CN115851632B - 一种漆酶突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物领域，具体涉及一种漆酶突变体及其应用。具体技术方案为：一种漆酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明提供了一种新的漆酶突变体，可极大提升桔霉素的降解效率，具有广阔的工业推广应用前景。
Description
技术领域
本发明属于酶解领域，具体涉及一种漆酶突变体及其应用。
背景技术
桔霉素(也称桔青霉素或橘霉素，citrinin)是一种小分子化合物，最早在桔青霉(Penicillium citrinum)中发现，现有研究表明：多种真菌都能产生桔霉素。桔霉素会导致肾脏毒性，被定义为一种真菌毒素。许多国家及地区均已相继对食品、药品等中的桔霉素检测量制定了限定标准。例如我国国标GB 1886.66-2015《食品安全国家标准食品添加剂红曲黄色素》规定：红曲黄色素中桔霉素的最高限量为1.0mg/kg。
由于桔霉素会污染食品，带来潜在的食品安全风险，因此需要消除桔霉素。然而，目前关于桔霉素的降解方法研究尚不成熟，其中酶解法是较具有应用潜力的方法之一。因为酶解法具有多种优势，例如反应条件温和、降解效果高、不引入新的有毒物质等。但现有技术已公开的具有桔霉素降解能力的酶较少，且降解效果并不理想，难以实现工业上的推广应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种漆酶突变体及其应用。
为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一种漆酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
相应的，编码所述漆酶突变体的DNA序列。
相应的，含有所述氨基酸序列的重组质粒。
相应的，含有所述DNA序列的表达质粒。
相应的，含有所述重组质粒的宿主微生物。
相应的，含有所述表达质粒的宿主微生物。
相应的，所述漆酶突变体在降解桔霉素中的应用。
相应的，所述DNA序列在降解桔霉素中的应用。
相应的，所述宿主微生物在降解桔霉素中的应用。
相应的，所述宿主微生物在降解桔霉素中的应用。
本发明具有以下有益效果：本发明提供了一种新的漆酶突变体，可极大提升桔霉素的降解效率，具有广阔的工业推广应用前景。
附图说明
图1为突变体漆酶LacIm表达情况示意图；
图2为桔霉素浓度变化情况示意图；
图3为桔霉素的标准曲线。
具体实施方式
本发明提供了一种漆酶突变体LacIm，在原始漆酶LacI的基础上，将99位Ser突变为Thr，将第196位Ala突变为Lys。所述原始漆酶LacI的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述漆酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例
1、原始漆酶LacI的编码DNA片段由安徽通用生物有限公司通过化学合成方法制备得到，DNA序列如SEQ ID NO.3所示。使用内切酶EcoRI单酶切表达载体pET30a(+)得到线性质粒，然后使用多DNA片段一步法克隆试剂盒(Hieff CloneTM Multi One Step PcrCloning Kit)将LacI基因与线性质粒连接到一起，得到重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌菌株TOP10后，挑取单菌落培养后提取质粒，基因测序验证序列正确。以重组质粒为模板，使用第一引物利用PCR方法复制整个质粒片段的方法，在99位引入突变，将Ser突变为Thr，获得PCR产物。
所述第一引物包括：F：AAAAGCCGGCGTTACCATTAGCGTGGTG；R：CACCACGCTAATGGTAACGCCGGCTTTT。
使用限制性内切酶DpnI处理PCR产物后，转化大肠杆菌菌株TOP10，在LB平板上培养后挑取阳性单菌落，培养后提取质粒。以该质粒为模板，使用第二引物利用PCR方法复制整个质粒片段的方法，进行第二次突变，将196位的Ala突变为Lys，得到携带有2个突变位点的漆酶突变体LacIm基因的质粒。所述漆酶突变体LacIm的DNA序列如SEQ ID NO.4所示。所述第二引物包括：F：ACCCTGAAAGAAAAATGCGATCAGC；R：GCTGATCGCATTTTTCTTTCAGGGT。
2、将步骤1制备的有2个突变位点的重组质粒与大肠杆菌菌株BL21(DE3)感受态细胞进行混合，冰浴30min后，再在42℃下热激90s。随后将细胞加入新鲜LB培养基中，混匀后在37℃，200r/min条件下，将菌液涂布于含卡那霉素(50μg/mL)的LB养基上，37℃过夜培养。筛选阳性克隆，对阳性克隆提取质粒进行PCR和酶切验证。获得含有原始漆酶LacI基因的重组大肠杆菌菌株A1和含有突变体漆酶LacIm基因的重组大肠杆菌菌株M1。
3、将步骤2获得的重组大肠杆菌A1和M1的菌液分别按照5％(V/V)的接种比例加入160mL含卡那霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中，37℃培养约3h，当OD600达到0.6时，加入终浓度为0.5mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，并在16℃诱导培养16h。离心弃去上清液，收集菌体，用磷酸缓冲液(50mM，pH＝7.0)重悬，超声破碎后离心取上清，即分别得到含有原始漆酶LacI蛋白和突变体漆酶LacIm蛋白的溶液，通过SDS-PAGE分析蛋白表达情况，突变体漆酶LacIm结果如图1所示。图1中，M为蛋白分子量标准；泳道1、2分别为对照组(菌株M1未经IPTG诱导)的上清液和沉淀；泳道3、4分别为实验组(菌株M1经IPTG诱导)的上清液和沉淀。图1表明：突变体漆酶LacIm依然能正常表达漆酶蛋白。
4、在磷酸缓冲液(pH＝7.2)中进行桔霉素降解反应。分别使用不同浓度原始LcacIm和突变体漆酶LacIm蛋白浓度，蛋白浓度梯度设置为3μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL和300μg/mL，反应体系中，桔霉素浓度为4μg/mL。在37℃下反应24h后，向体系加入体系总体积3倍体积乙腈终止反应，通过HPLC对反应样品中的桔霉素浓度进行检测，计算桔霉素降解率，降解率(％)＝(4-终浓度)/4×100％。桔霉素降解情况如图2所示，桔霉素标准曲线如图3所示。结果显示：在相同条件下，漆酶浓度均为200μg/mL时，原始漆酶LacI降解桔霉素24h后的降解率为57％，突变体漆酶LacIm降解桔霉素24h后的降解率为87％，降解效率显著提高。
除直接使用突变体漆酶降解桔霉素外，还可将突变体漆酶基因转入微生物中，获得具有降解桔霉素能力的微生物。例如，发明人将对应突变体漆酶基因转入大肠杆菌，成功获得具有高效降解桔霉素的大肠杆菌。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形、变型、修改、替换，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种漆酶突变体，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.编码权利要求1所述漆酶突变体的DNA序列。
3.含有权利要求1所述氨基酸序列对应的核苷酸的重组质粒。
4.含有权利要求2所述DNA序列的表达质粒。
5.含有权利要求3所述重组质粒的宿主微生物。
6.含有权利要求4所述表达质粒的宿主微生物。
7.权利要求1所述漆酶突变体在降解桔霉素中的非疾病诊断和治疗中的应用。
8.权利要求2所述DNA序列在降解桔霉素中的非疾病诊断和治疗中的应用。
9.权利要求5所述宿主微生物在降解桔霉素中的非疾病诊断和治疗中的应用。
10.权利要求6所述宿主微生物在降解桔霉素中的非疾病诊断和治疗中的应用。
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| GR01 | Patent grant | ||
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