CN104087560A

CN104087560A - 一种细菌漆酶突变体蛋白、其重组表达质粒、转化的工程菌株及其发酵制备方法

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Publication number: CN104087560A
Application number: CN201310655726.4A
Authority: CN
Inventors: 方泽民; 肖亚中; 常飞; 周鹏; 张学成; 房伟; 袁璟
Original assignee: Anhui University
Current assignee: Anhui University
Priority date: 2013-12-05
Filing date: 2013-12-05
Publication date: 2014-10-08
Anticipated expiration: 2033-12-05
Also published as: CN104087560B

Abstract

本发明公开了一种细菌漆酶突变体蛋白，其特征在于，该突变体蛋白氨基酸序列由SEQ ID No.1所示的细菌漆酶氨基酸序列第323位甘氨酸至332位甘氨酸进行缺失突变获得。本发明通过基因工程改造方法获得稳定性提高的细菌漆酶蛋白编码基因、其表达质粒及工程菌，并可在将工程菌大规模发酵及诱导表达后，获得稳定性提高的细菌漆酶蛋白。本发明以海洋未培养微生物来源的细菌漆酶Lac15为基础，通过基因工程改造，获得突变基因；同时利用重组大肠杆菌进行高密度培养的方法，高效表达细菌漆酶突变体蛋白。本发明大幅提高了细菌漆酶的稳定性和产量。

Description

一种细菌漆酶突变体蛋白、其重组表达质粒、转化的工程菌株及其发酵制备方法

技术领域

本发明涉及通过定向改造方法构建的稳定性提高的细菌漆酶突变体蛋白，及其在重组大肠杆菌中的高密度培养生产方法，属于酶的基因工程技术和发酵工程技术领域。

背景技术

漆酶(Laccase，EC 1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶，具有广泛的底物作用范围，能催化氧化多种酚类和非酚类化合物，在木质素类物质降解、酚类物质(如苯氧基类除草剂等)毒性去除、新型化合物合成等方面发挥重要作用。漆酶广泛存在于真菌和细菌中。真菌漆酶可在酸性或中性偏酸性条件下发挥活性，部分真菌漆酶已应用于工业生产当中。与真菌漆酶相比，细菌漆酶可在碱性条件下发挥催化活性，部分细菌漆酶还具有真菌漆酶不具有的生物活性，如高卤族离子耐受活性等，可应用于真菌漆酶无法应用的现代生物技术产业。因此，细菌漆酶可作为真菌漆酶的重要补充，拓展漆酶的工业应用范围。

细菌漆酶研究目前主要集中于新酶的发现和酶学性质分析。已有研究表明，部分细菌漆酶具有工业应用价值。然而，现有细菌漆酶性质不能满足现代工业生物技术对细菌漆酶的系列要求，如同时具有温度稳定性和氯离子耐受性等，从而阻碍了细菌漆酶的工业化应用进程。分子生物学技术的发展，为酶蛋白的定向改造提供了途径。现有证据表明，通过分子生物学技术手段，结合生物信息学相关理论，对候选细菌漆酶进行定向改造，改良细菌漆酶性质，具有完全的可行性。

大肠杆菌由于其遗传学、生物化学和分子生物学等方面已充分被人们了解而成为表达异源蛋白的首选表达系统。大肠杆菌容易培养且费用低、对多种蛋白具有良好的耐受能力、能高水平的表达异源蛋白；同时，大肠杆菌可进行高密度发酵，可进一步降低生产成本。因此，利用大肠杆菌表达系统近年在生物药物制备、酶制剂生产等方面被广泛采用。

发明内容

本发明的首要目的在于提供一种运用定向改造方法获得的稳定性提高的细菌漆酶突变体蛋白的氨基酸序列，该序列由SEQ ID No.1所示的细菌漆酶的氨基酸序列第323位甘氨酸至332位甘氨酸进行缺失突变后获得。

本发明的第二个目的在于提供一种上述细菌漆酶突变体蛋白的DNA编码序列及含有该DNA序列的一种表达质粒。

本发明的第三个目的在于提供一种转化有上述重组表达质粒的生产菌株，该菌株具有细菌漆酶突变体蛋白合成性能。

本发明的第四个目的在于提供一种高密度培养发酵制备上述细菌漆酶突变体蛋白的方法。

本发明中的一种细菌漆酶突变体，所述突变体的蛋白氨基酸序列还可以包括序列中的无义突变或同义突变的组合。

本发明具体技术方案如下：

对细菌漆酶Lac15(GenBank Accession No.ADM87301)进行生物信息学分析和稳定性试验，确定氨基酸序列323GAMSRRMMQG332为柔性可变区域，野生型蛋白长时间保存过程中，该区域氨基酸出现断裂，并引发蛋白降解。因此，本发明的主要技术方案围绕氨基酸序列柔性可变区域进行缺失突变，进而以Escherichia coli BL21(DE3)/pET22b(+)-lac15(Del)为出发菌株，以指数补料和恒速补料相结合的方式，对重组大肠杆菌进行高密度发酵生产细菌漆酶突变体蛋白Lac15(Del)。

具体操作步骤如下：

1.以细菌漆酶Lac15(GenBank Accession No.ADM87301)为模板，选择第323位到332位的10个氨基酸(323GAMSRRMMQG332)，利用PCR方法进行缺失突变，并将该突变体基因连接到表达载体pET22b(+)中，构建表达质粒pET22b(+)-lac15(Del)并转化进入工程菌Escherichia coli BL21(DE3)中进行诱导表达。

以Escherichia coli BL21(DE3)/pET22b(+)-lac15(Del)为出发菌株，进行高密度培养生产细菌漆酶突变体蛋白Lac15(Del)，发酵初始培养基为改良后的TB培养基，其中初始甘油浓度为15-20g·L^-1，接种量为5-7％，维持发酵罐内温度为26-32℃，较优水平为28-30℃。待甘油耗尽发酵液溶氧DO上升幅度超过30％时，约为接种后8-12小时，开始进行指数方法流加补料培养基。按照如下公式计算补料流加速率：F_(t)＝(μ_setX₀V₀/Y_X/SS_F)exp(μ_sett)。其中，F_(t)：补料流加速率，单位L·h^-1；X₀：流加补料时的初始生物量，单位：g·L^-1；V₀：发酵液初始体积，单位：L；S_F：补料中甘油浓度，单位：g·L^-1；μ_set：比生长速率为0.1-0.2h^-1；Y_X/S：细胞对底物的得率系数，单位:g·g^-1；t：补料开始时间，单位：h。当发酵液菌体干重达到17-26g·L^-1，加入IPTG进行诱导(终浓度为0.05-0.2mM)，以6–18mL·h-1的速率流加补料培养基直至发酵结束(诱导8-12h结束)。整个发酵过程用25％(v/v)氨水控制在6.5-7.5，较优水平为7.0-7.3，并调节通气量和搅拌速度将DO控制在20-60％，较优水平为35-40％。

2.细菌漆酶酶学性质测定方法：

酶活测定：使用漆酶底物2,6-DMP(2,6-二甲基苯酚)检测细菌漆酶Lac15及其突变体活性，反应体系为50mM Na₂HPO₄-KH₂PO₄(pH7.5)、0.1mM CuS0₄和0.1mM的2,6-DMP。在反应体系中加入适量稀释的酶液后置于45℃反应5min，立即冰浴30s，用MV-7200型紫外分光光度计测定477nm的吸收值。2,6-DMP在477nm处的消光系数为4.96×10⁴M^-1 cm^-1，酶活力定义为在一定条件下每分钟氧化1μmol底物为1个酶活力单位。

本发明大幅提高了细菌漆酶的稳定性、可溶性诱导表达温度和产量，有利于大规模工业化生产。

附图说明

图1.SDS-PAGE电泳图谱检测纯化后的野生型细菌漆酶Lac15与突变体Lac15(Del)在28℃保存时的降解情况。1-2：野生型、突变体在28℃放置0时刻的降解情况；3-4：野生型、突变体在28℃放置4天的降解情况；5-6：野生型、突变体在28℃放置7天的降解情况；7-8：野生型、突变体在28℃放置15天的降解情况；9-10：野生型、突变体在28℃放置22天的降解情况。

图2.以Escherichia coli BL21(DE3)/pET22b(+)-lac15(Del)为出发菌株进行高密度发酵，发酵过程中生物量(DCW g/L)及细菌漆酶突变体酶活(U/L)变化。

具体实施方式：

实施例中涉及到的培养基配方如下：

LB液体培养基：酵母粉5g·L^-1，胰蛋白胨10g·L^-1，NaCl 10g·L^-1，使用时添加氨苄青霉素至终浓度100ug·mL^-1。

改良TB培养基：甘油15-20g·L^-1，酵母粉20-26g·L^-1，胰蛋白胨10-12g·L^-1，KH₂PO₄17mM,K₂HPO₄72mM，使用时添加氨苄青霉素100ug·mL^-1；

LB固体培养基：LB液体培养基添加1.5％琼脂，使用时添加氨苄青霉素100ug·mL^-1；

补料培养基：甘油450-500g·L^-1，酵母粉40-50g·L^-1，胰蛋白胨40-50g·L^-1，使用时添加氨苄青霉素100ug·mL^-1。

实施例1、利用PCR方法进行缺失突变体DNA编码序列的构建

选择包含断裂位点氨基酸332位甘氨酸在内往蛋白序列上游共10个氨基酸(323GAMSRRMMQG332)进行定点缺失。引物设计如下：

以含有野生型细菌漆酶Lac15基因编码序列的表达载体pET-22b(+)-lac15为模板，用lac15_F与缺失引物D(323-332)_R进行第一轮PCR，同时用lac15_R与突变引物D(323-332)_F进行第二轮PCR。将第一轮与第二轮PCR产物回收作为第三轮PCR的模板，用lac15_F与lac15_R进行第三轮PCR，得到带有缺失突变的全长序列。将获得的缺失突变体基因序列连接至pET22b(+)表达载体，并转化进入表达菌株Escherichia coli BL21(DE3)。

本发明的菌株Escherichia coli BL21(DE3)/pET22b(+)-lac15(Del)已送往中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，CCTCC)保藏，保藏日期：2013年11月24日，菌株保藏编号为CCTCC M 2013598。

实施例2、突变体蛋白的诱导表达及纯化

将测序确认无误的重组工程菌Escherichia coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-lac15(Del)和野生型基因重组工程菌Escherichia coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-lac15接种入5ml液体LB培养基中，接种量1％，37℃下220rpm震荡培8-12h。按1％的接种量将过夜培养的重组工程菌接入400ml液体LB培养基中，37℃，200rpm震荡培养，当发酵液OD₆₀₀达到0.6-1.0时，加入IPTG至终浓度为0.2mM，同时降温至28℃诱导表达12-14h。

4℃、8000g离心收集菌体，加入0.1倍菌液体积的Binding buffer，350W冰浴条件下超声40min破碎细胞，30000g离心收集上清，得到粗酶液。

粗酶液经过Ni-NTA柱层析进行纯化。洗脱液中咪唑浓度分别为60mM、70mM、80mM、90mM、100mM，每个浓度洗脱3个柱体积。在咪唑浓度为90-100mM时，得到的蛋白经过检测达到SDS-PAGE纯度。

实施例3、野生型细菌漆酶及其突变体Lac15(Del)稳定性实验

纯化后的野生型细菌漆酶及其突变体蛋白保存于28℃，缓冲液为50mMNa₂HPO₄-KH₂PO₄(pH 7.5)。定期检测野生型细菌漆酶及其突变体蛋白的剩余酶活，同时对样品进行SDS-PAGE检测。

如图1所示，第4天，7天，15天和22天的SDS-PAGE电泳图谱显示野生型蛋白在第4天降解约80％，突变体蛋白在第14天降解约50％，细菌漆酶突变体蛋白在28℃的半衰期为野生型的3-4倍。

实施例4、重组大肠杆菌进行高密度培养生产细菌漆酶突变体Lac15(Del)

初始发酵培养基为改良的TB培养基，接种量为5％，用25％(v/v)氨水控制在6.9-7.1，通过调节通气量和搅拌速度将DO控制在25-30％，温度控制在28-30℃。当甘油耗尽发酵液溶氧DO上升幅度超过30％时，按照比生长速率为0.1-0.25h^-1指数流加补料培养基。按照如下公式计算补料流加速率：

F_(t)＝(μ_setX₀V₀/Y_X/SS_F)exp(μ_sett)

其中，F_(t)：补料流加速率；X₀：流加补料时的初始生物量，单位：g·L^-1；V₀：发酵液初始体积，单位：L；S_F：补料中甘油浓度，单位：g·L^-1；μ_set：比生长速率为0.2h^-1；Y_X/S：细胞对底物的得率系数，单位:g·g^-1；t：补料开始时间，单位：h；

发酵液菌体干重达到17-26g·L^-1，加入IPTG进行诱导(终浓度为0.05-0.2mM)，以6–18mL·h^-1的速率流加补料培养基直至发酵结束。

诱导8-12h后，细菌漆酶突变体蛋白总产量达到20000-24000U/L。

Claims

1.一种细菌漆酶突变体蛋白，其特征在于，该突变体蛋白氨基酸序列由SEQ ID No.1所示的细菌漆酶氨基酸序列第323位甘氨酸至332位甘氨酸进行缺失突变获得。

2.编码权利要求1所述的一种细菌漆酶突变体蛋白的DNA，所述DNA序列如SEQ ID No.2所示。

3.一种细菌漆酶突变体蛋白表达质粒，其特征在于，含有权利要求2所述的细菌漆酶突变体蛋白的DNA序列。

4.一种具有细菌漆酶突变体蛋白合成性能的工程菌，其特征在于，含有权利要求3所述的表达质粒。

5.一种细菌漆酶突变体蛋白，其特征在于，由权利要求4所述的工程菌发酵获得。

6.一种利用重组大肠杆菌高密度培养生产细菌漆酶突变体蛋白的方法：其特征在于，以权利要求4所述工程菌为出发菌株，以改良的TB培养基为初始发酵培养基，初始接种量为5-7%。培养过程中，当培养基中甘油耗尽、发酵液溶氧DO上升幅度超过30%时，按照如下计算公式速率流加补料培养基：

F_（t）=(μ_setX₀V₀/Y_X/SS_F)exp(μ_sett)；

其中，F_（t）：补料流加速率，单位：L·h^-1；X₀：流加补料时的初始生物量，单位：g·L^-1；V₀：发酵液初始体积，单位：L；S_F：补料中甘油浓度，单位：_g·L^-1；μ_set：比生长速率为0.1-0.2h^-1；Y_X/S：细胞对底物的得率系数，单位：g·g^-1；t：补料开始时间，单位：h；

当菌体干重达到17-26g·L^-1，加入终浓度为0.05-0.2mM的IPTG进行诱导，以6-18mL·h^-1的速率恒速流加补料培养基，诱导8-10h后结束。

7.按照权利要求6所述方法，其特征在于，所述发酵温度为28-30℃；所述发酵培养基pH范围为7.0-7.3。

8.按照权利要求6所述方法，其特征在于，所述改良的TB培养基为：甘油15-20g·L^-1，酵母粉20-26g·L^-1，胰蛋白胨10-12g·L^-1，KH₂PO₄17mM，K₂HPO₄72mM，使用时添加氨苄青霉素至终浓度100μg·mL^-1；所述补料培养基为：甘油450-500g·L^-1，酵母粉40-50g·L^-1，蛋白胨40-50g·L^-1，使用时添加氨苄青霉素至终浓度100μg·mL^-1。

9.一种重组表达菌株E.coli BL21(DE3)，其特征在于，所述菌株保藏编号为CCTCC M2013598。