CN110184229B - 一种提高重组枯草芽孢杆菌合成n-乙酰氨基葡萄糖效率的方法 - Google Patents

一种提高重组枯草芽孢杆菌合成n-乙酰氨基葡萄糖效率的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高重组枯草芽孢杆菌合成N‑乙酰氨基葡萄糖效率的方法，属于遗传工程技术领域。本发明以枯草芽孢杆菌自身功能膜微域FMMs为空间支架，以双质粒系统形式将FMMs定位功能结构域SPFH domain分别与氨基葡萄糖‑6‑磷酸合成酶GlmS和氨基葡萄糖‑6‑磷酸乙酰化酶GNA1进行融合表达，并通过一对工具小肽CC‑Di‑A和CC‑Di‑B调控GlmS与GNA1之间的化学计量比。在摇瓶发酵过程中，对照菌株的乙酰氨基葡萄糖的产量仅为1.97g/L，而G1:N2的乙酰氨基葡萄糖产量增加至6.15g/L，是对照菌株的3.12倍。本发明的重组枯草芽孢杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好的应用前景。

Description

一种提高重组枯草芽孢杆菌合成N-乙酰氨基葡萄糖效率的 方法
技术领域
本发明涉及一种提高重组枯草芽孢杆菌合成N-乙酰氨基葡萄糖效率的方法，属于遗传工程技术领域。
背景技术
在人体中，乙酰氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖单元的合成前体，其对修复和维持软骨及关节组织功能具有重要作用。因此，乙酰氨基葡萄糖被广泛添加在药物和营养膳食中来治疗和修复关节损伤。此外，乙酰氨基葡萄糖在化妆品和制药领域也具有诸多应用。
目前，乙酰氨基葡萄糖的生产原料主要为酸解虾壳或蟹壳中的甲壳素，然而，此方法产生的废液对环境污染较为严重，而且得到的产品易引起过敏反应，不适宜海鲜过敏的人群服用。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为GRAS(Generally Regarded as Safe)安全级别。
前期研究发现，利用细胞自身的支架构建多酶复合体系统可以在不加重细胞代谢负担的前提下显著提高N-乙酰氨基葡萄糖的产量。然而，研究过程中发现我们所构建的支架-多酶复合体系统存在代谢溢流。因此，提高一种减少代谢溢流的支架-多酶复合体系统，对于提高N-乙酰氨基葡萄糖产量有重要的意义。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种提高重组枯草芽孢杆菌合成N-乙酰氨基葡萄糖效率的方法，所述重组枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌自身的功能膜微域FMMs作为空间支架，融合表达FMMs定位功能结构域SPFH domain、氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS与氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰化酶GNA1，并以工具小肽CC-Di-A和CC-Di-B分别调控氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS与氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰化酶GNA1，使GlmS与GNA1的化学计量比为1:1～3；所述CC-Di-A的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述CC-Di-B的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明的第二个目的是提供一种重组枯草芽孢杆菌，以枯草芽孢杆菌自身的功能膜微域FMMs作为空间支架，通过双质粒系统表达FMMs定位功能结构域SPFH domain、氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS与氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰化酶GNA1；以工具小肽CC-Di-A和CC-Di-B分别调控氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS与氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰化酶GNA1，使GlmS与GNA1化学计量比为1:1～3；双质粒系统中包括A质粒和B质粒，A质粒表达SPFH domain、氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS和CC-Di-A，B质粒表达氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰化酶GNA1和CC-Di-B。
在本发明的一种实施方式中，以枯草芽孢杆菌BSN6作为出发菌株。
在本发明的一种实施方式中，所述A质粒为pHT01，所述B质粒为pP43。
在本发明的一种实施方式中，所述氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的编码基因的核苷酸序列如NCBI-Gene ID:938736所示。
在本发明的一种实施方式中，所述氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰化酶的编码基因的核苷酸序列如NCBI-Gene ID:179437所示。
在本发明的一种实施方式中，所述小肽CC-Di-A的编码基因的核苷酸序列如SEQID NO:2所示。
在本发明的一种实施方式中，所述小肽CC-Di-B的编码基因的核苷酸序列如SEQID NO:3所示。
在本发明的一种实施方式中，所述小肽CC-Di-A与氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶连接的linker的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在本发明的一种实施方式中，所述小肽CC-Di-B与氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰化酶与之间连接的linker的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明的第三个目的是提供上述重组枯草芽孢杆菌的构建方法，包括如下步骤:
(1)以pP43为载体，构建游离表达GNA1基因和CC-Di-B基因的质粒，转化入枯草芽孢杆菌BSN6感受态中，得到重组枯草芽孢杆菌pBG；
(2)以pHT01为载体，构建游离表达含有SPFH、GlmS、不同份数的CC-Di-A融合表达片段的质粒，得到pHT01-SPFH-(CC-Di-A)n-GlmS重组质粒，其中n为1-3，将重组质粒转入(1)中的重组枯草芽孢杆菌pBG中，得到重组芽孢杆菌。
本发明的第四个目的是提供一种重组枯草芽孢杆菌制备N-乙酰氨基葡萄糖的方法，应用了权利要求2-4任一所述重组枯草芽孢杆菌进行发酵培养得到N-乙酰氨基葡萄糖。
在本发明的一种实施方式中，重组菌在35～38℃下在种子培养基中活化，活化后的种子以2-5％的接种量接入发酵培养基中，在35～38℃下发酵培养。
在本发明的一种实施方式中，种子培养基包括以下成分：蛋白胨、酵母粉和氯化钠。
在本发明的一种实施方式中，种子培养基以其重量为基准，包括以下成分：5～15g/L蛋白胨、5～10g/L酵母粉和5～15g/L氯化钠。
在本发明的一种实施方式中，发酵培养基包括以下成分：葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、硫酸铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、碳酸钙和微量元素溶液。
在本发明的一种实施方式中，发酵培养基以其重量为基准，包括以下成分：30-60g/L葡萄糖、5～8g/L蛋白胨、10～15g/L酵母粉、5～8g/L硫酸铵、10～15g/L磷酸氢二钾、2～3g/L磷酸二氢钾、4～6g/L碳酸钙和8～12ml/L微量元素溶液。
在本发明的一种实施方式中，微量元素溶液包括：硫酸锰、氯化钴、钼酸钠、硫酸锌、氯化铝、氯化铜、硼酸和盐酸。
在本发明的一种实施方式中，微量元素溶液以其重量为基准，包括以下成分：0.8～1.2g/L硫酸锰、0.2～0.6g/L氯化钴、0.1～0.3g/L钼酸钠、0.1～0.3g/L硫酸锌、0.1～0.3g/L氯化铝、0.1～0.3g/L氯化铜、0.04～0.06g/L硼酸和3～8mol/L盐酸。
本发明的第五个目的是提供上述重组枯草芽孢杆菌在化妆品或制药领域内制备含N-乙酰氨基葡萄糖产品的应用。
本发明的第六个目的是提供上述的方法在化妆品或制药领域内制备含N-乙酰氨基葡萄糖产品的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明选择枯草芽孢杆菌自身的功能膜微域FMMs作为空间支架，以双质粒系统形式将FMMs定位功能结构域SPFH domain分别与氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS和氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰化酶GNA1进行融合表达，并通过一对工具小肽CC-Di-A和CC-Di-B调控GlmS与GNA1之间的化学计量比，将不同化学计量比组成的Glms和GNA1多酶复合体固定在支架上，以提高N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)的产量。在复合培养基摇瓶发酵过程中，对照菌株GN的乙酰氨基葡萄糖的产量仅为1.97g/L，而G1:N2的乙酰氨基葡萄糖产量增加至6.15g/L，是对照菌株GN的3.12倍。本发明的重组枯草芽孢杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好的应用前景。
附图说明
图1为发酵过程中，GN和SPFH-GN菌株发酵液中乙酰氨基葡萄糖GlcNAc的含量(A)和细胞生长情况((B)。
图2为质膜上用不同化学计量比的GFP标记的SPFH domain的分布和动态特征：(A)和(E)、(B)和(F)、(C)和(G)、(D)和(H)分别为BBE、BBE1、BBE2、BBE3菌株的激光共聚焦显微术成像图和全内反射荧光显微术成像图。(J)、(K)、(L)、(M)分别为BBE、BBE1、BBE2、BBE3菌株在如图(I)中圆圈所示荧光点的荧光相对强度分析。
图3为发酵过程中，G1:N1、G1:N2、G1:N3菌株发酵液中乙酰氨基葡萄糖GlcNAc的含量。
图4:为发酵过程中，G1:N1、G1:N2、G1:N3细胞生长情况。
具体实施方式
(一)培养基
种子培养基的成分包括：10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉和10g/L氯化钠。
发酵培养基的成分包括：40g/L葡萄糖、6g/L蛋白胨、12g/L酵母粉、6g/L硫酸铵、12.5g/L磷酸氢二钾、2.5g/L磷酸二氢钾、5g/L碳酸钙和10mL/L微量元素溶液。
其中微量元素溶液以其重量为基准，包括如下成分：1.0g/L硫酸锰、0.4g/L氯化钴、0.2g/L钼酸钠、0.2g/L硫酸锌、0.1g/L氯化铝、0.1g/L氯化铜、0.05g/L硼酸和5mol/L盐酸。
(二)高效液相色谱法检测乙酰氨基葡萄糖的含量
高效液相色谱法测试条件：仪器型号Agilent 1200，RID检测器，柱子：有机酸柱(250×4.6mm，5μm)，流动相：5mM H2SO4，流速0.6mL/min，柱温40℃，进样体积为10μL。
菌株生长情况检测：使用紫外-可见分光光度计定时测定发酵液的吸光光度值OD600。
下面结合具体实施例，对本发明的技术方案作进一步详细描述。以下实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的保护范围。
实施例1：构建重组枯草芽孢杆菌SPFH-BB、BB
以pStop为载体，将GFP基因与FMMs定位功能结构域SPFH domain的编码基因SPFH融合表达，构建得到pStop-SPFH-GFP质粒；以pStop为载体，将小肽的编码基因CC-Di-B和GFP基因融合表达，构建得到pStop-CC-Di-B-GFP质粒。将pStop-SPFH-GFP质粒、pStop-CC-Di-B-GFP质粒分别转入枯草芽孢杆菌BSN6中，通过四环素抗性平板筛选、菌落PCR验证、测序，确认构建成功得到重组芽孢杆菌SPFH-BB、BB。
实施例2：构建枯草芽孢杆菌BBE、BBE1、BBE2、BBE3
以pHT01为载体，将GlmS基因与FMMs定位功能结构域SPFH domain的编码基因SPFH融合表达，构建得到pHT01-SPFH-Glms质粒，转入重组芽孢杆菌SPFH-BB中，通过氯霉素抗性平板筛选、菌落PCR验证、测序，确认构建成功得到重组芽孢杆菌BBE。
以pHT01为载体，将GlmS基因与FMMs定位功能结构域SPFH domain的编码基因SPFH和一份小肽的编码基因CC-Di-A融合表达，构建得到pHT01-SPFH-CC-Di-A-Glms质粒；以pHT01为载体，将GlmS基因与FMMs定位功能结构域SPFH domain的编码基因SPFH和二份小肽的编码基因CC-Di-A融合表达，构建得到pHT01-SPFH-(CC-Di-A)2-GlmS质粒；以pHT01为载体，将GlmS基因与FMMs定位功能结构域SPFH domain的编码基因SPFH和三份小肽的编码基因CC-Di-A融合表达，构建得到pHT01-SPFH-(CC-Di-A)3-GlmS质粒。将pHT01-SPFH-CC-Di-A-Glms、pHT01-SPFH-(CC-Di-A)2-GlmS、pHT01-SPFH-(CC-Di-A)3-GlmS质粒分别转入重组芽孢杆菌BB中，通过氯霉素抗性平板筛选、菌落PCR验证、测序，确认构建成功得到重组芽孢杆菌BBE1、BBE2、BBE3。
实施例3：验证通过调控工具小肽CC-Di-A和CC-Di-B之间的化学计量比，可以调控多酶复合体中酶的组成
通过使用4％的多聚甲醛分别对枯草芽孢杆菌BBE、BBE1、BBE2、BBE3进行固定，将固定过后的BBE、BBE1、BBE2、BBE3置于VA-TIRFM下观察，获取连续的时间序列图像，并对该图像进行荧光强度追踪，绘制荧光漂白曲线(图2J、K、L、M)。通过对荧光漂白曲线的分析，发现漂白曲线存在一步漂白、两步漂白、三步漂白，即比例CC-Di-A：CC-Di-B＝1:1、2:1、3:1时，能够结合一份、两份、三份的GFP蛋白。上述结果说明，小肽CC-Di-A与CC-Di-B可以调控与之相融合的基因的化学计量比，进而调控多酶复合体中酶的组成。
实施例4：构建重组枯草芽孢杆菌pG、pSG、pBG
以pP43为载体，游离表达GNA1基因，构建得到pP43-GNA1质粒；以pP43为载体，将GNA1基因与FMMs定位功能结构域SPFH domain的编码基因SPFH融合表达，构建得到pP43-SPFH-GNA1质粒；以pP43为载体，将小肽的编码基因CC-Di-B和氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰化酶的编码基因GNA1融合表达，构建得到pP43-CC-Di-B-GNA1质粒。将pP43-GNA1质粒、pP43-SPFH-GNA1质粒、pP43-CC-Di-B-GNA1质粒分别转入枯草芽孢杆菌BSN6中，通过卡那霉素抗性平板筛选、菌落PCR验证、测序，确认构建成功得到重组芽孢杆菌pG、pSG、pBG。
实施例5：构建重组枯草芽孢杆菌GN、SPFH-GN、G1:N1、G1:N2、G1:N3
以pHT01为载体，游离表达GlmS基因，构建得到pHT01-GlmS质粒，转入重组芽孢杆菌pG中，通过氯霉素抗性平板筛选、菌落PCR验证、测序，确认构建成功得到重组芽孢杆菌GN。
以pHT01为载体，将Glms基因与FMMs定位功能结构域SPFH domain的编码基因SPFH融合表达，构建得到pHT01-SPFH-GlmS质粒，转入重组芽孢杆菌pSG中，通过氯霉素抗性平板筛选、菌落PCR验证、测序，确认构建成功得到重组芽孢杆菌SPFH-GN。
以pHT01为载体，将GlmS基因与FMMs定位功能结构域SPFH domain的编码基因SPFH和一份小肽的编码基因CC-Di-A融合表达，构建得到pHT01-SPFH-CC-Di-A-Glms质粒；以pHT01为载体，将GlmS基因与FMMs定位功能结构域SPFH domain的编码基因SPFH和二份小肽的编码基因CC-Di-A融合表达，构建得到pHT01-SPFH-(CC-Di-A)2-GlmS质粒；以pHT01为载体，将GlmS基因与FMMs定位功能结构域SPFH domain的编码基因SPFH和三份小肽的编码基因CC-Di-A融合表达，构建得到pHT01-SPFH-(CC-Di-A)3-GlmS质粒。将pHT01-SPFH-CC-Di-A-Glms质粒、pHT01-SPFH-(CC-Di-A)2-GlmS质粒、pHT01-SPFH-(CC-Di-A)3-GlmS质粒分别转入重组芽孢杆菌pBG中，通过氯霉素抗性平板筛选、菌落PCR验证、测序，确认构建成功得到重组芽孢杆菌G1:N1、G1:N2、G1:N3。
实施例6：重组枯草芽孢杆菌发酵生产乙酰氨基葡萄糖
在种子培养基中将重组枯草芽孢杆菌GN、SPFH-GN、G1:N1、G1:N2、G1:N3分别于37℃、220rpm下培养10h，然后将种子以4％的接种量转入发酵培养基，于250mL摇瓶中37℃、220rpm条件下培养48h。发酵结束时，检测发酵上清液中乙酰氨基葡萄糖的含量。如图1所示，A图中发酵30h后，融合表达定位功能结构域SPFH domain的重组枯草芽孢杆菌SPFH-GN的乙酰氨基葡萄糖产量为5.05g/L，对照菌株GN为1.85g/L，B图表明融合表达定位功能结构域SPFH domain的重组枯草芽孢杆菌SPFH-GN不仅生长不受到抑制，反而生长情况优于对照菌株GN。
摇瓶发酵结束后，GN、SPFH-GN、G1:N1、G1:N2、G1:N3菌株乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)的产量分别为1.97g/L、5.03g/L、5.02g/L、6.15g/L、4.58g/L，其中G1:N2菌株产量最高，是对照菌株GN的3.12倍(见图3)，实现了乙酰氨基葡萄糖在重组枯草芽孢杆菌胞外产量的提高。发酵过程中，G1:N1、G1:N2、G1:N3细胞生长情况见图4。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
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20 25 30

Claims (4)

1.一种重组枯草芽孢杆菌制备N-乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于，应用重组枯草芽孢杆菌进行发酵培养得到N-乙酰氨基葡萄糖；所述重组枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌自身的功能膜微域FMMs作为空间支架，通过双质粒系统表达FMMs定位功能结构域SPFHdomain、氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS与氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰化酶GNA1；以工具小肽CC-Di-A和CC-Di-B分别调控氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS与氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰化酶GNA1，使GlmS与GNA1化学计量比为1:1～3；双质粒系统中包括A质粒和B质粒，A质粒为pHT01，用于表达SPFH domain、氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS和CC-Di-A，B质粒为pP43，用于表达氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰化酶GNA1和CC-Di-B；所述CC-Di-A的氨基酸序列如SEQ IDNO .5所示，所述CC-Di-B的氨基酸序列如SEQ ID NO .6所示。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，重组菌在35～38℃下在种子培养基中活化，活化后的种子以2-5％的接种量接入发酵培养基中，在35～38℃下发酵培养。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，发酵培养基以其重量为基准，包括以下成分：30-60g/L葡萄糖、5～8g/L蛋白胨、10～15g/L酵母粉、5～8g/L硫酸铵、10～15g/L磷酸氢二钾、2～3g/L磷酸二氢钾、4～6g/L碳酸钙和8～12ml/L微量元素溶液；微量元素溶液以其重量为基准，包括以下成分：0 .8～1 .2g/L硫酸锰、0 .2～0 .6g/L氯化钴、0 .1～0 .3g/L钼酸钠、0 .1～0 .3g/L硫酸锌、0 .1～0 .3g/L氯化铝、0 .1～0 .3g/L氯化铜、0 .04～0.06g/L硼酸和3～8mol/L盐酸。
4.权利要求1-3任一所述的方法在制备含N-乙酰氨基葡萄糖产品中的应用。
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