CN114164223B

CN114164223B - 一种南极土壤来源的酯酶及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN114164223B
Application number: CN202210044312.7A
Authority: CN
Inventors: 周明扬; 刘晓雨; 楚天歌; 曹炜彤; 孙诗泽
Original assignee: Qilu University of Technology
Current assignee: Qilu University of Technology
Priority date: 2022-01-14
Filing date: 2022-01-14
Publication date: 2023-05-23
Anticipated expiration: 2042-01-14
Also published as: CN114164223A

Abstract

本发明提供一种南极土壤来源的酯酶及其编码基因与应用，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明从南极乔治王岛土壤中分离获得一株产酯酶菌株Pseudomonas sp.Soil2，确定了其基因组中编码酯酶的基因片段Est‑soil2，以及Est‑soil2的核酸序列，并成功克隆了码南极土壤来源酯酶Est‑soil2的基因，构建了含南极土壤来源酯酶基因Est‑soil2的表达载体以及含有该表达载体的大肠杆菌重组细胞。该酯酶属于冷适应性酯酶，在10～30℃范围内有很好的催化性能，在0℃时仍有活性，同时能耐受pH6～10的酸碱性，在强碱性和弱酸性条件下活性极强，因此在不耐高温的化学品合成过程中有应用潜力。

Description

一种南极土壤来源的酯酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体涉及一种南极土壤来源的酯酶及其编码基因与应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

酯酶(esterase)可以催化酯键的水解和合成，作用底物广泛。具有冷适应性的酯酶可以应用于反应条件严苛的生产过程，一些酯酶具有良好的区域选择性和立体选择性，能够作为催化合成光学纯化合物的潜在生物催化剂。而且酯酶发挥催化作用不需要额外的辅助因子，对一些有机试剂有一定的耐受，可以广泛作用于多种底物，已经成为多种化学过程和工业生产中应用广泛的一类生物催化剂。酯酶在自然界中广泛存在，其中，以微生物来源的酯酶数目最大，应用最广。在之前报道过的微生物来源的酯酶中，大部分的作用条件都比较温和，不适应于工业化生产，只有一小部分可以应用于工业生产领域中。因而，新型酯酶的发掘成为开发工业酶制剂亟待解决的问题。

在各种极端条件下也有微生物的存在，这些微生物在极端环境中的生存和繁殖的能力是各种生理适应和酶分子进化的结果。因而，极端条件下的微生物迫于生存压力，可能会进化出多种极端适应性的酶类。极端条件下的微生物资源，也成为蕴含新型酯酶的宝库。

南极洲全洲平均气温可达到-25℃，常年寒冷，南极地区的土壤是就是在这样恶劣的条件下形成的。特殊的气候条件导致南极几乎没有大型植物生长，微生物在土壤生态系统中占据着绝对的优势地位。南极微生物资源成了极端条件适应性酯酶的资源宝库，为开展新型酯酶的发掘提供了很好的样品来源。

南极极端严寒的环境条件，可能造就了一些具有冷适应性的酯酶。冷适应性酯酶可以更好地催化不耐热化合物，同时，可以避免反应混合物加热和热不稳定化合物失活时的能量损失。具有新型性能的适冷性酯酶具有更加广阔的应用前景，冷适应酯酶被应用于低温工业反应中。总的来说，冷适应性酯酶在生物技术应用中是很有前途的资源。

发明内容

为了克服上述技术问题，本发明提供一种南极土壤来源的酯酶及其编码基因与应用。本发明从南极乔治王岛土壤中分离获得一株产酯酶菌株Pseudomonas sp.Soil2，通过对该菌株进行全基因组测序，确定了其基因组中编码酯酶的基因片段Est-soil2，以及Est-soil2的核酸序列，并成功克隆了码南极土壤来源酯酶Est-soil2的基因，构建了含南极土壤来源酯酶基因Est-soil2的表达载体以及含有该表达载体的大肠杆菌重组细胞。该酯酶属于冷适应性酯酶，在10～30℃范围内有很好的催化性能，在0℃时仍有活性，同时能耐受pH6～10的酸碱性，在强碱性和弱酸性条件下活性极强，因此在不耐高温的化学品合成过程中有应用潜力。

为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明的第一个方面，提供一种酯酶编码基因，所述编码基因具有(a1)-(a3)中任一所述核苷酸序列：

(a1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

(a2)与(a1)互补的核苷酸序列；

(a3)与(a1)或(a2)所示的核苷酸序列具有≥90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(完全)序列)一致性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

本发明的第二个方面，提供一种酯酶，其氨基酸序列为如下(b1)-(b3)中任一项：

(b1)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b2)将(b1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同生物活性的由其衍生的蛋白质；

(b3)其它基因编码的与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成具有相似性达到50％以上并且具有SEQ ID NO.2所示的蛋白的活性的蛋白；

上述(b2)中，所述“一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加”为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述(b1)-(b3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

本发明通过研究发现，该酯酶对短链酯类(如碳链长度在6～8个碳原子的短链酯类)表现出较高的降解活性，其最适pH值为9，且在pH6～10的范围内稳定存在，可以耐受的pH值范围较广。同时其最适温度为30℃，且在10～30℃范围内有很好的催化性能，在0℃时仍有活性，其为冷适应性酯酶，能在低温条件下发挥催化作用。

本发明的第三个方面，基于上述酶编码基因所设计的扩增引物、含有上述酶编码基因的重组表达载体和/或含有上述酶编码基因的宿主亦在本发明的保护范围之内。

本发明的第四个方面，提供上述酯酶在水解制备酯类及其衍生物中的应用。

上述一个或多个技术方案的有益技术效果在于：

1、上述技术方案提供的南极土壤来源酯酶在较低温度下仍然保持了较好的酶活性，属于冷适应性酯酶，在不耐高温的化学品合成过程中有应用潜力。

2、上述技术方案提供的南极土壤来源酯酶Est-soil2能耐受pH6～10的酸碱性，在强碱性和弱酸性条件下活性极强，可耐受pH值范围较广，从而有效拓宽其应用领域，因此具有良好的实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例2中电泳图，M为蛋白质分子量标记(marker)；

其中，(A)经过麦芽糖亲和层析纯化后，结合有MBP标签的酯酶Est-soil2电泳图(B)经由Factor Xa蛋白酶切除MBP标签，并经亲和层析纯化的纯酶Est-soil2电泳图；

图2为本发明实施例3中酯酶Est-soil2的降解底物活性分析柱状图；

图3为本发明实施例3中酯酶Est-soil2的酶活温度曲线，其中：(A)温度对酶活性的影响(B)温度对酶稳定性的影响；

图4为本发明实施例3中酯酶Est-soil2的酶活性pH曲线；

图5为本发明实施例3中金属离子对酯酶Est-soil2的酶活力影响柱状图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

如前所述，具有新型性能的适冷性酯酶具有更加广阔的应用前景，冷适应酯酶被应用于低温工业反应中。总的来说，冷适应性酯酶在生物技术应用中是很有前途的资源。

有鉴于此，本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种酯酶编码基因，所述编码基因具有(a1)-(a3)中任一所述核苷酸序列：

(a1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

(a2)与(a1)互补的核苷酸序列；

SEQ ID NO.1由1017个核苷酸组成，其中第1-1014为编码序列，第1015-1017位核苷酸转录为终止密码子终止肽链合成。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种酯酶，其氨基酸序列为如下(b1)-(b3)中任一项：

(b1)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

本发明的又一具体实施方式中，基于上述酶编码基因所设计的扩增引物、含有上述酶编码基因的重组表达载体和/或含有上述酶编码基因的宿主亦在本发明的保护范围之内。

本发明的又一具体实施方式中，所述扩增引物包括SEQ ID NO.3-4所示序列。

本发明的又一具体实施方式中，所述重组表达载体是通过将上述编码基因有效的连接到表达载体上获得，所述表达载体为病毒载体、质粒、噬菌体、噬菌粒、黏粒、F黏粒、噬菌体或人工染色体中的任意一种或多种；病毒载体可包括腺病毒载体、逆转录病毒载体或腺伴随病毒载体，人工染色体包括细菌人工染色体(BAC)、噬菌体P1衍生的载体(PAC)、酵母人工染色体(YAC)或哺乳动物人工染色体(MAC)；进一步优选为细菌质粒；更进一步优选为pMAL-c2x质粒。

本发明的又一具体实施方式中，所述宿主包括但不限于细菌、真菌和真核细胞，进一步选自埃希氏大肠杆菌、芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、里氏木霉和草酸青霉；更进一步优选为大肠杆菌。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述酯酶在水解制备酯类及其衍生物中的应用。

所述酯类优选为短链酯类，所述短链酯类具体为碳链长度为6～8个碳原子的酯类化合物。

上述应用可以在低温环境中进行，所述低温环境可以为不高于30℃，如0-30℃，进一步为10-30℃；同时，上述应用在酸性(如弱酸性)和碱性(如强碱性)环境中均可进行，优选pH为6-10。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

培养基：

LB液体培养基：1wt％蛋白胨，0.5wt％酵母粉，1wt％NaCl，蒸馏水配制。

LB固体培养基：1wt％蛋白胨，0.5wt％酵母粉，1wt％NaCl，1.5wt％琼脂，蒸馏水配制。

实施例1：南极土壤来源酯酶编码基因序列的获取及其序列分析

菌种来源：P.sp.Soil2菌株分离自南极乔治王岛土壤(62°11'17.5"S，58°55'23.4"W)。

具体步骤如下：

1.1酯类水解酶基因序列的确定

根据Pseudomonas sp.Soil2菌株全基因组测序及基因注释分析的结果，从P.sp.Soil2菌株基因组中寻找标记为酯酶或者脂肪酶的基因片段。并用Esther及NCBI数据库中的Blast功能对这些基因片段进行序列相似度分析，进一步筛选得到编码酯酶的基因片段Est-soil2。基因Est-soil2共1017bp，其中含有一个1017bp的开放阅读框架，其编码南极土壤来源酯酶Est-soil2，起始密码子位于1bp，终止密码子位于1017bp，共编码338个氨基酸的蛋白。获得的南极土壤酯酶Est-soil2编码基因Est-soil2的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。南极土壤来源酯酶Est-soil2前体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

1.2南极土壤来源酯酶的序列分析

GenBank中，与南极土壤酯酶Est-soil2最相似的序列为来源于Pseudomonascarnis的水解酶(WP_198861816.1)，序列相似性为90％。

实施例2：Est-soil2酯酶的克隆、异源表达及分离纯化

2.1利用PCR对基因序列进行扩增

(1)根据基因Est-soil2序列设计两条特异性引物：

2-MalF：

CAACCTCGGGATCGAGGGAAGGATGACCCCTTCTCCCGACCGCT(SEQ ID NO.3)；

2-MalR：

ACGACGGCCAGTGCCAAGCTTTTACTGACCCGAAGCGGGCGAT(SEQ ID NO.4)；

引物由济南铂尚生物技术有限公司合成。

(2)以2-MalF和2-MalR为引物，P.sp.Soil2菌株的全基因组为模板，用FastPfuDNA聚合酶(购自Transgen公司)扩增目的基因片段；

PCR反应条件为：95℃预变性2min；然后95℃变性20sec，69℃退火20sec，72℃延伸1min，30个循环后；72℃延伸10min。

(3)对PCR扩增产物进行1wt％琼脂糖凝胶电泳，结果表明获得一条约1,100bp的DNA片段。然后用Omega公司的DNA回收试剂盒按照其说明回收扩增DNA片段。

(4)使用无缝克隆试剂盒(购自近岸蛋白质科技有限公司)将回收的Est-soil2基因片段连接到pMAL-c2x载体上。

(5)按《分子克隆实验指南》上制备大肠杆菌感受态的方法制备大肠杆菌DH5α感受态。

(6)按《分子克隆实验指南》上的热激转化方法将连接好的重组pMAL-c2x载体转至大肠杆菌DH5α感受态。

(7)转化的大肠杆菌DH5α涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基，37℃过夜培养。挑选阳性克隆子，转接至LB液体培养基中培养，提取质粒。

上述LB固体培养基组分如下：

1wt％蛋白胨，0.5wt％酵母粉，1wt％NaCl，1.5wt％琼脂，蒸馏水配制。

上述LB液体培养基组分如下：

1wt％蛋白胨，0.5wt％酵母粉，1wt％NaCl，蒸馏水配制。

2.2重组表达载体pMAL-c2x-Est-soil2转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。

(1)按《分子克隆实验指南》上制备大肠杆菌感受态的方法制备大肠杆菌BL21感受态；

(2)按《分子克隆实验指南》上的热激转化方法将测序正确的重组载体pMAL-c2x-Est-soil2转至大肠杆菌BL21感受态；

(3)将转化的大肠杆菌BL21涂于含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃过夜培养。

2.3基因在大肠杆菌中诱导表达与纯化

(1)在平板上刮取菌苔，接于100ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养2～3h；

(2)按1％(v/v)接种量转接到50ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37℃、180rpm下培养，至600nm下OD值为0.6～0.8，加入IPTG至终浓度0.05～0.1mM，继续在17℃、120rpm下培养48h；

(3)收集经过IPTG诱导的LB培养液，在12000rpm、4℃下离心3min，收集菌体；

(4)加入一定体积含200mM NaCl及1mM EDTA的20mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)重悬菌体；

(5)将重悬的菌液超声破碎；

(6)将破碎后的菌液12000rpm、4℃下离心30min，收集上清；再将上清液于12000rpm、4℃下离心20min，收集上清；

(7)将上清用22μm滤膜过滤，上样于Amylose树脂(Biolabs)，按照说明书要求进行亲和层析；

(8)层析后收集的样品用SDS-PAGE检测纯度，证明已经获得携带pMAL-c2x载体上MBP结合蛋白的酯酶Est-soil2的电泳纯酶。通过透析除去残留的麦芽糖。

(9)利用Factor Xa蛋白酶对酯酶携带的MBP融合蛋白进行切除，并进一步通过Amylose树脂亲和层析，除去MBP标签的杂蛋白，得到Est-soil的单一组分。用SDS-PAGE检测纯度，最后置于-20℃保存备用。

实施例3：南极酯酶Est-soil2的性质测定

3.1底物特异性分析

用异丙醇配制不同碳链长度的pNP酯底物C2、C4、C8、C10、C12、C16(购自Sigma公司)。

标准反应为：

20μl 10mM底物与960μl 50mM Tris-HCl(pH 8.0)于30℃下预热3min，加入酶液20μl，并于30℃下反应，10min后加入100μl20wt％SDS(十二烷基硫酸钠)终止反应，测定405nm下的OD值，以不加酶液的反应作为空白对照。标准曲线以不同浓度的pNP(购自Sigma公司)来绘制。

酶活力定义为，在一定温度下，每分钟催化pNP酯底物水解产生1μM pNP所需的酶量为一个酶活力单位(U)。结果表明，酯酶Est-soil能高效降解短链的pNP酯底物(C6、C8)，其中对C8底物的降解能力最强，相反，对于长链酯底物(C12、C16)降解能力差。

3.2最适温度及温度稳定性分析

最适反应温度的测定：以C8为底物，在50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液中，分别检测南极酯酶在0℃、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃下的酶活。最高酶活定义为100％。

结果表明该酶的最适酶活温度为30℃，其在10～30℃保留超过50％的高活力，并且在0℃时，仍有20％的酶活力(如图3A)。

温度稳定性分析：酶液在20℃、30℃、40℃温育，2小时内每隔15min取出相同酶量检测南极酯酶Est-soil2在30℃、50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液中的残余活力。将0℃时的酶活定义为100％。

结果表明，在20℃低温温育2h后，仍保留40％以上的酶活力(如图3B)。

3.3最适pH

pNPC8底物在碱性条件下不稳定，酶反应完成后向反应体系中加入等体积的含2wt％SDS的2M Tris-HCl(pH 7.0)终止液以去除pH对反应的影响。

最适反应pH的测定：配制pH值在4.0～11.0范围内、间隔1个pH单位的Britton-Robinson缓冲液。测定南极酯酶Est-soil2在30℃、不同pH条件下的酶活，最高酶活定义为100％。

结果表明酯酶Est-soil2是碱性酯酶，其最适pH为9.0，在pH6-10的范围内基本稳定(如图4)。

3.4金属离子对酶活性的影响

以C8为底物，30℃下，在50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液中，分别检测南极土壤来源酯酶在10mM的Zn²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、Cu²⁺、K⁺、Ba²⁺、Ni²⁺、Li²⁺、Mg²⁺、Co²⁺、Fe²⁺存在条件下的酶活。最高酶活定义为100％。

结果表明，K⁺在1mM和10mM两种浓度对酯酶Est-soil2都有微弱的促进作用，使其酶活有一定程度的提高。Mn²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺对酶活性有明显的抑制作用。

4.结果

通过对P.sp.Soil2菌株全基因组测序及基因注释结果的分析，从P.sp.Soil2菌株基因组中确定了编码酯酶的基因Est-soil2，并确定了其核酸序列及编码蛋白序列。根据Est-soil2基因序列设计特异性引物，利用PCR技术从P.sp.Soil2菌株的全基因组中克隆了编码南极土壤来源酯酶Est-soil2的基因片段，构建了含南极土壤来源酯酶基因Est-soil2的表达载体以及含有该表达载体的大肠杆菌重组细胞。基因Est-soil2含有一个1017bp的开放阅读框架，其编码新型酯酶Est-soil2，起始密码子位于1bp，终止密码子位于1017bp，共编码338个氨基酸的前体蛋白。将基因Est-soil2在大肠杆菌中进行异源表达和纯化，获得成熟有活性的酯酶Est-soil2。

对纯化的酯酶Est-soil2进行性质测定。结果表明该酶对碳链长度在6～8个碳原子的短链酯类表现出较强的降解活性(图2)。其在10～30℃范围内保持很高的酶活力，且能在20℃条件下稳定存在(图3)。最适pH为9.0，且在pH6.0～10.0范围内稳定存在(图4)。酶活力受到K⁺的微弱促进，以及Mn²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺等的明显抑制(图5)。

最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

SEQUENCE LISTING

<110> 齐鲁工业大学

<120> 一种南极土壤来源的酯酶及其编码基因与应用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1017

<212> DNA

<213> 酯酶编码基因

<400> 1

atgacccctt ctcccgaccg cttcacccca gccttcggcc tcggcaaccc gcacctgcaa 60

acgttgtggg ggccgctgtg gcgcccgact actcatatcg aacgtcagcg tgaacggctg 120

tggctagaag acggcgattt tctcgacctc gactggcacg gcccgcacga tccgcacgcg 180

ccgttggtgt tggtactgca cgggctgacc ggctcttcca actcgcccta cgtggcaggc 240

ctgcaaaaag ccctggcgtc ccaaggatgg gctagcgtgg cgctgaattg gcgcggctgt 300

tccggcgagc ccaatctgtt ggcccgcagt taccattccg gtgccagcga agatttggcc 360

gccgccatta cgcacctgcg aagcaagcgc ccgttagcac cgttgtatgc agtgggctat 420

tccctgggcg gcaacgtgct gctcaagtat ttgggagaaa ccggtgaaga ctccggcctg 480

caaggcgcgg cggcggtatc ggtgccgttt cgcctggatc agtgcgcaga ccgcattggc 540

ctgggattct ctcgtgtgta ccaaaagcat ttcatgcgcg agatgctggc ttacatccgc 600

gtcaaggagc gccagtttct ccaggatggc cgtgaagaag gactgaaagc catcgccgcc 660

ctcggctcac tggaaaaaat gcgcaccttc tgggacttcg acggccgggt cactgcgcca 720

ctgcatggtt acctgagcgc cgaggattat taccgtcggg cctccagccg gtatttcctg 780

ggcgcggtcc gcacgccgac cctgattatc caggccgccg acgatccctt cgtattcgcc 840

cacagccttc ccgaggccag cgaactgtcg gcttgcaccg agttcgagtt gctggccaag 900

ggcggccatg tcgggtttgt cgatggcacg ctgaagcggc cggggtacta cctggagcgg 960

cggattccgg cctggttgct cagtcacccg tcgcaatcgc ccgcttcggg tcagtaa 1017

<210> 2

<211> 338

<212> PRT

<213> 酯酶

<400> 2

Met Thr Pro Ser Pro Asp Arg Phe Thr Pro Ala Phe Gly Leu Gly Asn

1 5 10 15

Pro His Leu Gln Thr Leu Trp Gly Pro Leu Trp Arg Pro Thr Thr His

20 25 30

Ile Glu Arg Gln Arg Glu Arg Leu Trp Leu Glu Asp Gly Asp Phe Leu

35 40 45

Asp Leu Asp Trp His Gly Pro His Asp Pro His Ala Pro Leu Val Leu

50 55 60

Val Leu His Gly Leu Thr Gly Ser Ser Asn Ser Pro Tyr Val Ala Gly

65 70 75 80

Leu Gln Lys Ala Leu Ala Ser Gln Gly Trp Ala Ser Val Ala Leu Asn

85 90 95

Trp Arg Gly Cys Ser Gly Glu Pro Asn Leu Leu Ala Arg Ser Tyr His

100 105 110

Ser Gly Ala Ser Glu Asp Leu Ala Ala Ala Ile Thr His Leu Arg Ser

115 120 125

Lys Arg Pro Leu Ala Pro Leu Tyr Ala Val Gly Tyr Ser Leu Gly Gly

130 135 140

Asn Val Leu Leu Lys Tyr Leu Gly Glu Thr Gly Glu Asp Ser Gly Leu

145 150 155 160

Gln Gly Ala Ala Ala Val Ser Val Pro Phe Arg Leu Asp Gln Cys Ala

165 170 175

Asp Arg Ile Gly Leu Gly Phe Ser Arg Val Tyr Gln Lys His Phe Met

180 185 190

Arg Glu Met Leu Ala Tyr Ile Arg Val Lys Glu Arg Gln Phe Leu Gln

195 200 205

Asp Gly Arg Glu Glu Gly Leu Lys Ala Ile Ala Ala Leu Gly Ser Leu

210 215 220

Glu Lys Met Arg Thr Phe Trp Asp Phe Asp Gly Arg Val Thr Ala Pro

225 230 235 240

Leu His Gly Tyr Leu Ser Ala Glu Asp Tyr Tyr Arg Arg Ala Ser Ser

245 250 255

Arg Tyr Phe Leu Gly Ala Val Arg Thr Pro Thr Leu Ile Ile Gln Ala

260 265 270

Ala Asp Asp Pro Phe Val Phe Ala His Ser Leu Pro Glu Ala Ser Glu

275 280 285

Leu Ser Ala Cys Thr Glu Phe Glu Leu Leu Ala Lys Gly Gly His Val

290 295 300

Gly Phe Val Asp Gly Thr Leu Lys Arg Pro Gly Tyr Tyr Leu Glu Arg

305 310 315 320

Arg Ile Pro Ala Trp Leu Leu Ser His Pro Ser Gln Ser Pro Ala Ser

325 330 335

Gly Gln

<210> 3

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

caacctcggg atcgagggaa ggatgacccc ttctcccgac cgct 44

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

acgacggcca gtgccaagct tttactgacc cgaagcgggc gat 43

Claims

1.一种酯酶在水解制备酯类中的应用，其特征在于，所述酯类为短链酯类，所述短链酯类为碳链长度为6～8个碳原子的酯类化合物；所述应用在低温、酸性或碱性环境中进行；

所述酯酶为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述酸性环境包括弱酸性。

3.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述碱性环境包括强碱性。

4.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述低温环境为不高于30℃。

5.如权利要求4所述应用，其特征在于，所述低温环境包括0-30℃。

6.如权利要求5所述应用，其特征在于，所述低温环境为10-30℃。

7.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述应用在pH为6-10环境中进行。

8.如权利要求1所述应用，其特征在于，编码所述酯酶的基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

9.如权利要求8所述应用，其特征在于，基于所述编码所述酯酶的基因所设计的扩增引物。

10.如权利要求9所述应用，其特征在于，所述扩增引物包括SEQ ID NO.3-4所示序列。

11.如权利要求8所述应用，其特征在于，含有所述编码所述酯酶的基因的重组表达载体。

12.如权利要求11所述应用，其特征在于，所述重组表达载体是通过将权利要求8所述编码所述酯酶的基因有效的连接到表达载体上获得。

13.如权利要求12所述应用，其特征在于，所述表达载体为病毒载体、质粒、噬菌体、黏粒或人工染色体中的任意一种或多种。

14.如权利要求13所述应用，其特征在于，所述病毒载体包括腺病毒载体、逆转录病毒载体或腺伴随病毒载体。

15.如权利要求13所述应用，其特征在于，所述人工染色体包括细菌人工染色体、噬菌体P1衍生的载体、酵母人工染色体或哺乳动物人工染色体。

16.如权利要求13所述应用，其特征在于，所述表达载体为细菌质粒。

17.如权利要求16所述应用，其特征在于，所述表达载体为pMAL-c2x质粒。

18.如权利要求8所述应用，其特征在于，含有所述编码所述酯酶的基因的宿主。

19.如权利要求18所述应用，其特征在于，所述宿主包括细菌、真菌和真核细胞。

20.如权利要求19所述应用，其特征在于，所述宿主选自埃希氏大肠杆菌、芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、里氏木霉和草酸青霉。

21.如权利要求20所述应用，其特征在于，所述宿主为大肠杆菌。