CN114875010B - 一种提升蛋白翻译效率的基因及其编码产物与应用 - Google Patents

一种提升蛋白翻译效率的基因及其编码产物与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114875010B
CN114875010B CN202210424935.7A CN202210424935A CN114875010B CN 114875010 B CN114875010 B CN 114875010B CN 202210424935 A CN202210424935 A CN 202210424935A CN 114875010 B CN114875010 B CN 114875010B
Authority
CN
China
Prior art keywords
ala
leu
pro
val
asp
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210424935.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114875010A (zh
Inventor
王泉
庄洁怡
罗浩林
胡章立
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen University
Original Assignee
Shenzhen University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen University filed Critical Shenzhen University
Priority to CN202210424935.7A priority Critical patent/CN114875010B/zh
Publication of CN114875010A publication Critical patent/CN114875010A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114875010B publication Critical patent/CN114875010B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07058—(2,3-Dihydroxybenzoyl)adenylate synthase (2.7.7.58)

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种提升蛋白翻译效率的基因及其编码产物与应用，其中，一种真核细胞多聚腺苷酸合成酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示；编码上述的一种真核细胞多聚腺苷酸合成酶的一种提升蛋白翻译效率的CrePAPS基因，所述CrePAPS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示。本发明可以通过CrePAPS基因的导入，可以编码得到具有加尾活性的真核细胞多聚腺苷酸合成酶，其可以向菌株中pre‑mRNA的3’端添加多聚腺苷酸尾巴，进而显著提高mRNA的聚腺苷酸化，实现mRNA稳定性和翻译效率的提升，最终达到提高蛋白翻译和积累量的目的。

Description

一种提升蛋白翻译效率的基因及其编码产物与应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体涉及一种提升蛋白翻译效率的基因及其编码产物与应用。
背景技术
近年来重组蛋白尤其是药用重组蛋白市场需求日益增加，传统的药用重组蛋白生产载体诸如细菌、酵母、高等植物、哺乳动物细胞等由于各种限制无法满足全部需求，因此，素来有光合酵母之称的莱茵衣藻逐渐走入视野。莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是一种单细胞光合绿藻，因其具有分布广、繁殖快、容易培养、含有高价值附加产物等特点而备受关注。
现有许多研究通过基因工程手段成功的创制了表达各种药用重组蛋白的衣藻工程藻株。迄今为止，已有数十种具有商业价值的药用重组蛋白在衣藻中成功表达，其中包括抗体、抗原、免疫毒素、酶和治疗性蛋白等。然而，这些工程藻株中目的蛋白表达效率普遍偏低，所以开发衣藻为重组蛋白表达载体的工程尚未实现产业化、规模化应用。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有衣藻中目的蛋白表达效率普遍偏低的缺陷，从而提供一种提升蛋白翻译效率的基因及其编码产物与应用。
一种真核细胞多聚腺苷酸合成酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示。本发明还提供了编码上述的一种真核细胞多聚腺苷酸合成酶的一种提升蛋白翻译效率的CrePAPS基因(多聚腺苷酸合成酶编码基因)。所述CrePAPS基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:3所示。
本发明提供的上述的CrePAPS基因，其中SEQ ID NO:1的核酸序列长2 412bp，编码803个氨基酸组成的真核细胞多聚腺苷酸合成酶，如SEQ ID NO:2所示；SEQ ID NO:3的核酸序列长1 440bp，编码480个氨基酸组成的真核细胞多聚腺苷酸合成酶，如SEQ ID NO:4所示。其主要功能是向pre-mRNA的3’端添加多聚腺苷酸尾巴；通过向pre-mRNA的3’端添加多聚腺苷酸尾巴可以有效达到以下功能：①提升mRNA的稳定性；②促进mRNA从核内向细胞质运输；③与多聚腺苷酸结合蛋白(PABPs)结合维持稳定的同时提升被核糖体识别的概率。因此，本发明可以通过提高细胞内CrePAPS表达量来提高mRNA的聚腺苷酸化，进而提升mRNA稳定性和翻译效率，最终提高蛋白的翻译和积累。因此，本发明可以达到通过CrePAPS的加尾活性作用提升重组蛋白的积累量，进而达到符合大规模工业化生产的目的。
本发明还公开了包含上述的一种提升蛋白翻译效率的CrePAPS基因的重组载体。所述载体为真核表达载体，优选为适于衣藻的表达载体，更优选为适于莱茵衣藻的表达载体。本发明还公开了包含上述的一种提升蛋白翻译效率的CrePAPS基因的重组菌株。所述菌株为光合绿藻，优选为衣藻，更优选为莱茵衣藻。
本发明通过在菌株内过量表达该CrePAPS基因，进而通过在分子水平提升蛋白的翻译效率，达到提升细胞蛋白积累量的目的。因此，本发明还提供了CrePAPS基因、一种真核细胞多聚腺苷酸合成酶及其重组载体在提高菌株内mRNA的加尾长度中的应用；优选的，在通过提高mRNA的加尾长度进而提升蛋白翻译效率中的应用。同时，本发明还提供了上述重组菌株在通过提升mRNA的加尾长度进而提高药用重组蛋白积累量中的应用。
本发明技术方案，具有如下优点：
本发明的CrePAPS基因的导入，可以编码得到具有加尾活性的真核细胞多聚腺苷酸合成酶，其可以向菌株中pre-mRNA的3’端添加多聚腺苷酸尾巴，进而显著提高mRNA的聚腺苷酸化，实现mRNA稳定性和翻译效率的提升，最终达到提高蛋白翻译和积累量的目的。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1a是本发明实施例1的pEASY-E1-CrePAPS载体的结构示意图；
图1b是本发明实施例1的蛋白产物的纯化结果图；
图1c是本发明实施例1中对体外对转录mRNA进行加尾检测的结果图；
图2a是本发明实施例2的过表达载体pJDHSP-CrePAPS的结构示意图；
图2b是本发明实施例2的30组莱茵衣藻中CrePAPS基因表达的结果示意图；
图2c是本发明实施例2中CrePAPS基因编码蛋白的荧光定量PCR检测结果图；
图3是本发明实施例2中外源CrePAPS基因的相对表达量结果图；
图4是本发明实施例2中相比野生型蛋白表达量改变2倍以上的蛋白数量示意图；
图5是本发明实施例2中3个过表达藻株中粗蛋白和水溶蛋白含量结果图。
具体实施方式
实施例1
将核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的CrePAPS基因编码序列克隆后，将其插入原核表达载体pEASY-E1的6×His和T7 terminator之间，得到pEASY-E1-CrePAPS载体，如图1a所示。并将该pEASY-E1-CrePAPS载体转入BL21大肠杆菌菌株，在带氨苄抗性(50μg/ml，氨苄青霉素Amp)的LB培养基上平板筛选，选取经PCR鉴定的阳性单克隆，接种于3ml带Amp抗性的液体LB中37℃，220rpm过夜培养。取1ml上一步过夜培养的菌液至含Amp抗性的50ml LB中37℃，220rpm摇菌至OD600＝0.4～0.6之间，加入50μl 1M IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，终浓度1mM，28℃，220rpm诱导表达4h。取诱导前和诱导后的菌液进行超声破碎(240W，超声开3s，超声关30s，5min)，然后利用SDS-PAGE检测得到结果如图1b所示。将诱导后的菌体离心收集，加入lysis buffer(0.1M Tris-HCl；1.5M NaCl；0.02M Na2EDTA；2％CTAB；0.1％DIECA；2％PVP K-30加0.2％β-巯基乙醇后调pH值至7.4)超声破碎，收集蛋白产物，利用蛋白纯化试剂盒(全式金，DP101)对蛋白产物进行纯化，纯化结果SDS-PAGE检测如图1b所示。该图1b中，编号2-3为转入原核表达载体pEASY-E1-CrePAPS的大肠杆菌诱导前，编号4-5为加入IPTG诱导后，编号6-7为经过Ni-NTA树脂纯化试剂盒纯化后的SDS-PAGE检测结果。由图1b可知，CrePAPS基因可以表达并纯化出84.9kDa的蛋白产物，该蛋白产物的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
利用该纯化后84.9kDa的蛋白产物在体外对转录mRNA进行加尾检测。检测方法如下，首先利用全式金公司T7高效转录试剂盒(JT101)体外转录获得pre-mRNA；然后在含2.5％(wt/vol)聚乙烯醇、8％(wt/vol)甘油、8mM HEPES(pH 7.9)、17mM(NH4)2SO4、2mMMgCl2、0.08mM EDTA、0.02mM DTT、4mM磷酸肌酸、50μM ATP、0.5U RNasin的反应体系中加入浓度为0.1pmol的上一步获得的pre-mRNA，和50ng、40ng、20ng、10ng和0ng的纯化CrePAPS蛋白，25℃反应3h，然后加入含0.2μg/μl蛋白酶K、20mM Tris(pH 7.9)、0.1M NaCl、10mM EDTA和1％体积SDS的终止液300μl，30℃终止反应15min。然后加入V:V＝1:1的酚氯仿提取上一步反应中的RNA，并用5％聚丙烯酰胺尿素变性胶电泳检测。检测结果如图1c所示，证明一定范围内增加该蛋白产物的量能提升mRNA的加尾长度，从而证明CrePAPS基因编码的蛋白具有加尾活性。
基于上述结果，可以有效证明提升细胞内CrePAPS基因编码的蛋白的聚腺苷酸活性，能有效促进细胞内mRNA的加尾；从而维持mRNA的稳定性，进而提升菌株内蛋白的翻译效率，并最终提高蛋白积累。
实施例2
将核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的CrePAPS基因的编码序列克隆后，将其插入到过表达载体pJDHSP(Avector for multiple gene co-expression in Chlamydomonasreinhardtii，Algal Research，Volume 20,December 2016,Pages 53-56)中，插入位置为RBCS2 5’UTR与RBCS2 3’UTR之间，获得过表达载体pJDHSP-CrePAPS，如图2a所示。将过表达载体pJDHSP-CrePAPS采用电穿孔法插入野生型(WT)莱茵衣藻的基因组中，具体转化方法如下：培养100mL藻液，3 000rpm离心5min收集藻细胞。加入10mL TAP液体培养基洗涤1次后，加入1mL TAP液体培养基充分重悬，使藻液浓度达到108细胞/mL。取250μL藻液于1.5mL离心管中，加入6-10μg线性化pJDHSP-CrePAPS质粒，混匀后小心转移至0.4mm电转杯中，孵育5min。将电转杯放入电穿孔仪的杯池室，以电压500V，电容50μV，电阻800Ω的电击参数进行电击。电击结束后向电转杯中加入750μL TAP液体培养基，混匀后转移到15mL离心管中，再加入10mL TAP液体培养基，于25℃120rpm摇床暗光培养16h以上。藻液涂布于含有相应抗性的TAP平板上，光照培养7-15d后，挑取平板上的单藻落提取DNA进行PCR验证，PCR引物位置如图2a所示，经过验证总共筛选出1、3、5、6、14、15、16、18、19、20、21、25、26、30共计14个有CrePAPS插入的藻株。如图2b所示标有白色数字的为对应的阳性藻株，其中N是利用野生型藻DNA进行PCR作为阴性对照，P是用pJDHSP-CrePAPS质粒DNA进行PCR作为阳性对照。
利用RNA提取试剂盒(全式金，ER301)提取14个阳性株的RNA，调节RNA浓度一致然后进行反转录(全式金，AE411)获得cDNA。然后进行半定量检测，分别利用这14个株系的cDNA扩增CrePAPS基因片段和CrePP2A基因的片段。如图2c所示14个株系中CrePP2A扩增条带亮度一致表明RNA浓度一致，而CrePAPS扩增结果中6、19、21号藻株的条带明显亮于其它株系表明在这几个株系中表达量更高。同时实时荧光定量PCR检测也确定了这3个过表达藻株中有外源CrePAPS表达，并且表达超过野生型(WT)表达水平两倍以上，如图3所示。因此将这3个株系命名为OE6、OE19、OE21，并用于后续检测。
提取OE6、OE19和OE21这3个过表达藻株的总蛋白，具体提取方法如下：取培养至指数生长期的藻细胞，3 000rpm离心5min收集藻细胞，蒸馏水洗涤2次后立即浸泡于液氮中。加入500μl RIPAlysis buffer(YEASEN，20101ES60)和5μl PMSF(用异丙醇配制成1mM苯甲基磺酰氟溶液)，然后置于冰上进行超声破碎，360W超声开2s，超声关2s，5min，使得细胞蛋白释放，然后12 000rpm离心30min去除沉淀。向上清中加入10mM DTT(二硫苏糖醇)在56℃下还原30min，然后用20mM碘乙酰胺在黑暗条件下反应30min。加入甲醇和氯仿沉淀蛋白质，4℃12000×g离心10min，收集沉淀，加入ddH2O溶解后再次于冰上超声破碎。4℃12 000×g离心后，取上清液，然后用于液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分析和无标签蛋白质组分析(检测分析由武汉百蓁生物公司完成)。蛋白组检测得到3 613个蛋白和对应的相对表达量。并通过与野生型(WT)对比筛选表达量改变2倍以上的蛋白(DAPs)，统计结果如图4所示。由图4可知，显示在3个CrePAPS过表达株系中上调蛋白远远多于下调蛋白，这进一步证明过表达CrePAPS基因能促进绝大部分蛋白的表达。
为了进一步验证上述效果，本发明还通过凯氏定氮法和BCA蛋白定量法分别对野生型(WT)和3个过表达藻株(OE6、OE19和OE21)的粗蛋白(CPC)和水溶蛋白(DPC)含量进行测定，得到的结果显示如图5所示。通过图5可知，与野生型相比，CrePAPS过表达藻株中无论是粗蛋白含量还是水溶蛋白含量都明显高于野生型。这为利用衣藻作为重组蛋白生产载体提供了一个应用思路。
综上，我们可以利用CrePAPS过表达的藻株为底盘藻，进行基因工程改造使之能生产特定的药用重组蛋白，通过CrePAPS的加尾活性作用提升重组蛋白的积累量达到符合大规模工业化生产的目的。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于，在原核表达蛋白时仅截取1-480氨基酸进行表达和聚腺苷酸活性检测，即，在原核中表达SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的蛋白产物，其实现方式为：将SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列插入到载体中，再导入到原核生物中进行表达。
具体的，仅扩增CrePAPS基因1-1 440bp的如SEQ ID NO:3所示的序列(编码N端480个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示)，连入pEASY-E1载体，进行诱导表达和纯化(诱导表达和纯化方法同实施例1)也表现出体外加尾活性。
证明只保留保守结构域的蛋白产物也具有聚腺苷酸活性，也可以用于提升蛋白翻译效率。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
序列表
<110> 深圳大学
<120> 一种提升蛋白翻译效率的基因及其编码产物与应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2412
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggcagttg cagacccaaa cgatgtctac cttttgcggc cgctaaacaa ttctcttcct 60
tcagcagagg acaaacggca cagcgctgag ctagaacagt tccttcgcga tgccggcctc 120
tatgagccgg acgaggacgc ctacctccgt caggaggtcc ttgggctgtt ctacgagttg 180
acacaaacat gggtgaaggg tgtttgccgg aagaagaacc ttaacgtgga ggatgcgcgt 240
gctcacgtct acaccttcgg ctcgtaccga ctgggcgtgc acggcccagg ggcggacatg 300
gacacgctgg tggtgggccc gcgctacgtg ctgcgggact cggacttctt cggcagcgag 360
aagcactgcc tggaatacat gctctcgcaa acgcccgaca tcacggacat tcagccagtg 420
cccgacgcct tcgtgcccat gatcggcatc aagtacaagg gcgtgcaaat cgacatcctg 480
tacgcctcgc tggcgatgca gacgctgccc gagcagctgg acctgtccaa ccacgccgtg 540
ctgcgtggct gcgacgagcc caccgtgcgc gcgctcaacg gctgccgcgt gacggacacc 600
atgctgaagc tggtgccgcg gcaggaggtg ttccgcaccg cgctgcgcgc cgtgaagcac 660
tgggcctcgc tgcgcggcat ctcctccaac gtgaccggct acctgggcgg cgtcaacctg 720
gccatcatgg tggccaagat ctgccagctc tacccgcgcg ccgaggcctc caccgtgctg 780
ctcaagttct tcatcctgct caaggcctgg ccctggccgc gcgccatcca cctgcggatc 840
ccggaggagc acagcctggg gctgccggtg tgggacccgc ggcccggcac gcgcgacagc 900
ctggcgctca tgccggtcat cacacccgcc taccccgcaa tgaactcact gtacaacgtg 960
cagcgctcca cgctcgaggt aatgacggag gagttcgccg cggccgccga cgtgtgcacc 1020
tccttcctgc actgcccgcc cggcaagccc atcgagtgga gccgcctctt cacgcccgtg 1080
cccttcttca cgcagcactc cttttacatc cagctggagg tgtctgctga cagcgagggc 1140
gacctggtgc tgtgggacgg ctgggtgagc agccgcatca ggaggctggt gcgcaacctg 1200
gaggaccacg tgcgggtcag gccctacccc aaggcgcaga agccgccagt agagccggcc 1260
aaagaggcag acccggacgg caacgacgcc aagccggtca ccgaggaggc ctccaaggac 1320
gtcgttaagg cggagcccaa ggatgccgac aaggaccccg acgcaaccgc ccccaaccgg 1380
ccgcgcctgt gctactacat cggcgtggac aagcgcgcgg cggcggcgct gacggcgcag 1440
cagctgctgc ccaacgggca agtggcgcag ctaccggcgc acgcgctgac ggggccggcg 1500
ggcgcgccgg cgggcaaggt ggacctgaag cagccctgca tcatcttcgt gaacgaggtg 1560
tcggcctggc ctgcaaagcg gcccggcatg gcgctgaaag tgaacgtgct caagcgggcg 1620
ttgctgccgt catggctgcc gggagtgccg cagcggccgc agacacaggc gctgccggcg 1680
ccgcccccag caaccgcggg cggcaaggcg ggcatcaagc gggctccgtc agaggatccg 1740
gcccatcagg acgcgagcgc tgcgcccgcc gcagcgctgc cggcgcagca gccagcaaag 1800
cgcccacgag tagcccaggc cgcaccagca gcagcgggcc cgaagcgtgc tgctgtgcaa 1860
gatgccagcc catcaaccgc ggcggtggcg gcaccagcag gcgcgccgcc tgcgaagcgt 1920
tccaaggttg cacaggcaac ctcgcgctcg caggcgcagc ctcccgcgct cacctccgag 1980
ccgcaggccg gcgccacaac ggctgcggcc cccaccgtgc cagcaccggt gcaggctgct 2040
tgtgaggtgg cggcagcggc ggcggagcca ccgtcaggtg caggccctgt tagcgcaggc 2100
gcgggcggtg agtcgggcgt ggcggtggcc tccggtagtg ctgctcctca gtcagcagat 2160
gctacctctc tgagtggtgc cgccacagac gatgctacag cggacacggc cgcggcggca 2220
ggaggcggcg gggtggggct gtcgccagag gcggcgcagc agctggcgga gcgggcgtcc 2280
caggcggatg agcgggcggc ggtgcaggag tcgcagctgc acaacacggg ccgggacatg 2340
ggcgactggc tgggagtgga ccacggcgtg gcgctcacgg gcgtgcaggg ttcgcctacg 2400
gctggctctt ga 2412
<210> 2
<211> 803
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Ala Val Ala Asp Pro Asn Asp Val Tyr Leu Leu Arg Pro Leu Asn
1 5 10 15
Asn Ser Leu Pro Ser Ala Glu Asp Lys Arg His Ser Ala Glu Leu Glu
20 25 30
Gln Phe Leu Arg Asp Ala Gly Leu Tyr Glu Pro Asp Glu Asp Ala Tyr
35 40 45
Leu Arg Gln Glu Val Leu Gly Leu Phe Tyr Glu Leu Thr Gln Thr Trp
50 55 60
Val Lys Gly Val Cys Arg Lys Lys Asn Leu Asn Val Glu Asp Ala Arg
65 70 75 80
Ala His Val Tyr Thr Phe Gly Ser Tyr Arg Leu Gly Val His Gly Pro
85 90 95
Gly Ala Asp Met Asp Thr Leu Val Val Gly Pro Arg Tyr Val Leu Arg
100 105 110
Asp Ser Asp Phe Phe Gly Ser Glu Lys His Cys Leu Glu Tyr Met Leu
115 120 125
Ser Gln Thr Pro Asp Ile Thr Asp Ile Gln Pro Val Pro Asp Ala Phe
130 135 140
Val Pro Met Ile Gly Ile Lys Tyr Lys Gly Val Gln Ile Asp Ile Leu
145 150 155 160
Tyr Ala Ser Leu Ala Met Gln Thr Leu Pro Glu Gln Leu Asp Leu Ser
165 170 175
Asn His Ala Val Leu Arg Gly Cys Asp Glu Pro Thr Val Arg Ala Leu
180 185 190
Asn Gly Cys Arg Val Thr Asp Thr Met Leu Lys Leu Val Pro Arg Gln
195 200 205
Glu Val Phe Arg Thr Ala Leu Arg Ala Val Lys His Trp Ala Ser Leu
210 215 220
Arg Gly Ile Ser Ser Asn Val Thr Gly Tyr Leu Gly Gly Val Asn Leu
225 230 235 240
Ala Ile Met Val Ala Lys Ile Cys Gln Leu Tyr Pro Arg Ala Glu Ala
245 250 255
Ser Thr Val Leu Leu Lys Phe Phe Ile Leu Leu Lys Ala Trp Pro Trp
260 265 270
Pro Arg Ala Ile His Leu Arg Ile Pro Glu Glu His Ser Leu Gly Leu
275 280 285
Pro Val Trp Asp Pro Arg Pro Gly Thr Arg Asp Ser Leu Ala Leu Met
290 295 300
Pro Val Ile Thr Pro Ala Tyr Pro Ala Met Asn Ser Leu Tyr Asn Val
305 310 315 320
Gln Arg Ser Thr Leu Glu Val Met Thr Glu Glu Phe Ala Ala Ala Ala
325 330 335
Asp Val Cys Thr Ser Phe Leu His Cys Pro Pro Gly Lys Pro Ile Glu
340 345 350
Trp Ser Arg Leu Phe Thr Pro Val Pro Phe Phe Thr Gln His Ser Phe
355 360 365
Tyr Ile Gln Leu Glu Val Ser Ala Asp Ser Glu Gly Asp Leu Val Leu
370 375 380
Trp Asp Gly Trp Val Ser Ser Arg Ile Arg Arg Leu Val Arg Asn Leu
385 390 395 400
Glu Asp His Val Arg Val Arg Pro Tyr Pro Lys Ala Gln Lys Pro Pro
405 410 415
Val Glu Pro Ala Lys Glu Ala Asp Pro Asp Gly Asn Asp Ala Lys Pro
420 425 430
Val Thr Glu Glu Ala Ser Lys Asp Val Val Lys Ala Glu Pro Lys Asp
435 440 445
Ala Asp Lys Asp Pro Asp Ala Thr Ala Pro Asn Arg Pro Arg Leu Cys
450 455 460
Tyr Tyr Ile Gly Val Asp Lys Arg Ala Ala Ala Ala Leu Thr Ala Gln
465 470 475 480
Gln Leu Leu Pro Asn Gly Gln Val Ala Gln Leu Pro Ala His Ala Leu
485 490 495
Thr Gly Pro Ala Gly Ala Pro Ala Gly Lys Val Asp Leu Lys Gln Pro
500 505 510
Cys Ile Ile Phe Val Asn Glu Val Ser Ala Trp Pro Ala Lys Arg Pro
515 520 525
Gly Met Ala Leu Lys Val Asn Val Leu Lys Arg Ala Leu Leu Pro Ser
530 535 540
Trp Leu Pro Gly Val Pro Gln Arg Pro Gln Thr Gln Ala Leu Pro Ala
545 550 555 560
Pro Pro Pro Ala Thr Ala Gly Gly Lys Ala Gly Ile Lys Arg Ala Pro
565 570 575
Ser Glu Asp Pro Ala His Gln Asp Ala Ser Ala Ala Pro Ala Ala Ala
580 585 590
Leu Pro Ala Gln Gln Pro Ala Lys Arg Pro Arg Val Ala Gln Ala Ala
595 600 605
Pro Ala Ala Ala Gly Pro Lys Arg Ala Ala Val Gln Asp Ala Ser Pro
610 615 620
Ser Thr Ala Ala Val Ala Ala Pro Ala Gly Ala Pro Pro Ala Lys Arg
625 630 635 640
Ser Lys Val Ala Gln Ala Thr Ser Arg Ser Gln Ala Gln Pro Pro Ala
645 650 655
Leu Thr Ser Glu Pro Gln Ala Gly Ala Thr Thr Ala Ala Ala Pro Thr
660 665 670
Val Pro Ala Pro Val Gln Ala Ala Cys Glu Val Ala Ala Ala Ala Ala
675 680 685
Glu Pro Pro Ser Gly Ala Gly Pro Val Ser Ala Gly Ala Gly Gly Glu
690 695 700
Ser Gly Val Ala Val Ala Ser Gly Ser Ala Ala Pro Gln Ser Ala Asp
705 710 715 720
Ala Thr Ser Leu Ser Gly Ala Ala Thr Asp Asp Ala Thr Ala Asp Thr
725 730 735
Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Val Gly Leu Ser Pro Glu Ala Ala
740 745 750
Gln Gln Leu Ala Glu Arg Ala Ser Gln Ala Asp Glu Arg Ala Ala Val
755 760 765
Gln Glu Ser Gln Leu His Asn Thr Gly Arg Asp Met Gly Asp Trp Leu
770 775 780
Gly Val Asp His Gly Val Ala Leu Thr Gly Val Gln Gly Ser Pro Thr
785 790 795 800
Ala Gly Ser
<210> 3
<211> 1440
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggcagttg cagacccaaa cgatgtctac cttttgcggc cgctaaacaa ttctcttcct 60
tcagcagagg acaaacggca cagcgctgag ctagaacagt tccttcgcga tgccggcctc 120
tatgagccgg acgaggacgc ctacctccgt caggaggtcc ttgggctgtt ctacgagttg 180
acacaaacat gggtgaaggg tgtttgccgg aagaagaacc ttaacgtgga ggatgcgcgt 240
gctcacgtct acaccttcgg ctcgtaccga ctgggcgtgc acggcccagg ggcggacatg 300
gacacgctgg tggtgggccc gcgctacgtg ctgcgggact cggacttctt cggcagcgag 360
aagcactgcc tggaatacat gctctcgcaa acgcccgaca tcacggacat tcagccagtg 420
cccgacgcct tcgtgcccat gatcggcatc aagtacaagg gcgtgcaaat cgacatcctg 480
tacgcctcgc tggcgatgca gacgctgccc gagcagctgg acctgtccaa ccacgccgtg 540
ctgcgtggct gcgacgagcc caccgtgcgc gcgctcaacg gctgccgcgt gacggacacc 600
atgctgaagc tggtgccgcg gcaggaggtg ttccgcaccg cgctgcgcgc cgtgaagcac 660
tgggcctcgc tgcgcggcat ctcctccaac gtgaccggct acctgggcgg cgtcaacctg 720
gccatcatgg tggccaagat ctgccagctc tacccgcgcg ccgaggcctc caccgtgctg 780
ctcaagttct tcatcctgct caaggcctgg ccctggccgc gcgccatcca cctgcggatc 840
ccggaggagc acagcctggg gctgccggtg tgggacccgc ggcccggcac gcgcgacagc 900
ctggcgctca tgccggtcat cacacccgcc taccccgcaa tgaactcact gtacaacgtg 960
cagcgctcca cgctcgaggt aatgacggag gagttcgccg cggccgccga cgtgtgcacc 1020
tccttcctgc actgcccgcc cggcaagccc atcgagtgga gccgcctctt cacgcccgtg 1080
cccttcttca cgcagcactc cttttacatc cagctggagg tgtctgctga cagcgagggc 1140
gacctggtgc tgtgggacgg ctgggtgagc agccgcatca ggaggctggt gcgcaacctg 1200
gaggaccacg tgcgggtcag gccctacccc aaggcgcaga agccgccagt agagccggcc 1260
aaagaggcag acccggacgg caacgacgcc aagccggtca ccgaggaggc ctccaaggac 1320
gtcgttaagg cggagcccaa ggatgccgac aaggaccccg acgcaaccgc ccccaaccgg 1380
ccgcgcctgt gctactacat cggcgtggac aagcgcgcgg cggcggcgct gacggcgcag 1440
<210> 4
<211> 480
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Ala Val Ala Asp Pro Asn Asp Val Tyr Leu Leu Arg Pro Leu Asn
1 5 10 15
Asn Ser Leu Pro Ser Ala Glu Asp Lys Arg His Ser Ala Glu Leu Glu
20 25 30
Gln Phe Leu Arg Asp Ala Gly Leu Tyr Glu Pro Asp Glu Asp Ala Tyr
35 40 45
Leu Arg Gln Glu Val Leu Gly Leu Phe Tyr Glu Leu Thr Gln Thr Trp
50 55 60
Val Lys Gly Val Cys Arg Lys Lys Asn Leu Asn Val Glu Asp Ala Arg
65 70 75 80
Ala His Val Tyr Thr Phe Gly Ser Tyr Arg Leu Gly Val His Gly Pro
85 90 95
Gly Ala Asp Met Asp Thr Leu Val Val Gly Pro Arg Tyr Val Leu Arg
100 105 110
Asp Ser Asp Phe Phe Gly Ser Glu Lys His Cys Leu Glu Tyr Met Leu
115 120 125
Ser Gln Thr Pro Asp Ile Thr Asp Ile Gln Pro Val Pro Asp Ala Phe
130 135 140
Val Pro Met Ile Gly Ile Lys Tyr Lys Gly Val Gln Ile Asp Ile Leu
145 150 155 160
Tyr Ala Ser Leu Ala Met Gln Thr Leu Pro Glu Gln Leu Asp Leu Ser
165 170 175
Asn His Ala Val Leu Arg Gly Cys Asp Glu Pro Thr Val Arg Ala Leu
180 185 190
Asn Gly Cys Arg Val Thr Asp Thr Met Leu Lys Leu Val Pro Arg Gln
195 200 205
Glu Val Phe Arg Thr Ala Leu Arg Ala Val Lys His Trp Ala Ser Leu
210 215 220
Arg Gly Ile Ser Ser Asn Val Thr Gly Tyr Leu Gly Gly Val Asn Leu
225 230 235 240
Ala Ile Met Val Ala Lys Ile Cys Gln Leu Tyr Pro Arg Ala Glu Ala
245 250 255
Ser Thr Val Leu Leu Lys Phe Phe Ile Leu Leu Lys Ala Trp Pro Trp
260 265 270
Pro Arg Ala Ile His Leu Arg Ile Pro Glu Glu His Ser Leu Gly Leu
275 280 285
Pro Val Trp Asp Pro Arg Pro Gly Thr Arg Asp Ser Leu Ala Leu Met
290 295 300
Pro Val Ile Thr Pro Ala Tyr Pro Ala Met Asn Ser Leu Tyr Asn Val
305 310 315 320
Gln Arg Ser Thr Leu Glu Val Met Thr Glu Glu Phe Ala Ala Ala Ala
325 330 335
Asp Val Cys Thr Ser Phe Leu His Cys Pro Pro Gly Lys Pro Ile Glu
340 345 350
Trp Ser Arg Leu Phe Thr Pro Val Pro Phe Phe Thr Gln His Ser Phe
355 360 365
Tyr Ile Gln Leu Glu Val Ser Ala Asp Ser Glu Gly Asp Leu Val Leu
370 375 380
Trp Asp Gly Trp Val Ser Ser Arg Ile Arg Arg Leu Val Arg Asn Leu
385 390 395 400
Glu Asp His Val Arg Val Arg Pro Tyr Pro Lys Ala Gln Lys Pro Pro
405 410 415
Val Glu Pro Ala Lys Glu Ala Asp Pro Asp Gly Asn Asp Ala Lys Pro
420 425 430
Val Thr Glu Glu Ala Ser Lys Asp Val Val Lys Ala Glu Pro Lys Asp
435 440 445
Ala Asp Lys Asp Pro Asp Ala Thr Ala Pro Asn Arg Pro Arg Leu Cys
450 455 460
Tyr Tyr Ile Gly Val Asp Lys Arg Ala Ala Ala Ala Leu Thr Ala Gln
465 470 475 480

Claims (5)

1.一种提升蛋白翻译效率的CrePAPS基因在提升mRNA 的加尾长度进而提高药用重组蛋白积累量中的应用，其特征在于，所述CrePAPS基因编码氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的一种真核细胞多聚腺苷酸合成酶，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.包含权利要求1所述的CrePAPS基因的重组载体在提升mRNA 的加尾长度进而提高药用重组蛋白积累量中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述重组载体为真核表达载体。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述重组载体为适于衣藻的表达载体。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述重组载体为适于莱茵衣藻的表达载体。
CN202210424935.7A 2022-04-21 2022-04-21 一种提升蛋白翻译效率的基因及其编码产物与应用 Active CN114875010B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210424935.7A CN114875010B (zh) 2022-04-21 2022-04-21 一种提升蛋白翻译效率的基因及其编码产物与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210424935.7A CN114875010B (zh) 2022-04-21 2022-04-21 一种提升蛋白翻译效率的基因及其编码产物与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114875010A CN114875010A (zh) 2022-08-09
CN114875010B true CN114875010B (zh) 2023-10-24

Family

ID=82671242

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210424935.7A Active CN114875010B (zh) 2022-04-21 2022-04-21 一种提升蛋白翻译效率的基因及其编码产物与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114875010B (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101432427A (zh) * 2006-02-28 2009-05-13 三得利株式会社 来自酿造用酵母的有用蛋白质的鉴定方法
CN102286481A (zh) * 2004-04-20 2011-12-21 辛根塔参与股份公司 用于在植物繁殖组织中表达基因产物的调控序列
CN111321081A (zh) * 2012-12-06 2020-06-23 合成基因组股份有限公司 具有不易变化的高光适应表型的藻类突变体
CN111733174A (zh) * 2020-08-07 2020-10-02 北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院） 一种分离的核酸分子及其用途
WO2021136347A1 (zh) * 2019-12-30 2021-07-08 南京金斯瑞生物科技有限公司 一种哺乳动物表达系统使用的高表达载体

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040235001A1 (en) * 2002-09-18 2004-11-25 Liaoteng Wang Regulatory poly(A) polymerase and uses thereof

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102286481A (zh) * 2004-04-20 2011-12-21 辛根塔参与股份公司 用于在植物繁殖组织中表达基因产物的调控序列
CN101432427A (zh) * 2006-02-28 2009-05-13 三得利株式会社 来自酿造用酵母的有用蛋白质的鉴定方法
CN111321081A (zh) * 2012-12-06 2020-06-23 合成基因组股份有限公司 具有不易变化的高光适应表型的藻类突变体
WO2021136347A1 (zh) * 2019-12-30 2021-07-08 南京金斯瑞生物科技有限公司 一种哺乳动物表达系统使用的高表达载体
CN111733174A (zh) * 2020-08-07 2020-10-02 北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院） 一种分离的核酸分子及其用途

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Merchant,S.S.等.Accession:XM_001702604.2，Chlamydomonas reinhardtii uncharacterized protein (CHLRE_10g433750v5), mRNA.genbank.2021,FEATURES和ORIGIN部分. *
Sara L. Zimmer等.Genome-Based Analysis of Chlamydomonas reinhardtii Exoribonucleases and Poly(A) Polymerases Predicts Unexpected Organellar and Exosomal Features.Genetics.2008,第125-136页. *
Sarah L. Zimmer等.Polyadenylation in Arabidopsis and Chlamydomonas organelles: the input of nucleotidyltransferases, poly(A) polymerases and polynucleotide phosphorylase.The Plant Journal.2009,第88-99页. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114875010A (zh) 2022-08-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Yim et al. Isolation of fully synthetic promoters for high‐level gene expression in Corynebacterium glutamicum
CN110408635B (zh) 一种含有链霉亲和素元件的核酸构建物在蛋白质表达、纯化中的应用
KR102345759B1 (ko) 뉴클레아제 시스템의 녹-아웃에 의한 시험관 내 생합성 활성을 조절하기 위한 방법
CN113667685B (zh) 信号肽相关序列及其在蛋白质合成中的应用
KR100975153B1 (ko) Pdi를 융합파트너로 이용한 수용성 및 활성형 재조합단백질의 제조방법
CN110643622A (zh) 一种褐藻胶裂解酶基因及其应用
KR101985345B1 (ko) 질산환원효소 유래 서열을 포함하는 미세조류 형질전환용 재조합 벡터 및 이의 용도
CN114107353A (zh) 一种高效表达多肽毒素的质粒及其制备方法与应用
CN114875010B (zh) 一种提升蛋白翻译效率的基因及其编码产物与应用
CN111117942B (zh) 一种产林可霉素的基因工程菌及其构建方法和应用
CN108034642B (zh) 葡萄糖氧化酶CnGOD19及其改良酶、基因和应用
MXPA04004934A (es) Metodo mejorado para la produccion recombinante de proteinas.
KR100427587B1 (ko) 신규 ｄ-글루탐산 합성효소 유전자 ｄｎａ 및 이를 이용한 항생제 비의존성 벡터
CN110234761B (zh) 二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体、和利用了该变异体的烯烃化合物的制造方法
CN102277327B (zh) 过表达RimL的大肠杆菌及其在制备N-乙酰化胸腺素α中的应用
CN116926103B (zh) 一种高产麦角硫因的圆红冬孢酵母工程菌的构建方法及其应用
CN114164223B (zh) 一种南极土壤来源的酯酶及其编码基因与应用
CN114517197B (zh) 大肠杆菌sRNA120、DNA分子、重组载体及在调控细菌耐药能力方面的应用
CN111073894B (zh) 菲律宾蛤仔ape基因片段、编码蛋白、制备方法及用途
JPWO2004031243A1 (ja) タンパク質ポリマー及びその製造方法
CN106220718B (zh) 一种草菇热激蛋白VvHSP60及其应用
CN115873852A (zh) 重组核酸序列、基因工程菌及生产1,5-戊二胺的方法
CN117757813A (zh) 一种指状青霉转录因子pdidsm_85260及其应用
KR20220065616A (ko) 자가분해능이 저하된 켁신 효소 및 이의 생산 방법
CN115873880A (zh) 重组核酸序列、重组表达载体以及基因工程菌

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant