CN111593061A - 一种提高染料脱色过氧化物酶活性的方法 - Google Patents

一种提高染料脱色过氧化物酶活性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高染料脱色过氧化物酶活性的方法，属于酶工程领域。本发明中将编码染料脱色过氧化物酶(DyP)的基因与编码大肠杆菌内源谷氨酰‑tRNA还原酶的基因hemA共同连接到载体pET28a上，得到重组载体，将重组载体转入敲除了编码大肠杆菌内源通道蛋白基因eamA的大肠杆菌中进行表达，结果发现，表达后重组DyP的比酶活显著提高。该方法简便经济，具有应用价值。

Description

一种提高染料脱色过氧化物酶活性的方法
技术领域
本发明涉及一种提高染料脱色过氧化物酶活性的方法，属于酶工程技术领域。
背景技术
染料脱色过氧化物酶(DyP)是近年来新发现的一类过氧化物酶，在生物体内以血红素为辅基，参与生物体的氧化应激调节和基质降解等过程。由于该酶能够降解蒽醌类染料和木质素，可用于废水处理以及生物废弃物的再利用，因此成为研究热点。
在DyP的异源表达中常因辅基血红素的不足，导致酶活水平低下。大肠杆菌(E.coli)作为重要的基因工程宿主菌，主要以谷氨酸为前体经C5途径合成血红素(图1)。谷氨酸在谷氨酰-tRNA合成酶(gltX编码)和谷氨酰-tRNA还原酶(hemA编码)的催化下合成5-氨基乙酰丙酸(ALA)，进而合成血红素。
以往的研究主要是通过外源添加血红素或者5-氨基乙酰丙酸(ALA)的方式来提高辅基的供给，但这种方式会造成成本的增加和操作的不便。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种提高染料脱色过氧化物酶活性的方法。本发明通过敲除通道蛋白eamA，阻碍ALA向细胞外的输送；结合过表达ALA合成关键酶hemA，达到增加血红素胞内供给的目的(图1)，从而提升DyP的酶活性。该方法简便经济，具有应用价值。
本发明提供了一种提高染料脱色过氧化物酶活性的方法，所述方法是将编码染料脱色过氧化物酶的基因与编码大肠杆菌内源谷氨酰-tRNA还原酶的hemA基因共同连接到载体上，得到重组载体，将重组载体转入宿主中得到大肠杆菌基因工程菌，表达大肠杆菌基因工程菌，得到的重组染料脱色过氧化物酶活性提高；所述宿主是敲除了编码大肠杆菌内源通道蛋白的eamA基因的大肠杆菌。
进一步地，所述宿主是敲除了编码大肠杆菌内源通道蛋白的eamA基因的大肠杆菌BL21(DE3)。
进一步地，所述hemA基因的核苷酸序列为GenBank编号为AM946981.2所示核苷酸序列的第1251856位-1253112位。
进一步地，所述eamA基因的核苷酸序列为GenBank编号为AM946981.2所示核苷酸序列的第1569528位-1570427位。
进一步地，所述载体为pET28a。
进一步地，所述染料脱色过氧化物酶的GenBank编号为AAZ57111.1。
进一步地，所述表达是将大肠杆菌基因工程菌于30-37℃，200-220r/min活化培养8-14h后，按1-4％接种体积比转接至LB液体培养基中培养，当菌体的OD600＝0.6-0.8时，加入终浓度0.1-0.5mmol/LIPTG，30-37℃条件诱导8-14h。
本发明还提供了一种大肠杆菌基因工程菌，所述大肠杆菌基因工程菌以敲除了编码大肠杆菌内源通道蛋白的eamA基因的大肠杆菌为宿主，以编码染料脱色过氧化物酶的基因与编码大肠杆菌内源谷氨酰-tRNA还原酶的hemA基因为目的基因。
进一步地，所述大肠杆菌基因工程菌以pET28a为载体；所述染料脱色过氧化物酶的GenBank编号为AAZ57111.1。
进一步地，所述hemA基因的核苷酸序列为GenBank编号为AM946981.2所示核苷酸序列的第1251856位-1253112位；所述eamA基因的核苷酸序列为GenBank编号为AM946981.2所示核苷酸序列的第1569528位-1570427位。
本发明有益的技术效果在于：
本发明中将编码染料脱色过氧化物酶DyP的基因与编码大肠杆菌内源谷氨酰-tRNA还原酶的hemA基因共同连接到载体pET28a上，得到重组载体，将重组载体转入敲除了编码大肠杆菌内源通道蛋白的eamA基因的大肠杆菌中表达，结果发现，表达后重组DyP的比酶活显著提高。该方法简便经济，具有应用价值。
附图说明
图1：血红素合成示意图。
图2：敲除菌WT△eamA与出发菌株WT菌液在不同培养时间时的600nm吸光度值。
图3：WT和WT△eamA/pA的血红素含量。
图4：WT△eamA/pAD表达的重组DyP酶活。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进行具体描述。
下述实施例中涉及的未作说明的试剂均可通过商业化途径获得，下述实施例中涉及的未作详细说明的方法均为常规的分子生物学方法。
实施例1敲除菌WT△eamA的构建及生长情况检测
以大肠杆菌BL21(DE3)为出发菌株WT，分别扩增eamA基因(参考GenBank：AM946981.2:1569528-1570427)上下游各500bp同源臂。以pKD4质粒为模板，扩增Kan抗性序列。将pET-22b质粒双酶切线性化，使用诺唯赞
Figure BDA0002571565890000031
Multis One Step CloningKit将上下游各500bp同源臂、Kan抗性序列3个片段与载体pET-22b连接，连接产物转入E.coliJM109的感受态中，在添加了Amp和Kan的LB平板上筛选阳性菌得到质粒pEUKD。以pEUKD为模板，进行PCR扩增，得到含有eamA基因上下游同源臂、Kan抗性的打靶片段。
利用含有eamA基因上下游同源臂、Kan抗性的打靶片段，通过Red同源重组的方法(参考文献：Datsenko K A.One-step inactivation of chromosomal genes inEscherichia coli K-12 using PCR products[J].Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America,2000,97(12):6640-6645.)敲除大肠杆菌内源eamA基因，得到敲除菌WT△eamA。将敲除菌WT△eamA与出发菌株WT分别在LB培养基上37℃，200r/min活化培养8-14h，次日以1％的体积比转接于50mL的LB培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L；pH为7.0)中，每间隔2h取样，测定菌液在600nm下的吸光度值。以时间对吸光值作图得到生长曲线。结果如图2所示，敲除菌WT△eamA与出发菌株WT在生长情况上无显著差异。
实施例2工程菌WT△eamA/pA的构建及血红素含量测定
将谷氨酰-tRNA还原酶hemA基因(GenBank:AM946981.2:1251856-1253112)连接在pET28a载体上，导入出敲除菌WT△eamA中，具体导入方法为使用热激法将连接的产物转入感受态细胞WT△eamA中：将连接产物加入冰浴后融化的感受态细胞中，混匀，在冰上静置30min；42℃水浴热激90s，迅速放置冰上5min，后加入800μL的LB液体培养基；37℃摇床200r·min-1，复苏45min，离心，取离心后的菌液涂布于添加了Kan的LB平板，筛选得到工程菌WT△eamA/pA，采用荧光法检测WT与WT△eamA/pA的血红素浓度，具体为：将WT与WT△eamA/pA分别在LB培养基上37℃，200r/min培养8-14h，次日以1％的体积比转接于50mL的LB培养基中，取培养后的菌体测定血红素含量。荧光检测的激发波长为400nm、发射波长为620nm。结果如图3所示，WT△eamA/pA的血红素含量达到36.03μmol·L-1，是WT的13倍。
实施例3大肠杆菌基因工程菌WT△eamA/pAD的构建、表达及重组酶酶活测定
将编码谷氨酰-tRNA还原酶的hemA基因(GenBank:AM946981.2:1251856-1253112)与编码染料脱色过氧化物酶DyP的基因(GenBank：AAZ57111.1)得到重组载体pAD。将重组载体pAD分别导入WT与WT△eamA中，得到大肠杆菌基因工程菌WT/pAD与WT△eamA/pAD，将上述大肠杆菌基因工程菌于30-37℃，200r/min活化培养8-14h后，按1-4％接种量转接至含50μg/mL Kan抗生素的LB液体培养基中培养，当菌体的OD600＝0.6-0.8时，加入终浓度0.1-0.5mmol/L IPTG，30-37℃条件诱导8h。用磷酸缓冲液(20mmol/L，pH＝7.4)悬浮菌体，超声破碎细胞20min，4℃，10000r/min离心30min，所获得的上清即为DyP粗酶液。
以2,2-联氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)为底物，检测DyP的酶活性。反应体系包括20mmol/L的醋酸缓冲液(pH＝4.5)、终浓度0.2mmol/L的ABTS、100μL粗酶液，终浓度0.2mmol/L的H2O2启动反应，反应时间为30s，终止剂为200μL、2％SDS。使用紫外可见分光光度计仪检测反应产物在420nm(ε＝36000M-1cm-1)的光吸收值。一个酶活力单位定义为：在25℃、pH4.5条件下，每分钟氧化1μmolABTS所需要的酶量。
比酶活(U/mg)＝酶活/蛋白浓度。蛋白质浓度测定采用BCA试剂盒，以牛血清蛋白为标准蛋白。
结果如图4所示，pAD在WT△eamA中表达的重组DyP酶活为0.8U/mg，是在出发菌株WT中表达的1.5倍。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种提高染料脱色过氧化物酶活性的方法，其特征在于，所述方法是将编码染料脱色过氧化物酶的基因与编码大肠杆菌内源谷氨酰-tRNA还原酶的hemA基因共同连接到载体上，得到重组载体，将重组载体转入宿主中得到大肠杆菌基因工程菌，表达大肠杆菌基因工程菌；所述宿主是敲除了编码大肠杆菌内源通道蛋白eamA基因的大肠杆菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述宿主是敲除了编码大肠杆菌内源通道蛋白eamA基因的大肠杆菌BL21(DE3)。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述hemA基因的核苷酸序列为GenBank编号为AM946981.2所示核苷酸序列的第1251856位-1253112位。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述eamA基因的核苷酸序列为GenBank编号为AM946981.2所示核苷酸序列的第1569528位-1570427位。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述载体为pET28a。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述染料脱色过氧化物酶的GenBank编号为AAZ57111.1。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表达是将大肠杆菌基因工程菌于30-37℃，200-220r/min活化培养8-14h后，按1-4％接种体积比转接至LB液体培养基中培养，当菌体的OD600＝0.6-0.8时，加入终浓度0.1-0.5mmol/LIPTG，30-37℃条件诱导8-14h。
8.一种大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌基因工程菌以敲除了编码大肠杆菌内源通道蛋白的eamA基因的大肠杆菌为宿主，以编码染料脱色过氧化物酶的基因与编码大肠杆菌内源谷氨酰-tRNA还原酶的hemA基因为目的基因。
9.根据权利要求8所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌基因工程菌以pET28a为载体；所述染料脱色过氧化物酶的GenBank编号为AAZ57111.1。
10.根据权利要求8所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述hemA基因的核苷酸序列为GenBank编号为AM946981.2所示核苷酸序列的第1251856位-1253112位；所述eamA基因的核苷酸序列为GenBank编号为AM946981.2所示核苷酸序列的第1569528位-1570427位。
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