CN116479027B - 表达牛乳铁蛋白的重组表达载体及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了表达牛乳铁蛋白的重组表达载体及其构建方法和应用。所述重组表达载体以裂殖壶菌表达载体pMG‑18s‑BleoR为骨架构建而成，在EM7启动子的下游依次连接牛乳铁蛋白cDNA基因，终止子SV40和启动子PGK。本发明进一步提供了表达牛乳铁蛋白重组表达载体的构建方法以及重组裂殖壶菌株。本发明使用裂殖壶菌18S rRNA保守序列进行同源重组，并依据裂殖壶菌的密码子偏好性对牛乳铁蛋白进行了优化，使其能够在裂殖壶菌中表达且具有抗菌的生物学活性，同时所述重组表达载体的构建与组装完全在体外完成，无需中间载体，能够有效的在大肠杆菌中稳定拷贝与提取，极大提高了转化效率。

Description

表达牛乳铁蛋白的重组表达载体及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及表达乳铁蛋白的重组表达载体，尤其涉及表达牛乳铁蛋白的重组表达载体及其构建方法，进一步涉及含有重组表达载体的重组宿主藻株及其在制备具有抑菌活性的重组牛乳铁蛋白中的应用，属于牛乳铁蛋白的重组表达领域。

背景技术

乳铁蛋白是一种分子量约80KDa，含有703个氨基酸残基的蛋白质，主要存在于哺乳动物的母乳及唾液等粘膜之中，具有广泛的抗菌、抗炎、抗癌等作用，能够维持肠道粘膜的完整性并有助于肠道有益微生物的定殖。目前，对重组乳铁蛋白的真核异源表达研究较为有限，而现有的原核异源表达则主要通过大肠杆菌进行，使得重组乳铁蛋白的纯化及后续的应用存在一定生物安全隐患，因此，一种能够安全、有效的表达活性乳铁蛋白的异源表达体系成为了乳铁蛋白研究及生产的实际需求。

发明内容

本发明的目的之一是提供表达牛乳铁蛋白的重组表达载体；

本发明的目的之二是提供一种表达牛乳铁蛋白的重组表达载体的构建方法；

本发明的目的之三是将提供一种应用所述重组表达载体在裂殖壶菌中表达牛乳铁蛋白的方法；

本发明的目的之四是提供含有表达牛乳铁蛋白的重组表达载体的重组宿主菌。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明的一方面是提供了一种表达牛乳铁蛋白的重组表达载体，该重组表达载体以裂殖壶藻表达载体pMG-18s-BleoR为骨架构建而成，所述裂殖壶藻表达载体pMG-18s-BleoR含有EM7启动子，在该EM7启动子的下游依次连接牛乳铁蛋白cDNA基因，终止子SV40和启动子PGK。

作为本发明的一种优选的具体实施方式，在EM7启动子和牛乳铁蛋白cDNA基因之间连接有信号肽编码基因，更优选的，所述信号肽编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

所述的牛乳铁蛋白cDNA基因的核苷酸序列可以为作为SEQ ID NO.4所示；作为本发明的一种优选的具体实施方式，所述的牛乳铁蛋白cDNA基因是将牛乳铁蛋白原始cDNA基因按照裂殖壶藻的偏好性对牛乳铁蛋白的cDNA基因进行了优化得到的优化cDNA基因，优化cDNA基因能够在裂殖壶藻中高效表达牛乳铁蛋白且所表达的牛乳铁蛋白具有抗菌的生物学活性。为了便于纯化所表达的重组蛋白，本发明在优化cDNA基因上加入了6xhis标签以便纯化，其中，密码子优化后的牛乳铁蛋白cDNA基因再加上6xhis纯化标签的核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示。

作为本发明的一种优选的具体实施方式，所述终止子SV40的核苷酸序列为SEQ IDNO.2所示。

作为本发明的一种优选的具体实施方式，所述启动子PGK的核苷酸序列为SEQ IDNO.3所示。

本发明的另一方面是提供了一种构建所述表达牛乳铁蛋白的重组表达载体的方法，包括：

(1)采用PCR分别扩增得到前置有组氨酸的牛乳铁蛋白原基因cDNA、终止子SV40以及启动子PGK；

(2)以具有同源臂的一对PCR引物通过聚合PCR将终止子SV40与启动子PGK融合得到片段1；

(3)以具有同源臂的一对PCR引物通过聚合PCR将前置有组氨酸的牛乳铁蛋白原基因cDNA与片段1融合得到载体元件；

(4)采用PCR引物扩增线性化的载体骨架pMG-18s-BleoR；

(5)通过无缝克隆酶对扩增的线性化的载体骨架pMG18s-BleoR与步骤（3）获得的载体元件进行同源重组得到表达牛乳铁蛋白的重组表达载体。

作为本发明一种优选的具体实施方式，步骤（1）以SEQ ID NO.5所示人工合成牛乳铁蛋白cDNA为模板，以核苷酸序列分别为SEQID NO.9和SEQ ID NO.10所示的核苷酸为上下游扩增引物，扩增得到牛乳铁蛋白原基因cDNA与前置组氨酸6xHis标签；以质粒pMiRGLO为模板，采用核苷酸序列分别为SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示的PCR上下游引物扩增得到终止子SV40；以质粒pMiRGLO（购于NTCC典型培养物保藏中心）为模板，采用核苷酸序列分别为SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示的PCR上下游引物扩增得到启动子PGK。

作为本发明一种优选的具体实施方式，步骤（2）中所述的具有同源臂的一对PCR引物的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示。

作为本发明一种优选的具体实施方式，步骤（3）中所述的具有同源臂的一对PCR引物的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.14所示。

作为本发明一种优选的具体实施方式，步骤（4）中以pMG18s-BleoR为模板进行PCR扩增得到线性化的载体骨架pMG-18s-BleoR，其中，所述的PCR引物的核苷酸序列分别为SEQID NO.6和SEQ ID NO.7所示。

作为本发明一种优选的具体实施方式，步骤（5）中所述的无缝克隆酶是ABclonalSeamless。

本发明的再一方面是提供了含有表达牛乳铁蛋白的重组表达载体的重组裂殖壶菌株，该重组裂殖壶菌株的构建方法包括：

将构建的表达牛乳铁蛋白的重组表达载体转染感受态裂殖壶菌株；筛选获得含有表达牛乳铁蛋白的重组表达载体的重组裂殖壶菌株。

作为本发明一种优选的具体实施方式，本发明将构建的表达牛乳铁蛋白的重组表达载体通过电穿孔法转染感受态裂殖壶菌株，其中，电穿孔法转染感受态裂殖壶菌株的电压可以为1.35kv- 1.5kv，优选为1.5kv。

作为本发明一种优选的具体实施方式，采用25μg/ml- 100μg/ml博莱霉素筛选获得含有表达牛乳铁蛋白的重组表达载体的重组裂殖壶菌株，更优选采用100μg/ml博莱霉素筛选获得含有表达牛乳铁蛋白的重组表达载体的重组裂殖壶菌株。

作为本发明一种优选的具体实施方式，本发明将所获得的筛选获得含有表达牛乳铁蛋白的重组表达载体的重组裂殖壶菌株提交到专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号是：CGMCC No.45266；其分类命名是：裂殖壶菌Schizochytrium sp.；保藏时间是：2022年9月7日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所。

本发明的再一方面是应用所述的所筛选获得含有表达牛乳铁蛋白的重组表达载体的重组裂殖壶菌株制备重组牛乳铁蛋白，包括：

（1）将所筛选获得含有表达牛乳铁蛋白的重组表达载体的重组裂殖壶菌株接入到裂殖壶菌种子培养基中进行培养；

（2）将步骤（1）获得培养物离心，弃上清，取沉淀，从沉淀中提取得到重组牛乳铁蛋白。

作为本发明一种优选的具体实施方式，步骤（1）中所述的裂殖壶菌种子培养基中含有博来霉素与卡那霉素。

作为本发明一种优选的具体实施方式，步骤（2）中所述的从沉淀中提取得到重组牛乳铁蛋白的方法包括：向沉淀中加入细胞裂解液将裂殖壶菌细胞裂解，裂解后的产物采用超声破碎处理，将超声破碎处理后的产物离心，收集上清液即得重组牛乳铁蛋白。

本发明使用裂殖壶藻18S rRNA保守序列进行同源重组，并依据裂殖壶菌的密码子偏好性对牛乳铁蛋白进行了优化，使其能够在裂殖壶菌中表达且具有抗菌的生物学活性，同时本重组载体的构建与组装完全在体外完成，无需中间载体，且能够有效的在大肠杆菌中稳定拷贝与提取，极大的提高了转化效率。

附图说明

图1为出发质粒pMG18s-BleoR的图谱。

图2为本发明的表达牛乳铁蛋白的重组表达载体的组装技术路线图。

图3为目的片段扩增后的电泳图谱。

图4为线性化质粒扩增后的电泳图谱。

图5 为TSV40与PGK连接后的电泳检验结果。

图6 为TSV40、PGK与LF连接后的电泳检验结果。

图7为无信号肽牛乳铁蛋白目的片段的电泳检验结果。

图8为大肠杆菌转化子的PCR检验图谱；Marker自下而上为8000，5000，3000，2000，1000，750，500，250，100bp，目的条带长度为3020bp。

图9为重组藻株的PCR检验图谱；Marker自下而上为8000，5000，3000，2000，1000，750，500，250，100bp，目的条带长度为2143bp.从左至右1-4泳道为重组藻株，第5泳道为原始藻株，第6泳道为空白对照为原始藻株。

图10为重组藻株的western化学发光与白光合成图像，最左侧蛋白marker自上而下分别为10，17，25，34，68，75KDa，从左至右各泳道分别为Δs7，+s7，+s12，原始株，Δs8，+s17目的蛋白大小为80Kda。

图11为重组藻株粗蛋白对金黄色葡萄球菌与大肠杆菌的抑菌试验；B3为原始菌株，中央为4mg氨苄西林，其余为重组藻株。（a）各转化株对金黄色葡萄球菌的抑菌结果。（b）各株对大肠杆菌的抑菌结果。

图12为乳铁蛋白的OD450-浓度标准曲线。

图13为使用了pAlgevir转化方式通过SmaI与BamHI双酶切产生粘性末端的方式连接各目的蛋白与上游启动子ALCR与下游35s终止子的图谱。

图14为质粒转入农杆菌后的PCR图谱。

图15为1.35kV转化后三代的目的基因电泳图谱。

图16为25μg/ml转化五代后的目的基因电泳图谱。

图17为50μg/ml转化五代后的目的基因电泳图谱。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

生物材料，基因片段，试剂

原始菌株：裂殖壶菌B3（SchizochytriumB3），由本发明人实验室突变选育并保存），大肠杆菌DH5α感受态细胞（北京瑞博兴科）。

出发质粒：pMG18s-BleoR（中国科学院烟台海岸带研究所惠赠），其图谱为图1所示。

表1 TSV40终止子，PGK启动子和乳铁蛋白基因（密码子优化前和优化后）的核苷酸序列

表2引物序列

培养基：

LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，定容至1L。

LB固体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，琼脂粉15g，定容至1L。

裂殖壶菌培养基：葡萄糖30g，酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，人工海盐34.4g，维生素储存液5ml，定容至1L。

维生素储存液：维生素B1 1g，维生素B6 1g， 维生素B12 0.01g，定容至100mL。

试剂：ApexHF HS DNA Polymerase FS Master Mix DNA聚合酶（北京艾科瑞生物），10xTAE琼脂糖核酸电泳缓冲液（北京瑞博兴科），10x DNA loading buffer（北京瑞博兴科），10x tris-SDS-PAGE-蛋白电泳缓冲液（北京瑞博兴科）；蛋白非变性裂解液（索莱宝生物）；山梨醇（北京索莱宝生物；5x蛋白loading buffer（瑞博兴科）；溶菌酶（Takara）；苯甲基磺酰氟（PMSF，索莱宝），琼脂糖电泳DNA回收试剂盒（诺贝莱生物），植物基因组提取试剂盒（诺贝莱生物），无缝重组试剂盒（Abclonal）。

试验例1表达牛乳铁蛋白的重组载体构建、在裂殖壶菌中的表达以及所表达的重组蛋白的鉴定

1.试验方法

1.1 目的片段的组装

目的片段组装的技术路线如图2所示，基于设计引物时加入的额外碱基序列，使得各条目的基因元件与重组质粒之间互相具有15-30bp的同源片段，以使其能够通过聚合PCR的方式互相连接为一完整片段并与线性化的出发质粒重组为一环形质粒。

1.1.1 目的片段的扩增

通过乳铁蛋白基因、PGK启动子和TSV40终止子碱基序列，设计引物如表3。

表3目的片段的引物

按表4加样并低速短暂离心。

表4目的片段PCR扩增体系

BLF扩增反应程序：94℃预变性 3 min→98 ℃变性30 sec，52℃退火30 sec, 72℃延伸1 min，共30个循环→72℃延伸2 min。

TSV40扩增反应程序：94℃预变性 3 min→98 ℃变性30 sec，52℃退火30 sec,72℃延伸1 min，共30个循环→72℃延伸2 min。

PGK扩增反应程序：94℃预变性 3 min→98 ℃变性30 sec，52℃退火30 sec, 72℃延伸1 min，共30个循环→72℃延伸2 min。

PCR产物使用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增条带大小并准确切下DNA条带，利用诺贝莱琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收扩增产物。

1.1.2 线性化质粒的扩增

以pMG18s-BleoR序列如表5设计引物，以扩增线性化质粒。

表5 线性化质粒的引物

以pMG18s-BleoR为模板，对出发质粒进行扩增与线性化，PCR体系如表4，程序如表6。

表6 线性化质粒的扩增程序

随后电泳检验并依据琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明回收，浓度为191.7ng/μl。

1.1.3 目的片段的连接

将回收后的PGK，TSV通过聚合PCR进行连接，PCR体系如表7，程序如表8。

表7 TSV40终止子与PGK启动子的聚合PCR体系

表8 TSV40终止子与PGK启动子的聚合PCR程序

随后向体系内加入引物TSV40F及PGKR各2μl，以表9程序进行PCR。

表9 TSV40终止子与PGK启动子的聚合后扩增程序

将PCR产物电泳检验并回收，随后将其与乳铁蛋白基因再次进行聚合PCR，扩增体系如表10，扩增程序如表11。

表10 TSV+PGK片段与BLF的聚合PCR体系

表11 TSV+PGK片段与BLF的聚合PCR程序

随后向体系内加入引物LRGeneF及PGKR各2μl，以表12程序进行PCR。

表12 TSV+PGK片段与BLF的聚合PCR程序

将电泳检验PCR产物并回收，随后，以其为模板扩增无信号肽乳铁蛋白片段，程序见表13。

表13无信号肽BLF片段的PCR扩增程序

随后电泳检验PCR产物。

1.1.4 重组质粒的组装

通过ABclonal Seamless无缝克隆酶对已线性化的pMG18s-BleoR质粒及组装完毕的LF-TSV40-PGK片段进行同源重组，组装体系为表14，将体系于50℃金属浴30min后置于4℃，准备转入感受态大肠杆菌。

表14 重组质粒的组装体系

1.2重组质粒的转染

1.2.1重组质粒转入大肠杆菌

取100μl感受态大肠杆菌DH5α株置于1.5ml离心管中，冰上分别加入10μl1.2.1.4所制备重组质粒后静置30min，42℃水浴45s，转入冰上静置3min，随后向离心管中加入500μlLB液体培养基，于37摄氏度，180rpm下培养1h，随后室温下8000rpm离心5min，弃上清，加入100μl液体LB培养基重悬，涂布于含有100μg/ml氨苄西林的LB固体培养基平板，37℃培养过夜。挑取阳性单菌落，接种入1.5ml含有100μg/m氨苄西林的LB液体培养基，于37℃180rpm培养8h，随后以菌体为模板进行PCR检验，PCR检验体系如表15，程序如表16。

表15 大肠杆菌转化子的PCR检验体系

表16大肠杆菌转化子的PCR检验程序

随后进行电泳检验，选择具有阳性条带的菌株接种于20ml含有100μg/ml氨苄西林的LB培养基中，于37℃180rpm培养12h，随后以艾科瑞SteadyPure 质粒 DNA 提取试剂盒说明书操作提取质粒并进行测序。

1.2.2 重组质粒的提取与浓缩

将带有测序后重组质粒的大肠杆菌菌株接种入100ml含有100μg/ml氨苄西林的LB培养基中，于37℃180rpm培养12h，以艾克瑞SteadyPure 质粒 DNA 提取试剂盒说明书操作提取质粒，将质粒在-80℃预冷2h后，在冻干机中冻干4h，短暂离心后加入20μl无菌水重新溶解质粒，并检测浓度，重复质粒提取操作至质粒浓度大于3μg/μl，与-20℃存放待用。

1.2.3感受态菌体的制备

将裂殖壶B3菌株接种入50ml液体裂殖壶菌种子培养基中，于28℃，180rpm培养4d，随后5000rpm离心5min。弃去上清，使用预冷的无菌水重悬藻体并于4℃下5000rpm离心10min，重复一次；随后使用预冷的1mol/L的山梨醇重悬菌体于4℃下5000rpm离心10min，重复一次，使用10ml预冷的1mol/L的山梨醇重悬菌体，并分装至1.5ml离心管中，于冰上待用。

1.2.4 电穿孔法转染裂殖壶菌

于冰上取20μl 1.3.2所浓缩的重组质粒，与80μl感受态裂殖壶菌于1.5ml离心管中混匀，静置5min，随后加入预冷的电击杯中，静置10min。随后将电击杯柔和的置于BIORADmicropulser电穿孔仪中，将参数设置为真菌模式SC2，以1.5KV电击转化。

将向电穿孔结束的电击杯中加入900μl裂殖壶菌种子培养基，与转化后的菌液混匀，转入1.5ml离心管中，于28℃ 180rpm复苏培养12h。随后取100μl藻液涂布于含有100μg/ml博来霉素与100μg/mg卡那霉素的裂殖壶菌固体培养基平板。

1.2.5 裂殖壶菌转化子的筛选

将于100μg/ml博莱霉素与100μg/mg卡那霉素的裂殖壶菌固体培养基平板所生长的单菌落与固体培养基中进行连续划线传代，在5代后选取平板上的单菌落，接种入含有100μg/ml博来霉素与100μg/mg卡那霉素的裂殖壶菌种子培养基中培养3d；以1200rpm离心藻液，弃去上清，取200mg藻体，在液氮冷冻后于-20℃冷冻研磨15min，随后加入50μl无菌水，12000rpm离心5min后取上清以简易提取裂殖壶菌基因组DNA，进行PCR检验，检验体系如表17，程序如表18。

表17裂殖壶菌转化子的PCR检验体系

表18裂殖壶藻转化子的PCR检验程序

以含有100μg/ml博来霉素的裂殖壶菌种子培养基重悬具有阳性条带的藻株，取600μl藻液与1200μl 50%甘油混匀后与-20℃冻存。

1.3 重组牛乳铁蛋白乳铁蛋白表达裂殖壶菌的检定

1.3.1 重组菌株总蛋白的提取

选取1.2.5所筛选的阳性菌株，接种入含有以含有100μg/ml博来霉素与100μg/ml卡那霉素的裂殖壶菌种子培养基中，与28℃180rpm培养5d后，12000rpm离心5min弃去上清，取30mg藻体，加入2ml非变性细胞裂解液，200μlPMSF，30μl DNAase I，10μl溶菌酶，混匀后于冰上放置30min；随后在冰浴条件下以100w功率超声300s（超声时间3s，间隔时间7s，100循环），将超声破碎后的液体于4℃ 12000rpm离心5min，收集上清液即为总蛋白，取90μl上清，加入10μl 10x SDS-PAGE loading buffer，混匀后于99℃金属浴中变性10min以制备电泳样品，将剩余上清于-80℃冻存。

1.3.2重组菌株总蛋白的Western blot试验

①以睿博兴科15%快速蛋白制胶试剂盒配置SDS-PAGE凝胶，分离胶5 ml，浓缩胶1.5 ml，待胶凝固后至于电泳槽中；

②加入5-10μl 蛋白电泳样品，于200 V电泳40 min，随后切下凝胶，并依据凝胶大小裁剪PVDF膜并在甲醇活化后浸泡入预冷的电转液中，随后在预冷电转液的浸泡下在转膜夹阴极侧上分别放置纤维垫层，滤纸，电泳凝胶，PVDF膜，滤纸，纤维垫层，确认膜间无气泡后置入电转夹，冰浴条件下100 V转膜1 h；

③随后将PVDF膜在低速摇床上使用预冷的1xTBST溶液清洗三次，每次5 min，加入50 ml 0.05 g/ml脱脂奶粉，于冰上封闭2 h；

④使用预冷的1xTBST溶液清洗三次，每次5 min，加入以25 ml TBST5000倍稀释的abcam 小鼠Anti-6X His tag单克隆抗体，4℃孵育8 h；

⑤使用预冷的1xTBST溶液清洗三次，每次5 min，加入30 ml以TBST 3000倍稀释的HRP标记bioss羊抗鼠IgG，4℃孵育1 h；

⑥使用预冷的1xTBST溶液清洗三次，每次5 min，使用absin ECL化学发光检测试剂盒避光孵育1 min，随后使用tanon化学发光成像仪进行成像。

1.3.3 重组菌株总蛋白的抑菌实验

将金黄色葡萄球菌接种于10mlLB培养基中，37℃180rpm培养12h后，取1ml加入9ml温度约40℃的LB固体培养基，混匀后倒入LB固体培养基平板上，待凝固后，将滤纸片放入平板，向各滤纸片分别滴加1.4.1所提取藻株总蛋白30μl，以4mg氨苄西林作为阳性对照，以原始菌株总蛋白作为阴性对照，37℃培养12h。

1.3.4 重组菌株乳铁蛋白的表达量检验

使用上海恒远生物牛乳铁蛋白酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒检测各藻株总蛋白中乳铁蛋白含量。以说明书操作建立标准曲线并将1.3.1所制备各样品以样本稀释液5倍稀释检验其乳铁蛋白含量。

试验结果

2.1.1 目的片段的扩增

对目的片段扩增后进行电泳检验，结果如图3，可见各片段有特异性条带，其中LF、TSV40和PGK片段长度分别为2112、309bp和566bp,与电泳条带大小吻合.。

2.1.2 线性化质粒的扩增

对线性化质粒扩增后进行电泳检验结果如图4，线性化质粒片段长度为5916bp，与与电泳条带大小吻合。

2.1.3目的片段的连接

在TSV40与PGK连接后进行电泳检验，结果如图5，连接后片段大小应为926bp，与电泳条带大小吻合

在TSV40、PGK与LF连接后进行电泳检验，结果如图6，可见有较多杂带，但于目的片段3020bp处有明显条带，于相应位置切割条带并回收，检测浓度为234.1ng/μl。无信号肽片段电泳检验结果如图7，于与目的片段3020bp出现明显条带，回收测定DNA浓度为401ng/μl。

2.1.4重组质粒转入大肠杆菌

菌落PCR结果如图8，见多个泳道于目的条带大小3020bp处出现条带。

2.1.5重组质粒转入裂殖壶菌

挑取阳性单克隆进行菌落PCR后电泳检验，结果如图9。

2.1.6 重组菌株的western blot检验

重组菌株的westernblot化学发光与白光合成图像如图10，可见Δs7，+s7，+s12，Δs8，+s17株均出现阳性条带，且大小与目的蛋白的预期大小一致。

2.1.7 重组菌（藻）株总蛋白的抑菌实验

各重组菌株总蛋白的抑菌圈结果如图11，可见Δ7，Δs8，+s12株均出现大于原始菌株B3的抑菌圈。

2.1.8 重组菌（藻）株乳铁蛋白的表达量检验

标准曲线如图12，可见其乳铁蛋白-OD450计算公式为：

该线性回归模型的R²=0.994，表明线性相关系数可靠。

将各转化子蛋白样品吸光度代入标准曲线，结果如表19。

表19各突变株的乳铁蛋白含量

可见，乳铁蛋白在各转化子中均有表达。乳铁蛋白成功在重组菌（藻）株中表达，并表现出一定的抑菌活性，且能够被乳铁蛋白抗体识别。

试验例2表达乳铁蛋白的重组表达载体的组成元件筛选试验

在构建表达乳铁蛋白的重组表达载体的构建中，分别在乳铁蛋白基因的上下游尝试了酒精诱导强启动子ALCR与植物源性35s终止子，但在转入裂殖壶藻后未见目的蛋白表达，随后经元件筛选，发现在目的基因乳铁蛋白基因的上下游分别采用TEF1启动子与Tsv40终止子所构建的重组表达载体能够使得裂殖壶藻在无诱导条件下以较高的效率表达目的蛋白，同时，在抗生素选择压力下实现稳定转染。

使用了pAlgevir转化方式，通过SmaI与BamHI双酶切产生粘性末端的方式连接各目的蛋白与上游启动子ALCR与下游35s终止子，所构建的重组表达载体的图谱见图13，将其成功转入了农杆菌，PCR检测也得到阳性条带，重组表达载体转入农杆菌后的PCR图谱见图14，但将该重组表达载体转入裂殖壶藻后未见乳铁蛋白表达。

试验例3表达乳铁蛋白的重组表达载体电穿孔法转染裂殖壶菌以及裂殖壶菌转化子筛选的参数优化试验

将试验例2所构建的表达乳铁蛋白的重组表达载体分别使用1.35kv及1.5kv电压进行裂殖壶菌转化，并分别使用25μg/ml,50μg/ml及100μg/ml博莱霉素进行筛选，其中，1.35KV转化时乳铁蛋白目的基因同质化程度较差，1.35kV转化后三代的目的基因电泳图谱见图15；以25μg/ml,及50μg/ml博莱霉素筛选时出现假阳性菌落，且在液体培养五代时乳铁蛋白目的基因丢失， 25μg/ml转化五代后的目的基因电泳图谱见图16，50μg/ml转化五代后的目的基因电泳图谱见图17。

Claims (8)

1.一种表达牛乳铁蛋白的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体以裂殖壶藻表达载体pMG-18s-BleoR为骨架构建而成，所述裂殖壶藻表达载体pMG-18s-BleoR含有EM7启动子，在该EM7启动子的下游依次连接牛乳铁蛋白cDNA基因、终止子SV40和启动子PGK；其中，在EM7启动子和牛乳铁蛋白cDNA基因之间连接有信号肽编码基因；所述信号肽编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示；所述终止子SV40的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示；所述启动子PGK的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示；所述的牛乳铁蛋白cDNA基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示。

2.一种构建权利要求1所述的重组表达载体的方法，其特征在于，包括：

(1)采用PCR分别扩增得到前置有组氨酸的牛乳铁蛋白原基因cDNA、终止子SV40以及启动子PGK；

(2)以具有同源臂的一对PCR引物通过融合PCR将终止子SV40与启动子PGK融合得到片段1；

(3)以具有同源臂的一对PCR引物通过融合PCR将前置有组氨酸的牛乳铁蛋白原基因cDNA与片段1融合得到载体元件；

(4) 采用PCR引物扩增线性化的载体骨架pMG-18s-BleoR；

(5) 通过无缝克隆酶对扩增的线性化的载体骨架pMG-18s-BleoR与步骤（3）获得的载体元件进行同源重组得到表达牛乳铁蛋白的重组表达载体。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）以SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列为模板，以核苷酸序列分别为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的核苷酸为上下游扩增引物扩增得到牛乳铁蛋白原基因cDNA与前置组氨酸6×His标签；以质粒pMiRGLO为模板，采用核苷酸序列分别为SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示的PCR上下游引物扩增得到终止子SV40；以质粒pMiRGLO为模板，采用核苷酸序列分别为SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示的PCR上下游引物扩增得到启动子PGK。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述的具有同源臂的一对PCR引物的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示；

步骤（3）中所述的具有同源臂的一对PCR引物的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.10和SEQID NO.14所示；

步骤（4）中以pMG-18s-BleoR为模板进行PCR扩增得到线性化的载体骨架pMG-18s-BleoR；所述的PCR引物的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示；

步骤（5）中所述的无缝克隆酶是ABclonal Seamless。

5.含有权利要求1所述的重组表达载体的重组裂殖壶菌株，其特征在于，其微生物保藏编号是：CGMCC No.45266。

6.权利要求5所述的重组裂殖壶菌株的构建方法，其特征在于，包括：构建表达牛乳铁蛋白的重组表达载体；将构建的表达牛乳铁蛋白的重组表达载体转染感受态裂殖壶菌；筛选获得含有表达牛乳铁蛋白的重组表达载体的重组裂殖壶菌株。

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，将构建的表达牛乳铁蛋白的重组表达载体通过电穿孔法转染感受态裂殖壶菌，其中，电穿孔法转染感受态裂殖壶菌的电压为1.5kv；采用100μg/ml博莱霉素筛选获得含有表达牛乳铁蛋白的重组表达载体的重组裂殖壶菌株。

8.权利要求1所述的表达牛乳铁蛋白的重组表达载体或权利要求5所述的重组裂殖壶菌株在制备牛乳铁蛋白中的应用。