CN116376871A - 一种热稳定型酯酶EstF及其突变体与应用 - Google Patents

一种热稳定型酯酶EstF及其突变体与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公布一种热稳定型酯酶EstF及其突变体与应用。该酯酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：2，其表达的酯酶EstF最适pH为9.0，最适温度55℃，热稳定性良好，100℃下的半衰期为4h。利用定点突变技术，设计突变引物，以重组质粒pET‑estF为模板，构建两种酯酶突变体P144G和R203K；所述的酯酶突变体具有更优良的热稳定性，在100℃下，孵育6h后，P144G酶活仍有75％，R203K残留活性仍保持在80％以上。该热稳定型酯酶和酯酶突变体在医药工业、化工生产、生物修复等领域具有广泛的应用价值。

Description

一种热稳定型酯酶EstF及其突变体与应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体是一种热稳定型酯酶EstF及其突变体与应用。
背景技术
酯酶(Esterases,EC3.1.1.X)是指具有催化水解酯键能力的一类水解酶的统称，广泛分布于动物、植物和微生物中，其主要分成两类：羧酸酯酶和脂肪酶，其中羧酸酯酶倾向于水解短链酯类(<10)，脂肪酶倾向于水解长链酯类(≥10)。作为一种在工业生产中被广泛使用的生物酶类，由于酯酶催化底物合成和水解时不需要辅助因子，在有机溶剂中具有很高的稳定性，立体特异性和区域专一性等特点，酯酶被广泛应用于医药工业领域，其不仅可以促进血脂降解、预防肿瘤生成、调节肠胃消化、促进炎症消散，还可以通过专一性的特点识别催化合成特定构象的化合物，用于药物合成；化工生产领域，参与油脂加工、拆分手性化合物和降解高分子化合物等过程，生物修复领域，通过水解农药残留、抗生素或塑化剂实现对环境污染物的清除作用。
热稳定性是判断酯酶是否具有工业应用价值的一个重要指标，所以与常温酶相比，热稳定酶即便在极端环境下也具有更长的工作寿命和更高的催化效率，因此具有更广阔的应用前景，在中温宿主中异源表达的热稳定型酶多数保留了原始酶的生化性质，包括正确的折叠、热稳定性、酶的催化性能等。因此重组热稳定性酶的研究为理解酶的进化、蛋白质耐热的分子机制和温度对酶催化功能的影响等提供了理想的对象。已有研究表明静电相互作用、疏水性、螺旋含量、特定氨基酸、氢键、二硫键、离子键等因素可能对酯酶的热稳定性有一定影响。
理性设计是基于对酶的结构与功能关系规律认识基础上，精确设计出突变位点，利用定点突变等方法实现蛋白质分子的定向改造。理性设计需要基于蛋白质的二级、三级结构、生物学功能以及催化机制等，对氨基酸序列进行精确的设计，并对其中特定的氨基酸进行替换，从而鉴定出与酶特性相关的关键氨基酸位点，这是一种高效省力的方法。定点突变是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目的DNA片段(可以是基因组，也可以是质粒)中引入所需变化(通常是表征有利方向的变化)，包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变在获悉目标酶分子特征，空间结构以及构效关系的前提下，基于序列的合理化设计方案，有目的地对酶分子实施人工改造，因其高效性更多地应用于分子工程改造中。
在工业生产，临床诊疗等实际应用中，极其需要目标酶分子具有良好的热稳定性，从而易于保存，通过定点突变改造这些天然酶就显得尤为必要。但正确预测出有效位点并选择合适氨基酸进行替换以达到提高酶稳定性的目的在实际操作中难度较大。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提出了一种热稳定型酯酶及其突变体和应用。本发明的酯酶由人工设计合成的estF基因所编码，通过异源表达构建带有该基因的表达载体和基因工程菌；通过定点突变技术对该酯酶进行理性改造，分别将其氨基酸序列中的144位脯氨酸变为甘氨酸和203位精氨酸变为赖氨酸，得到两个酯酶突变体P144G和R203K。相对于酯酶EstF，酯酶突变体具有更加优异的热稳定性。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种热稳定型酯酶EstF及其突变体，其特征在于：包括酯酶编码基因、编码蛋白EstF、酯酶突变体P144G与酯酶突变体R203K；
所述酯酶编码基因，具有碱基序列SEQ ID NO：1，共1338bp，A含量为15.2％，T含量为19.4％，G含量为38.0％，C含量为27.4％；
优选的，所述编码蛋白EstF，具有氨基酸序列SEQ ID NO：2，共445个氨基酸，分子量为45.7kDa，等电点位为4.84，其中包含35个能增加蛋白质刚性的脯氨酸；
优选的，所述酯酶突变体P144G，其氨基酸序列为SEQ ID NO：3，与所述编码蛋白EstF氨基酸序列相比，144位的脯氨酸突变为甘氨酸。所述酯酶突变体根据酯酶EstF与同源酯酶进行基于二级结构序列比对确定突变氨基酸位点；依据定点突变技术及大肠杆菌密码子偏好性原则，将SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中编码第144位氨基酸的密码子CCG突变为GGA；
优选的，所述酯酶突变体R203K，其氨基酸序列为SEQ ID NO：4，与所述编码蛋白EstF氨基酸序列相比，203位的精氨酸突变为赖氨酸，所述的酯酶突变体R203K是基于酯酶EstF与同源酯酶二级结构序列比对和大肠杆菌中密码子使用频率的原则，通过定点突变技术将SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中编码第203位氨基酸密码子CGU突变为AAA。
优选的，所述编码蛋白EstF具有良好的酶学性质，酶活为112.83U/mg，具优良的热稳定性，100℃下的半衰期为4h。
优选的，所述酯酶突变体P144G，具有比所述编码蛋白EstF更优良的热稳定性，在100℃下，孵育3h，酯酶活性保留87％，孵育6h后，酯酶突变体残留酶活仍有75％。
优选的，所述酯酶突变体R203K，具有比所述的编码蛋白EstF更优良的热稳定性，在100℃下，孵育6h后，酯酶突变体残留酶活性仍保持在80％以上。
优选的，所述三种重组质粒，其包含以上所述的酯酶基因estF的pET28b-estF、estF’(编码酯酶突变体P144G基因)的pET28b-estF’或estF”(编码酯酶突变体R203K基因)的pET28b-estF”。
优选的，所述的3种酯酶基因重组工程菌，其包含上述的重组质粒，该重组工程菌为Rosetta(DE3)pLysS/pET28b-estF、Rosetta(DE3)pLysS/pET28b-estF’或Rosetta(DE3)pLysS/pET28b-estF”。
优选的，所述酯酶编码基因、酯酶突变体P144G与酯酶突变体R203K用于医药工业、化工生产、生物修复等领域的应用，所述的应用包括促进血脂降解、预防肿瘤生成、调节肠胃消化、促进炎症消散、药剂合成医药领域，参与油脂加工、拆分手性化合物和降解高分子化合物等化工生产过程，通过水解农药残留、抗生素或塑化剂实现对环境污染物清除作用的生物修复领域。
本发明的有益之处在于：
1.本发明合成了酯酶estF基因，并将其与pET28b质粒连接构建具卡那霉素(Kan)抗性的重组表达载体pET28b-estF，将该重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞，成功构建用于estF表达的基因工程菌Rosetta(DE3)pLysS/pET28b-estF，随后通过Co2+离子亲和层析，获得高度纯化酯酶蛋白EstF，该蛋白具有一定的热稳定性，在100℃条件下孵育4h，逐渐达到半衰期；
2.本发明通过对酯酶EstF进行序列比对，根据生物信息学分析，采用理性设计策略，通过定点突变技术，设计突变引物，以pET28b-estF为模板，构建了estF突变体estF’表达的基因工程菌Rosetta(DE3)pLysS/pET28b-estF’和estF突变体estF”表达的基因工程菌Rosetta(DE3)pLysS/pET28b-estF”，并通过异源表达和纯化获得高度纯化酯酶突变体P144G和R203K；
3.本发明所合成的酯酶突变体P144G和R203K均具有比酯酶EstF更优异的热稳定性，在100℃下，孵育6h后，P144G酶活仍有75％，R203K残留活性仍保持在80％以上；两突变体的比酶活与EstF没有差异，为112.83U/mg。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为酯酶EstF及其突变体P144G、R203K的100℃热稳定性图。
图2为实施例2所制的酯酶EstF的SDS–PAGE图。
图3为实施例4中酯酶EstF的最适pH图，其中■表示50mM柠檬酸盐缓冲液，●表示50mM Tris-HCl缓冲液，
Figure BDA0004079481630000041
表示50mM K2HPO4-KOH缓冲液。
图4为实施例5中酯酶EstF的最适温度图。
图5为实施例6中酯酶EstF的100℃的热稳定性图。
图6为实施例7中有机溶剂对酯酶EstF的影响图。
图7为实施例7中去垢剂对酯酶EstF的影响图。
图8为实施例8中酯酶EstF的与3FCY的氨基酸序列比对图。
图9为实施例12中酯酶突变体P144G的100℃热稳定性图。
图10为实施例13中酯酶突变体R203K的100℃热稳定性图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：酯酶EstF重组质粒及表达菌株构建
将人工合成的酯酶基因estF和质粒表达载体pET-28b(+)分别进行XhoI和NdeI酶切，酶切体系为30μL estF/pET-28b(+)、3μL Xho I、3μL Nde I、6μL 10×缓冲液和18μLddH2O，酶切条件为37℃，反应6h，之后将双酶切的基因estF与载体pET-28b(+)进行连接，构建带有estF的重组质粒。连接体系为6μL estF、2μL pET-28b(+)、1μL T4和1μL 10×T4连接缓冲液，连接条件为16℃，反应12h。然后按照1：10的比例将连接反应液与E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞轻轻吹打混匀，冰浴30min，将混合物于45℃条件下热击90s，后立即冰浴5min，加入500μL LB培养基复苏1h，10,000rpm离心1min，弃去500μL上清后将菌体重悬，涂布于含有卡那霉素(Kan)和氯霉素(Cam)的LB固体养基上，37℃电热恒温培养箱中正置培养0.5h，倒置培养24h，构建具有Kan和Cam抗性的重组工程菌Rosetta(DE3)pLysS/pET28b-estF。
实施例2：酯酶EstF的异源表达及SDS-PAGE鉴定
从上述成功转化的LB固体培养基上挑取单菌落至装有5mL含Kan和Cam双抗的LB液体培养基中，37℃，225rpm过夜培养，培养物以1％的接种量接种于100mL含Kan和Cam的LB液体培养基中，37℃，225rpm摇床中培养至OD600达到0.6。随后，向培养物中加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导剂至终浓度为0.1mM，20℃，180rpm低温诱导表达20h。结束诱导表达后，取若干，将培养物分装于50mL离心管，并使用台式高速冷冻离心机，在4℃，5000rpm条件下离心5min，弃去上清，收集菌体。向菌体中加入3mL LEW Buffer重悬，再次4℃，5000rpm，离心5min，使用35mL预冷的LEW Buffer悬浮菌体，冰浴超声破碎细胞(超声破碎仪参数：工作时间1s，间隔时间2s，功率85％，总时间40min)。破碎后于4℃，10,000rpm离心20min，收集上清，加入预先处理好的Co2+亲和层析柱中，置于垂直混匀区，4℃下充分混匀40min后，放出已与层析柱结合后的溶液，依次向其中加入30mL LEW缓冲液冲洗5次、10mM的洗脱缓冲液冲洗1次，最后加入10mL 150mM的洗脱缓冲液，洗脱与层析柱结合能力强的目的蛋白，得到酯酶EstF，并用12％的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测经Co2+亲和层析纯化后的酯酶在大肠杆菌中的表达(图2)，由图1可见，该蛋白在对应45.7kDa处有一特异性很高的条带，表明该蛋白在大肠杆菌中成功实现异源表达，且Co2+亲和层析成功纯化酯酶。
实施例3：酯酶EstF的酶活性质测定
酯酶EstF可以催化对硝基苯酚酯类底物pNPA2水解，并在410nm处生成有特异性吸收峰的产物对硝基苯酚(pNP)。利用紫外-可见光分光光度计，检测吸光值在410nm处的变化，并通过测定反应体系中pNP的释放量，从而确定酯酶EstF的酶活性。酶活性测定体系见表1，反应总体系为1mL，将各组分溶液添加并混合均匀后，置于25℃水浴锅中温育5min，立即测定OD410。以未添加酶的反应物为对照，所有平行实验均独立重复三次，测量值为其平均值。该酯酶EstF的酶活为112.83U/mg。
表1：标准反应体系
Figure BDA0004079481630000061
实施例4：酯酶EstF最适pH测定
采用标准反应体系，以不同pH值的缓冲液(pH＝5.5-7.0，50mM柠檬酸盐缓冲液；pH＝7.0-9.0，50mM Tris-HCl缓冲液；pH＝9.0-10.5，50mM K2HPO4-KOH缓冲液)测定不同酸碱度下EstF相对酶活性的变化，以最适pH条件下的酶活性为100％。结果显示(图3)，EstF在pH值为9.0时表现出最大活性，当pH值为7.5-9.5时，其活性保持在65％以上，在pH小于7.0时，EstF酶活性几乎为零，说明EstF是一种偏碱性酯酶。
实施例5：酯酶EstF最适温度测定
采用标准反应体系，测定EstF在15-65℃范围内的酶活性，以最适温度条件下的酶活力为100％，测定其他温度下的相对酶活。结果显示(图4),EstF在温度为55℃时表现出最大活性，当温度在50-60℃范围内，酶活性保持在60％以上，当温度在30-45℃范围内，酶活性保持在40％以上。
实施例6：酯酶EstF热稳定性测定
为了测定EstF的热稳定性，将EstF置于100℃温育一定时间后，采用标准反应体系检测其残余酶活性，以未经热处理的酶活力定义为100％，测定不同热处理时间条件下的相对酶活。结果显示(图5)，EstF在100℃水浴锅中经热处理1h后，其残留活性仍保持在80％以上，继续在100℃条件下孵育4h后，EstF逐渐达到半衰期，6h后其酶活仍有20％，EstF氨基酸序列中有较多的脯氨酸，脯氨酸的N-Cα旋转受到其吡咯烷环的束缚，从而具有更小的构象自由度，同时限定其前面氨基酸的构象空间，使得它比其他氨基酸更能增加蛋白质的刚性，提高蛋白的热稳定性，故EstF具有优良的热稳定性。
实施例7：有机溶剂、去垢剂对酯酶EstF活性的影响
向标准反应体系中分别添加一定浓度的有机溶剂(甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜)和去垢剂(十二烷基磺酸钠(SDS)、吐温-20(Tween-20)、吐温-80(Tween-80)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100))，在25℃，pH 9.0条件下反应5min后检测EstF的残余酶活，以不添加任何化学试剂的EstF的活性为100％。其中，有机溶剂的浓度为15和30％[vol/vol]，去垢剂的浓度为0.1和1％[vol/vol]。结果显示(图6、7)，EstF对有机溶剂(15％)和去垢剂(0.1％)的耐受性较高，相对酶活性均在60％以上，且对有机溶剂甲醇、二甲基亚砜(15和30％)的耐受性显著，相对酶活分别为79.87％和61.68％、83.93％和63.90％，对去垢剂TritonX-100的耐受性显著，相对酶活分别为84.12％和59.10％。
实施例8：酯酶突变位点的选择
使用PDB蛋白质结构数据库(RCSB PDB,https://www.rcsb.org/)进行EstF氨基酸序列相似性检索，运用Clustal X软件以及ESPript 3.0在线网站建立EstF及其同源性羧酸酯酶的氨基酸多重序列比对(https://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi)。将EstF与已报道的3FCY进行基于二级结构的氨基酸序列比对，结果如图8所示，图中三角形标记的是单点突变所选取的突变位点。EstF第144位的Pro位于第3个α螺旋区，第203位的Arg位于第4个α螺旋区。选择将EstF第144位Pro突变为Gly，第203位Arg突变为Lys。
实施例9：突变体引物的设计及定点突变
在符合引物设计原则的情况下，根据序列比对后确定的突变位点、大肠杆菌中密码子使用频率及酯酶EstF的基因序列，使用Primer premier 5.0设计引物，进行相应位点的突变。根据模板序列的方向，正向引物以突变位点为中心，向3’端延伸25bp，5’端延伸12bp，反向引物以突变位点为中心，向3’端延伸25bp，5’端延伸12bp，共设计2对正反向突变引物，具体引物详见表2。
利用设计好的2对引物，以重组质粒pET-estF作为突变模板，分别以144位的Pro和203位的Arg为目标位点进行突变，将原位置上的Pro和Arg分别替换为Gly和Lys，通过PCR进行目的基因的扩增，得到含有突变碱基的突变质粒。PCR反应体系为7.5μL的DNA聚合酶、0.3μL的上游引物、0.3μL的下游引物、0.5μL的模板和6.4μL的超纯水，反应条件为：98℃预变性5min，98℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸3min，72℃充分延伸10min。
表2：定点突变引物
Figure BDA0004079481630000081
Figure BDA0004079481630000091
实施例10：表达菌株的构建及异源表达
使用胶回收试剂盒回收纯化PCR产物，并对其进行消化。消化反应体系为17μL PCR产物、2.0μL FD缓冲液(10×)1.0μL DpnI，反应条件为37℃孵育50min，80℃孵育10min。然后将消化后的PCR产物转化到E.coli DH5α中，并进行基因测序验证，将测序结果与重组质粒基因进行序列比对，对比后发现第144位氨基酸的密码子由CCG变为GGA，第203位氨基酸的密码子由CGT变为AAA，表明突变质粒构建成功。随后将突变质粒转化到E.coli Rosetta(DE3)中，分别构建具有P144G和R203K的表达菌株，然后通过异源表达和分离纯化得到突变体P144G和R203K。
实施例11：两个突变体酶活性质测定
分别将10μL突变体酶，10μL 50mM pNPA2和980μL 50mM Tris-HCl缓冲液(pH9.0)置于25℃水浴锅中温育5min，立即测定OD410。以酯酶EstF的酶活力为100％，计算两个突变体的相对酶活。结果表明，突变体P144G和R203K与酯酶EstF的比活力基本相同，故以144位和203位为目标位点进行突变没有对酶活力产生影响。
实施例12：突变体P144G的热稳定性检测
为了测定突变体的热稳定性，将突变体P144G置于100℃温育一定时间后，分别将10μL突变体，10μL 50mM pNPA2和980μL 50mM Tris-HCl缓冲液(pH 9.0)置于25℃水浴锅中温育5min，测定OD410，以未经热处理的酶活力定义为100％，计算不同热处理时间条件下的相对酶活。实验结果显示，P144G在100℃条件下孵育6h后，其酶活仍有75％(图9)。低温酶在α螺旋区有更多的脯氨酸残基，因此可以通过在α螺旋区替换脯氨酸来提高酶的热稳定性，并且酯酶144位脯氨酸位于第3个α螺旋区，故实验证明替换该位点可以提高其热稳定性。
实施例13：突变体R203K的热稳定性检测
为了测定突变体的热稳定性，将突变体R203K置于100℃温育一定时间后，分别将10μL突变体，10μL 50mM pNPA2和980μL 50mM Tris-HCl缓冲液(pH 9.0)置于25℃水浴锅中温育5min，测定OD410，以未经热处理的酶活力定义为100％，计算不同热处理时间条件下的相对酶活。结果表明R203K在100℃条件下热处理6h后，其残留活性仍保持在80％以上(图10)。分子内盐桥对蛋白质在高温条件下刚性的维持有重要作用，带相反电荷的氨基酸之间通过产生静电力而形成盐桥，因此可以在蛋白质的α螺旋区内部或之间适当地增加带电荷氨基酸来增加盐桥的数量，对蛋白质的热稳定性有促进作用，该酯酶203位氨基酸位于第4个α螺旋区，实验证明，将其替换成赖氨酸可以提高酯酶的热稳定性。

Claims (10)

1.一种热稳定型酯酶EstF及其突变体，其特征在于：包括酯酶编码基因、编码蛋白EstF、酯酶突变体P144G与酯酶突变体R203K；
所述酯酶编码基因，具有碱基序列SEQ ID NO：1，共1338bp，A含量为15.2％，T含量为19.4％，G含量为38.0％，C含量为27.4％。
2.根据权利要求1所述的一种热稳定型酯酶EstF及其突变体，其特征在于：所述编码蛋白EstF，具有氨基酸序列SEQ ID NO：2，共445个氨基酸，分子量为45.7kDa，等电点位为4.84，其中包含35个能增加蛋白质刚性的脯氨酸。
3.根据权利要求1所述的一种热稳定型酯酶EstF及其突变体，其特征在于：所述酯酶突变体P144G，其氨基酸序列为SEQ ID NO：3，与所述编码蛋白EstF氨基酸序列相比，144位的脯氨酸突变为甘氨酸。所述酯酶突变体根据酯酶EstF与同源酯酶进行基于二级结构序列比对确定突变氨基酸位点；依据定点突变技术及大肠杆菌密码子偏好性原则，将SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中编码第144位氨基酸的密码子CCG突变为GGA。
4.根据权利要求1所述的一种热稳定型酯酶EstF及其突变体，其特征在于：所述酯酶突变体R203K，其氨基酸序列为SEQ ID NO：4，与所述编码蛋白EstF氨基酸序列相比，203位的精氨酸突变为赖氨酸，所述的酯酶突变体R203K是基于酯酶EstF与同源酯酶二级结构序列比对和大肠杆菌中密码子使用频率的原则，通过定点突变技术将SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中编码第203位氨基酸密码子CGU突变为AAA。
5.根据权利要求2所述的一种热稳定型酯酶EstF及其突变体，其特征在于：所述编码蛋白EstF具有良好的酶学性质，酶活为112.83U/mg，具优良的热稳定性，100℃下的半衰期为4h。
6.根据权利要求3所述的一种热稳定型酯酶EstF及其突变体，其特征在于：所述酯酶突变体P144G，具有比所述编码蛋白EstF更优良的热稳定性，在100℃下，孵育3h，酯酶活性保留87％，孵育6h后，酯酶突变体残留酶活仍有75％。
7.根据权利要求4所述的一种热稳定型酯酶EstF及其突变体，其特征在于：所述酯酶突变体R203K，具有比所述的编码蛋白EstF更优良的热稳定性，在100℃下，孵育6h后，酯酶突变体残留酶活性仍保持在80％以上。
8.根据权利要求1、3、4所述的一种热稳定型酯酶EstF及其突变体与应用，其特征在于：所述酯酶基因estF的pET28b-estF、estF’(编码酯酶突变体P144G基因)的pET28b-estF’或estF”(编码酯酶突变体R203K基因)的pET28b-estF”包含在三种重组质粒内。
9.根据权利要求8所述的一种热稳定型酯酶EstF及其突变体与应用，其特征在于：所述重组质粒，Rosetta(DE3)pLysS/pET28b-estF、Rosetta(DE3)pLysS/pET28b-estF’或Rosetta(DE3)pLysS/pET28b-estF”包含在3种酯酶基因重组工程菌内。
10.根据权利要求1-9所述的一种热稳定型酯酶EstF及其突变体与应用，其特征在于：所述酯酶编码基因、酯酶突变体P144G与酯酶突变体R203K用于医药工业、化工生产、生物修复等领域的应用，所述的应用包括促进血脂降解、预防肿瘤生成、调节肠胃消化、促进炎症消散、药剂合成医药领域，参与油脂加工、拆分手性化合物和降解高分子化合物等化工生产过程，通过水解农药残留、抗生素或塑化剂实现对环境污染物清除作用的生物修复领域。
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