CN106929499A

CN106929499A - 一种定向改造的氨基葡萄糖合酶突变体及其应用

Info

Publication number: CN106929499A
Application number: CN201710282955.4A
Authority: CN
Inventors: 史劲松; 许正宏; 张超; 龚劲松; 李恒; 丁振中; 方祥; 张万宏
Original assignee: YANGZHOU RIXING BIO-TECH Co Ltd; Jiangnan University
Current assignee: YANGZHOU RIXING BIO-TECH Co Ltd; Jiangnan University
Priority date: 2017-04-26
Filing date: 2017-04-26
Publication date: 2017-07-07
Also published as: US20180312829A1; US10233439B2

Abstract

本发明公开了一种定向改造的氨基葡萄糖合酶突变体及其应用。其氨基酸序列如序列表SEQ ID No.1所示，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。本发明成功构建氨基葡萄糖合酶基因工程菌，为提升重组菌对氨基葡萄糖的耐受能力，对氨基葡萄糖合酶进行定向进化改造，通过高通量筛选方法从突变文库中筛选获得一种氨基葡萄糖合酶突变体，突变体氨基酸的变化改变了酶的空间构象，增加了酶与底物结合的区域，提高了酶与底物的结合效率。应用本发明的氨基葡萄糖合酶，具有生产周期短、原料葡萄糖来源丰富、后续提取方便等优点，为发酵法合成氨基葡萄糖的大规模、低成本工业应用奠定了基础。

Description

一种定向改造的氨基葡萄糖合酶突变体及其应用

技术领域

本发明属于工业生物技术领域，具体涉及一种定向改造的氨基葡萄糖合酶突变体及其应用。

背景技术

氨基葡萄糖(Glucosamine,GlcN)，简称氨糖，存在多种有机体中，能够作为蛋白聚糖与糖蛋白的主要成分，在细胞内通过氨基化生成6-磷酸葡萄糖。N-乙酰化氨基葡萄糖(GlcNAc)在医药、食品以及日化等领域有着广泛的应用。传统生产工艺主要采用虾蟹来源的甲壳素为原料，较多采用酸水解进行制备，反应需要浓酸和高温条件，对环境污染严重，设备要求高，且生产成本偏高。随着代谢工程与合成生物学的迅速发展，生物发酵法运用在工业上的生产也日趋成熟，以葡萄糖为原料直接进行氨糖的转化，具有原料成本低、提取简单、产品纯度高、过程污染少等优势。

氨基葡萄糖合酶(简称氨糖合酶，gls)是GlcN生物合成的关键酶，能够催化6-磷酸果糖生成GlcN-6-P，由谷氨酰胺作为氨基供体。该步是GlcN合成途径中第一个限速反应，gls严重受该合成途径代谢产物GlcN-6-P的反馈抑制，因而GlcN-6-P在正常的代谢合成中无法大量积累。为降低这种产物抑制作用，在大肠杆菌E.coli体系中通常采用共表达氨糖乙酰化酶基因，将代谢体系中的GlcN-6-P转化为刺激性较小的GlcNAc-6-P，产物GlcN-6-P和GlcNAc-6-P均可以从胞内转移到胞外，并经去磷酸化作用形成GlcN和GlcNAc，而GlcNAc能在酸性条件下去乙酰化再次转化为GlcN。

gls的生物合成能力偏低、对产物耐受能力较差是影响产量水平提升的主要原因。尽管目前工业生产上使用的菌株已远远突破上述水平，其中大都经过系统的代谢工程技术改造和发酵优化控制，但从有关文献分析，其改造的重点之一是氨糖合酶。

发明内容

本发明旨在提供一种通过基因工程的方法克隆表达氨糖合酶以及通过易错PCR对氨基葡萄糖合酶进行定向改造，从而构建高产氨糖的工程菌的方法。该方法是一种简便、有效地获得DNA序列变异的技术，主要是针对特定的基因，这在遗传和基因改良研究中具有巨大的应用前景。该方法构建的工程菌在工业生产中周期短、能耗少、污染小，完全适合于工业化生产的要求。

本发明为探索gls新的改造策略，首先筛选出较优的表达质粒和表达宿主，进而利用易错PCR对gls进行非理性改造，通过培养基中外加氨糖作为筛选压力，筛选出耐受性提升的突变株。此外，本发明也通过共表达氨基葡萄糖乙酰化酶gnal的方式，削弱GlcN积累对宿主细胞的抑制效应，考察突变株的合成能力。

一种定向改造的氨基葡萄糖合酶突变体，其氨基酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。

上述定向改造的氨基葡萄糖合酶突变体的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。

包含所述氨基葡萄糖合酶突变体基因的工程菌。

上述定向改造的氨基葡萄糖合酶突变体在氨基葡萄糖生物合成中的应用，将突变体通过共表达氨基葡萄糖乙酰化酶，将发酵体系中的氨基葡萄糖转化为乙酰化氨基葡萄糖，从而减少产物的抑制效应，提升氨基葡萄糖产量。

一种通过基因工程手段定向改造氨基葡萄糖合酶的方法，包括克隆表达氨基葡萄糖合酶基因，并采用连续易错PCR，建立突变体文库进行高通量筛选，获得发酵性能提升的氨基葡萄糖合酶突变体M15-9。

所述定向改造的氨基葡萄糖合酶编码基因相对于天然酶60位的丙氨酸变为丝氨酸，128位的缬氨酸变为丙氨酸，352位的天冬氨酸变成了丙氨酸，354位的精氨酸变成半胱氨酸，422位的异亮氨酸变成蛋氨酸，432位的亮氨酸变成了缬氨酸，471位的天冬氨酸变成了谷氨酸，556位的亮氨酸变成了脯氨酸，567位的的缬氨酸变为谷氨酸。上述突变是多轮累积的结果，结构分析结果显示突变酶相对于野生酶疏水性明显增加，导致酶活性中心的残基向里或侧面聚集，同时突变酶的氢键加强，另外带负电荷的氨基酸明显减少，变成了中性氨基酸，减弱了酶分子的极性，更利于酶与底物结合的区域；以上变化改变了酶的空间构象，增加了酶与底物结合的区域，提高了酶与底物的结合效率。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明通过基因工程的方法克隆表达氨糖合酶，采用基因工程手段克隆表达氨糖合酶，通过不同表达质粒和宿主的优化筛选出最优表达体系，以大肠杆菌E.coli为例，成功构建获得E.coli Rosetta-gami(DE3)-pET-24a-gls工程菌，检测其氨糖产量为1.63g/L。为提升重组菌对氨糖的耐受能力，采用易错PCR技术对氨糖合酶进行定向进化改造，通过高通量筛选方法从2700余株突变株中筛选获得一株高产GlcN的菌株，GlcN产量达到3.57g/L，相比出发菌株提高1.19倍。由于GlcN的积累对于氨糖合酶重组菌生长及代谢活动具有一定的抑制作用，本发明进一步通过共表达氨糖乙酰化酶gnal将GlcN转化为乙酰化氨糖GlcNAc从而减少产物的抑制效应，结果表明gnal与gls串联表达能显著提升菌株的发酵能力，GlcN及GlcNAc累积产量达到7.83g/L，相比单独表达gls时提升2.19倍。经过初步摇瓶发酵优化及5L罐发酵验证，结果显示氨糖发酵水平基本稳定，经过22h发酵最高产量可达到9.85g/L。

附图说明

图1为gls基因扩增产物电泳图；

图中的M为Marker,lane 1和lane 2为PCR扩增获得的gls基因,在1800bp左右能看到目的条带。

图2为表达质粒和表达宿主的优化图；

图中，●：pET-28a，■：pET-24a，▲：pRSFDuet-1，◆：pET-22b，图A为E.coli BL21(DE3)的表达宿主；图B为E.coli BL21(DE3)plss；图C为E.coli Rosetta-gami(DE3)。

图3为突变株的GlcN产量；

图中，●：原始菌株；■：第一轮最优突变株；▲：第二轮最优突变株；◆：第三轮最优突变株。

图4为野生酶和M15-9突变酶疏水性的对比；

图中，(A)为野生酶，(B)为M15-9突变酶。

图5为两种酶氢键的对比；

图中，(A)为野生酶，(B)为M15-9突变酶。

图6为两种酶电荷的对比；

图中(A)为野生酶，(B)为M15-9突变酶。

图7为共表达重组菌的GlcN产量；

图中1为gls未突变重组菌；2为gls突变后的重组菌；3为突变后的gls与gnal共表达的重组菌。

图8为7L发酵液中的GlcN和GlcNAc产量

图中●：GlcNAc，▲：GlcN，■：GlcNAc+GlcNAc，◆：OD600，◇：pH。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

实施例1

根据gls基因设计引物5’端的引物为gls(1)，3‘端的引物为gls(2)。根据gnal基因设计引物5’端的引物为gnal(1)，3’端的引物为gnal(2)，本发明中所涉及到的引物序列如表1所示。

表1本实验所用的引物

以引物gls(1)和gls(2)对gls基因进行克隆，反应采用Extaq聚合酶进行扩增，体系为体系为50μL，PCR反应条件为：94℃预变性10min；94℃变性30s，62℃退火45s，72℃延伸60s，35个循环；72℃终延伸10min。PCR反应结束后，将PCR产物进行1.0％的琼脂糖凝胶电泳(图1)，对目的片段进行胶回收。将gls和pMD19-T连接构建克隆质粒，将克隆质粒和表达质粒分别用BamH I和EcoR I进行酶切，然后通过T4连接酶反应构建重组表达质粒。

实施例2

选择四种不同的表达质粒，分别是pET-22b，pET-24a，pET-28a及pRSFduet-1，表达质粒均采用EcoR I和BamH I进行酶切。通过T4连接酶将gls连接到表达质粒上，分别构建重组质粒pET-22b-gls，pET-24a-gls，pET-28a-gls和pRSFduet-1-gls。以E.coli Rosetta-gami(DE3)，E.coli BL21(DE3)，E.coli BL21(DE3)plss作为表达宿主，建立了不同的gls重组表达系统，经筛选获得的阳性克隆加入IPTG进行诱导表达，结果表明以pET-24a作为表达质粒时具有最高氨糖合成能力，在E.coli BL21(DE3)，E.coli BL21(DE3)plss和E.coliRosetta-gami(DE3)分别达到1.31g/L，1.37g/L及1.63g/L(图2)。

实施例3

为提升氨糖合酶的氨糖耐受能力和氨糖产生能力，采用易错PCR方法对氨糖合酶进行定向进化改造。经过优化的易错PCR反应体系如表2所示：

表2易错PCR的反应体系

PCR反应条件为：94℃预变性10min；94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸60s，30个循环；72℃终延伸10min。PCR反应结束后，将PCR产物进行1.0％的琼脂糖凝胶电泳，对目的片段割胶回收，用Elution buffer复溶。将PCR产物进行1.0％的琼脂糖凝胶电泳，对目的片段进行割胶，通过胶回收试剂盒回收。将gls和pET-24a用BamH I和EcoR I进行双酶切，然后通过T₄连接酶反应构建pET-24a-gls重组质粒。

实施例4

将突变的重组质粒转化到E.coli Rosetta-gami(DE3)，转接到5mL含有25g/L氨糖的LB培养基中进行驯化培养，在37℃，220rpm的条件下培养10h。将培养后的菌液涂布于含有25g/L氨糖的LB固体平板上，放置在37℃培养箱中培养12h，实时监测菌落的生长情况。挑取转化子接入含有3％葡萄糖的TB液体培养基，在96孔深孔培养板中进行培养，同时对每个挑取的菌株在孔板上做上标。每孔对应一个阳性转化子，同时预留2孔作为对照，一孔接入出发菌株，一孔只添加培养基不接入任何菌种，培养条件为37℃、220rpm。培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时加入终浓度为0.5mM的IPTG进行产酶诱导，培养条件为25℃、220rpm。发酵24h后测定氨糖含量。

发酵结束后取出深孔板进行离心，然后向深孔板里面加入100μL乙酰丙酮试剂，然后将孔板固定在90℃的水浴锅中水浴1h,取出待其冷却后加入1mL的96％的乙醇，然后加入100μL的DMAB试剂，然后室温显色1h后用排枪从深孔板中对应吸出200μL样品到96孔板中，然后将96孔板放在酶标仪上测量530nm处的分光光度值，筛选出高于出发菌株的编号并再次从平板上挑取出进行培养测量GlcN产量。

实验以pET-24a-gls作为模板，采用易错PCR技术对gls进行体外突变时，应用高浓度GlcN进行驯化以筛选突变株，在96孔板上进行高通量筛选。第一轮易错PCR从1152株克隆中筛选出产量性状得到提升的突变株22株，经复筛验证，其中的编号M4-27突变株GlcN生成量为2.84g/L，产量提升了74.2％。提取该突变株的质粒作为模板，进行下一轮突变和筛选，从864株克隆中筛选出突变株15株，产量最高的一株为3.39g/L(编号M6-9)；第三轮实验从691株克隆中筛选出突变株20株，最高产量达到3.57g/L(编号M15-9)，其产量累计提升119％(图3)。

实施例5

将原始菌株M0-0和最优突变株M15-9接种到LB的种子培养基中，并转接到TB(3％葡萄糖)发酵培养基中在37℃、220r/min的条件下发酵至菌液的OD600至0.6-0.8时，向发酵液中添加终浓度为0.5mmol/L的IPTG并转移到25℃进行诱导，发酵18h后测定产量。野生菌及突变菌各项指标对比如表3所示。

表3菌株摇瓶发酵指标对比

本实施例通过调控反应体系中的MnCl₂和dGTP的含量控制碱基突变率为2-3‰，使每一轮的突变株中均可以获得阳性突变。每一轮突变的碱基和氨基酸位点如表4所示，多轮优势积累最终获得一株稳定高产的菌株M15-9，该突变酶成熟蛋白的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该氨糖合酶野生酶氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

表4突变碱基和氨基酸

氨糖合酶的模型构建：通过与蛋白质数据库(PDB)内同源性高的蛋白序列分析，利用在线软件SWISS-MODEL进行同源建模，获得氨糖合酶的立体结构模型。通过序列和结构分析得知氨糖合酶的三维结构活性中心附近有两个位点的改变，尤其是突变位点352(D-A)和354(R-C)的改变对底物果糖-6-磷酸的结合区域的影响最大，具体改变如下：

①疏水性的对比

在酶的氨基酸残基变化后，导致如图4B左下角区域中的突变酶相对于野生酶有明显疏水性的增加，导致酶活性中心的残基向里或侧面聚集，改变了酶的空间构象，增加了酶与底物结合的区域，提高了酶的结合效率。

②氢键的对比

如图5的(A)中的野生酶中含有5个氢键，图5的(B)中含有7个氢键，活性中心的氢键加强。氢键及疏水相互作用在维系酶分子三维构象的稳定性中起着至关重要的作用。活性中心周围由氢键连接起来增强了非极性基团之间的疏水相互作用，也使得酶分子三维构象更加稳定。残基的改变导致氢键的增减和相互作用影响了酶的空间结构，从而影响了酶分子的三维构象，提升了酶和底物的催化效率。

③电荷的对比

在酶的氨基酸残基变化后，导致如图6的(B)左下角区域中的突变酶相对于野生酶带负电荷的氨基酸明显减少，变成了中性氨基酸，减弱了酶分子的极性，更利于酶与底物结合的区域，提高了酶与底物的结合效率。

实施例6

由于乙酰氨基葡萄糖对细胞刺激性小，且在下游提取过程中，用弱酸进行脱乙酰化即可转化为GlcN，所以发酵产物通常是乙酰氨基葡萄糖。以引物gnal(1)和gnal(2)对gnal基因进行扩增，将PCR产物进行1.0％的琼脂糖凝胶电泳，对目的片段割胶回收，然后将gnal和pET-24a-gls用Hind III和Xho I进行双酶切，然后通过T₄连接酶反应构建pET-24a-gls-gnal重组质粒。并将重组质粒导入到E.coli Rosetta-gami(DE3)中，将验证成功后的阳性克隆子接入发酵培养基，在37℃、250r/min的条件下发酵至菌液的OD₆₀₀至0.6～0.8时，向发酵液中添加终浓度为0.5mmol/L的IPTG并转移到25℃进行诱导，发酵18h后测定GlcN和GlcNAc的含量，结果显示，GlcN及GlcNAc累积产量达到8.57g/L，相比单独表达gls时产量提升2.4倍(图7)。

在7L数控式发酵罐中进行分批补糖发酵实验，初始装液量控制在4L。接种量5％，初始培养温度37℃，诱导后在25℃下进行培养。由于发酵过程中产酸，实验通过补加氨水调节pH。图8为7L发酵罐上的分批发酵过程曲线。16h时生物量OD600达到最高，而GlcN、GlcNAc浓度要到20h后才达到最高，分别为3.93g/L、5.86g/L，二者在22h累计达到最高，为9.79g/L。

以上公开的仅为本发明的具体实施例，但是，本发明并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 扬州日兴生物科技股份有限公司；江南大学

<120> 一种定向改造的氨基葡萄糖合酶突变体及其应用

<130> 1111

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 600

<212> PRT

<213> E.coli

<400> 1

Met Cys Gly Ile Val Gly Tyr Ile Gly Gln Leu Asp Ala Lys Glu Ile

1 5 10 15

Leu Leu Lys Gly Leu Glu Lys Leu Glu Tyr Arg Gly Tyr Asp Ser Ala

20 25 30

Gly Ile Ala Val Ala Asn Glu Gln Gly Ile His Val Phe Lys Glu Lys

35 40 45

Gly Arg Ile Ala Asp Leu Arg Glu Val Val Asp Ser Asn Val Glu Ala

50 55 60

Lys Ala Gly Ile Gly His Thr Arg Trp Ala Thr His Gly Glu Pro Ser

65 70 75 80

Tyr Leu Asn Ala His Pro His Gln Ser Ala Leu Gly Arg Phe Thr Leu

85 90 95

Val His Asn Gly Val Ile Glu Asn Tyr Val Gln Leu Lys Gln Glu Tyr

100 105 110

Leu Gln Asp Val Glu Leu Lys Ser Asp Thr Asp Thr Glu Val Val Ala

115 120 125

Gln Val Ile Glu Gln Phe Val Asn Gly Gly Leu Glu Thr Glu Glu Ala

130 135 140

Phe Arg Lys Thr Leu Thr Leu Leu Lys Gly Ser Tyr Ala Ile Ala Leu

145 150 155 160

Phe Asp Asn Asp Asn Arg Glu Thr Ile Phe Val Ala Lys Asn Lys Ser

165 170 175

Pro Leu Leu Val Gly Leu Gly Asp Thr Phe Asn Val Val Ala Ser Asp

180 185 190

Ala Met Ala Met Leu Gln Val Thr Asn Glu Tyr Val Glu Leu Met Asp

195 200 205

Lys Glu Met Val Ile Val Thr Asp Asp Gln Val Val Ile Lys Asn Leu

210 215 220

Asp Gly Asp Val Ile Thr Arg Ala Ser Tyr Ile Ala Glu Leu Asp Ala

225 230 235 240

Ser Asp Ile Glu Lys Gly Thr Tyr Pro His Tyr Met Leu Lys Glu Thr

245 250 255

Asp Glu Gln Pro Val Val Met Arg Lys Ile Ile Gln Thr Tyr Gln Asp

260 265 270

Glu Asn Gly Lys Leu Ser Val Pro Gly Asp Ile Ala Ala Ala Val Ala

275 280 285

Glu Ala Asp Arg Ile Tyr Ile Ile Gly Cys Gly Thr Ser Tyr His Ala

290 295 300

Gly Leu Val Gly Lys Gln Tyr Ile Glu Met Trp Ala Asn Val Pro Val

305 310 315 320

Glu Val His Val Ala Ser Glu Phe Ser Tyr Asn Met Pro Leu Leu Ser

325 330 335

Lys Lys Pro Leu Phe Ile Phe Leu Ser Gln Ser Gly Glu Thr Ala Ala

340 345 350

Ser Cys Ala Val Leu Val Gln Val Lys Ala Leu Gly His Lys Ala Leu

355 360 365

Thr Ile Thr Asn Val Pro Gly Ser Thr Leu Ser Arg Glu Ala Asp Tyr

370 375 380

Thr Leu Leu Leu His Ala Gly Pro Glu Ile Ala Val Ala Ser Thr Lys

385 390 395 400

Ala Tyr Thr Ala Gln Ile Ala Val Leu Ala Val Leu Ala Ser Val Ala

405 410 415

Ala Asp Lys Asn Gly Met Asn Ile Gly Phe Asp Leu Val Lys Glu Val

420 425 430

Gly Ile Ala Ala Asn Ala Met Glu Ala Leu Cys Asp Gln Lys Asp Glu

435 440 445

Met Glu Met Ile Ala Arg Glu Tyr Leu Thr Val Ser Arg Asn Ala Phe

450 455 460

Phe Ile Gly Arg Gly Leu Glu Tyr Phe Val Cys Val Glu Gly Ala Leu

465 470 475 480

Lys Leu Lys Glu Ile Ser Tyr Ile Gln Ala Glu Gly Phe Ala Gly Gly

485 490 495

Glu Leu Lys His Gly Thr Ile Ala Leu Ile Glu Gln Gly Thr Pro Val

500 505 510

Phe Ala Leu Ala Thr Gln Glu His Val Asn Leu Ser Ile Arg Gly Asn

515 520 525

Val Lys Glu Val Ala Ala Arg Gly Ala Asn Thr Cys Ile Ile Ser Leu

530 535 540

Lys Gly Leu Asp Asp Ala Asp Asp Arg Phe Val Pro Pro Glu Val Asn

545 550 555 560

Pro Ala Leu Ala Pro Leu Glu Ser Val Val Pro Leu Gln Leu Ile Ala

565 570 575

Tyr Tyr Ala Ala Leu His Arg Gly Cys Asp Val Asp Lys Pro Arg Asn

580 585 590

Leu Ala Lys Ser Val Thr Val Glu

595 600

<210> 2

<211> 1803

<212> DNA

<213> E.coli

<400> 2

atgtgcggca ttgtgggtta tatcggccag ctggatgcaa aagaaattct gctgaaaggt 60

ctggaaaaac tggaatatcg cggttacgat agcgcgggca ttgctgtcgc gaacgaacaa 120

ggtatccatg tgttcaaaga aaaaggccgt attgccgatc tgcgcgaagt ggttgactca 180

aacgtggaag ccaaagcagg catcggtcat acccgttggg caacgcacgg cgaaccgagt 240

tacctgaatg ctcatccgca ccagtccgcg ctgggtcgtt ttaccctggt gcacaacggc 300

gttattgaaa attatgtgca gctgaaacaa gaatacctgc aagatgttga actgaaaagc 360

gataccgaca cggaagtcgt ggctcaggtt atcgaacaat ttgtcaatgg cggtctggaa 420

accgaagaag cgttccgcaa aaccctgacg ctgctgaaag gttcttatgc tattgcgctg 480

tttgataacg acaatcgtga aacgatcttc gtggccaaaa acaaatcacc gctgctggtt 540

ggcctgggtg ataccttcaa tgtcgtggca tcggacgcga tggcgatgct gcaggtgacg 600

aacgaatatg ttgaactgat ggataaagaa atggttattg tcaccgatga ccaagttgtc 660

atcaaaaatc tggatggtga cgtgattacg cgtgcaagct acatcgctga actggatgcg 720

tctgacattg aaaaaggcac ctatccgcat tacatgctga aagaaacgga tgaacagccg 780

gtggttatgc gcaaaattat ccagacctat caagatgaaa acggtaaact gagcgttccg 840

ggcgatattg cggcggcagt cgctgaagcg gaccgtatct atattatcgg ctgtggcacg 900

tcttaccatg cgggtctggt gggcaaacag tatattgaaa tgtgggccaa cgtgccggtt 960

gaagtccacg tggcaagtga attttcctac aatatgccgc tgctgagtaa aaaaccgctg 1020

tttattttcc tgagccagtc tggcgaaacc gccgcttcct gcgcagttct ggtccaagtg 1080

aaagccctgg gtcataaagc actgaccatc acgaatgtgc cgggctcaac cctgtcgcgt 1140

gaagctgatt atacgctgct gctgcacgcg ggtccggaaa ttgccgttgc aagcaccaaa 1200

gcgtatacgg cacagatcgc agtcctggca gtgctggctt ctgtggctgc ggataaaaac 1260

ggtatgaata tcggctttga cctggttaaa gaagtgggca ttgccgcaaa cgcgatggaa 1320

gccctgtgcg atcagaaaga cgaaatggaa atgattgctc gtgaatatct gaccgtgagt 1380

cgcaatgcct ttttcatcgg ccgtggtctg gagtattttg tttgtgtcga aggtgccctg 1440

aaactgaaag aaatttccta catccaggct gaaggcttcg cgggcggtga actgaaacat 1500

ggtaccattg cgctgatcga acagggcacc ccggtctttg ctctggcgac gcaagaacac 1560

gttaacctgt caattcgcgg taatgttaaa gaagtcgctg cgcgtggcgc aaacacctgc 1620

attatctcgc tgaaaggtct ggatgacgcg gatgaccgct ttgtcccgcc ggaagtgaat 1680

ccggcactgg caccgctgga gagtgtcgtg ccgctgcagc tgatcgcgta ttacgccgca 1740

ctgcatcgcg gctgtgatgt tgacaaaccg cgtaacctgg ccaaaagcgt gaccgttgaa 1800

taa 1803

<210> 3

<211> 600

<212> PRT

<213> E.coli

<400> 3

Met Cys Gly Ile Val Gly Tyr Ile Gly Gln Leu Asp Ala Lys Glu Ile

1 5 10 15

Leu Leu Lys Gly Leu Glu Lys Leu Glu Tyr Arg Gly Tyr Asp Ser Ala

20 25 30

Gly Ile Ala Val Ala Asn Glu Gln Gly Ile His Val Phe Lys Glu Lys

35 40 45

Gly Arg Ile Ala Asp Leu Arg Glu Val Val Asp Ala Asn Val Glu Ala

50 55 60

Lys Ala Gly Ile Gly His Thr Arg Trp Ala Thr His Gly Glu Pro Ser

65 70 75 80

Tyr Leu Asn Ala His Pro His Gln Ser Ala Leu Gly Arg Phe Thr Leu

85 90 95

Val His Asn Gly Val Ile Glu Asn Tyr Val Gln Leu Lys Gln Glu Tyr

100 105 110

Leu Gln Asp Val Glu Leu Lys Ser Asp Thr Asp Thr Glu Val Val Val

115 120 125

Gln Val Ile Glu Gln Phe Val Asn Gly Gly Leu Glu Thr Glu Glu Ala

130 135 140

Phe Arg Lys Thr Leu Thr Leu Leu Lys Gly Ser Tyr Ala Ile Ala Leu

145 150 155 160

Phe Asp Asn Asp Asn Arg Glu Thr Ile Phe Val Ala Lys Asn Lys Ser

165 170 175

Pro Leu Leu Val Gly Leu Gly Asp Thr Phe Asn Val Val Ala Ser Asp

180 185 190

Ala Met Ala Met Leu Gln Val Thr Asn Glu Tyr Val Glu Leu Met Asp

195 200 205

Lys Glu Met Val Ile Val Thr Asp Asp Gln Val Val Ile Lys Asn Leu

210 215 220

Asp Gly Asp Val Ile Thr Arg Ala Ser Tyr Ile Ala Glu Leu Asp Ala

225 230 235 240

Ser Asp Ile Glu Lys Gly Thr Tyr Pro His Tyr Met Leu Lys Glu Thr

245 250 255

Asp Glu Gln Pro Val Val Met Arg Lys Ile Ile Gln Thr Tyr Gln Asp

260 265 270

Glu Asn Gly Lys Leu Ser Val Pro Gly Asp Ile Ala Ala Ala Val Ala

275 280 285

Glu Ala Asp Arg Ile Tyr Ile Ile Gly Cys Gly Thr Ser Tyr His Ala

290 295 300

Gly Leu Val Gly Lys Gln Tyr Ile Glu Met Trp Ala Asn Val Pro Val

305 310 315 320

Glu Val His Val Ala Ser Glu Phe Ser Tyr Asn Met Pro Leu Leu Ser

325 330 335

Lys Lys Pro Leu Phe Ile Phe Leu Ser Gln Ser Gly Glu Thr Ala Asp

340 345 350

Ser Arg Ala Val Leu Val Gln Val Lys Ala Leu Gly His Lys Ala Leu

355 360 365

Thr Ile Thr Asn Val Pro Gly Ser Thr Leu Ser Arg Glu Ala Asp Tyr

370 375 380

Thr Leu Leu Leu His Ala Gly Pro Glu Ile Ala Val Ala Ser Thr Lys

385 390 395 400

Ala Tyr Thr Ala Gln Ile Ala Val Leu Ala Val Leu Ala Ser Val Ala

405 410 415

Ala Asp Lys Asn Gly Ile Asn Ile Gly Phe Asp Leu Val Lys Glu Leu

420 425 430

Gly Ile Ala Ala Asn Ala Met Glu Ala Leu Cys Asp Gln Lys Asp Glu

435 440 445

Met Glu Met Ile Ala Arg Glu Tyr Leu Thr Val Ser Arg Asn Ala Phe

450 455 460

Phe Ile Gly Arg Gly Leu Asp Tyr Phe Val Cys Val Glu Gly Ala Leu

465 470 475 480

Lys Leu Lys Glu Ile Ser Tyr Ile Gln Ala Glu Gly Phe Ala Gly Gly

485 490 495

Glu Leu Lys His Gly Thr Ile Ala Leu Ile Glu Gln Gly Thr Pro Val

500 505 510

Phe Ala Leu Ala Thr Gln Glu His Val Asn Leu Ser Ile Arg Gly Asn

515 520 525

Val Lys Glu Val Ala Ala Arg Gly Ala Asn Thr Cys Ile Ile Ser Leu

530 535 540

Lys Gly Leu Asp Asp Ala Asp Asp Arg Phe Val Leu Pro Glu Val Asn

545 550 555 560

Pro Ala Leu Ala Pro Leu Val Ser Val Val Pro Leu Gln Leu Ile Ala

565 570 575

Tyr Tyr Ala Ala Leu His Arg Gly Cys Asp Val Asp Lys Pro Arg Asn

580 585 590

Leu Ala Lys Ser Val Thr Val Glu

595 600

<210> 4

<211> 1803

<212> DNA

<213> E.coli

<400> 4

atgtgcggca ttgtgggtta tatcggccag ctggatgcaa aagaaattct gctgaaaggt 60

ctggaaaaac tggaatatcg cggttacgat agcgcgggca ttgctgtcgc gaacgaacaa 120

ggtatccatg tgttcaaaga aaaaggccgt attgccgatc tgcgcgaagt ggttgacgca 180

aacgtggaag ccaaagcagg catcggtcat acccgttggg caacgcacgg cgaaccgagt 240

tacctgaatg ctcatccgca ccagtccgcg ctgggtcgtt ttaccctggt gcacaacggc 300

gttattgaaa attatgtgca gctgaaacaa gaatacctgc aagatgttga actgaaaagc 360

gataccgaca cggaagtcgt ggttcaggtt atcgaacaat ttgtcaatgg cggtctggaa 420

accgaagaag cgttccgcaa aaccctgacg ctgctgaaag gttcttatgc tattgcgctg 480

tttgataacg acaatcgtga aacgatcttc gtggccaaaa acaaatcacc gctgctggtt 540

ggcctgggtg ataccttcaa tgtcgtggca tcggacgcga tggcgatgct gcaggtgacg 600

aacgaatatg ttgaactgat ggataaagaa atggttattg tcaccgatga ccaagttgtc 660

atcaaaaatc tggatggtga cgtgattacg cgtgcaagct acatcgctga actggatgcg 720

tctgacattg aaaaaggcac ctatccgcat tacatgctga aagaaacgga tgaacagccg 780

gtggttatgc gcaaaattat ccagacctat caagatgaaa acggtaaact gagcgttccg 840

ggcgatattg cggcggcagt cgctgaagcg gaccgtatct atattatcgg ctgtggcacg 900

tcttaccatg cgggtctggt gggcaaacag tatattgaaa tgtgggccaa cgtgccggtt 960

gaagtccacg tggcaagtga attttcctac aatatgccgc tgctgagtaa aaaaccgctg 1020

tttattttcc tgagccagtc tggcgaaacc gccgattccc gcgcagttct ggtccaagtg 1080

aaagccctgg gtcataaagc actgaccatc acgaatgtgc cgggctcaac cctgtcgcgt 1140

gaagctgatt atacgctgct gctgcacgcg ggtccggaaa ttgccgttgc aagcaccaaa 1200

gcgtatacgg cacagatcgc agtcctggca gtgctggctt ctgtggctgc ggataaaaac 1260

ggtattaata tcggctttga cctggttaaa gaactgggca ttgccgcaaa cgcgatggaa 1320

gccctgtgcg atcagaaaga cgaaatggaa atgattgctc gtgaatatct gaccgtgagt 1380

cgcaatgcct ttttcatcgg ccgtggtctg gattattttg tttgtgtcga aggtgccctg 1440

aaactgaaag aaatttccta catccaggct gaaggcttcg cgggcggtga actgaaacat 1500

ggtaccattg cgctgatcga acagggcacc ccggtctttg ctctggcgac gcaagaacac 1560

gttaacctgt caattcgcgg taatgttaaa gaagtcgctg cgcgtggcgc aaacacctgc 1620

attatctcgc tgaaaggtct ggatgacgcg gatgaccgct ttgtcctgcc ggaagtgaat 1680

ccggcactgg caccgctggt gagtgtcgtg ccgctgcagc tgatcgcgta ttacgccgca 1740

ctgcatcgcg gctgtgatgt tgacaaaccg cgtaacctgg ccaaaagcgt gaccgttgaa 1800

taa 1803

Claims

1.一种定向改造的氨基葡萄糖合酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如序列表SEQID No.1所示。

2.权利要求1所述定向改造的氨基葡萄糖合酶突变体的基因，其特征在于，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。

3.包含权利要求2所述氨基葡萄糖合酶突变体基因的工程菌。

4.权利要求1所述定向改造的氨基葡萄糖合酶突变体在氨基葡萄糖生物合成中的应用，其特征在于，将突变体通过共表达氨基葡萄糖乙酰化酶，将发酵体系中的氨基葡萄糖转化为乙酰化氨基葡萄糖，从而减少产物的抑制效应，提升氨基葡萄糖产量。

5.一种通过基因工程手段定向改造氨基葡萄糖合酶的方法，其特征在于，包括克隆表达氨基葡萄糖合酶基因，并采用连续易错PCR，建立突变体文库进行高通量筛选，获得发酵性能提升的氨基葡萄糖合酶突变体M15-9。

6.根据权利要求5所述的通过基因工程手段定向改造氨基葡萄糖合酶的方法，其特征在于，所述定向改造的氨基葡萄糖合酶编码基因相对于天然酶60位的丙氨酸变为丝氨酸，128位的缬氨酸变为丙氨酸，352位的天冬氨酸变成了丙氨酸，354位的精氨酸变成半胱氨酸，422位的异亮氨酸变成蛋氨酸，432位的亮氨酸变成了缬氨酸，471位的天冬氨酸变成了谷氨酸，556位的亮氨酸变成了脯氨酸，567位的的缬氨酸变为谷氨酸。