CN116121223B - 具有聚酯降解活性的酯酶突变体及其应用 - Google Patents
具有聚酯降解活性的酯酶突变体及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116121223B CN116121223B CN202310168094.2A CN202310168094A CN116121223B CN 116121223 B CN116121223 B CN 116121223B CN 202310168094 A CN202310168094 A CN 202310168094A CN 116121223 B CN116121223 B CN 116121223B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- esterase
- mutated
- seq
- amino acid
- acid sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 title claims abstract description 57
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 title claims abstract description 45
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 26
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 title abstract description 18
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 title abstract description 18
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims abstract description 144
- 101000796806 Aspergillus parasiticus (strain ATCC 56775 / NRRL 5862 / SRRC 143 / SU-1) Versiconal hemiacetal acetate esterase Proteins 0.000 claims abstract description 132
- 101001094647 Homo sapiens Serum paraoxonase/arylesterase 1 Proteins 0.000 claims abstract description 132
- 101001052533 Piromyces equi Feruloyl esterase B Proteins 0.000 claims abstract description 132
- 102100035476 Serum paraoxonase/arylesterase 1 Human genes 0.000 claims abstract description 132
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 120
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 claims abstract description 94
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims abstract description 52
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims abstract description 52
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims abstract description 47
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 47
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims abstract description 47
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 47
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims abstract description 47
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims abstract description 37
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 31
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims abstract description 31
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims abstract description 31
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 29
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 29
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims abstract description 29
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 claims abstract description 28
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 28
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims abstract description 28
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 28
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 claims abstract description 25
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims abstract description 22
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 22
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 8
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 32
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 30
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 29
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 27
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 24
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims description 24
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 claims description 18
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 3
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 claims description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 abstract description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 7
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 abstract description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 16
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 9
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 8
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 7
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101710094503 Metallothionein-1 Proteins 0.000 description 6
- 101710082270 Metallothionein-like protein 1 Proteins 0.000 description 6
- ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N ammonium persulfate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 102100040428 Chitobiosyldiphosphodolichol beta-mannosyltransferase Human genes 0.000 description 5
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 5
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 5
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 229910001870 ammonium persulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 2
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- CIJQGPVMMRXSQW-UHFFFAOYSA-M sodium;2-aminoacetic acid;hydroxide Chemical compound O.[Na+].NCC([O-])=O CIJQGPVMMRXSQW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 2
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241001575835 Ideonella sakaiensis Species 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000007797 corrosion Effects 0.000 description 1
- 238000005260 corrosion Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000000383 hazardous chemical Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- HOVAGTYPODGVJG-UHFFFAOYSA-N methyl beta-galactoside Natural products COC1OC(CO)C(O)C(O)C1O HOVAGTYPODGVJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000013502 plastic waste Substances 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000004080 punching Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B09—DISPOSAL OF SOLID WASTE; RECLAMATION OF CONTAMINATED SOIL
- B09B—DISPOSAL OF SOLID WASTE NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- B09B3/00—Destroying solid waste or transforming solid waste into something useful or harmless
- B09B3/60—Biochemical treatment, e.g. by using enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B09—DISPOSAL OF SOLID WASTE; RECLAMATION OF CONTAMINATED SOIL
- B09B—DISPOSAL OF SOLID WASTE NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- B09B2101/00—Type of solid waste
- B09B2101/75—Plastic waste
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02W—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES RELATED TO WASTEWATER TREATMENT OR WASTE MANAGEMENT
- Y02W30/00—Technologies for solid waste management
- Y02W30/50—Reuse, recycling or recovery technologies
- Y02W30/62—Plastics recycling; Rubber recycling
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Environmental & Geological Engineering (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了具有聚酯降解活性的酯酶突变体及其应用，酯酶突变体为下列之一：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第177位的谷氨酸突变为谷氨酰胺；或第178位的天冬酰胺突变为丙氨酸；或第180位的丝氨酸突变为苏氨酸、亮氨酸、缬氨酸；或第181位的异亮氨酸突变为缬氨酸等；实验表明，本发明的酯酶突变体基因表达的蛋白能够正确折叠，在大肠杆菌系统能够大量纯化。同时本发明的酯酶突变体具有降解聚酯的功能，酯酶突变体基因表达的蛋白的热稳定性及催化效率与野生型酯酶相比显著增加。本发明的酯酶突变体在pH为4‑11范围内均具有降解聚酯的活性。本发明的酯酶突变体在37‑70℃具有活性且稳定。
Description
技术领域
本发明属于蛋白的基因工程领域，具体的涉及具有聚酯降解活性的酯酶突变体及其应用。
背景技术
聚酯塑料在现代社会中发挥着重要作用，广泛应用于包装、建筑、纺织、运输、电子设备以及工业机械等方面，极大地改变了人类的生活方式。它具有重量轻、绝缘性好、强度和透明度高、热性能高、耐化学腐蚀等优良性能。随着聚酯塑料产品的大量使用和消费，越来越多的塑料废品在环境中积累，已经对全球的生态环境造成了严重的破坏，给人类健康也带来了严重威胁。
生物法是近年来兴起的一种新型聚酯塑料降解回收技术，通过生物实体(如微生物，即细菌、真菌和海洋微藻)或酶的作用分解这类有机物质。生物法的优点包括温和的工艺条件、相对较低的能量输入、不需要危险化学试剂和昂贵的机械，使其成为一个非常有前景的选择。近期，科学家报道了一种新型的可以水解聚酯的酯酶。与其它聚酯水解酶相比，该酯酶可以在常温(30℃)发挥降解功能；该酯酶能够降解商业化的高结晶度塑料瓶。但由于催化效率和热稳定性等方面存在明显不足，导致目前无法实现工业应用。
发明内容
本发明的第一个目的是克服现有技术的不足，提供具有聚酯降解活性的酯酶突变体。
本发明的第二个目的是提供具有聚酯降解活性的酯酶突变体的编码基因的重组质粒。
本发明的第三个目的是提供含有上述重组质粒的重组菌株。
本发明的第四个目的是提供具有聚酯降解活性的酯酶突变体在水解聚酯中的应用。
本发明的技术方案概述如下：
具有聚酯降解活性的酯酶突变体，所述酯酶突变体为下列之一：
MT-1：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第177位的谷氨酸突变为谷氨酰胺；
MT-2：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第178位的天冬酰胺突变为丙氨酸；
MT-3：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第180位的丝氨酸突变为苏氨酸；
MT-4：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第180位的丝氨酸突变为亮氨酸；
MT-5：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第180位的丝氨酸突变为缬氨酸；
MT-6：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第181位的异亮氨酸突变为缬氨酸；
MT-7：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第208位的甘氨酸突变为丙氨酸；
MT-8：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第209位的丝氨酸突变为苏氨酸；
MT-9：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第211位的丝氨酸突变为酪氨酸；
MT-10：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第177位的谷氨酸突变为谷氨酰胺且第180位的丝氨酸突变为亮氨酸；
MT-11：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第177位的谷氨酸突变为谷氨酰胺且第181位的异亮氨酸突变为缬氨酸；
MT-12：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第177位的谷氨酸突变为谷氨酰胺且第208位的甘氨酸突变为丙氨酸；
MT-13：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第178位的天冬酰胺突变为丙氨酸且第177位的谷氨酸突变为谷氨酰胺；
MT-14：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第178位的天冬酰胺突变为丙氨酸且第180位的丝氨酸突变为亮氨酸；
MT-15：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第178位的天冬酰胺突变为丙氨酸且第181位的异亮氨酸突变为缬氨酸；
MT-16：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第178位的天冬酰胺突变为丙氨酸且第208位的甘氨酸突变为丙氨酸；
MT-17：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第178位的天冬酰胺突变为丙氨酸且第209位的丝氨酸突变为苏氨酸；
MT-18：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第180位的丝氨酸突变为苏氨酸且第177位的谷氨酸突变为谷氨酰胺；
MT-19：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第180位的丝氨酸突变为苏氨酸且第178位的天冬酰胺突变为丙氨酸；
MT-20：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第180位的丝氨酸突变为苏氨酸且第181位的异亮氨酸突变为缬氨酸；
MT-21：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第180位的丝氨酸突变为苏氨酸且第208位的甘氨酸突变为丙氨酸；
MT-22：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第180位的丝氨酸突变为苏氨酸且第209位的丝氨酸突变为苏氨酸；
MT-23：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第180位的丝氨酸突变为苏氨酸且第211位的丝氨酸突变为酪氨酸；
MT-24：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第180位的丝氨酸突变为亮氨酸且第181位的异亮氨酸突变为缬氨酸；
MT-25：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第180位的丝氨酸突变为亮氨酸且第208位的甘氨酸突变为丙氨酸；
MT-26：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第180位的丝氨酸突变为缬氨酸且第177位的谷氨酸突变为谷氨酰胺；
MT-27：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第180位的丝氨酸突变为缬氨酸且第178位的天冬酰胺突变为丙氨酸；
MT-28：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第180位的丝氨酸突变为缬氨酸且第181位的异亮氨酸突变为缬氨酸；
MT-29：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第180位的丝氨酸突变为缬氨酸且第208位的甘氨酸突变为丙氨酸；
MT-30：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第180位的丝氨酸突变为缬氨酸且第209位的丝氨酸突变为苏氨酸；
MT-31：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第181位的异亮氨酸突变为缬氨酸且第208位的甘氨酸突变为丙氨酸；
MT-32：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第209位的丝氨酸突变为苏氨酸且第177位的谷氨酸突变为谷氨酰胺；
MT-33：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第209位的丝氨酸突变为苏氨酸且第180位的丝氨酸突变为亮氨酸；
MT-34：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第209位的丝氨酸突变为苏氨酸且第181位的异亮氨酸突变为缬氨酸；
MT-35：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第209位的丝氨酸突变为苏氨酸且第208位的甘氨酸突变为丙氨酸；
MT-36：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第211位的丝氨酸突变为酪氨酸且第177位的谷氨酸突变为谷氨酰胺；
MT-37：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第211位的丝氨酸突变为酪氨酸且第178位的天冬酰胺突变为丙氨酸；
MT-38：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第211位的丝氨酸突变为酪氨酸且第180位的丝氨酸突变为亮氨酸；
MT-39：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第211位的丝氨酸突变为酪氨酸且第180位的丝氨酸突变为缬氨酸；
MT-40：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第211位的丝氨酸突变为酪氨酸且第181位的异亮氨酸突变为缬氨酸；
MT-41：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第211位的丝氨酸突变为酪氨酸且第208位的甘氨酸突变为丙氨酸；
MT-42：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第211位的丝氨酸突变为酪氨酸且第209位的丝氨酸突变为苏氨酸。
与SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列相比，酯酶突变体的氨基酸序列涉及到的突变位点包括权利要求1中氨基酸突变位点的至少三种。
上述具有聚酯降解活性的酯酶突变体的编码基因的重组质粒。
含有上述重组质粒的重组菌株。
上述具有聚酯降解活性的酯酶突变体在水解聚酯中的应用。
本发明的优点：
实验表明，本发明的具有聚酯降解活性的酯酶突变体基因表达的蛋白能够正确折叠，在大肠杆菌系统能够大量纯化。同时本发明的酯酶突变体具有降解聚酯的功能，酯酶突变体基因表达的蛋白的热稳定性及催化效率与野生型酯酶(SEQ ID NO.1)相比显著增加。本发明的酯酶突变体在pH为4-11范围内均具有降解聚酯的活性。本发明的酯酶突变体在37℃-70℃具有活性且稳定。具体地，在pH 9.0，温度为50℃时对聚酯的降解能力与野生型酯酶相比显著提高。
具体实施方式
野生型酯酶来源于大阪伊德氏杆菌：Ideonella sakaiensis 201-F6，其氨基酸序列检索号：UniProtKB:A0A0K8P6T7.1，经过大肠杆菌密码子优化后获得SEQ ID NO.2(WT)，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1，它为人工合成。
酯酶A是SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列第94位氨基酸由丝氨酸突变为谷氨酸、第159位氨基酸由天冬氨酸突变为组氨酸、第206位氨基酸由天冬酰胺突变为半胱氨酸、第215位氨基酸由丝氨酸突变为苏氨酸、第219位氨基酸由天冬酰胺突变为天冬氨酸、第255位氨基酸由天冬酰胺突变为半胱氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其核苷酸序列如SEQID NO.4所示。
表达载体pET-21b(+)为市售，大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)为市售。
实验材料：
(1)LB液体培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，加入双蒸水定容至1L，121℃、0.1MPa高压灭菌20分钟。
LB固体培养基:蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，琼脂粉15g，加入双蒸水定容至
1L，121℃、0.1MPa高压灭菌20分钟。
(2)异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)：在无菌环境下，10g IPTG粉末溶解于42mL灭菌的双蒸水，充分混匀。
(3)SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)，其12％ SDS-PAGE分离胶见表1，其SDS-PAGE浓缩胶见表2。
10％ APS(过硫酸铵)溶液：1g APS固体粉末，加入灭菌水至10mL使其充分溶解。
10％ SDS(十二烷基硫酸钠)溶液：1g SDS固体粉末，加入灭菌水至10mL使其充分溶解。
30％丙烯酰胺溶液(100mL)：将30g丙烯酰胺与0.8g的甲叉双丙烯酰胺加双蒸水定容至100mL。
1.5M Tris-HCl pH＝8.8缓冲液(1L)：称取181.71g Tris溶解在800mL纯水中，调pH至8.8，定容至1L。
0.5M Tris-HCl pH＝6.8缓冲液(500mL)：称取60.57g Tris溶解在400mL纯水中，调pH至6.8，定容至500mL。
表1 12％ SDS-PAGE分离胶
表2SDS-PAGE浓缩胶
(5)5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液(5L)：75.5g Tris，470g甘氨酸，25g SDS，加纯水溶解，定容至5L。
(6)pH 2.5磷酸盐缓冲液：配置0.02M NaH2PO4，用H3PO4调pH到2.5，最终定容至1L。
(7)终止液：75mL pH 2.5磷酸盐缓冲液，25mL甲醇。
下面结合实施例对本发明做进一步说明，以下所述，仅是本发明的部分较佳实施例，并非对本发明做其他形式的限制。凡是未脱离本发明的方案内容，依据本发明的技术实质对实施例所做的任何修改或等同变化，均在本发明的保护范围内。
实施例1
具有聚酯降解活性的酯酶突变体MT-1重组质粒的构建
以人工合成的酯酶A的核苷酸序列SEQ ID NO.4为模板，以MT-1-F为正向引物(SEQID NO.5)，以MT-1-R(SEQ ID NO.6)为反向引物，经过PCR，得到的含有突变体编码基因的序列，经无缝克隆酶连接重组，得到含有酯酶突变体MT-1基因的重组质粒。
具体步骤如下：
设计并通过基因合成获得酯酶A的核苷酸序列SEQ ID NO.4序列后，首先设计引物进行PCR，正向引物和反向引物分别命名为MT-1-F(SEQ ID NO.5)和MT-1-R(SEQ IDNO.6)，扩增目的基因，PCR体系如表3所示。
表3 PCR体系
PCR反应条件为：95℃预变性3min，95℃变性30s，50-60℃设置温度梯度进行退火30s，72℃延伸30s，设置33个循环，最后再延伸5min反应结束。在反应结束后，使用1％琼脂糖凝胶电泳进行电泳，然后使用胶回收试剂盒进行胶回收，得到PCR产物。
PCR产物中包含原始模板酯酶A质粒，为防止其在转化后形成假阳性转化子，必须在进行重组环化之前进行Dpn I消化，去除甲基化模板质粒，得到消化产物。Dpn 1消化体系如表4所示。
对于不连续多碱基定点突变，于冰上配制以下连接体系(如表5所示)：使用移液器轻轻吸打混匀(请勿振荡混匀)，短暂离心将反应液收集至管底。37℃，30min；降至4℃或立即置于冰上冷却。
表4 Dpn 1消化体系
表5连接体系
连接反应完成后，将20μL的连接产物加入到100μL的E.coli DH5α感受态中，冰上静置30min，接着，42℃水浴热激90s，之后快速插入冰中，静置5min，加入500μL LB液体培养基，37℃摇床复苏45min。将复苏后的菌体离心，3000rpm，4min，吸弃部分上清，留约100μL上清液将菌体轻柔混匀，使用涂布棒均匀涂布在含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上，放置在37℃培养箱中过夜培养。第二天挑取单菌落到含100μg/mL氨苄青霉素的5mL的LB液体培养基中，37℃摇床震荡培养10-12h。使用天根质粒小提试剂盒提取质粒，接着将提取的质粒进行双酶切验证，双酶切验证体系见表6，将该反应体系置于37℃水浴反应30min，反应完成后进行琼脂糖凝胶电泳，将酶切验证正确的质粒送测序公司进行测序验证。
表6双酶切验证体系
通过验证，得到具有聚酯降解活性的酯酶突变体MT-1重组质粒pET-21b-MT-1。
分别以人工合成的酯酶A的核苷酸序列SEQ ID NO.4为模板，以表7所示的对应的引物对为引物，按本实施例的方法，制备得到重组质粒：
pET-21b-MT-2，pET-21b-MT-3，pET-21b-MT-4，pET-21b-MT-5，pET-21b-MT-6，pET-21b-MT-7，pET-21b-MT-8，pET-21b-MT-9，pET-21b-MT-10，pET-21b-MT-11，pET-21b-MT-13，pET-21b-MT-14，pET-21b-MT-15，pET-21b-MT-18，pET-21b-MT-19，pET-21b-MT-20，pET-21b-MT-24，pET-21b-MT-26，pET-21b-MT-27，pET-21b-MT-28，pET-21b-MT-35，pET-21b-MT-41，pET-21b-MT-42。
表7酯酶突变体引物序列
实施例2
具有聚酯降解活性的酯酶突变体MT-12重组质粒的构建
以人工合成的酯酶A的核苷酸序列SEQ ID NO.4为模板，以MT-12-F1为正向引物(SEQ ID NO.7)，以MT-12-R2(SEQ ID NO.10)为反向引物，经过PCR，得到编码基因短片段，以MT-12-F2为正向引物(SEQ ID NO.9)，以MT-12-R1(SEQ ID NO.8)为反向引物，经过PCR，得编码基因长片段，将上述编码基因短片段和编码基因长片段经无缝克隆酶连接重组后，得到含有酯酶突变体MT-12基因的重组质粒。
具体步骤如下：
设计并通过基因合成获得酯酶A的核苷酸序列SEQ ID NO.4序列后，首先设计引物进行PCR，以MT-12-F1(SEQ ID NO.7)为正向引物，以MT-12-R2(SEQ ID NO.10)为反向引物，经过PCR，得到编码基因短片段，以MT-12-F2(SEQ ID NO.9)为正向引物以MT-12-R1(SEQ IDNO.8)为反向引物，经过PCR，得到编码基因长片段，PCR体系如表3所示：
PCR反应条件同实施例1中的PCR反应条件。
PCR产物中包含原始模板酯酶A质粒，为防止其在转化后形成假阳性转化子，必须在进行重组环化之前进行Dpn I消化，去除甲基化模板质粒，得到消化产物。Dpn 1消化体系如表4所示。
对于不连续多碱基定点突变，于冰上配制以下连接体系(如表8所示)：使用移液器轻轻吸打混匀(请勿振荡混匀)，短暂离心将反应液收集至管底。37℃，30min；降至4℃或立即置于冰上冷却。
表8连接体系
连接反应完成后，将20μL的连接产物加入到100μL的E.coli DH5α感受态中，冰上静置30min，接着，42℃水浴热激90s，之后快速插入冰中，静置5min，加入500μL LB液体培养基，37℃摇床复苏45min。将复苏后的菌体离心，3000rpm，4min，吸弃部分上清，留约100μL上清液将菌体轻柔混匀，使用涂布棒均匀涂布在含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上，放置在37℃培养箱中过夜培养。第二天挑取单菌落到含100μg/mL氨苄青霉素的5mL的LB液体培养基中，37℃摇床震荡培养10-12h。使用天根质粒小提试剂盒提取质粒，接着将提取的质粒进行双酶切验证，双酶切验证体系见表6，将该反应体系置于37℃水浴反应30min，反应完成后进行琼脂糖凝胶电泳，将酶切验证正确的质粒送测序公司进行测序验证。
通过验证，得到具有聚酯降解活性的酯酶突变体MT-12重组质粒pET-21b-MT-12。
分别以人工合成的酯酶A的核苷酸序列SEQ ID NO.4为模板，以表9所示的对应的引物对为引物，按本实施例的方法，制备得到重组质粒：
pET-21b-MT-16，pET-21b-MT-17，pET-21b-MT-21，pET-21b-MT-22，pET-21b-MT-23，pET-21b-MT-25，pET-21b-MT-29，pET-21b-MT-30，pET-21b-MT-31，pET-21b-MT-32，pET-21b-MT-33，pET-21b-MT-34，pET-21b-MT-36，pET-21b-MT-37，pET-21b-MT-38，pET-21b-MT-39，pET-21b-MT-40。
表9酯酶突变体引物序列
/>
/>
实施例3
具有聚酯降解活性的酯酶突变体的表达及纯化
将重组质粒pET-21b-MT-1转化到E.coli BL21(DE3)中，过夜培养，挑取单菌落到5mL含100μg/mL的氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃摇床震荡培养6-8h(得到含有pET-21b-MT-1的重组菌株)；随后，将菌液转入1L含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃摇床震荡培养6-8h，菌液培养至OD600为0.6左右，降温至16℃，加入IPTG至终浓度400μM，诱导培养16-18h。随后离心收集菌体，将收集的菌体使用悬菌buffer(20mM Tris-HCl，300mM NaCl，10％甘油，pH 7.5)重悬，之后使用高压破菌仪进行破菌。将破菌产物高速离心(18000rpm，4℃，45min)，收集上清，加入到预先使用悬菌buffer平衡过的镍亲和层析填料，4℃孵育1h。孵育完成后，在4℃环境下使用洗杂buffer(20mM Tris-HCl，300mM NaCl，20mM咪唑，10％甘油，pH 7.5)洗杂，将非特异性结合到Ni柱上的杂蛋白清洗干净。在清洗干净后，使用约30mL洗脱液(20mM Tris-HCl，300mM NaCl，300mM咪唑，10％甘油，pH 7.5)将结合在Ni柱上的目的蛋白洗脱。收集洗脱液，使用10kDa浓缩管进行浓缩。
随后通过AKTA pure系统使用凝胶过滤层析柱(Superdex 200Increase 10/300GL，GE)对目的蛋白进行进一步纯化。所用缓冲液为20mM Tris-HCl，300mM NaCl，pH7.5，对出峰位置的流出组分进行收集，并通过蛋白凝胶电泳验证，根据分子量大小收集目的蛋白。
分别将重组质粒
pET-21b-MT-2，pET-21b-MT-3，pET-21b-MT-4，pET-21b-MT-5，pET-21b-MT-6，pET-21b-MT-7，pET-21b-MT-8，pET-21b-MT-9，pET-21b-MT-10，pET-21b-MT-11，pET-21b-MT-12，pET-21b-MT-13，pET-21b-MT-14，pET-21b-MT-15，pET-21b-MT-16，pET-21b-MT-17，pET-21b-MT-18，pET-21b-MT-19，pET-21b-MT-20，pET-21b-MT-21，pET-21b-MT-22，pET-21b-MT-23，pET-21b-MT-24，pET-21b-MT-25，pET-21b-MT-26，pET-21b-MT-27，pET-21b-MT-28，pET-21b-MT-29，pET-21b-MT-30，pET-21b-MT-31，pET-21b-MT-32，pET-21b-MT-33，pET-21b-MT-34，pET-21b-MT-35，pET-21b-MT-36，pET-21b-MT-37，pET-21b-MT-38，pET-21b-MY-39，pET-21b-MT-40，pET-21b-MT-41，pET-21b-MT-42按照本实施例的上述步骤进行，分别得到相应的突变体蛋白。
MT-1：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第177位的谷氨酸突变为谷氨酰胺；
MT-2：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第178位的天冬酰胺突变为丙氨酸；
MT-3：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第180位的丝氨酸突变为苏氨酸；
MT-4：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第180位的丝氨酸突变为亮氨酸；
MT-5：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第180位的丝氨酸突变为缬氨酸；
MT-6：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第181位的异亮氨酸突变为缬氨酸；
MT-7：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第208位的甘氨酸突变为丙氨酸；
MT-8：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第209位的丝氨酸突变为苏氨酸；
MT-9：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第211位的丝氨酸突变为酪氨酸；
MT-10：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第177位的谷氨酸突变为谷氨酰胺且第180位的丝氨酸突变为亮氨酸；
MT-11：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第177位的谷氨酸突变为谷氨酰胺且第181位的异亮氨酸突变为缬氨酸；
MT-12：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第177位的谷氨酸突变为谷氨酰胺且第208位的甘氨酸突变为丙氨酸；
MT-13：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第178位的天冬酰胺突变为丙氨酸且第177位的谷氨酸突变为谷氨酰胺；
MT-14：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第178位的天冬酰胺突变为丙氨酸且第180位的丝氨酸突变为亮氨酸；
MT-15：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第178位的天冬酰胺突变为丙氨酸且第181位的异亮氨酸突变为缬氨酸；
MT-16：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第178位的天冬酰胺突变为丙氨酸且第208位的甘氨酸突变为丙氨酸；
MT-17：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第178位的天冬酰胺突变为丙氨酸且第209位的丝氨酸突变为苏氨酸；
MT-18：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第180位的丝氨酸突变为苏氨酸且第177位的谷氨酸突变为谷氨酰胺；
MT-19：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第180位的丝氨酸突变为苏氨酸且第178位的天冬酰胺突变为丙氨酸；
MT-20：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第180位的丝氨酸突变为苏氨酸且第181位的异亮氨酸突变为缬氨酸；
MT-21：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第180位的丝氨酸突变为苏氨酸且第208位的甘氨酸突变为丙氨酸；
MT-22：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第180位的丝氨酸突变为苏氨酸且第209位的丝氨酸突变为苏氨酸；
MT-23：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第180位的丝氨酸突变为苏氨酸且第211位的丝氨酸突变为酪氨酸；
MT-24：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第180位的丝氨酸突变为亮氨酸且第181位的异亮氨酸突变为缬氨酸；
MT-25：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第180位的丝氨酸突变为亮氨酸且第208位的甘氨酸突变为丙氨酸；
MT-26：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第180位的丝氨酸突变为缬氨酸且第177位的谷氨酸突变为谷氨酰胺；
MT-27：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第180位的丝氨酸突变为缬氨酸且第178位的天冬酰胺突变为丙氨酸；
MT-28：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第180位的丝氨酸突变为缬氨酸且第181位的异亮氨酸突变为缬氨酸；
MT-29：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第180位的丝氨酸突变为缬氨酸且第208位的甘氨酸突变为丙氨酸；
MT-30：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第180位的丝氨酸突变为缬氨酸且第209位的丝氨酸突变为苏氨酸；
MT-31：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第181位的异亮氨酸突变为缬氨酸且第208位的甘氨酸突变为丙氨酸；
MT-32：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第209位的丝氨酸突变为苏氨酸且第177位的谷氨酸突变为谷氨酰胺；
MT-33：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第209位的丝氨酸突变为苏氨酸且第180位的丝氨酸突变为亮氨酸；
MT-34：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第209位的丝氨酸突变为苏氨酸且第181位的异亮氨酸突变为缬氨酸；
MT-35：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第209位的丝氨酸突变为苏氨酸且第208位的甘氨酸突变为丙氨酸；
MT-36：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第211位的丝氨酸突变为酪氨酸且第177位的谷氨酸突变为谷氨酰胺；
MT-37：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第211位的丝氨酸突变为酪氨酸且第178位的天冬酰胺突变为丙氨酸；
MT-38：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第211位的丝氨酸突变为酪氨酸且第180位的丝氨酸突变为亮氨酸；
MT-39：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第211位的丝氨酸突变为酪氨酸且第180位的丝氨酸突变为缬氨酸；
MT-40：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第211位的丝氨酸突变为酪氨酸且第181位的异亮氨酸突变为缬氨酸；
MT-41：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第211位的丝氨酸突变为酪氨酸且第208位的甘氨酸突变为丙氨酸；
MT-42：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第211位的丝氨酸突变为酪氨酸且第209位的丝氨酸突变为苏氨酸。
与SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列相比，酯酶突变体的氨基酸序列涉及到的突变位点包括权利要求1中氨基酸突变位点的至少三种。
实施例4
具有聚酯降解活性的酯酶突变体降解聚酯实验
(1)首先用打孔器打出聚酯圆片(直径6mm)；将聚酯圆片放入EP管中，加入体积浓度为0.5％的Triton X-100水溶液，50℃金属浴孵育30min，将圆片夹出；再加入到10mmol/LNa2CO3水溶液，50℃金属浴孵育30min；将圆片夹出，放入ddH2O浸泡，50℃金属浴孵育30min；取出，用氮气吹干备用。
(2)将终浓度为500nM的蛋白MT-1水溶液(野生型酯酶(SEQ ID No.1)作为对照)与步骤(1)获得的聚酯片，在600μL的50mM pH＝9.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中孵育，在反应温度50℃下进行聚酯水解反应，水解反应持续18h，用含体积比为25％的pH 2.5磷酸盐缓冲液和体积比为75％的甲醇配制的终止液稀释水溶液以终止反应，在85℃下加热处理10min，然后在12000rpm下离心10min以除去失活蛋白。将上清液吸出进行HPLC分析。所有实验都进行三次重复。
HPLC在water e2695色谱仪上进行，配备HyPURITY C18色谱柱(4.6×250mm)，其中流动相A为磷酸盐缓冲液(pH 2.5)，B为甲醇，流速设置为0.5mL/min，并在240nm波长下监测。设置程序为：0-5min，25％ V/V B液；5-25min，25-100％ V/V B液线性梯度。
将MT-2，MT-3，MT-4，MT-5，MT-6，MT-7，MT-8，MT-9，MT-10，MT-11，MT-12，MT-13，MT-14，MT-15，MT-16，MT-17，MT-18，MT-19，MT-20，MT-21，MT-22，MT-23，MT-24，MT-25，MT-26，MT-27，MT-28，MT-29，MT-30，MT-31，MT-32，MT-33，MT-34，MT-35，MT-36，MT-37，MT-38，MT-39，MT-40，MT-41，MT-42，均参照本实施例的方法进行降解聚酯实验，实验结果见表10。
表10具有聚酯降解活性的酯酶突变体在pH＝9.0，50℃对聚酯的相对降解活性
/>
实验证明，聚酯水解反应的温度也可以选37-70℃中任意值，如37℃、40℃、45℃、55℃、60℃或70℃，对聚酯水解强于野生型酯酶。
实验证明，聚酯水解反应的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液的pH可以选4-11中任意值，如4、5、6、7、8、8.5、10、11，对聚酯水解强于野生型酯酶。
Claims (4)
1.具有聚酯降解活性的酯酶突变体，其特征在于所述酯酶突变体为下列之一：
MT-1：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第177位的谷氨酸突变为谷氨酰胺；
MT-2：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第178位的天冬酰胺突变为丙氨酸；
MT-3：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第180位的丝氨酸突变为苏氨酸；
MT-4：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第180位的丝氨酸突变为亮氨酸；
MT-5：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第180位的丝氨酸突变为缬氨酸；
MT-6：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第181位的异亮氨酸突变为缬氨酸；
MT-7：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第208位的甘氨酸突变为丙氨酸；
MT-8：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第209位的丝氨酸突变为苏氨酸；
MT-9：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第211位的丝氨酸突变为酪氨酸；
MT-10：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第177位的谷氨酸突变为谷氨酰胺且第180位的丝氨酸突变为亮氨酸；
MT-11：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第177位的谷氨酸突变为谷氨酰胺且第181位的异亮氨酸突变为缬氨酸；
MT-12：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第177位的谷氨酸突变为谷氨酰胺且第208位的甘氨酸突变为丙氨酸；
MT-13：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第178位的天冬酰胺突变为丙氨酸且第177位的谷氨酸突变为谷氨酰胺；
MT-14：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第178位的天冬酰胺突变为丙氨酸且第180位的丝氨酸突变为亮氨酸；
MT-15：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第178位的天冬酰胺突变为丙氨酸且第181位的异亮氨酸突变为缬氨酸；
MT-16：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第178位的天冬酰胺突变为丙氨酸且第208位的甘氨酸突变为丙氨酸；
MT-17：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第178位的天冬酰胺突变为丙氨酸且第209位的丝氨酸突变为苏氨酸；
MT-18：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第180位的丝氨酸突变为苏氨酸且第177位的谷氨酸突变为谷氨酰胺；
MT-19：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第180位的丝氨酸突变为苏氨酸且第178位的天冬酰胺突变为丙氨酸；
MT-20：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第180位的丝氨酸突变为苏氨酸且第181位的异亮氨酸突变为缬氨酸；
MT-21：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第180位的丝氨酸突变为苏氨酸且第208位的甘氨酸突变为丙氨酸；
MT-22：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第180位的丝氨酸突变为苏氨酸且第209位的丝氨酸突变为苏氨酸；
MT-23：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第180位的丝氨酸突变为苏氨酸且第211位的丝氨酸突变为酪氨酸；
MT-24：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第180位的丝氨酸突变为亮氨酸且第181位的异亮氨酸突变为缬氨酸；
MT-25：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第180位的丝氨酸突变为亮氨酸且第208位的甘氨酸突变为丙氨酸；
MT-26：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第180位的丝氨酸突变为缬氨酸且第177位的谷氨酸突变为谷氨酰胺；
MT-27：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第180位的丝氨酸突变为缬氨酸且第178位的天冬酰胺突变为丙氨酸；
MT-28：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第180位的丝氨酸突变为缬氨酸且第181位的异亮氨酸突变为缬氨酸；
MT-29：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第180位的丝氨酸突变为缬氨酸且第208位的甘氨酸突变为丙氨酸；
MT-30：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第180位的丝氨酸突变为缬氨酸且第209位的丝氨酸突变为苏氨酸；
MT-31：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第181位的异亮氨酸突变为缬氨酸且第208位的甘氨酸突变为丙氨酸；
MT-32：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第209位的丝氨酸突变为苏氨酸且第177位的谷氨酸突变为谷氨酰胺；
MT-33：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第209位的丝氨酸突变为苏氨酸且第180位的丝氨酸突变为亮氨酸；
MT-34：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第209位的丝氨酸突变为苏氨酸且第181位的异亮氨酸突变为缬氨酸；
MT-35：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第209位的丝氨酸突变为苏氨酸且第208位的甘氨酸突变为丙氨酸；
MT-36：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第211位的丝氨酸突变为酪氨酸且第177位的谷氨酸突变为谷氨酰胺；
MT-37：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第211位的丝氨酸突变为酪氨酸且第178位的天冬酰胺突变为丙氨酸；
MT-38：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第211位的丝氨酸突变为酪氨酸且第180位的丝氨酸突变为亮氨酸；
MT-39：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第211位的丝氨酸突变为酪氨酸且第180位的丝氨酸突变为缬氨酸；
MT-40：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第211位的丝氨酸突变为酪氨酸且第181位的异亮氨酸突变为缬氨酸；
MT-41：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第211位的丝氨酸突变为酪氨酸且第208位的甘氨酸突变为丙氨酸；
MT-42：SEQ ID NO.3所示的酯酶A的氨基酸序列第211位的丝氨酸突变为酪氨酸且第209位的丝氨酸突变为苏氨酸。
2.含权利要求1的具有聚酯降解活性的酯酶突变体的编码基因的重组质粒。
3.含有权利要求2所述重组质粒的重组大肠杆菌菌株。
4.权利要求1的具有聚酯降解活性的酯酶突变体在水解聚酯中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310168094.2A CN116121223B (zh) | 2023-02-27 | 2023-02-27 | 具有聚酯降解活性的酯酶突变体及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310168094.2A CN116121223B (zh) | 2023-02-27 | 2023-02-27 | 具有聚酯降解活性的酯酶突变体及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116121223A CN116121223A (zh) | 2023-05-16 |
| CN116121223B true CN116121223B (zh) | 2023-11-21 |
Family
ID=86301071
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310168094.2A Active CN116121223B (zh) | 2023-02-27 | 2023-02-27 | 具有聚酯降解活性的酯酶突变体及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116121223B (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115927411A (zh) * | 2022-12-21 | 2023-04-07 | 天津大学 | 一种酯酶突变体基因及该基因表达的蛋白与应用 |
| CN116606873B (zh) * | 2023-05-06 | 2024-03-01 | 天津大学 | 分解聚酯的酯酶突变体基因及该基因表达的蛋白与应用 |
| CN117070494B (zh) * | 2023-10-13 | 2024-01-19 | 天津凯莱英生物科技有限公司 | 酯酶突变体及其应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106367408A (zh) * | 2016-10-20 | 2017-02-01 | 天津大学 | Pet分解酶突变体、编码基因及其应用 |
| CN108467857A (zh) * | 2018-03-14 | 2018-08-31 | 四川大学 | Pet水解酶突变体及其应用 |
| CN113227227A (zh) * | 2018-11-06 | 2021-08-06 | 卡比奥斯公司 | 用于酶促降解聚对苯二甲酸乙二酯的方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10851355B2 (en) * | 2018-08-08 | 2020-12-01 | Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation | IsPETase variants |
-
2023
- 2023-02-27 CN CN202310168094.2A patent/CN116121223B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106367408A (zh) * | 2016-10-20 | 2017-02-01 | 天津大学 | Pet分解酶突变体、编码基因及其应用 |
| CN108467857A (zh) * | 2018-03-14 | 2018-08-31 | 四川大学 | Pet水解酶突变体及其应用 |
| CN113227227A (zh) * | 2018-11-06 | 2021-08-06 | 卡比奥斯公司 | 用于酶促降解聚对苯二甲酸乙二酯的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Enhanced Poly(ethylene terephthalate) Hydrolase Activity by Protein Engineering;Yuan Ma等;Engineering;第4卷;888–893 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116121223A (zh) | 2023-05-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN116121223B (zh) | 具有聚酯降解活性的酯酶突变体及其应用 | |
| CN110564707B (zh) | 玉米赤霉烯酮水解酶突变体zhdm1及其编码基因和应用 | |
| CN102286441B (zh) | 一种低温酯酶及其编码基因与应用 | |
| CN110054702B (zh) | 玉米赤霉烯酮降解酶融合蛋白及其编码基因和应用 | |
| CN110527677B (zh) | 玉米赤霉烯酮水解酶突变体zhdm2及其编码基因和应用 | |
| CN111676210B (zh) | 一种提高纤维素酶活性的方法及纤维素酶突变体5i77-m和应用 | |
| CN116606873B (zh) | 分解聚酯的酯酶突变体基因及该基因表达的蛋白与应用 | |
| US11332731B2 (en) | Nitrile hydratase mutant, genetically engineered bacterium containing mutant and applications thereof | |
| EP0579360A2 (en) | Hyperthermophiles alpha-amylase gene | |
| CN113684198B (zh) | 一种提高纤维素酶催化效率的方法及突变体5i77-m2 | |
| CN117625581A (zh) | 一种N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体Ea2F及其应用 | |
| Fang et al. | Preparation and characterization of a novel thermostable lipase from Thermomicrobium roseum | |
| CN115927411A (zh) | 一种酯酶突变体基因及该基因表达的蛋白与应用 | |
| CN107446903B (zh) | 一种具有3个最适pH的耐盐耐乙醇果胶酶及其基因 | |
| CN116376871A (zh) | 一种热稳定型酯酶EstF及其突变体与应用 | |
| CN113604456A (zh) | 一种耐碱κ-卡拉胶酶及其应用 | |
| CN114164223B (zh) | 一种南极土壤来源的酯酶及其编码基因与应用 | |
| CN104611314A (zh) | 一种耐热β-甘露聚糖酶及其编码基因 | |
| Kiribayeva et al. | Cloning, purification and study of the biochemical properties of α-amylase from Bacillus licheniformis T5 strain | |
| CN114181922B (zh) | 一种重组酯酶、基因、重组菌及降解邻苯二甲酸酯的应用 | |
| CN113736807B (zh) | 一种纤维二糖水解酶及其编码基因与应用 | |
| AU2021100409A4 (en) | Recombinant low-temperature catalase, recombinant vector and engineered strain thereof | |
| CN112680427A (zh) | 一种脱卤酶HldD1及其编码基因与应用 | |
| CN103525791A (zh) | 一种耐高温中性纤维素酶Cel61P8及其基因和应用 | |
| CN109554383B (zh) | 一种耐热的酯酶编码基因、载体、工程菌及其编码蛋白的用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |