CN108517327A

CN108517327A - 5-氨基乙酰丙酸高产菌株及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN108517327A
Application number: CN201810362420.2A
Authority: CN
Inventors: 郑平; 陈久洲; 孙际宾; 周文娟; 孙村民; 郭轩; 马延和
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2018-04-20
Filing date: 2018-04-20
Publication date: 2018-09-11
Anticipated expiration: 2038-04-20
Also published as: CN108517327B

Abstract

本发明公开了一种构建5‑氨基乙酰丙酸生产菌株的方法，即在所述5‑氨基乙酰丙酸生产菌株表达ALA合成酶(ALAS)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)的基础上使得所述5‑氨基乙酰丙酸生产菌株的乙醛酸循环途径弱化。本发明还公开了利用所述方法构建的ALA高产菌株和利用所述菌株制备ALA的方法。利用本发明的菌株可显著提高ALA的产量。

Description

5-氨基乙酰丙酸高产菌株及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程和微生物发酵技术领域。具体地说，本发明涉及5-氨基乙酰丙酸的高产菌株及其制备方法和应用。

背景技术

5-氨基乙酰丙酸(ALA)是一种重要的高附加值生物基化工产品，在农业、医药等领域应用广泛。目前ALA主要通过化学合成法合成，成本高污染重，限制了其在各领域的推广应用。由于具备低成本和无污染的优势，利用微生物发酵法合成ALA逐渐成为研究的热点。

生物体内ALA主要有两种合成途径(C4途径和C5途径)，强化途径中关键酶的表达作为常规途径已被广泛用于ALA高产菌株的构建(CN101063104A、CN102206606A等)。现有技术针对ALA合成的代谢途径改造主要是通过增加底物琥珀酰辅酶A的供给或降低产物ALA的消耗来提高ALA产量，例如增强四碳回补途径(CN103981203B)、强化辅酶A供给途径(CN103710374A)、弱化ALA下游代谢途径(CN103695364A/CN104830748A)等。另有研究发现增强转运蛋白的表达可以提高ALA产量(CN106047916A、CN106434513A等)。

此外，目前也有科研人员对乙醛酸循环进行了研究，发觉通过增强乙醛酸循环能够提高某些代谢产物的产量。进一步地，也有人通过强化乙醛酸循环提高了ALA的产量，从而认为乙醛酸循环强化有利于ALA的合成。然而，考虑到微生物代谢的复杂性，该结论是否普遍适用仍然存疑。

目前现有技术中ALA的产量仍有很大的提升空间，因此本领域仍需要进一步提高ALA的产量，从而能够高效、低成本、低污染地制备ALA。

发明内容

本发明的目的在于提供一种5-氨基乙酰丙酸高产菌株的构建方法以及利用这种构建方法构建得到的5-氨基乙酰丙酸高产菌株。

本发明的目的还在于利用本发明的5-氨基乙酰丙酸高产菌株产生ALA，从而能够高效、低成本、低污染地制备ALA。

在第一方面，本发明提供一种5-氨基乙酰丙酸生产菌株的构建方法，所述方法包括：

使得所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株的乙醛酸循环弱化。

在具体的实施方式中，所述乙醛酸循环弱化是指乙醛酸循环所涉及的异柠檬酸裂解酶和/或苹果酸合酶的活性部分或完全缺失。

在优选的实施方式中，所述乙醛酸循环弱化是指异柠檬酸裂解酶和/或苹果酸合酶的活性下降；或者，异柠檬酸裂解酶或苹果酸合酶的活性完全丧失；或者，异柠檬酸裂解酶和苹果酸合酶活性均丧失。

在优选的实施方式中，所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株本身表达ALA合成酶(ALAS)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)；或者所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中ALA合成酶(ALAS)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)的活性增强。

在优选的实施方式中，所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中ALA合成酶(ALAS)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)的活性增强可以通过以下方法之一或组合实现：表达同源或异源ALA合成酶和酸烯醇式丙酮酸羧化酶的编码基因，和/或增加所述菌株中所述编码基因的拷贝数，和/或改造所述编码基因的启动子以增强转录启动速度，和/或修改携带有所述编码基因的信使RNA的翻译调控区以增强翻译强度。

在优选的实施方式中，所述构建方法包括：

1)使得所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株表达ALA合成酶(ALAS)或增强所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中ALA合成酶(ALAS)的活性；

2)使得所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)或增强所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)的活性；和

3)使得所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中乙醛酸循环弱化。

在具体的实施方式中，所述构建方法还包括使得所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株表达ALA外排蛋白或增强所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中ALA外排蛋白的活性。

在优选的实施方式中，所述ALA外排蛋白是指其功能是将合成的ALA从胞内排出的蛋白，包括但不限于苏氨酸/高丝氨酸转运蛋白或半胱氨酸/O-乙酰丝氨酸转运蛋白。

在优选的实施方式中，所述ALA外排蛋白为大肠杆菌来源的苏氨酸/高丝氨酸转运蛋白RhtA(其序列如SEQ ID NO:1所示)或半胱氨酸/O-乙酰丝氨酸转运蛋白EamA(其序列如SEQ ID NO:2所示)；优选EamA。

在优选的实施方式中，所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株是5-氨基乙酰丙酸高产菌株。

在优选的实施方式中，所述菌株包括但不限于：大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)等。

在第二方面，本发明提供一种5-氨基乙酰丙酸生产菌株，所述菌株中乙醛酸循环弱化。

在具体的实施方式中，所述乙醛酸循环弱化是指乙醛酸循环所涉及的异柠檬酸裂解酶和/或苹果酸合酶的活性弱化。

在优选的实施方式中，所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中ALA合成酶(ALAS)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)的活性增强可以通过以下方法之一或组合实现：表达同源或异源ALA合成酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的编码基因，和/或增加所述菌株中所述编码基因的拷贝数，和/或改造所述编码基因的启动子以增强转录启动速度，和/或修改携带有所述编码基因的信使RNA的翻译调控区以增强翻译强度。

在优选的实施方式中，所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株：

1)表达ALA合成酶(ALAS)或ALA合成酶(ALAS)的活性增强；

2)表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)或磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)的活性增强；和

3)乙醛酸循环弱化。

在优选的实施方式中，所述乙醛酸循环弱化是指异柠檬酸裂解酶和/或苹果酸合酶的活性下降；或者，异柠檬酸裂解酶或苹果酸合酶的活性完全丧失，但另一种活性未丧失或未完全丧失；或者，异柠檬酸裂解酶和苹果酸合酶活性均丧失。

在具体的实施方式中，所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株表达ALA外排蛋白或所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株的ALA外排蛋白的活性增强。

在优选的实施方式中，所述ALA外排蛋白为RhtA(其序列如SEQ ID NO:1所示，MPGSLRKMPVWLPIVILLVAMASIQGGASLAKSLFPLVGAPGVTALRLALGTLILIAFFKPWRLRFAKEQRLPLLFYGVSLGGMNYLFYLSIQTVPLGIAVALEFTGPLAVALFSSRRPVDFVWVVLAVLGLWFLLPLGQDVSHVDLTGCALALGAGACWAIYILSGQRAGAEHGPATVAIGSLIAALIFVPIGALQAGEALWHWSVIPLGLAVAILSTALPYSLEMIALTRLPTRTFGTLMSMEPALAAVSGMIFLGETLTPIQLLALGAIIAASMGSTLTVRKESKIKELDIN)或EamA(其序列如SEQ ID NO:2所示，MSRKDGVLALLVVVVWGLNFVVIKVGLHNMPPLMLAGLRFMLVAFPAIFFVARPKVPLNLLLGYGLTISFAQFAFLFCAINFGMPAGLASLVLQAQAFFTIMLGAFTFGERLHGKQLAGIALAIFGVLVLIEDSLNGQHVAMLGFMLTLAAAFSWACGNIFNKKIMSHSTRPAVMSLVIWSALIPIIPFFVASLILDGSATMIHSLVTIDMTTILSLMYLAFVATIVGYGIWGTLLGRYETWRVAPLSLLVPVVGLASAALLLDERLTGLQFLGAVLIMTGLYINVFGLRWRKAVKVGS)；优选EamA。

在第三方面，本发明提供一种5-氨基乙酰丙酸生产方法，所述方法包括：

1)培养第二方面所述的5-氨基乙酰丙酸生产菌株，从而得到5-氨基乙酰丙酸；和

2)任选从1)的发酵培养体系中获得5-氨基乙酰丙酸。

在第四方面，本发明提供一种5-氨基乙酰丙酸生产方法，所述方法包括：

1)在含有乙醛酸循环抑制剂的培养基中培养5-氨基乙酰丙酸的生产菌株，从而得到5-氨基乙酰丙酸；和

2)任选从1)的培养体系中获得5-氨基乙酰丙酸。

在优选的实施方式中，所述5-氨基乙酰丙酸的生产菌株表达ALA合成酶(ALAS)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)。

在第五方面，本发明提供第二方面所述的5-氨基乙酰丙酸菌株的用途，所述菌株用于产生5-氨基乙酰丙酸和/或产生以5-氨基乙酰丙酸为前体下游产物。

在优选的实施方式中，所述下游产物是以ALA为前体的血红素或VB12。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示强化乙醛酸循环对ALA合成的影响；

图2显示乙醛酸循环弱化对ALA合成的影响；和

图3显示乙醛酸循环弱化联合转运蛋白表达对ALA合成的影响。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现在5-氨基乙酰丙酸生产菌株中表达ALA合成酶(ALAS)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)的基础上，进一步使得所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中的乙醛酸循环弱化，能够显著提高5-氨基乙酰丙酸的产量。在此基础上完成了本发明。

术语定义

本文所用的术语“增强”是指提高某种酶的活性或某途径涉及的酶的活性。基于本发明的教导，本领域技术人员应该理解，本文所述的“增强”包括提高菌株中原始表达的酶的活性，也包括使得菌株表达原本不表达的酶。在本领域中，由于常通过敲除乙醛酸循环的阻遏蛋白编码基因来增强乙醛酸循环，本领域也常将“增强”乙醛酸循环描述为“打开”乙醛酸循环。

本领域技术人员知晓各种增强酶的活性的技术手段。例如，增强ALA合成酶(ALAS)的活性可以通过以下方式实现：表达同源或异源ALA合成酶的编码基因，和/或增加所述菌株中所述编码基因的拷贝数，和/或改造所述编码基因的启动子以增强转录启动速度，和/或修改携带有所述编码基因的信使RNA的翻译调控区以增强翻译强度。

相应地，本文所用的术语“弱化”是指某种酶的活性或某途径涉及的酶的活性的部分或完全丧失。此外，如果某生物学途径中涉及多种酶，则该途径的“弱化”可以是该生物学途径所涉及的一种或多种或全部的酶的活性部分丧失；也可以是指该生物学途径所涉及的一种或多种酶的活性完全丧失，但其它酶仍保留部分活性或全部活性，也可以是指该生物学途径所涉及的酶的活性丧失。

因此，本文所述的乙醛酸循环弱化可以是指乙醛酸循环途径中涉及的异柠檬酸裂解酶和/或苹果酸合酶的活性下降；也可以是指异柠檬酸裂解酶或苹果酸合酶的活性完全丧失，但另一种活性未丧失或未完全丧失；也可以是指异柠檬酸裂解酶和苹果酸合酶活性均丧失。

基于本发明的教导，本领域技术人员也可以采用“部分缺失”、“缺失”、“关闭”、“失活”等类似表述方式来表示“弱化”。同时，基于本领域的常规技术手段，本领域技术人员也知晓实现“弱化”的技术手段，可以通过部分或全部敲除酶的编码基因、基因突变失活或部分失活、基因启动子或翻译调控区改变令其转录或翻译弱化、改变基因序列使其mRNA稳定性减弱或酶结构不稳定等方法或其组合来实现，也可以通过外源性添加酶活性的抑制剂来实现，即外源添加可以弱化异柠檬酸裂解酶和/或苹果酸合酶活性的抑制剂来实现。

乙醛酸循环

乙醛酸循环，又称为乙醛酸支路或乙醛酸旁路，是TCA循环的重要补充途径，由异柠檬酸裂解酶(编码基因aceA)和苹果酸合酶(编码基因aceB)催化异柠檬酸形成琥珀酸和苹果酸。由于不涉及NADH的消耗和碳流的损失，增强乙醛酸循环(敲除aceBAK操纵子的阻遏蛋白编码基因iclR)常被用于提高琥珀酸、苏氨酸等重要代谢产物的产量。Kang等在包括iclR在内的5个基因缺失的菌株QZ1111(野生型大肠杆菌敲除ptsG、poxB、pta、iclR和sdhA基因)中表达ALA合成酶(ALAS)，ALA产量是对照菌株的5倍以上(Kang et al.BioengBugs.2011,2(6):342-5)，预示着强化乙醛酸循环可能也有利于ALA的合成。Noh等发现适当增强aceA的表达强度重新分配代谢流可以显著提高菌体生长和C5途径合成ALA的产量(Nohet al..Metab.Eng.,2017,43(Pt A):1-8)，进一步明确了乙醛酸循环强化有利于ALA的合成。然而，发明人通过大量实验发现，在表达外源ALAS合成ALA的菌株中通过缺失iclR打开乙醛酸循环的方式并不能提高ALA的产量，并且在单独表达ALAS的菌株中缺失aceA或aceB基因对ALA的合成也没有明显影响。然而在ALAS和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)共表达的菌株中乙醛酸循环弱化能够大幅提高ALA的产量。

本发明的5-氨基乙酰丙酸生产菌株构建方法以及构建的菌株

基于以上出乎意料的发现，本发明提供了一种构建5-氨基乙酰丙酸生产菌株的方法，所述方法使得所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株的乙醛酸循环弱化。本发明构建的5-氨基乙酰丙酸生产菌株是5-氨基乙酰丙酸高产菌株。

基于本发明的教导，本领域技术人员应该理解，本发明的构建方法适用于本身表达ALA合成酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的5-氨基乙酰丙酸生产菌株；也适用于ALA合成酶(ALAS)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)的活性增强的5-氨基乙酰丙酸生产菌株；甚至可以在5-氨基乙酰丙酸生产菌株外源性表达ALA合成酶(ALAS)和/或磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)并弱化乙醛酸循环。

本领域技术人员知晓如何增强所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中ALA合成酶(ALAS)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)的活性，例如可以通过以下方法之一或组合实现：表达同源或异源ALA合成酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的编码基因，和/或增加所述菌株中所述编码基因的拷贝数，和/或改造所述编码基因的启动子以增强转录启动速度，和/或修改携带有所述编码基因的信使RNA的翻译调控区以增强翻译强度。

在使得所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株的乙醛酸循环弱化的基础上，本发明人还发现提高所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中ALA外排蛋白的活性能够进一步增强ALA的产量。在具体的实施方式中，所述ALA外排蛋白为RhtA或EamA；优选EamA。

本领域技术人员知道许多菌株可以用于产生5-氨基乙酰丙酸。这些菌株虽然不同，但它们合成5-氨基乙酰丙酸的合成体系、途径却是类似的。因此，本领域普通技术人员鉴于本发明的教导和现有技术可以明白，本发明的菌株可以是任何可用于产生5-氨基乙酰丙酸的菌株，包括但不限于：大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)等。

基于本发明的教导，通过培养本发明的5-氨基乙酰丙酸生产菌株，可以显著提高5-氨基乙酰丙酸的产量是显而易见的。然而，本领域技术人员也可以预料，在含有乙醛酸循环抑制剂的培养基中培养表达ALA合成酶(ALAS)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)的5-氨基乙酰丙酸生产菌株，也能够显著提高5-氨基乙酰丙酸的产量。而在获得的5-氨基乙酰丙酸的基础上，可以进一步以5-氨基乙酰丙酸为前体生产下游产物；例如血红素或VB12。

本发明的优点：

1.本发明的5-氨基乙酰丙酸生产菌株显著提高了ALA的产量；

2.本发明的5-氨基乙酰丙酸生产菌株的葡萄糖转化率得到显著的提升；和

3.本发明的5-氨基乙酰丙酸生产菌株及其构建方法具有极其显著的经济价值和社会价值。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1.pZGA24和pZPA6转化iclR基因缺失菌株

为了验证强化乙醛酸循环对ALA合成的影响，分别将pZGA24和pZPA6(构建过程参考CN103981203B)载体转化aceBAK操纵子阻遏蛋白编码iclR缺失菌株JW3978(来自KeioCollection大肠杆菌单基因缺失菌株库)，感受态细胞制备和转化过程参考J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》。转化产物涂布氨苄青霉素抗性的LB平板，过夜培养后挑取阳性克隆提取质粒验证，分别获得重组菌株ΔiclR/pZGA24和ΔiclR/pZPA6。

实施例2.强化乙醛酸循环对ALA合成的影响

将上述重组菌单菌落及其对照菌株BW25113/pZGA24和BW25113/pZPA6分别接种5mL含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃，220rpm培养12h。按照初始OD为0.05转接装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶，37℃，220rpm培养2.5h后加入终浓度为50μM的IPTG，诱导培养24h后收集发酵液，检测ALA的浓度。其中发酵培养基为添加酵母粉的M9培养基，主要成分为：Na₂HPO₄·12H₂O 17.1g/L，KH₂PO₄ 3.0g/L，NaCl 0.5g/L，NH₄Cl 1.0g/L，MgSO₄2mM，CaCl₂ 0.1mM，葡萄糖15g/L，酵母粉2g/L，甘氨酸4g/L。ALA的检测方法如下：200μL稀释的发酵液加入100μL pH 4.6乙酸钠缓冲液，然后加入5μL乙酰丙酮，100℃水浴温育15min，冷却至室温后加入等体积的Ehrlish’s试剂(42mL冰醋酸，8mL 70％高氯酸，1g二甲氨基苯甲醛)混匀，显色10min后测553nm波长下的吸光度。

摇瓶发酵结果见图1，从图中可以看出iclR缺失对ALA合成酶(ALAS)单独表达或与磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)共表达的菌株ALA产量均没有明显影响，表明强化乙醛酸循环对ALA合成无明显的促进效果。

实施例3.pZGA24和pZPA6分别转化乙醛酸循环弱化菌株

为了验证乙醛酸循环弱化对ALA合成的影响，分别将pZGA24和pZPA6(构建过程参考CN103981203B)载体转入JW3975(异柠檬酸裂解酶编码基因aceA缺失菌株)或JW3974(苹果酸合成酶编码基因aceB缺失菌株)中，感受态细胞制备和转化过程参考J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》。转化产物涂布氨苄青霉素抗性的LB平板，过夜培养后挑取阳性克隆提取质粒验证，分别获得重组菌株ΔaceA/pZGA24、ΔaceB/pZGA24、ΔaceA/pZPA6和ΔaceB/pZPA6。

实施例4.AceA或AceB缺失菌株对ALA合成的影响

摇瓶发酵验证体系及过程同上，摇瓶发酵结果见图2，从图中可以看出aceA或aceB缺失对ALAS单独表达的菌株ALA产量基本没有影响，但对ALAS与PPC共表达的菌株ALA产量产生显著影响，ALA产量达到2.86和3.07g/L，分别比对照菌株提高29％和38％，同时葡萄糖转化率分别提高55％和61％，提升效果显著，表明在ALAS和PPC过表达的条件下乙醛酸循环缺失有利于ALA的合成。

实施例5.外排蛋白表达载体转化乙醛酸循环缺失菌株

为了验证进一步强化产物外排对ALA合成的影响，分别将pZPA6-RhtA和pZPA6-EamA(构建过程参考文献：张良程，大肠杆菌中5-氨基乙酰丙酸外排蛋白的研究，硕士学位论文，天津科技大学，2016)载体转入JW3975(异柠檬酸裂解酶编码基因aceA缺失菌株)或JW3974(苹果酸合成酶编码基因aceB缺失菌株)中，感受态细胞制备和转化过程参考J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》。转化产物涂布氨苄青霉素抗性的LB平板，过夜培养后挑取阳性克隆提取质粒验证，分别获得重组菌株ΔaceA/pZPA6-RhtA、ΔaceB/pZPA6-RhtA、ΔaceA/pZPA6-EamA和ΔaceB/pZPA6-EamA。

实施例6.AceA或AceB缺失组合外排蛋白表达对ALA合成的影响

摇瓶发酵验证体系及过程同上，摇瓶发酵结果见图3，从图中可以看出乙醛酸循环弱化组合EamA或RhtA表达后ALA产量进一步提升，其中EamA表达菌株效果更好，ALA产量达到4.47和3.53g/L，分别比出发菌株提高102％和59％，同时单位菌体ALA产量分别提高186％和103％，提升效果非常显著；而RhtA表达菌株ALA产量分别比出发菌株提高55％和57％，效果同样非常明显，表明乙醛酸弱化组合转运蛋白表达后可大幅提高ALA产量。

实施例7.AceA和AceB缺失对ALA合成的影响

进一步，将pZGA24和pZPA6载体转入异柠檬酸裂解酶编码基因aceA和苹果酸合成酶编码基因aceB均缺失的菌株中，获得AceA和AceB同时缺失且表达ALAS和PPC的重组工程菌株。菌株的构建和ALA产量的检测方法见实施例2。经检测，工程菌株ALA的产量比对照菌株提高30％左右，提升效果显著。

讨论

本发明基于ALA合成途径的整体分析，通过对乙醛酸循环的不同改造尝试，发现在ALAS和PPC共表达的菌株中乙醛酸循环弱化可以显著提高ALA产量，结合转运蛋白表达后ALA的产量更是大幅提升。

打开乙醛酸循环这种通常用于代谢工程改造提高琥珀酸等代谢产物的合成，前期也有文献证明乙醛酸循环打开可能有利于ALA的合成，但是本发明发现在利用ALAS合成ALA的菌株中上述操作对ALA的产量没有显著影响，并进一步发现在ALAS和PPC共表达的菌株中乙醛酸循环弱化更有利于ALA合成，该结论与一般工程菌株的常规理性设计思路相差较大。从而也证明，生物合成途径是一复杂的过程，并不能因某种技术手段对某一产物有促进作用，就合理预测该技术手段对其它产物也有类似作用。

根据CN103981203B和WO2014121724A1所述，本发明的对照菌株本身已经是本领域的ALA高产菌株，而本发明的菌株无论在ALA的绝对产量，还是在葡萄糖转化率等方面与对照菌株相比均得到了显著的提升，与本领域现有技术相比也具备较大优势，工艺放大后实际效果有望进一步提升，因而具有极其显著的经济价值和社会价值。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 5-氨基乙酰丙酸高产菌株及其制备方法和应用

<130> P2018-0065

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 295

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Pro Gly Ser Leu Arg Lys Met Pro Val Trp Leu Pro Ile Val Ile

1 5 10 15

Leu Leu Val Ala Met Ala Ser Ile Gln Gly Gly Ala Ser Leu Ala Lys

20 25 30

Ser Leu Phe Pro Leu Val Gly Ala Pro Gly Val Thr Ala Leu Arg Leu

35 40 45

Ala Leu Gly Thr Leu Ile Leu Ile Ala Phe Phe Lys Pro Trp Arg Leu

50 55 60

Arg Phe Ala Lys Glu Gln Arg Leu Pro Leu Leu Phe Tyr Gly Val Ser

65 70 75 80

Leu Gly Gly Met Asn Tyr Leu Phe Tyr Leu Ser Ile Gln Thr Val Pro

85 90 95

Leu Gly Ile Ala Val Ala Leu Glu Phe Thr Gly Pro Leu Ala Val Ala

100 105 110

Leu Phe Ser Ser Arg Arg Pro Val Asp Phe Val Trp Val Val Leu Ala

115 120 125

Val Leu Gly Leu Trp Phe Leu Leu Pro Leu Gly Gln Asp Val Ser His

130 135 140

Val Asp Leu Thr Gly Cys Ala Leu Ala Leu Gly Ala Gly Ala Cys Trp

145 150 155 160

Ala Ile Tyr Ile Leu Ser Gly Gln Arg Ala Gly Ala Glu His Gly Pro

165 170 175

Ala Thr Val Ala Ile Gly Ser Leu Ile Ala Ala Leu Ile Phe Val Pro

180 185 190

Ile Gly Ala Leu Gln Ala Gly Glu Ala Leu Trp His Trp Ser Val Ile

195 200 205

Pro Leu Gly Leu Ala Val Ala Ile Leu Ser Thr Ala Leu Pro Tyr Ser

210 215 220

Leu Glu Met Ile Ala Leu Thr Arg Leu Pro Thr Arg Thr Phe Gly Thr

225 230 235 240

Leu Met Ser Met Glu Pro Ala Leu Ala Ala Val Ser Gly Met Ile Phe

245 250 255

Leu Gly Glu Thr Leu Thr Pro Ile Gln Leu Leu Ala Leu Gly Ala Ile

260 265 270

Ile Ala Ala Ser Met Gly Ser Thr Leu Thr Val Arg Lys Glu Ser Lys

275 280 285

Ile Lys Glu Leu Asp Ile Asn

290 295

<210> 2

<211> 299

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ser Arg Lys Asp Gly Val Leu Ala Leu Leu Val Val Val Val Trp

1 5 10 15

Gly Leu Asn Phe Val Val Ile Lys Val Gly Leu His Asn Met Pro Pro

20 25 30

Leu Met Leu Ala Gly Leu Arg Phe Met Leu Val Ala Phe Pro Ala Ile

35 40 45

Phe Phe Val Ala Arg Pro Lys Val Pro Leu Asn Leu Leu Leu Gly Tyr

50 55 60

Gly Leu Thr Ile Ser Phe Ala Gln Phe Ala Phe Leu Phe Cys Ala Ile

65 70 75 80

Asn Phe Gly Met Pro Ala Gly Leu Ala Ser Leu Val Leu Gln Ala Gln

85 90 95

Ala Phe Phe Thr Ile Met Leu Gly Ala Phe Thr Phe Gly Glu Arg Leu

100 105 110

His Gly Lys Gln Leu Ala Gly Ile Ala Leu Ala Ile Phe Gly Val Leu

115 120 125

Val Leu Ile Glu Asp Ser Leu Asn Gly Gln His Val Ala Met Leu Gly

130 135 140

Phe Met Leu Thr Leu Ala Ala Ala Phe Ser Trp Ala Cys Gly Asn Ile

145 150 155 160

Phe Asn Lys Lys Ile Met Ser His Ser Thr Arg Pro Ala Val Met Ser

165 170 175

Leu Val Ile Trp Ser Ala Leu Ile Pro Ile Ile Pro Phe Phe Val Ala

180 185 190

Ser Leu Ile Leu Asp Gly Ser Ala Thr Met Ile His Ser Leu Val Thr

195 200 205

Ile Asp Met Thr Thr Ile Leu Ser Leu Met Tyr Leu Ala Phe Val Ala

210 215 220

Thr Ile Val Gly Tyr Gly Ile Trp Gly Thr Leu Leu Gly Arg Tyr Glu

225 230 235 240

Thr Trp Arg Val Ala Pro Leu Ser Leu Leu Val Pro Val Val Gly Leu

245 250 255

Ala Ser Ala Ala Leu Leu Leu Asp Glu Arg Leu Thr Gly Leu Gln Phe

260 265 270

Leu Gly Ala Val Leu Ile Met Thr Gly Leu Tyr Ile Asn Val Phe Gly

275 280 285

Leu Arg Trp Arg Lys Ala Val Lys Val Gly Ser

290 295

Claims

1.一种5-氨基乙酰丙酸生产菌株的构建方法，所述方法包括：

使得所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株的乙醛酸循环弱化。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述乙醛酸循环弱化是指乙醛酸循环所涉及的异柠檬酸裂解酶和/或苹果酸合酶的活性部分或完全缺失。

3.如权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括使得所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株表达ALA外排蛋白或增强所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中ALA外排蛋白的活性。

4.一种5-氨基乙酰丙酸生产菌株，所述菌株中乙醛酸循环弱化。

5.如权利要求4所述的5-氨基乙酰丙酸生产菌株，其特征在于，所述乙醛酸循环弱化是指乙醛酸循环所涉及的异柠檬酸裂解酶和/或苹果酸合酶的活性弱化。

6.如权利要求4或5所述的5-氨基乙酰丙酸生产菌株，其特征在于，所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株表达ALA外排蛋白或所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株的ALA外排蛋白的活性增强。

7.一种5-氨基乙酰丙酸生产方法，所述方法包括：

1)培养权利要求4-6中任一项所述的5-氨基乙酰丙酸生产菌株，从而得到5-氨基乙酰丙酸；和

2)任选从1)的发酵培养体系中获得5-氨基乙酰丙酸。

8.一种5-氨基乙酰丙酸生产方法，所述方法包括：

2)任选从1)的培养体系中获得5-氨基乙酰丙酸。

9.权利要求4-6中任一项所述的5-氨基乙酰丙酸菌株的用途，所述菌株用于产生5-氨基乙酰丙酸和/或产生以5-氨基乙酰丙酸为前体下游产物。