CN112921043A - 突变的核酸、表达载体和制备高比活力漆酶突变体及其方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了突变的核酸、表达载体和制备高比活力漆酶突变体及其方法，该突变的核酸的序列如SEQ IDNO：1所示；本发明通过ep‑PCR技术快速获取突变漆酶基因，以形成庞大的突变体文库；同时在蛋白N‑末端构建组氨酸标签，便于后续利用标签进行突变体菌株的高通量筛选，实现了漆酶基因在毕赤酵母中的异源表达和改造，重组毕赤酵母突变菌株酶蛋白的比活力提高约2倍，降低该漆酶的使用成本，提升重组毕赤酵母菌的工业应用潜力。

Description

突变的核酸、表达载体和制备高比活力漆酶突变体及其方法

技术领域

本发明涉及漆酶的蛋白质工程改造和异源表达，属于漆酶基因工程和蛋白质工程技术领域，具体涉及突变的核酸、表达载体和制备高比活力漆酶突变体及其方法。

背景技术

漆酶(EC1.10.3.2)是研究历史悠久的工业酶之一，它属于蓝色多铜氧化酶家族(Blue multicopper oxidases，MCOs)，因其催化底物谱广、副产物生态友好等优点，已在复合材料生产、污水处理以及生物医学诊断等多方面得到广泛应用，目前，工业漆酶主要来源于细菌和真菌，然而，野生酶的自然特性基本不符合工业应用标准，为此通过现代生物技术对漆酶的改造尤为重要。

蛋白质的定向进化技术是蛋白质改造的有效方法之一，通过定向进化技术进行蛋白质工程改造已成为学术界和工业界(主要用于生物催化)调整酶学性质的常用方法，据不完全统计，包括淀粉酶、碱性蛋白酶、和纤维素酶等在内的多种酶得到了不同改造，有关漆酶定向进化研究主要包括催化效率、有机溶剂的耐受性、最适催化pH和氧化还原电势的提高，然而，有关漆酶高比活力的定向进化研究甚少，因此，对漆酶高比活力的定向进化研究具有重大研究意义和实际应用价值。

为提高漆酶蛋白的定向进化改造效率，一般需要对目标蛋白进行重组表达，目前，漆酶重组蛋白表达系统可分为以大肠杆菌为代表的原核表达系统、以毕赤酵母为代表的子囊真菌表达系统和以里氏木霉为代表的丝状真菌表达系统，其中，以里氏木霉为代表的丝状真菌表达系统主要用于漆酶的高效表达，一般不用于蛋白质工程改造中；以大肠杆菌为代表的原核表达系统主要用于细菌漆酶的重组表达；而以毕赤酵母为代表的子囊真菌表达系统具有生长快、培养方便、遗传操作成熟，同时还可以对表达蛋白进行加工、修饰和折叠等特点，被广泛用于真菌漆酶的重组表达和改造。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的真菌表达系统不能用于漆酶的蛋白质工程改造问题，提供突变的核酸、表达载体和制备高比活力漆酶突变体及其方法。

为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种突变的核酸，该突变的核酸的序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明第二方面提供一种表达载体，该表达载体插入有前述第一方面所述的突变的核酸。

本发明第三方面提供一种制备高比活力漆酶突变体的方法，该方法包括，使用权利要求2所述的表达载体转化酵母细胞，得到转化后的酵母细胞。

优选地，所述方法包括：

(1)提取漆酶基因模板：对Escherichia coli-JM109-T1-pie5菌株进行培养、收集，以质粒提取试剂盒操作说明提取质粒，得到漆酶基因模板；

(2)突变基因克隆：以PIE5-F/PIE5-R/His-PIE5-F为引物，采用易错PCR技术对所述漆酶基因模板进行突变、扩增，得到突变LacMut基因；

(3)表达载体构建：通过酶切连接法，将所述突变LacMut基因插入到pPIC9K启动子AOX1下游，将pPIC9K-LacMut表达载体转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中，得到JM109-pPICK-LacMut菌落；

(4)重组菌株的获得：使用限制性内切酶Sac I对JM109-pPICK-LacMut质粒线性化，通过电转化将线性化表达载体转入宿主毕赤酵母GS115中；

(5)微孔板法初筛选：将重组菌株单克隆转接于含BMGY培养基的96孔板中培养，后加入BMM培养基诱导突变漆酶表达，通过底物活性检测法，检测发酵上清中突变漆酶的活性，筛选出高活性漆酶突变体；

(6)相对比活力检测法定向筛选：通过His MultiTrap预装柱对含组氨酸标签的突变漆酶进行可重复的高通量筛选，获得高比活力的漆酶突变体Pichia pastoris-LacMut。

优选地，在步骤(2)中，所述PIE5-F的序列为：

GGAATTCCAAATCCTTGGCCCG。

优选地，所述PIE5-R的序列为：

AGGAAAAAAGCGGCCGCTTAAGGAGTGG。

优选地，所述His-PIE5-F的序列为：

GGAATTCCATCATCATCATCATCATCAAATCCTTGGCCCG。

优选地，在步骤(3)中，所述酶切连接法包括：采用EocRⅠ和NotⅠ两种限制性内切酶对所述突变LacMut基因和pPIC9K空载进行双酶切，然后，通过T4连接酶将载体与突变基因连接。

本发明第四方面提供一种根据所述的方法制备得到的高比活力的漆酶突变体Pichiapastoris-LacMut。

优选地，所述漆酶突变体Pichiapastoris-LacMut经0.75％甲醇诱导5d，28℃，200rpm培养后，LacMut酶活力可达1317U/L，比活力705U/mg。

通过上述技术方案，本发明具有以下技术效果：

1、本发明利用ep-PCR技术构建随机突变文库，实现对目标漆酶的随机改造。

2、本发明将6个组氨酸密码子导入漆酶基因的反向引物中，使目的蛋白N-末端带有His标签，实现突变蛋白比活力的高通量筛选。

3、本发明对重组酶的比活力进行了测定，其比活力优于天然漆酶，可代天然漆酶应用于染料脱色中。

4、本发明获得了高性能毕赤酵母工程菌株，该工程菌株所表达的漆酶比活力达705U/mg，大幅度缩减了染料脱色等应用成本。

附图说明

图1是根据本发明一实施方式的突变基因表达载体构建琼脂糖凝胶电泳图；

图2是根据本发明一实施方式的突变基因表达载体构建示意图；

图3是根据本发明一实施方式的微孔板法初筛结果图；

图4是根据本发明一实施方式的相对比活力法复筛图；

图5是根据本发明一实施方式的LacMut漆酶测序结果比对图；

图6是LacMut漆酶SDS-PAGE检测图；

图7是蛋白质标准曲线图；

图8是LacMut漆酶摇瓶发酵酶活检测图。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

实施案例1漆酶基因的突变扩增：

1.1将来源于现代生物制造安徽省重点实验室的Escherichia coli-JM109-T1-pie5(E.coli-JM109-T1-pie5)菌株取出，于LB(Amp)平板上划线，37℃培养箱培养，挑取单克隆后，接种于LB(Amp)试管中，37℃摇床过夜培养，收集菌体后以质粒提取试剂盒操作说明提取质粒，得到漆酶基因模板；

1.2突变基因克隆：根据pie5质粒序列设计引物，并在上下游引物中分别引入EocRⅠ和NotⅠ的酶切位点，另一条在下游引物中引入组氨酸标签，引物设计结果见表1。

表1 PCR引物设计

1.3以pie5质粒为模板，使用低保真DNA聚合酶(EasyTaq DNA Polymerase)，同时加入不同浓度的Mn²⁺产生和调节碱基互补错配率，实现突变基因引入，得到突变LacMut基因。ep-PCR反应体系见表2，反应条件见表3。

表2 ep-PCR反应体系(50μL)

表3 ep-PCR反应条件

实施案例2pPIC9K-LacMut表达载体构建：

2.1将回收的易错PCR产物和pPIC9K空载分别进行双酶切(EocRⅠ和NotⅠ限制性内切酶)，酶切于37℃反应60min，将所述突变LacMut基因插入到pPIC9K启动子AOX1下游，构建pPIC9K-LacMut表达载体，反应体系如表4。酶切完成后，产物以1％的核酸胶进行纯化回收。

表4双酶切反应体系(50μL)

2.2将所回收酶切产物构建连接体系，目的基因与载体用量摩尔比为1:6，在T4连接酶作用下，22℃连接60min，将pPIC9K-LacMut表达载体转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中，得到JM109-pPICK-LacMut菌落。

2.3重组菌株的获得：使用无菌水将所有JM109-pPICK-LacMut菌落轻轻刮起，提取混合质粒；采用限制性内切酶Sac I将混合质粒线性化，条件为：37℃反应60min；然后电转入准备好的毕赤酵母GS115感受态细胞中。

实施案例3随机突变文库的筛选：

3.1微孔板法初筛：取无菌96孔板，加入150μL BMGY液体培养基，将初筛的所有阳性克隆转接至对应96孔板中，于28℃摇床培养48h；后重新加入150μL液体BMM培养基(含0.75％甲醇和0.25mM硫酸铜)于28℃摇床进行诱导表达48h，诱导结束后使用ABTS为底物检测突变体蛋白酶活性。

3.2漆酶活性检测：在pH 4.0的酒石酸钠缓冲液中，使用1mM ABTS为底物，在30℃下与发酵上清/酶液反应3min，然后冰浴30s，反应后测定OD₄₂₀吸光值。一个酶活单位为每分钟氧化1μmol底物所需的酶。

3.3漆酶蛋白浓度检测：配置不同浓度的牛血清蛋白标准液，取200μL Brandford溶液和20μL标准蛋白液混合均匀。使用分光光度计测定在OD₅₉₅处的吸光值，以标准蛋白液浓度为横坐标，OD₅₉₅为纵坐标建立蛋白标准曲线，实验结果如表7所示。通过检测漆酶蛋白与Brandford的混合液在OD₅₉₅处的吸光值，测定漆酶蛋白的浓度。

3.4相对比活力快速检测法复筛：将初筛获得的高活性突变体转接于24孔板中重新培养诱导蛋白表达，培养和诱导条件如初筛一致。诱导结束后使用His MultiTrap预装柱对突变体蛋白进行简易纯化，并检测纯化后目标蛋白的活性和蛋白浓度，从而筛选出比活力提高的突变体菌株。

实施案例4突变体漆酶LacMut的表达纯化：

4.1突变体漆酶LacMut的摇瓶发酵：将复筛中获得的正向突变体LacMut接种于含50mL液体BMGY培养基的摇瓶中，于28℃、220rpm摇床中培养1天；然后转接至400mL的BMM(含0.25mM CuSO₄)培养基中进行目标蛋白的诱导表达培养，培养条件为28℃、220rpm摇床培养，并每天添加0.75％的甲醇；诱导表达培养5天后4℃、8000rpm条件下离心20min收集上清粗酶液，并对粗酶液进行纯化。

4.2漆酶LacMut突变体蛋白的纯化：首先，利用切向流超滤仪将发酵上清液超滤浓缩至50mL；然后，使用0.5M K₂HPO₄调节pH至7.0；最后，按GE Healthcare镍柱蛋白纯化说明书进行突变体蛋白纯化。

4.3漆酶LacMut突变体活性检测：测试方法同实施例3.2，检测结果如表5和图8所示。

4.4漆酶LacMut突变体蛋白质浓度检测：测试方法同实施例3.3，检测结果如表5。

表5 Lac-Mut突变体比酶活测定

综上可以看出，菌株P.pastoris-LacMut经0.75％甲醇诱导5天，28℃，200rpm培养后，LacMut酶活力可达1317U/L，比活力705U/mg，与野生型漆酶PIE5相比，重组突变漆酶比活力提高1.97倍，可代替灰盖鬼伞天然分泌的漆酶组分用于污水处理和染料脱色中。

本发明通过ep-PCR技术快速获取突变漆酶基因，以形成庞大的突变体文库；同时在蛋白N-末端构建组氨酸标签，便于后续利用标签进行突变体菌株的高通量筛选，实现了漆酶基因在毕赤酵母中的异源表达和改造，在不改变漆酶性质的条件下提高重组毕赤酵母突变菌株酶蛋白的比活力，降低该漆酶的使用成本，提升重组毕赤酵母菌的工业应用潜力。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 安徽大学

<120> 突变的核酸、表达载体和制备高比活力漆酶突变体及其方法

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1515

<212> DNA

<213> laccase

<400> 1

caaatccttg gcccgaccag taccatgacg gtctcgaaca ttgacgcgag ccctgacggt 60

ttcaatcgcc ccgtcgttgc tgtaaatggc caacatcctg ggccccttgt acgggcgaac 120

aagggtgaca acttccgaat caacgttgtc aacgacctta atgatcccac tatgcttcgg 180

cagacgagtg tgcattggca cggagtgttc cagcacggca cagcctgggc agatggcccc 240

gacggagtca ctcagtgccc gatcgctcag aacggagagt cgtttaagta caggttcaat 300

gctggagctg aagctggcac attctggtac cactctcatt tcggaactca atattgcgac 360

ggattgagag gcccgctcgt gatctacgat ccgaatgacc cgcacaggaa cctttacgat 420

gttgacaatg ccgacactgt cattaccttg gtagactggt accacctaca ggcaccctct 480

attgaggggc ctgcgctttc cgacgcgacc ttgatcaacg gcaaaggtcg acgcccggga 540

ggaccagaga ctgacatcgc aatcgtcaac gtccaacgga accggcgcta cagattccga 600

cttgtgtcaa tgtcgtgcga tcccaactac aagttctcca ttgacggaca caagttgact 660

gtcatcgaag tagacggaca gttgaccgag cctctcatgg tcgacgaaat ccagatcttc 720

gcaggtcagc gctactcatt tgtcctcagt gcgaataggc ctgtcggaaa ttactggatc 780

cgtgcgatcc ccaacgttgg aagcaacaat ctcccaaatt tctcttctgg aggtatcaac 840

tcggcgattc tgcgctatgc tggcgctccc aatgccaatc ccaccagcac tcctgtcact 900

aaccccgttg cgcttcacga atccaacctc catgccctct tgaaccctgg tgccccagga 960

ggaagtggtc cggccgacga gaacattgtg cttcagatgg gccttggacc tgccggcttc 1020

gagatcaacg gtgttacctg ggccaatccc gacagccctg tcatggttca aatcatgaac 1080

ggcgtcccac ctgctgatat tgttcccagt ggtgcgaccc atactttgcc tcgaaaccgt 1140

gttgtcgaag tatccatccc tggattcgag cttgctggac ctcatccttt ccacctgcac 1200

ggccatgcct tcagcgttgt gagaagtgcg ggcagcagca cttacaacta tgagaatccc 1260

gtccgccgcg acgttgtcga cgttggaggt gcaagcgaca acgtcaccat tcgcttcacc 1320

acggataacc caggaccttg gttcttccat tgccacattg agttccacct cgtccttggc 1380

ctcgctatgg tcttcatgga agctcccagt gacattcctt caaccagccc acctccccct 1440

tcctggagtg agctttgccc caaatttgaa agcctcccgg cctcagccac ctctatccaa 1500

attgtcccca ctcct 1515

Claims (10)

1.一种突变的核酸，其特征在于，该突变的核酸的序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种表达载体，其特征在于，该表达载体插入有权利要求1所述的突变的核酸。

3.一种制备高比活力漆酶突变体的方法，其特征在于，该方法包括，使用权利要求2所述的表达载体转化酵母细胞，得到转化后的酵母细胞。

4.根据权利要求3所述的方法，所述方法包括：

(1)提取漆酶基因模板：对Escherichia coli-JM109-T1-pie5菌株进行培养、收集，提取质粒，得到漆酶基因模板；

(2)突变基因克隆：以PIE5-F/PIE5-R/His-PIE5-F为引物，采用易错PCR技术对所述漆酶基因模板进行突变、扩增，得到突变LacMut基因；

(3)表达载体构建：通过酶切连接法，将所述突变LacMut基因插入到pPIC9K启动子AOX1下游，将pPIC9K-LacMut表达载体转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中，得到JM109-pPICK-LacMut菌落；

(4)重组菌株的获得：使用限制性内切酶Sac I对JM109-pPICK-LacMut质粒线性化，通过电转化将线性化表达载体转入宿主毕赤酵母GS115中；

(5)微孔板法初筛选：将重组菌株单克隆转接于含BMGY培养基的96孔板中培养，后加入BMM培养基诱导突变漆酶表达，通过底物活性检测法，检测发酵上清中突变漆酶的活性，筛选出高活性漆酶突变体；

(6)相对比活力检测法定向筛选：通过His MultiTrap预装柱对含组氨酸标签的突变漆酶进行可重复的高通量筛选，获得高比活力的漆酶突变体Pichia pastoris-LacMut。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述PIE5-F的序列为：CGGAATTCCAAATCCTTGGCCCG。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述PIE5-R的序列为：AAGGAAAAAAGCGGCCGCTTAAGGAGTGG。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述His-PIE5-F的序列为：CGGAATTCCATCATCATCATCATCATCAAATCCTTGGCCCG。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述酶切连接法包括：采用EocRⅠ和NotⅠ两种限制性内切酶对所述突变LacMut基因和pPIC9K空载进行双酶切，然后，通过T4连接酶将载体与突变基因连接。

9.一种根据权利要求4-8任意一项所述的方法制备得到的高比活力的漆酶突变体Pichiapastoris-LacMut。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述漆酶突变体Pichia pastoris-LacMut经0.75％甲醇诱导5d，28℃，200rpm培养后，LacMut粗酶活力可达1317U/L，比活力705U/mg。

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