过基因工程手段，构建基因组同时包含角鲨烯合成酶基因erg9和甲羟戊酸途径的还原酶基因tHMG1的重组裂殖壶菌，以达到高效、稳定地发酵生产角鲨烯的目的；
本发明的另外一个目的，是要提供上述重组裂殖壶菌在发酵生产角鲨烯中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种重组裂殖壶菌，该重组裂殖壶菌的基因组包括角鲨烯合成酶基因erg9和甲羟戊酸途径的还原酶基因tHMG1。
作为一种限定，所述角鲨烯合成酶基因erg9来源于酿酒酵母S288C。
作为另一种限定，所述甲羟戊酸途径的还原酶基因tHMG1来源于裂殖壶菌。
其中，角鲨烯合成酶基因erg9的序列为：
ATGGGAAAGCTATTACAATTGGCATTGCATCCGGTCGAGATGAAGGCAGCTTTGAAGCTGAAGTTTTGCAGAACACCGCTATTCTCCATCTATGATCAGTCCACGTCTCCATATCTCTTGCACTGTTTCGAACTGTTGAACTTGACCTCCAGATCGTTTGCTGCTGTGATCAGAGAGCTGCATCCAGAATTGAGAAACTGTGTTACTCTCTTTTATTTGATTTTAAGGGCTTTGGATACCATCGAAGACGATATGTCCATCGAACACGATTTGAAAATTGACTTGTTGCGTCACTTCCACGAGAAATTGTTGTTAACTAAATGGAGTTTCGACGGAAATGCCCCCGATGTGAAGGACAGAGCCGTTTTGACAGATTTCGAATCGATTCTTATTGAATTCCACAAATTGAAACCAGAATATCAAGAAGTCATCAAGGAGATCACCGAGAAAATGGGTAATGGTATGGCCGACTACATCTTAGATGAAAATTACAACTTGAATGGGTTGCAAACCGTCCACGACTACGACGTGTACTGTCACTACGTAGCTGGTTTGGTCGGTGATGGTTTGACCCGTTTGATTGTCATTGCCAAGTTTGCCAACGAATCTTTGTATTCTAATGAGCAATTGTATGAAAGCATGGGTCTTTTCCTACAAAAAACCAACATCATCAGAGATTACAATGAAGATTTGGTCGATGGTAGATCCTTCTGGCCCAAGGAAATCTGGTCACAATACGCTCCTCAGTTGAAGGACTTCATGAAACCTGAAAACGAACAACTGGGGTTGGACTGTATAAACCACCTCGTCTTAAACGCATTGAGTCATGTTATCGATGTGTTGACTTATTTGGCCGGTATCCACGAGCAATCCACTTTCCAATTTTGTGCCATTCCCCAAGTTATGGCCATTGCAACCTTGGCTTTGGTATTCAACAACCGTGAAGTGCTACATGGCAATGTAAAGATTCGTAAGGGTACTACCTGCTATTTAATTTTGAAATCAAGGACTTTGCGTGGCTGTGTCGAGATTTTTGACTATTACTTACGTGATATCAAATCTAAATTGGCTGTGCAAGATCCAAATTTCTTAAAATTGAACATTCAAATCTCCAAGATCGAACAGTTTATGGAAGAAATGTACCAGGATAAATTACCTCCTAACGTGAAGCCAAATGAAACTCCAATTTTCTTGAAAGTTAAAGAAAGATCCAGATACGATGATGAATTGGTTCCAACCCAACAAGAAGAAGAGTACAAGTTCAATATGGTTTTATCTATCATCTTGTCCGTTCTTCTTGGGTTTTATTATATATACACTTTACACAGAGCG
甲羟戊酸途径的还原酶基因tHMG1的序列为：
ATGAGGCAGGGTGTCCGCTCGGGCGTGGCGCTGGCCAAGGCCGGCGCGCGCAGACAGGCGTGGGCCGCGGGCGGCAGGAGGTCGCTGGCGTCGTCGTCGTCGAGCTCGGGCGCCGCGTCCGACGTGGACATTGATAACATCCCGCACCACAAGCTCGAGGCCGTGCTGGGCGACGCCCTGCTGGCCGCGCAGACCCGCAAGAAGAAGCTCCTCGGCGACGCTCCGGGACTCCCCGTCACGGGCCCCGAGTTCGATGCCGCCGCCTTTTACGAACAGGTGCAGGGCGCCAACTGCGAGAACGTCGTAGGCTTTTTGCCCATCCCTGTCGGCGTCGTGGGCCCGCTCGAGGTCAACGGCAAGTCGCACTACGTGCCCATGGCCACCACGGAGGGCGCCCTCTTGGCCTCGACGAACCGTGGCGCGCGCGCCATCCGCGAAGCCGGCGGTGCCAAGGCCCGCGTCGTGCGCGAGGGCATGACGCGTTCGCCCGTTCTTGGCTTCAACAGCACTATGGAGGCCGCCGACTTTGCCGCCTGGATCAAGGAGCCCGAGACGCTGCAAAAGCTCAAGGACATCTTTGCCACCACCACCAGCTTTGGCAAGCTCACCAGCGTCACCCCCACGGTCGCCGGACGCTACTGCTACCTGCGCTTCGAGGCCCAGACCGGCGACGCCATGGGCATGAACATGGTTGGTAAGGGCACCAACCGCATCGTCGAGGAGCTCGTGCAGACCTCTTCGGCCAAGCTCATCTCGCTCTCGAGCAACATGTGTACCGACAAGAAGCCCAGCGCGCTCAACTGGACCCAGGGCCGCGGCAAGTCTGTCGTCTGCGAGGTCGTCCTCTCTGCCGAGATTGTCGAAAAGGTCCTCAAGACCAACATTGCTGATCTTGCGCAGCTCAGCATCACAAAGAACCTCGTGGGCTCCTCGCTCGCGGGCTCGATCGGCGGCAACAACGCGCACGCCGCCAATGTCGTCACGGCAATCTACCTCGCCACTGGCCAGGATCCGGCGCAAAACGTCGAGTCTAGCAACTGCATGGTGCTTTTTGAGCCCATCGACGAGGGCAAGAACCTCCACGTTTCTGTGACCATGCCTAGCATCGAGGTTGGCACTGTCGGCGGCGGCACTACGCTCCCTGCTCAGCGCCAGAACCTTGAGGTCCTCGGCGTCGCCGGCGCTGACCGCGAGAACCCGGGCGGTAACGCCCGCAGCCTCGCCGAGATCGTCGCGGCCAGTGTGCTTGCTGGAGAGCTTTCGCTCAACGCTGCGCTGTCCTCCAATGCGCTCATTTCTGCTCACCTCGCCCTCAACCGCAAGTAG。
本发明还提供了上述重组裂殖壶菌的一种构建方法，它包括依次进行的以下步骤：
S1.过表达载体的构建
将角鲨烯合成酶基因erg9连接入pNeoR-PG6DPH载体，构建得过表达载体pNeoR-PG6DPH-erg9；其中，NeoR基因前连接有2A肽序列编码基因；
将甲羟戊酸途径的还原酶基因tHMG1连接入pbleR-PG6DPH载体，构建得过表达载体pbleR-PG6DPH-tHMG1；其中，bleR基因前连接有2A肽序列编码基因；
S2.转化
将过表达载体pNeoR-PG6DPH-erg9和过表达载体pbleR-PG6DPH-tHMG1线性化后，转化入裂殖壶菌，得重组裂殖壶菌。
其中，将角鲨烯合成酶基因erg9连接入pNeoR-PG6DPH载体和将甲羟戊酸途径的还原酶基因tHMG1连接入pbleR-PG6DPH载体，均采用Giboson组装技术。
作为一种限定，所述过表达载体pNeoR-PG6DPH-erg9中，erg9基因与NeoR基因通过P2A编码基因连接；所述过表达载体pbleR-PG6DPH-tHMG1中，tHMG1基因与bleR基因通过P2A编码基因连接。
其中，P2A编码基因为一种2A肽序列编码基因。
作为一种限定，所述连接采用Giboson组装技术；所述转化采用电转化法。
本领域人员也可根据具体情况，选用热激法等其它转化方法。
本发明也提供了上述重组裂殖壶菌的一种应用，所述重组裂殖壶菌用于发酵生产角鲨烯。
作为限定，将所述重组裂殖壶菌接种于种子培养基活化后，得发酵用菌种；将所述发酵用菌种接种于发酵培养基中进行发酵培养；收集菌体，加入1M氢氧化钠-甲醇，1200rpm震荡12-16h后，加入浓硫酸和正己烷，提取角鲨烯。
作为另一种限定，所述发酵用菌种的OD值为8-10；所述发酵用菌种的接种量为发酵培养基体积的0.8-1.5％。
作为再一种限定，所述发酵生产的温度为25-29℃，转速为150-200rpm，时间为90-100h。
由于采用了上述技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：
1)本发明构建的重组裂殖壶菌，其基因组中，包含角鲨烯合成酶基因erg9，通过表达来自酿酒酵母S288C的角鲨烯合成酶基因erg9，从而能够高效发酵生产角鲨烯；
2)本发明构建的重组裂殖壶菌，其基因组中，包含甲羟戊酸途径的还原酶基因tHMG1，通过增强裂殖壶菌的内源甲羟戊酸途径中关键限速酶tHMG1的表达，提高乙酰辅酶A前体供应，从而提高重组裂殖壶菌的角鲨烯产量；
3)本发明构建的重组裂殖壶菌，其基因组中，同时包含角鲨烯合成酶基因erg9和甲羟戊酸途径的还原酶基因tHMG1，这两个基因的同时存在，协同增效，进一步增强角鲨烯合成途径，从而提高重组裂殖壶菌中角鲨烯的积累量，进而提高角鲨烯产量，产率较野生型裂殖壶菌提高26.67倍；
本发明的重组裂殖壶菌构建方法操作简单，适用于工业化发酵生产角鲨烯。
下面结合附图及具体实施例对本发明作详细说明。
附图说明
图1为本发明实施例1中过表达载体pNeoR-PG6DPH-erg9的质粒图谱；
图2为本发明实施例1中过表达载体pbleR-PG6DPH-tHMG1的质粒图谱；
图3为本发明实施例2中气相色谱分析的结果图；
图4为本发明对比例中重组裂殖壶菌和野生型裂殖壶菌的角鲨烯产量对比结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施例和附图对本发明做进一步详细说明，应当理解所描述的实施例仅用于解释本发明，并不限定本发明。
本发明实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件。
各实施例中采用的培养基成分如下：
筛选平板培养基的成分为：葡萄糖45g/L、酵母粉2g/L、谷氨酸钠15g/L、MgCl2·7H2O 4g/L、Na2SO4 15g/L、KCl 1g/L、NaCl 1g/L、MgSO4·7H2O 5g/L、KH2PO4 3g/L和琼脂200g/L；
种子培养基除不添加琼脂外，其余成分及用量与筛选平板培养基相同。
发酵培养基的成分为：葡萄糖90g/L、酵母粉4g/L、谷氨酸钠15g/L、MgCl2·7H2O4g/L、Na2SO4 15g/L、KCl 1g/L、NaCl 1g/L、MgSO4·7H2O 5g/L、KH2PO4 3g/L和(NH4)2SO4 4g/L。
实施例1一种重组裂殖壶菌的构建方法
本实施例中重组裂殖壶菌的构建方法，包括依次进行的以下步骤：
S1.过表达载体的构建
I)erg9基因和tHMG1基因的克隆
i)角鲨烯合成酶基因erg9片段的克隆
根据酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae S288C的角鲨烯合成酶基因erg9的序列信息，设计如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物P1和P2，引物加粗部分表示与骨架相连的overlap区域。
引物P1和P2序列为：
SEQ ID No.1P1(sense)：
SEQ ID No.2P2(antisense)：
通过PCR克隆得角鲨烯合成酶基因erg9片段，其中，PCR扩增的程序为：98℃30s，57℃30s，72℃2min，进行34个循环。
ii)甲羟戊酸途径的还原酶基因tHMG1片段的克隆
根据裂殖壶菌Schizochytrium sp.的甲羟戊酸途径的还原酶基因tHMG1的序列信息，设计如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的引物P3和P4，引物加粗部分表示与骨架相连的overlap区域。
引物P3和P4序列为：
SEQ ID No.3P3(sense)：
SEQ ID No.4P4(antisense)：
通过PCR克隆得甲羟戊酸途径的还原酶基因tHMG1片段，其中，PCR扩增的程序为：98℃30s，57℃30s，72℃3min，进行34个循环；上述PCR扩增的体系和程序，本领域技术人员均可根据实际情况调整。
II)过表达载体的构建
(i)构建过表达载体pNeoR-PG6DPH-erg9：
设计如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的引物P5和P6，以pNeoR-PG6DPH为模板进行扩增，胶回收，得pNeoR-PG6DPH线性载体；
SEQ ID No.5P5(sense)：
5’-TATACACTTTACACAGAGCGGGAAGCGGAGCCACGAACTT-3’
SEQ ID No.6P6(antisense)：
5’-GAGCGGACACCCTGCCTCATCTTTTCTCTCGCCTCTCGCT-3’
将pNeoR-PG6DPH线性载体和角鲨烯合成酶基因erg9片段通过Giboson组装技术，按照连接体系为：3.5μL角鲨烯合成酶基因erg9片段，1.5μLpNeoR-PG6DPH线性载体，5μLGibson组装酶，于50℃连接15min，得过表达载体pNeoR-PG6DPH-erg9，质粒图谱如图1所示。
(ii)构建过表达载体pbleR-PG6DPH-tHMG1：
设计如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的引物P7和P8，以pbleR-PG6DPH为模板进行扩增，胶回收，得pbleR-PG6DPH线性载体；
SEQ ID No.7P7(sense)：
5’-TCGCCCTCAACCGCAAGTAGGGAAGCGGAGCCACGAACTT-3’
SEQ ID No.8P8(antisense)：
5’-GAGCGGACACCCTGCCTCATCTTTTCTCTCGCCTCTCGCT-3’
参照(i)中方法，将甲羟戊酸途径的还原酶基因tHMG1片段连接入pbleR-PG6DPH载体，构建得过表达载体pbleR-PG6DPH-tHMG1，质粒图谱如图2所示；
其中，过表达载体pNeoR-PG6DPH-erg9中，erg9基因与NeoR基因通过2A肽序列P2A的编码基因连接，过表达载体pbleR-PG6DPH-tHMG1中，tHMG1基因与bleR基因通过2A肽序列P2A的编码基因连接。
构建成果鉴定：将过表达载体pNeoR-PG6DPH-erg9和过表达载体pbleR-PG6DPH-tHMG1分别转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，以卡那霉素抗性平板鉴定阳性转化子，鉴定结果表明过表达载体均构建成功。
S2.转化
(I)制备裂殖壶菌感受态细胞
(1)挑取培养平板上已活化好的Schizochytrium sp.裂殖壶菌单菌落至250mL种子培养基，26℃，150rpm培养24h；
(2)按1％(v/v)接种量转接至250mL种子培养基，25℃，150rpm培养23h；
(3)取10mL菌液，4℃，5000rpm，离心10min，弃上清；
(4)用10mL已预冷的无菌水洗涤菌体两次，离心条件均为：4℃，5000rpm，离心10min；
(6)用10mL 1M的无菌预冷山梨醇溶液洗涤菌体两次，离心条件均为：4℃，5000rpm，离心10min；重复洗涤一次；
(7)用1mL 1M的无菌预冷山梨醇溶液重悬菌体，每管100μL进行分装，得裂殖壶菌感受态细胞，置于冰上备用。
(II)电转化
利用限制性核酸内切酶HindⅢ将过表达载体pNeoR-PG6DPH-erg9和过表达载体pbleR-PG6DPH-tHMG1线性化后，取20μL线性过表达载体pNeoR-PG6DPH-erg9和8μL线性过表达载体pbleR-PG6DPH-tHMG1，加入至100μL裂殖壶菌感受态细胞中，冰浴5min；转移至预冷的电转杯，冰上静置10min，设置电击参数0.75KV，200Ω，50μF，进行电击，电击后加入1mL种子培养基；在30℃，200rpm复苏1h后，将经转化的菌液涂布在含有博莱霉素200μg/L和G418400μg/L的筛选平板培养基中，28℃避光培养3天。
抗性基因和目的基因串联表达，鉴定在筛选平板培养基中，划线传代4次的转化子，为稳定遗传的重组裂殖壶菌。
本实施例制备的重组裂殖壶菌标记为J1，可应用于发酵生产角鲨烯。
本领域技术人员也可根据需要采取热激法等其它转化方法。
实施例2重组裂殖壶菌的一种应用
采用实施例1构建的重组裂殖壶菌J1用于发酵生产角鲨烯，对所得角鲨烯进行气相色谱分析。
发酵生产：将重组裂殖壶菌J1接种到种子培养基中，培养24h，得一级种子；取一级种子接种到种子培养基中，再次培养24h，得二级种子；取二级种子接种到种子培养基中，再次培养25h，经上述活化过程，得发酵用菌种；
取1L OD值为8-10的发酵用菌种接种至100L发酵培养基，在温度为25℃，转速为170rpm的条件下，发酵培养95h，收集菌体，加入1M氢氧化钠-甲醇，1200rpm震荡15h后，加入浓硫酸和正己烷提取得角鲨烯。
气相色谱分析：取发酵培养结束后的发酵液调节pH至10，添加1％(v/v)的溶壁酶，55℃酶解1h后，加入正己烷萃取，静置等待分层，取上层呈黄色的有机相液体，重复萃取至上层颜色变为无色，合并有机相液体，挥干溶剂，得总油脂；向总油脂中加入4mL 15％的NaOH溶液，和甲醇含量为70％的水溶液。在65℃中水浴反应1.5h；冷却至室温，加入2mL正己烷(色谱级)萃取，收集上层有机相；将上层有机相通过微孔膜去杂质，再通过气相色谱分析。
气相色谱分析结果如图3所示，表明采用本发明的构建方法构建的重组裂殖壶菌能够成功发酵生产角鲨烯。
实施例3-7重组裂殖壶菌的应用
实施例3-7分别为一种采用重组裂殖壶菌J1发酵生产角鲨烯的方法，具体发酵生产方法与实施例2基本相同，不同之处仅在于工艺参数中具体接种量或发酵参数设置不同，具体区别见表1；
表1实施例3-7工艺参数表
实施例3-7的发酵生产方法中其他部分与实施例2相同。
对实施例3-7发酵生产所得的角鲨烯进行气相色谱分析，结果表明，均成功生产出角鲨烯。
对比例 重组裂殖壶菌和野生型裂殖壶菌的角鲨烯产量对比
对重组裂殖壶菌J1和野生型裂殖壶菌的角鲨烯产量进行对比，具体方法为：根据实施例2中发酵生产方法对重组裂殖壶菌J1和野生型裂殖壶菌进行发酵培养，发酵过程中，分别于发酵24h、48h、72h和96h时，收集菌体，提取角鲨烯，通过气相色谱，添加角鲨烷标准液作为内标，以角鲨烯与角鲨烷峰面积比为横坐标，角鲨烯与角鲨烷的质量比为纵坐标绘制标准曲线，代入计算角鲨烯产量，结果如图4所示，结果表明，重组裂殖壶菌J1在发酵24h、48h、72h和96h时，角鲨烯产量依次为25.66mg/L、55.24mg/L、82.34mg/L及102.65mg/L。
野生型裂殖壶菌在发酵24h、48h、72h和96h时，角鲨烯产量依次为0.93mg/L、1.35mg/L、2.34mg/L及3.85mg/L。
经计算，与野生型裂殖壶菌相比，重组裂殖壶菌J1发酵84h后产量提高了26.67倍。
需要说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域技术人员来说，其依然可以对上述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明权利要求保护的范围之内。
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<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 1
agcgagaggc gagagaaaag atgggaaagc tattacaatt ggc 43
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 2
aagttcgtgg ctccgcttcc cgctctgtgt aaagtgtata 40
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 3
agcgagaggc gagagaaaag atgaggcagg gtgtccgctc 40
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 4
aagttcgtgg ctccgcttcc ctacttgcgg ttgagggcga 40
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 5
tatacacttt acacagagcg ggaagcggag ccacgaactt 40
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 6
gagcggacac cctgcctcat cttttctctc gcctctcgct 40
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 7
tcgccctcaa ccgcaagtag ggaagcggag ccacgaactt 40
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 8
gagcggacac cctgcctcat cttttctctc gcctctcgct 40
<210> 9
<211> 1332
<212> DNA
<213> 酿酒酵母S288C（Saccharomyces cerevisiae S288c）
<400> 9
atgggaaagc tattacaatt ggcattgcat ccggtcgaga tgaaggcagc tttgaagctg 60
aagttttgca gaacaccgct attctccatc tatgatcagt ccacgtctcc atatctcttg 120
cactgtttcg aactgttgaa cttgacctcc agatcgtttg ctgctgtgat cagagagctg 180
catccagaat tgagaaactg tgttactctc ttttatttga ttttaagggc tttggatacc 240
atcgaagacg atatgtccat cgaacacgat ttgaaaattg acttgttgcg tcacttccac 300
gagaaattgt tgttaactaa atggagtttc gacggaaatg cccccgatgt gaaggacaga 360
gccgttttga cagatttcga atcgattctt attgaattcc acaaattgaa accagaatat 420
caagaagtca tcaaggagat caccgagaaa atgggtaatg gtatggccga ctacatctta 480
gatgaaaatt acaacttgaa tgggttgcaa accgtccacg actacgacgt gtactgtcac 540
tacgtagctg gtttggtcgg tgatggtttg acccgtttga ttgtcattgc caagtttgcc 600
aacgaatctt tgtattctaa tgagcaattg tatgaaagca tgggtctttt cctacaaaaa 660
accaacatca tcagagatta caatgaagat ttggtcgatg gtagatcctt ctggcccaag 720
gaaatctggt cacaatacgc tcctcagttg aaggacttca tgaaacctga aaacgaacaa 780
ctggggttgg actgtataaa ccacctcgtc ttaaacgcat tgagtcatgt tatcgatgtg 840
ttgacttatt tggccggtat ccacgagcaa tccactttcc aattttgtgc cattccccaa 900
gttatggcca ttgcaacctt ggctttggta ttcaacaacc gtgaagtgct acatggcaat 960
gtaaagattc gtaagggtac tacctgctat ttaattttga aatcaaggac tttgcgtggc 1020
tgtgtcgaga tttttgacta ttacttacgt gatatcaaat ctaaattggc tgtgcaagat 1080
ccaaatttct taaaattgaa cattcaaatc tccaagatcg aacagtttat ggaagaaatg 1140
taccaggata aattacctcc taacgtgaag ccaaatgaaa ctccaatttt cttgaaagtt 1200
aaagaaagat ccagatacga tgatgaattg gttccaaccc aacaagaaga agagtacaag 1260
ttcaatatgg ttttatctat catcttgtcc gttcttcttg ggttttatta tatatacact 1320
ttacacagag cg 1332
<210> 10
<211> 1326
<212> DNA
<213> 裂殖壶菌（Schizochytrium sp.）
<400> 10
atgaggcagg gtgtccgctc gggcgtggcg ctggccaagg ccggcgcgcg cagacaggcg 60
tgggccgcgg gcggcaggag gtcgctggcg tcgtcgtcgt cgagctcggg cgccgcgtcc 120
gacgtggaca ttgataacat cccgcaccac aagctcgagg ccgtgctggg cgacgccctg 180
ctggccgcgc agacccgcaa gaagaagctc ctcggcgacg ctccgggact ccccgtcacg 240
ggccccgagt tcgatgccgc cgccttttac gaacaggtgc agggcgccaa ctgcgagaac 300
gtcgtaggct ttttgcccat ccctgtcggc gtcgtgggcc cgctcgaggt caacggcaag 360
tcgcactacg tgcccatggc caccacggag ggcgccctct tggcctcgac gaaccgtggc 420
gcgcgcgcca tccgcgaagc cggcggtgcc aaggcccgcg tcgtgcgcga gggcatgacg 480
cgttcgcccg ttcttggctt caacagcact atggaggccg ccgactttgc cgcctggatc 540
aaggagcccg agacgctgca aaagctcaag gacatctttg ccaccaccac cagctttggc 600
aagctcacca gcgtcacccc cacggtcgcc ggacgctact gctacctgcg cttcgaggcc 660
cagaccggcg acgccatggg catgaacatg gttggtaagg gcaccaaccg catcgtcgag 720
gagctcgtgc agacctcttc ggccaagctc atctcgctct cgagcaacat gtgtaccgac 780
aagaagccca gcgcgctcaa ctggacccag ggccgcggca agtctgtcgt ctgcgaggtc 840
gtcctctctg ccgagattgt cgaaaaggtc ctcaagacca acattgctga tcttgcgcag 900
ctcagcatca caaagaacct cgtgggctcc tcgctcgcgg gctcgatcgg cggcaacaac 960
gcgcacgccg ccaatgtcgt cacggcaatc tacctcgcca ctggccagga tccggcgcaa 1020
aacgtcgagt ctagcaactg catggtgctt tttgagccca tcgacgaggg caagaacctc 1080
cacgtttctg tgaccatgcc tagcatcgag gttggcactg tcggcggcgg cactacgctc 1140
cctgctcagc gccagaacct tgaggtcctc ggcgtcgccg gcgctgaccg cgagaacccg 1200
ggcggtaacg cccgcagcct cgccgagatc gtcgcggcca gtgtgcttgc tggagagctt 1260
tcgctcaacg ctgcgctgtc ctccaatgcg ctcatttctg ctcacctcgc cctcaaccgc 1320
aagtag 1326

Claims (9)

1.一种重组裂殖壶菌，其特征在于，该重组裂殖壶菌过表达角鲨烯合成酶基因erg9和甲羟戊酸途径的还原酶基因tHMG1；
所述角鲨烯合成酶基因erg9的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；
所述甲羟戊酸途径的还原酶基因tHMG1的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示。
2.根据权利要求1所述的重组裂殖壶菌，其特征在于，所述角鲨烯合成酶基因erg9来源于酿酒酵母S288C。
3.根据权利要求1或2所述的重组裂殖壶菌，其特征在于，所述甲羟戊酸途径的还原酶基因tHMG1来源于裂殖壶菌。
4.权利要求1-3中任一项所述的重组裂殖壶菌的一种构建方法，其特征在于，它包括依次进行的以下步骤：
S1. 过表达载体的构建
分别构建含有角鲨烯合成酶基因erg9和甲羟戊酸途径的还原酶基因tHMG1的过表达载体；
S2.转化
将过表达载体转化入裂殖壶菌，得重组裂殖壶菌。
5.根据权利要求4所述的重组裂殖壶菌的构建方法，其特征在于，所述转化采用电转化法。
6.权利要求1-3中任一项所述的重组裂殖壶菌的一种应用，其特征在于，所述重组裂殖壶菌用于发酵生产角鲨烯。
7.根据权利要求6所述的重组裂殖壶菌的应用，其特征在于，将所述重组裂殖壶菌接种于种子培养基活化后，得发酵用菌种；将所述发酵用菌种接种于发酵培养基中进行发酵培养；收集菌体提取角鲨烯。
8.根据权利要求6所述的重组裂殖壶菌的应用，其特征在于，所述发酵用菌种的OD值为8-10；所述发酵用菌种的接种量为发酵培养基体积的0.8-1.5%。
9.根据权利要求6-8中任一项所述的重组裂殖壶菌的应用，其特征在于，所述发酵生产的温度为25-29℃，转速为150-200rpm，时间为90-100h。
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