CN110923223B

CN110923223B - 一种新型腈水解酶及其应用

Info

Publication number: CN110923223B
Application number: CN201911167683.9A
Authority: CN
Inventors: 李文均; 熊梦洁; 田野; 肖敏
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University
Priority date: 2019-11-25
Filing date: 2019-11-25
Publication date: 2021-10-08
Anticipated expiration: 2039-11-25
Also published as: CN110923223A

Abstract

本发明公开了一种新型腈水解酶及其应用。具体的，本发明公开了氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示蛋白作为腈水解酶的应用；核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示编码基因作为腈水解酶编码基因的应用。本发明首次提出SEQ ID NO：1所示蛋白具有腈水解酶活性，能够有效地催化乙腈转化为苯乙酸，利用其制备的工程菌菌体表现出较高腈水解酶活性，发酵周期短，催化效率高，适合于工业生产苯乙酸的需要。

Description

一种新型腈水解酶及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，更具体地，涉及一种新型腈水解酶及其应用。

背景技术

腈水解酶能够催化腈类化合物转化为具有广泛应用价值的羧酸类化合物，如丙烯酸、扁桃酸、烟酸、异烟酸、苯乙酸、甘氨酸等，同时该酶可以用于处理含有腈的废水和腈污染的有毒废水。腈水解酶作用底物的广泛性及优良的化学、区域、立体选择性使其在羧酸合成中表现出巨大应用潜力，在制药、饲料、食品、环保等领域具有良好的应用前景。

苯乙酸是一种重要的有机化合物，由于其具有羧基、亚甲基氢和苯环的典型反应，可以生成多种中间体，在医药工业中用于青霉素、地巴唑等药物的生产。苯乙酸经氯化、酯化得到α-氯代苯乙酸乙酯，用于稻丰散和乙基稻丰散的生产，这两种农药是广谱性有机磷杀虫剂。苯乙酸在低浓度时具有甜蜂蜜味，在1ppm以下仍具有甜味，是一种重要的香料成分。

目前，苯乙酸的合成路线多达数十种，其中常见的有：氰化钠法、苯乙烯法、苯乙酮法以及苄基卤化物羰化法。国内苯乙酸的生产主要采用氰化钠法，该方法主要分为两步，首先由氯苄和氰化钠合成苯乙腈，随后通过酸碱水解法将苯乙腈转化为苯乙酸。然而，在苯乙腈水解生产为苯乙酸的过程中，由于需要强酸强碱的参与以及持续保持高温的过程，能耗较高。

相对于传统化学方法，生物催化法反应条件温和，环境友好，催化剂易于制备，催化效率较高，选择性强且成本较低，适合于工业化生产，为苯乙酸的大规模制备提供了一条行之有效的途径。目前国内没有对腈基降解菌腈水解酶基因的克隆、表达的研究。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种新型腈水解酶及其应用。

本发明的第一个目的是氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示蛋白作为腈水解酶的应用。

本发明的第二个目的是核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示编码基因作为腈水解酶编码基因的应用。

本分明的第三个目的是权利要求1中所述的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示蛋白催化腈水解中的应用。

本发明的第四个目的是一种重组载体在以苯乙腈为底物进行腈水解制备苯乙酸中的应用。

本分明的第五个目的是一种工程菌在以苯乙腈为底物进行腈水解制备苯乙酸中的应用。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

腈基降解菌(Nitriliruptor alkaliphilus)ANL-iso2(保藏编号DSM 45188)是一株具有腈水解酶活性的菌株，能够水解苯乙腈产生苯乙酸。此外，腈基降解菌(Nitriliruptor alkaliphilus)ANL-iso2(保藏编号DSM 45188)所产的腈水解酶还能够转化扁桃腈、正戊腈、己二腈等腈类化合物产生相应的酸。因此，腈基降解菌(Nitriliruptoralkaliphilus)ANL-iso2(保藏编号DSM 45188)腈水解酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达，为其实际应用及作用机理研究显得非常重要。

本发明提供一种来源于腈基降解菌(Nitriliruptor alkaliphilus)ANL-iso2(保藏编号DSM 45188)的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示具有腈水解酶(Nit2)活性。为实现腈水解酶在大肠杆菌等原核生物中的可溶性异源表达，通过基因工程常规操作，以全合成的方法获得了对应于所述SEQ ID NO：1氨基酸序列的该腈水解酶的核苷酸序列，如SEQ IDNO：2所示。

因此本发明要求保护以下内容：

氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示蛋白作为腈水解酶的应用。

核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示编码基因作为腈水解酶编码基因的应用。

权利要求中所述的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示蛋白进行腈水解中的应用。

优选地，在以苯乙腈为底物进行腈水解，制备苯乙酸中的应用。

优选地，腈水解的温度为 15～70℃。

更优选地，腈水解的温度为 50℃。

优选地，腈水解的pH为 5～12。

更优选地，腈水解的pH为 7.0。

本发明还要求保护一种重组载体在以苯乙腈为底物进行腈水解制备苯乙酸中的应用，所述重组载体含有所述的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示编码基因。

本发明还要求保护一种工程菌在以苯乙腈为底物进行腈水解制备苯乙酸中的应用，所述工程菌由所述的重组载体转化得到。

所述工程菌的菌体制备方法为：将所述工程菌接种至含有50μg/mL氨卞青霉素的LB液体培养基，在37℃培养12h，再以体积浓度2％接种量接种至新鲜的含有50μg/mL氨卞青霉素的LB液体培养基中，37℃培养至菌体浓度OD 600值为0.5，再向LB液体培养基中加入终浓度为0.5mM的IPTG，15℃诱导培养20h后，将培养液在4℃、8000rpm离心5min，弃去上清液，收集含有重组腈水解酶的菌体。

本发明将腈水解酶编码基因Nit2同表达载体pCold I DNA连接，构建了含有该腈水解酶基因Nit2的表达重组质粒pCold I DNA-Nit2。将表达重组质粒pCold I DNA-Nit2转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，获得含有重组质粒pCold I DNA-Nit2的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pCold I DNA-Nit2。以重组菌为酶源，进行生物催化。重组菌株BL21(DE3)/pCold I DNA-Nit2表现出较高腈水解酶活性，纯化腈水解酶的最适反应温度为50℃，最适反应pH为7.0，该酶能有效地将底物苯乙腈转化为苯乙酸。

其中，重组菌株的腈水解酶的纯化液的制备方法为：收集发酵液中的菌体，利用PB缓冲液进行重悬浮并破碎细胞，固液分离取上清液，得到无细胞抽提液，过0.45μm滤膜制备成上样样品，先将Ni-NTA琼脂糖凝胶柱用Binding/Washing Buffer冲洗至平衡，冲柱流速2mL/min，而后上样，上样流速为1mL/min，待完全吸附后，用Elution Buffer进行洗脱，洗脱流速2mL/min，收集各阶段洗脱液即为腈水解酶的纯化液。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明首次提出SEQ ID NO：1所示蛋白具有腈水解酶活性，能够有效地催化乙腈转化为苯乙酸，利用其制备的工程菌菌体表现出较高腈水解酶活性，发酵周期短，催化效率高，适合于工业生产苯乙酸的需要。

附图说明

图1为连接转化子阳性验证。

图2为重组腈水解酶分离纯化SDS-PAGE图谱；(从左到右)泳道1：标准蛋白分子量Marker，泳道2：无细胞抽提液上清，泳道3：纯化后的腈水解酶洗脱液，泳道4：纯化后的腈水解酶。

图3为重组腈水解酶的最适反应温度(以苯乙腈为底物反应)。

图4为重组腈水解酶的最适反应pH(以苯乙腈为底物反应)。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1腈水解酶的获得

一、实验方法

利用NCBI数据库数据检索得到腈基降解菌(Nitriliruptor alkaliphilus)ANL-iso2(保藏编号DSM 45188)的基因组数据(NCBI Reference Sequence:NZ_KQ033901.1)，对基因组依据功能基因的预测与注释进行筛选，得到一个腈水解酶基因(Nit2)。根据该腈水解酶的氨基酸序列，并依据大肠杆菌偏好的密码子进行密码子优化，并根据表达载体pColdI DNA的特点设计了酶切位点Nde I和Xba I。

二、实验结果

通过基因工程的常规操作以全合成的方法合成了该段腈水解酶基因Nit2(SEQID:2所示)，编码酶的氨基酸序列如SEQ ID:1所示。

实施例2重组表达载体pCold I DNA-Nit2的构建以及重组工程菌的构建

一、实验方法

利用Nde I和Xba I限制性内切酶对Nit2基因片段进行双酶切以及回收处理，并利用T4DNA连接酶将该片段与用相同的限制性内切酶处理的商业化载体pCold I DNA在16℃下进行连接6h，从而构建得到胞内重组表达载体pCold I DNA-Nit2。将构建的胞内表达载体pCold I DNA-Nit2转化至E.coli BL21(DE3)受体菌中，涂布于含氨卞青霉素(终浓度为50μg/mL)的LB琼脂平板上，37℃下培养过夜，第二天于平板上长出的菌落中随机挑取克隆并抽提质粒进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。

二、实验结果

结果如图1所示，获得重组基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pCold I DNA-Nit2。

实施例3含有腈水解酶BrNit菌体细胞的制备

一、实验方法

将实施例2构建的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pCold I DNA-Nit2接种至含有50μg/mL氨卞青霉素的LB液体培养基，在37℃培养12h，再以2％接种量(v/v)接种至新鲜的含有50μg/mL氨卞青霉素的LB液体培养基中，37℃培养至菌体浓度OD₆₀₀约0.5左右，再向LB液体培养基中加入终浓度为0.5mM的IPTG，15℃诱导培养20h后，将培养液在4℃、8000rpm离心5min，弃去上清液，收集含有重组腈水解酶的湿菌体，即含有胞内表达重组腈水解酶的大肠杆菌BL21(DE3)/pCold I DNA-Nit2湿菌体。然后进行SDS-PAGE电泳验证目的蛋白大小及表达情况。

二、实验结果

SDS-PAGE电泳结果表示含有pCold I DNA-Nit2的该大肠杆菌BL21(DE3)菌体能通过诱导高效表达大小约为40000道尔顿的目的蛋白。

实施例4重组腈水解酶的分离纯化与酶学特征

一、实验方法

将重组菌体的发酵液于4℃，8000rpm离心5min，去除上清。离心收集的细胞悬浮于PB缓冲液(0.2M，pH7.4)中，制备成菌悬液。菌悬液在冰浴中用超声破碎仪破碎，200W功率下工作30min，每个循环工作2s停4s。样品用结晶紫进行染色，在显微镜下进行观察，直到显示细胞完全裂解为止。细胞破碎液4℃下12,000rpm离心10min，所得上清液即为无细胞抽提液。无细胞抽提液用0.45μm滤膜过滤制备成上样样品，先将Ni-NTA琼脂糖凝胶柱用Binding/Washing Buffer冲洗至平衡，冲柱流速2mL/min，而后上样，上样流速为1mL/min，待完全吸附后，用Elution Buffer进行洗脱，洗脱流速2mL/min，收集各阶段洗脱液，得到腈水解酶的纯化液后进行SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达及纯化情况。并以苯乙腈为底物利用腈水解酶的纯化液进行降解反应。

二、实验结果

SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达及纯化情况结果如图2所示，表观分子量为42000道尔顿。

以苯乙腈为底物时，腈水解酶的最适反应温度为55℃(如图3所示)，最适反应pH为7.0(如图4所示)。在最适反应条件下，纯化重组腈水解酶酶活为2.91μmol/(mg·min)。

实施例5重组腈水解酶的对于腈类物质的降解作用

一、实验方法

按照实施例4的方法获得腈水解酶的纯化液，之后利用其进行其他腈类物质降解的检测，在温度为35℃，pH在8.0的条件下进行降解，并计算酶的相对活力(relativeactivity)。

二、实验结果

表1：

结果如表1所示，在相同水解条件下，该腈水解酶对苯乙腈的特异性水解能力最强，水解扁桃腈的相对酶活约为其30％，除此之外，该腈水解酶对正戊腈、己二腈、4-氯丁腈、丙二腈也有微弱的水解能力，对丁烯腈和丁二腈的水解能力最差。

序列表

<110> 中山大学

<120> 一种新型腈水解酶及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 352

<212> PRT

<213> Nitriliruptor alkaliphilus

<400> 1

Met Val Asp Tyr Asn Thr Thr Met Lys Val Gly Ala Val Gln Ala Glu

1 5 10 15

Pro Val Trp Leu Asp Ala Ala Ala Thr Val Glu Lys Ser Arg Glu Leu

20 25 30

Ile Ala Gln Ala Ala Asn Asp Gly Val Glu Leu Leu Ala Phe Ala Glu

35 40 45

Thr Trp Ile Pro Gly Tyr Pro Phe Trp Ile Trp Leu Asp Ala Pro Ala

50 55 60

Ala Gly Met Pro Leu Val Gly Arg Tyr His Ala Asn Ser Met Thr Arg

65 70 75 80

Asp Asp Glu His Met Arg Ala Leu Gln Asp Ala Ala Arg Thr His Asn

85 90 95

Ile Ser Leu Val Val Gly Leu Ser Glu Arg Asn Ala Gly Thr Leu His

100 105 110

Met Ser Gln Ala Leu Ile Asn Ala Asp Gly Glu Leu Val Arg Leu Arg

115 120 125

Arg Lys Leu Arg Pro Thr His Val Glu Arg Thr Ile Phe Gly Asp Gly

130 135 140

Asp Gly Ser Asp Leu Ala Val Val Asp Met Ala Gly Ala Arg Val Gly

145 150 155 160

Ala Leu Cys Cys Trp Glu His Leu Gln Pro Leu Val Arg Met Ala Met

165 170 175

Tyr Gly Gln His Glu Gln Val His Val Ala Ser Trp Pro Ser Phe Gly

180 185 190

Leu Tyr Arg Gly Met Ala Phe Ala Leu Gly Pro Glu Val Asn Met Ala

195 200 205

Ala Ser Arg Met Tyr Ala Ala Glu Gly Gln Cys Phe Val Ile Ala Ala

210 215 220

Thr Gln Val Val Gly Glu Ala Ala Tyr Glu Val Phe Gly Asp Asp Glu

225 230 235 240

Arg Thr Arg Ser Phe Leu Gln Pro Gly Gly Gly Tyr Ser Met Ile Phe

245 250 255

Gly Pro Asp Gly Arg Glu Leu Ala Glu Gly Leu Asp Glu Thr Ala Glu

260 265 270

Gly Ile Val Thr Ala Asp Ile Asp Leu Ala Met Ile Pro Leu Ala Lys

275 280 285

Asn Ala Gly Asp Pro Val Gly His Tyr Gly Arg Pro Asp Ile Leu Arg

290 295 300

Met Phe Val Ser Ser Glu Pro Arg Ser Val Val Thr Ile Gly Glu Gln

305 310 315 320

Arg His Asp Ala Ala Gly Glu Ser His His Val Ala Ser Val Pro Glu

325 330 335

Val Ser Leu Leu Pro Glu Ile Gly Asn Gly Ile Ala Glu Ala Arg Ser

340 345 350

<210> 2

<211> 1059

<212> DNA

<213> Nitriliruptor alkaliphilus

<400> 2

gtggtcgact acaacacgac aatgaaggtg ggcgccgtcc aggcggagcc ggtgtggctg 60

gacgcagcag cgacggtgga gaagtcgcgg gagctgatcg cccaggcagc caacgacggc 120

gtcgagctcc tggccttcgc agagacgtgg atccccgggt acccgttctg gatctggctc 180

gacgccccag cggccgggat gcccctcgtc ggcaggtacc acgccaactc gatgacgcgt 240

gacgacgagc acatgcgtgc gctccaggac gcggcccgca cccacaacat cagcctcgtc 300

gtcgggctca gcgagcggaa cgccgggacg ctgcacatgt cgcaggcgct catcaacgcc 360

gacggcgagt tggttcgcct ccgtcgcaag ctccgcccga cgcacgtcga gcggacgatc 420

ttcggtgacg gcgacggatc cgacctcgcg gtcgtggaca tggccggcgc ccgggtcgga 480

gcgttgtgct gctgggagca cctgcagccg ttggtcagga tggccatgta cgggcagcac 540

gagcaggtcc acgtcgcgtc ctggccgagc ttcgggctct accgcggcat ggcgttcgca 600

ctcggaccgg aagtcaacat ggctgcctcg aggatgtacg ccgcagaggg ccagtgcttc 660

gtgatcgctg ccacgcaggt cgtcggcgaa gccgcctacg aggtcttcgg ggacgacgaa 720

cgcacccgtt cgttcctcca gcccggtggt gggtattcga tgatcttcgg cccggatggt 780

cgcgagctcg ccgagggcct ggacgagacc gccgaaggca tcgtgacggc ggacatcgat 840

ctcgcgatga tccccctggc caagaacgcc ggcgacccgg tgggacatta cgggcgcccc 900

gacatcctca ggatgttcgt ctcgtcggaa ccgcggtccg tcgtcacgat cggcgaacag 960

cggcacgacg ctgccggcga gtctcaccac gtggcatcgg tcccagaggt cagcctcctc 1020

ccggagatcg ggaacgggat cgccgaggcg cgctcatga 1059

Claims

1.氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示蛋白催化腈水解中的应用，其特征在于，以苯乙腈为底物进行腈水解，制备苯乙酸中的应用，腈水解的温度为50℃，腈水解的pH为7.0。

2.一种重组载体在以苯乙腈为底物进行腈水解制备苯乙酸中的应用，其特征在于，所述重组载体含有核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示编码基因，以苯乙腈为底物进行腈水解，制备苯乙酸中的应用，腈水解的温度为50℃，腈水解的pH为7.0。

3.一种工程菌在以苯乙腈为底物进行腈水解制备苯乙酸中的应用，其特征在于，所述工程菌由权利要求2中所述的重组载体转化得到，以苯乙腈为底物进行腈水解，制备苯乙酸中的应用，腈水解的温度为50℃，腈水解的pH为7.0。