CN114672525B - N-乙酰基-5-甲氧基色胺的生物合成方法及其应用 - Google Patents

N-乙酰基-5-甲氧基色胺的生物合成方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了N‑乙酰基‑5‑甲氧基色胺的生物合成方法及其应用。利用所述的合成N‑乙酰基‑5‑甲氧基色胺所有蛋白编码基因或能够表达合成N‑乙酰基‑5‑甲氧基色胺所有蛋白编码基因的重组基因工程菌用于合成N‑乙酰基‑5‑甲氧基色胺；从体系中分离得到N‑乙酰基‑5‑甲氧基色胺。还公开了包含合成N‑乙酰基‑5‑甲氧基色胺的一系列酶编码基因的重组载体以及重组基因工程菌。其通过发酵培养的方式，表达重组载体中编码所合成N‑乙酰基‑5‑甲氧基色胺的一系列酶编码基因，合成N‑乙酰基‑5‑甲氧基色胺的一系列酶，用于N‑乙酰基‑5‑甲氧基色胺合成，N‑乙酰基‑5‑甲氧基色胺的产量高。过程易实施，条件易于控制，适宜推广工业化生产。

Description

N-乙酰基-5-甲氧基色胺的生物合成方法及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程、代谢工程、酶工程、生物信息学、合成生物学技术领域，具体涉及N-乙酰基-5-甲氧基色胺的生物合成方法及其应用。
背景技术
N-乙酰基-5-甲氧基色胺，属于β-吲哚基丙氨酸衍生物，是由哺乳动物的松果体受到黑暗刺激后产生的一种胺类激素，是生物体内一种重要的抗氧化剂。能够改善动物机体睡眠质量。随着动物年龄的增长，N-乙酰基-5-甲氧基色胺的分泌量逐渐下降，从而影响动物的睡眠质量。N-乙酰基-5-甲氧基色胺最早发现于牛松果体中，被认为是一种重要的神经激素，后研究发现N-乙酰基-5-甲氧基色胺在人体内各个器官均有分布并发挥着不同的重要功能，现在越来越多的研究表明N-乙酰基-5-甲氧基色胺除了能够治疗失眠症外，还具有抗氧化、抗衰老、调节免疫、抗癌等多种生理功能。目前，N-乙酰基-5-甲氧基色胺的获得主要有生物提取和化学合成两大类。由于动植物中天然存在的N-乙酰基-5-甲氧基色胺含量很少，并且提取原料来源有限，提取成本居高不下，工业应用受到诸多限制。化学合成是目前工业生产N-乙酰基-5-甲氧基色胺中普遍采用的方法，经文献调研发现合成方法大致分为造环和借环合成两大类，需要用到污染且毒性较大的含苯环类物质和催化剂，并且产物分离提纯工艺复杂、耗能大、产物纯度低等问题。
相比化学合成，生物合成具有对环境友好，能耗低，绿色环保等优点。随着合成生物学的发展，越来越多的化合物实现了生物绿色生产。N-乙酰基-5-甲氧基色胺得生物合成途径为：葡萄糖→β-吲哚基丙氨酸→5-羟β-吲哚基丙氨酸→5-羟色胺→N-乙酰-5-羟色胺→N-乙酰基-5-甲氧基色胺。
大肠杆菌作为外源基因表达的宿主，遗传背景清楚，技术操作简单，培养条件简单，大规模发酵经济，倍受遗传工程专家的重视。目前大肠杆菌是应用最广泛，最成功的表达体系，常做高效表达的首选体系。本发明以大肠杆菌出发，通过改造大肠杆菌以实现发酵法高效大规模工业化生产N-乙酰基-5-甲氧基色胺。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为提供N-乙酰基-5-甲氧基色胺高产菌株、N-乙酰基-5-甲氧基色胺的生物合成方法，以实现发酵法高效大规模工业化生产N-乙酰基-5-甲氧基色胺。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
提供一种N-乙酰基-5-甲氧基色胺的合成方法，包括以下步骤：
1）利用所述的合成N-乙酰基-5-甲氧基色胺所有蛋白编码基因或能够表达合成N-乙酰基-5-甲氧基色胺所有蛋白编码基因的重组基因工程菌用于合成N-乙酰基-5-甲氧基色胺，所述的能够表达合成N-乙酰基-5-甲氧基色胺所有蛋白编码基因包括色氨酸羟化途径关键酶TPH2基因；BH4合成途径关键酶folE，PTPS，SPR基因和BH4再生关键酶PCD，DHPR基因；5-羟基β-吲哚基丙氨酸产N-乙酰-5-羟色胺途径关键酶AANAT、ACS基因，和N-乙酰-5-羟色胺产N-乙酰基-5-甲氧基色胺途径关键酶COMT、MAT基因；
2）从1）的体系中分离得到N-乙酰基-5-甲氧基色胺。
上述合成N-乙酰基-5-甲氧基色胺所有蛋白编码基因表达如下蛋白，所述蛋白是如下任一所述的氨基酸序列：
a：氨基酸序列由如SEQ ID NO：13-22所示的序列，具体地：色氨酸羟化途径关键酶TPH2氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示；BH4合成途径关键酶folE，PTPS，SPR基因氨基酸序列依次如SEQ ID NO：14-16所示，BH4再生关键酶PCD，DHPR的氨基酸序列如SEQ ID NO：17-18所示；5-羟基β-吲哚基丙氨酸产N-乙酰-5-羟色胺途径关键酶AANAT、ACS的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：19-20所示；N-乙酰-5-羟色胺产N-乙酰基-5-甲氧基色胺途径关键酶COMT、MAT的核苷酸序列如 SEQ ID NO：21-22所示；
或 b：为具有与a所述的各氨基酸序列至少95%以上的序列同一性；
进一步地，为具有与a所述的氨基酸序列98%以上的序列同一性；更优选为具有与a所述的氨基酸序列99%以上的序列同一性；
或 c：由a所述的各氨基酸序列的C末端和/或N末端取代、添加或缺失一个或几个氨基酸残基而形成；
进一步地，由a所述的氨基酸序列的C末端和/或N末端添加或缺失1-30个，更优选1-10个，还要优选1-6个，最优选1-3个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的具有所述蛋白的功能的衍生蛋白。
按上述方案，色氨酸羟化途径关键酶TPH2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；BH4合成途径关键酶folE，PTPS，SPR基因核苷酸序列依次如SEQ ID NO：2-4所示，BH4再生关键酶PCD，DHPR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：5-6所示；5-羟基β-吲哚基丙氨酸产N-乙酰-5-羟色胺途径关键酶AANAT、ACS基因核苷酸序列序列依次如SEQ ID NO：7-8所示；N-乙酰-5-羟色胺产N-乙酰基-5-甲氧基色胺途径关键酶COMT、MAT基因核苷酸序列如 SEQ ID NO：9-10所示。
按上述方案，上述合成N-乙酰基-5-甲氧基色胺所有蛋白编码基因还包括DDC基因，核苷酸序列为SEQ ID NO：12所示，表达DDC蛋白，氨基酸序列为SEQ ID NO：24所示。
按上述方案，上述合成N-乙酰基-5-甲氧基色胺所有蛋白编码基因还包括GDH基因，核苷酸序列为SEQ ID NO：11所示，表达GDH蛋白，氨基酸序列为SEQ ID NO：223所示。
按上述方案，上述合成方法为第一合成方法或第二合成方法：
下面就第一合成方法进行描述：
按上述方案，第一合成方法具体为：
S1：按照如下方法构建重组基因工程菌：将色氨酸羟化途径关键酶TPH2基因；BH4合成途径关键酶folE，PTPS，SPR基因和BH4再生关键酶PCD，DHPR基因放入同一质粒串连表达；将5-羟基β-吲哚基丙氨酸产N-乙酰-5-羟色胺途径关键酶AANAT、ACS基因放入同一质粒串连表达；将N-乙酰-5-羟色胺产N-乙酰基-5-甲氧基色胺途径关键酶COMT、MAT基因放入同一质粒串连表达；将上述质粒共同转化至宿主细胞中，得到重组基因工程菌；
S2：将上述重组基因工程菌用于合成N-乙酰基-5-甲氧基色胺。
按上述方案，所述的S2具体步骤为：将S1所构建的重组基因工程菌，经过LB培养基活化培养后，转接至TB培养基诱导表达酶后，以葡萄糖为底物从头合成N-乙酰基-5-甲氧基色胺。
进一步地，所述的宿主细胞为大肠杆菌宿主细胞，优选为BL21（DE3），加强β-吲哚基丙氨酸合成途径，ΔtrpR（DDC），ΔtnaA大肠杆菌宿主细胞，即以BL21（DE3）为出发菌株，将基因组上的trpR基因替换为DDC基因，加强β-吲哚基丙氨酸合成途径的酶的表达，即trpE的启动子替换为tac启动子，并敲除tnaA基因。
本发明提供的一个具体实施方式为：
宿主菌的改造：出发菌株BL21（DE3），以tac-trpEup-F，tac-trpEup-R为引物，BL21（DE3）基因组为模板，获得带有trpEup上下游同源臂的的tac启动子基因，将此片段电转入BL21（DE3）感受态中插入基因组trpEup部分，PCR筛选出阳性克隆。命名为HP213。
分别以tnaAup-F、tnaAup-R，tnaAdown-F，tnaAdown-R为引物，BL21（DE3）基因组为模板，获得tnaA基因上游片段和tnaA基因下游片段。将两片段以tnaAup-F、tnaAdown-R为引物进行融合PCR连接，得到ΔtnaA片段。将此片段电转入HP213感受态中替换基因组tnaA基因，PCR筛选出阳性克隆。命名为HP214。
DDC基因经密码子优化，序列为如 SEQ ID NO：24所示所示，插入到pET28a（+）质粒的NdeI和XhoI位点之间，获得pET28a-DDC质粒。
以DDC/trpR-F，DDC/trpR-R为引物，以质粒pET28a-DDC为模板，获得带有trpR上下游同源臂的DDC基因片段。将此片段电转入HP214感受态中替换基因组trpR基因，PCR筛选出阳性克隆，获得BL21（DE3），加强β-吲哚基丙氨酸合成途径，ΔtrpR（DDC），ΔtnaA）大肠杆菌宿主细胞，命名为HP215。
引物序列如下表
下面就第二合成方法进行描述：
第二合成方法：
将合成N-乙酰基-5-甲氧基色胺基因分别表达，获得二个以上的重组基因工程菌，经多菌株培养方式，合成N-乙酰基-5-甲氧基色胺。
按上述方案，所述的第二合成方法为：将所构建的重组基因工程菌分别经过LB培养基活化培养后，转接至TB发酵培养基诱导表达酶并生成一定量的中间产物，经过一定时间的发酵后，再混合以葡萄糖为底物从头合成N-乙酰基-5-甲氧基色胺。
第二合成方法的方法一，具体为：
将色氨酸羟化途径关键酶TPH2基因；BH4合成途径关键酶folE，PTPS，SPR基因和BH4再生关键酶PCD，DHPR基因放入同一质粒串连表达；将上述质粒转化到宿主细胞中，获得第一重组基因工程菌；
将5-羟基β-吲哚基丙氨酸产N-乙酰-5-羟色胺途径关键酶AANAT、ACS基因放入同一质粒串连表达；将N-乙酰-5-羟色胺产N-乙酰基-5-甲氧基色胺途径关键酶COMT、MAT基因放入同一质粒串连表达；将上述质粒转化至宿主细胞中，得到第二重组工程菌；
将第一重组基因工程菌和第二重组基因工程菌经多菌株培养方式，进行N-乙酰基-5-甲氧基色胺的合成。
进一步地，构建第一重组基因工程菌的宿主细胞为大肠杆菌宿主细胞，优选为大肠杆菌（BL21（DE3），加强β-吲哚基丙氨酸合成途径，ΔtnaA）宿主细胞，即以BL21（DE3）为出发菌株，加强β-吲哚基丙氨酸合成途径的酶的表达即trpE的启动子替换为tac启动子，并敲除tnaA基因。
本发明提供的一个具体实施方式为：
宿主菌的改造：出发菌株BL21（DE3），以tac-trpEup-F，tac-trpEup-R为引物，BL21（DE3）基因组为模板，获得带有trpEup上下游同源臂的的tac启动子基因，将此片段电转入BL21（DE3）感受态中插入基因组trpEup部分，PCR筛选出阳性克隆。命名为HP213。
分别以tnaAup-F、tnaAup-R，tnaAdown-F，tnaAdown-R为引物，BL21（DE3）基因组为模板，获得tnaA基因上游片段和tnaA基因下游片段。将两片段以tnaAup-F、tnaAdown-R为引物进行融合PCR连接，得到ΔtnaA片段。将此片段电转入HP213感受态中替换基因组tnaA基因，PCR筛选出阳性克隆，获得大肠杆菌（BL21（DE3），加强β-吲哚基丙氨酸合成途径，ΔtnaA）宿主细胞，命名为HP214。
进一步地，构建第二重组基因工程菌的宿主细胞为大肠杆菌（BL21（DE3）ΔtrpR（DDC），ΔtnaA）宿主细胞，即以BL21（DE3）为出发菌株，将基因组上的trpR基因替换为DDC基因，并敲除tnaA基因。
其中：本发明提供的一个具体实施方式为：
宿主菌的改造：分别以tnaAup-F、tnaAup-R，tnaAdown-F，tnaAdown-R为引物，BL21（DE3）基因组为模板，获得tnaA基因上游片段和tnaA基因下游片段。将两片段以tnaAup-F、tnaAdown-R为引物进行融合PCR连接，得到ΔtnaA片段。将此片段电转入BL21（DE3）感受态中替换基因组tnaA基因，PCR筛选出阳性克隆。命名为HP114。
以DDC/trpR-F，DDC/trpR-R为引物，以质粒pET28a-DDC为模板，获得获得带有trpR上下游同源臂的DDC基因片段。将此片段电转入HP114感受态中替换基因组trpR基因，PCR筛选出阳性克隆，得到大肠杆菌（BL21（DE3）ΔtrpR（DDC），ΔtnaA）宿主细胞。命名为HMT115。
按上述方案，将第一重组基因工程菌和第二重组基因工程菌的培养体系先单独培养一段时间后，然后混合，进行N-乙酰基-5-甲氧基色胺的合成。
按上述方案，第一重组基因工程菌和第二重组基因工程菌的培养体系单独培养6-36h，优选为12-30h，进一步优选为12-24h，更优选为18-24h，然后混合，进行N-乙酰基-5-甲氧基色胺的合成。
按上述方案，所述的第一、二重组基因工程菌培养过程为：将所构建的第一、二重组基因工程菌，分别经过LB培养基活化培养后，转接至TB发酵培养基诱导表达酶并生成一定量的中间产物，经过一定时间的发酵后，再将两种发酵液混合以葡萄糖为底物从头合成N-乙酰基-5-甲氧基色胺。TB发酵培养基中的甘油用葡萄糖替换。
第二合成方法的方法二，具体为：
构建表达氨酸羟化途径关键酶TPH2；BH4合成途径关键酶folE，PTPS，SPR和BH4再生关键酶PCD，DHPR基因的质粒，将质粒上的BH4合成途径关键酶folE，PTPS，SPR替换成GDH酶基因，获得质粒；将质粒转化至基因组上表达了BH4合成途径关键酶folE，PTPS，SPR基因的宿主细胞中，得到第一重组基因工程菌；
将5-羟基β-吲哚基丙氨酸产N-乙酰-5-羟色胺途径关键酶AANAT、ACS放入同一质粒串连表达；将N-乙酰-5-羟色胺产N-乙酰基-5-甲氧基色胺途径关键酶COMT、MAT放入同一质粒串连表达；将上述质粒转化至宿主细胞中，得到第二重组工程菌；
将第一重组基因工程菌和第二重组基因工程菌经多菌株培养方式，进行N-乙酰基-5-甲氧基色胺的合成。
进一步地，构建第一重组基因工程菌中用的宿主细胞为大肠杆菌宿主细胞，优选为大肠杆菌宿主细胞（BL21（DE3），加强β-吲哚基丙氨酸合成途径，ΔtrpR（folE，PTPS，SPR），ΔtnaA），即以BL21（DE3）为出发菌株，加强β-吲哚基丙氨酸合成途径的酶的表达即trpE的启动子替换为tac启动子，将基因组上的trpR基因替换为folE，PTPS，SPR基因，并敲除tnaA基因；
进一步地，上述构建第二重组基因工程菌用的宿主细胞为大肠杆菌宿主细胞（BL21（DE3）ΔtrpR（DDC），ΔtnaA），即以BL21（DE3）为出发菌株，将基因组上的trpR基因替换为DDC基因，并敲除tnaA基因。
按上述方案，第一重组基因工程菌和第二重组基因工程菌的培养体系单独培养6-36h，优选为12-30h，进一步优选为12-24h，更优选为18-24h，然后混合，进行N-乙酰基-5-甲氧基色胺的合成。
按上述方案，所述的第一、二重组基因工程菌培养过程为：将所构建的第一、二重组基因工程菌，分别经过LB培养基活化培养后，转接至TB培养基诱导表达酶并生成一定量的中间产物，经过一定时间的发酵后，再将两种发酵液混合以葡萄糖为底物从头合成N-乙酰基-5-甲氧基色胺。
本发明还提供一种包含所述合成N-乙酰基-5-甲氧基色胺所有酶编码基因的重组载体，所述合成N-乙酰基-5-甲氧基色胺所有酶编码基因序列如SEQ ID NO：1-10所示。
本发明还提供一种重组基因工程菌，所述重组基因工程菌为包括上述重组载体的重组基因工程菌。
本发明还提供将部分酶基因整合入宿主细胞的基因组表达，其余酶基因在质粒中表达后转入前述宿主细胞中得到的重组基因工程菌。
按上述方案，所述的重组基因工程菌基因组上整合有DDC基因。
按上述方案，BH4合成途径关键酶folE，PTPS，SPR基因在工程菌基因组上表达，其他目的酶基因在质粒中表达后转入基因组表达了BH4合成途径关键酶folE，PTPS，SPR基因的宿主细胞中。进一步地，其他目的酶基因包括GDH基因，在质粒中表达GDH基因。
提供一种重组载体的构建方法：将色氨酸羟化途径关键酶TPH2基因；BH4合成途径关键酶folE，PTPS，SPR基因和BH4再生关键酶PCD，DHPR基因放入同一质粒串连表达；将5-羟基β-吲哚基丙氨酸产N-乙酰-5-羟色胺途径关键酶AANAT、ACS基因放入同一质粒串连表达；将N-乙酰-5-羟色胺产N-乙酰基-5-甲氧基色胺途径关键酶COMT、MAT基因放入同一质粒串连表达，获得重组载体。
提供一种重组基因工程菌的构建方法：
将上述重组载体转入到宿主细胞中，得到重组基因工程菌；
或将一部分目的酶基因整合入宿主细胞的基因组表达，其余目的酶基因在质粒中表达后转入前述宿主细胞中得到重组基因工程菌。
本发明还提供上述所述的合成N-乙酰基-5-甲氧基色胺所有酶编码基因、所述的重组载体或所述的基因工程菌在生产合成N-乙酰基-5-甲氧基色胺路径中的酶的应用。
本发明还提供所述的合成N-乙酰基-5-甲氧基色胺所有酶编码基因、所述的重组载体或所述的重组基因工程菌在生产N-乙酰基-5-甲氧基色胺中的应用。
本发明通过解析N-乙酰基-5-甲氧基色胺化合物的生物合成途径，揭示参与该化合物合成途径中相关的酶基因，在此基础上，在生产菌株中重构目标化合物合成途径，表达重组载体中编码所合成N-乙酰基-5-甲氧基色胺的一系列酶编码基因，以获取合成N-乙酰基-5-甲氧基色胺的一系列酶，从而实现以廉价的原料如葡萄糖催化生产高附加值的目标产物N-乙酰基-5-甲氧基色胺的目的。
本发明提供了一系列合成N-乙酰基-5-甲氧基色胺的酶、几种酶的表达质粒、几种表达宿主以及合成N-乙酰基-5-甲氧基色胺重组基因工程菌株：
本发明进一步通过发酵培养的方式的优化，达到了进一步提升N-乙酰基-5-甲氧基色胺合成的产量的效果。
本发明的有益效果：
（1）本发明公开了包含合成N-乙酰基-5-甲氧基色胺的一系列酶编码基因的重组载体以及重组基因工程菌。通过发酵培养的方式，表达重组载体中编码所合成N-乙酰基-5-甲氧基色胺的一系列酶编码基因，以获取合成N-乙酰基-5-甲氧基色胺的一系列酶。该过程易实施，条件易于控制，适宜推广工业化生产。
（2）本发明通过将葡萄糖生产N-乙酰基-5-甲氧基色胺路径上的所有关键酶强化表达，提高了N-乙酰基-5-甲氧基色胺的产量，并进一步通过改变传统的单菌发酵模式，能进一步增加N-乙酰基-5-甲氧基色胺的产量。这为利用葡萄糖生产N-乙酰基-5-甲氧基色胺工业化，提高其生产效率、降低生产成本提供了数据支持。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为：pET28a-TPH2质粒图谱
图2为：folE-PET28a质粒图谱
图3为：PTPS-PET28a质粒图谱
图4为：SPR-PET28a质粒图谱
图5为：PCD-PET28a质粒图谱
图6为：DHPR-PET28a治理图谱
图7为：PET28a-5-HTP质粒图谱
图8为：pACYCDuet-AANAT质粒图谱
图9为：pACYCDuet-ACS质粒图谱
图10为：pACYCDuet-AANAT-ACS质粒图谱
图11为：pETDuet-COMT质粒图谱
图12为：pETDuet-MAT质粒图谱
图13为：pETDuet-CM质粒图谱
图14为：PET28a-DDC质粒图谱
图15为：PET28a-GDH质粒图谱
图16为：PET28a-HGPD质粒图谱
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1 产5-羟基β-吲哚基丙氨酸质粒的构建
β-吲哚基丙氨酸羟化途径关键酶基因TPH2；BH4合成途径关键酶folE，PTPS，SPR；BH4再生关键酶PCD，DHPR的串联表达。
将TPH2、folE、PTPS、SPR、PCD、DHPR基因分别插入到pET28a（+）质粒的NdeI和XhoI位点之间，获得pET28a-TPH2、pET28a-folE、pET28a-PTPS、pET28a-SPR、pET28a-PCD、pET28a-DHPR质粒（如图1-6所示）。
以F1和R1为引物，pET28a-TPH2质粒为模板克隆获得含TPH2基因的pET28a质粒载体；以F2和R2为引物，质粒pET28a-folE为模板克隆获得folE基因；以F3和R3为引物，质粒pET28a-PTPS为模板克隆获得PTPS基因；以F4和R4为引物，质粒pET28a-SPR为模板克隆获得SPR基因；以F5和R5为引物，质粒pET28a-PCD为模板克隆获得PCD基因；以F6和R6为引物，质粒pET28a-DHPR为模板克隆获得DHPR基因。
将以上片段通过无缝克隆试剂盒连接在一起，形成质粒pET28a-5-HTP（如图7）。
表1 引物序列1
实施例2产N-乙酰-5-羟色胺质粒的构建
5-羟基β-吲哚基丙氨酸产N-乙酰-5-羟色胺途径关键酶基因AANAT、ACS的串联表达。
AANAT、ACS基因插入到pACYCDuet质粒的NcoI和AflⅡ位点之间，获得pACYCDuet-AANAT、pACYCDuet-ACS质粒（如图8、9所示）。
以F7和R7为引物，pACYCDuet-AANAT质粒为模板克隆获得含AANAT基因的pACYCDuet质粒载体；以F8和R8为引物，质粒pACYCDuet-ACS为模板克隆获得ACS基因。
将以上片段通过无缝克隆试剂盒连接在一起，形成质粒pACYCDuet-AANAT-ACS（如图10）。
表2 引物序列2
实施例3产N-乙酰基-5-甲氧基色胺质粒的构建
N-乙酰-5-羟色胺产N-乙酰基-5-甲氧基色胺途径关键酶基因COMT、MAT的串联表达。
COMT、MAT基因插入到质粒pETDuet的NcoI和AflⅡ位点之间，获得pETDuet-COMT、pETDuet-MAT质粒（如图11、12所示）。
以F9和R9为引物，pETDuet-COMT质粒为模板克隆获得含COMT基因的pETDuet质粒载体；以F10和R10为引物，质粒pETDuet-MAT为模板克隆获得MAT基因。
将以上片段通过无缝克隆试剂盒连接在一起，形成质粒pETDuet-CM（如图13）。
表3 引物序列3
实施例4以葡萄糖产N-乙酰基-5-甲氧基色胺菌株的构建
宿主菌的改造：出发菌株BL21（DE3），以tac-trpEup-F，tac-trpEup-R为引物，BL21（DE3）基因组为模板，获得带有trpEup上下游同源臂的的tac启动子基因，将此片段电转入BL21（DE3）感受态中插入基因组trpEup部分，PCR筛选出阳性克隆。命名为HP213。
分别以tnaAup-F、tnaAup-R，tnaAdown-F，tnaAdown-R为引物，BL21（DE3）基因组为模板，获得tnaA基因上游片段和tnaA基因下游片段。将两片段以tnaAup-F、tnaAdown-R为引物进行融合PCR连接，得到ΔtnaA片段。将此片段电转入HP213感受态中替换基因组tnaA基因，PCR筛选出阳性克隆。命名为HP214。
DDC基因经密码子优化，序列为如 SEQ ID No.24 所示，插入到pET28a（+）质粒的NdeI和XhoI位点之间，获得pET28a-DDC质粒（如图14所示）。
以DDC/trpR-F，DDC/trpR-R为引物，以质粒pET28a-DDC为模板，获得带有trpR上下游同源臂的DDC基因片段。将此片段电转入HP214感受态中替换基因组trpR基因，PCR筛选出阳性克隆。命名为HP215。
表4 引物序列4
将实例1、实例2、实例3中的质粒电转化至宿主细胞HP215（BL21（DE3），加强β-吲哚基丙氨酸合成途径，ΔtrpR（DDC），ΔtnaA）中，得到重组工程菌HP215-MT，经固体LB培养基平板活化的单菌落接种于装有100 mL液体LB培养基（蛋白胨1 %、酵母粉0.5 %、氯化钠1 %，其余为水，pH 7.0）的500 mL种子瓶内，添加50 mg/L的卡那霉素、34mg/L的氯霉素、100mg/L的氨苄青霉素，在37℃、220 rpm振荡培养12 h；按接菌量5%转接装100 mL TB发酵培养基（酵母粉24 g/L、蛋白胨12 g/L、磷酸氢二钾16.43 g/L、磷酸二氢钾2.31 g/L、葡萄糖10 g/L）的500 mL中，添加50 mg/L的卡那霉素、34mg/L的氯霉素、100mg/L的氨苄青霉素素，发酵温度为37℃，转速220 rpm，OD600生长至0.6-0.8时，补加0.1 mM IPTG诱导转化48 h。将催化反应溶液用去离子水稀释适当倍数，12000×g离心3 min，上清液经0.22 μm有机滤膜过滤后，用岛津LAT-20A高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）检测产物及中间体生产量变化。
表5 各产物及中间体含量
上述结果表明：其实现了将葡萄糖催化生产高附加值的目标产物N-乙酰基-5-甲氧基色胺的目的。
实施例5多菌株混合培养方式合成N-乙酰基-5-甲氧基色胺
宿主菌的改造：分别以tnaAup-F、tnaAup-R，tnaAdown-F，tnaAdown-R为引物，BL21（DE3）基因组为模板，获得tnaA基因上游片段和tnaA基因下游片段。将两片段以tnaAup-F、tnaAdown-R为引物进行融合PCR连接，得到ΔtnaA片段。将此片段电转入BL21（DE3）感受态中替换基因组tnaA基因，PCR筛选出阳性克隆。命名为HP114。
以DDC/trpR-F，DDC/trpR-R为引物，以质粒pET28a-DDC为模板，获得获得带有trpR上下游同源臂的DDC基因片段。将此片段电转入HP114感受态中替换基因组trpR基因，PCR筛选出阳性克隆。命名为HMT115。
将实例1中的质粒电转化至实施例4中的宿主细胞HP214（BL21（DE3），加强β-吲哚基丙氨酸合成途径，ΔtnaA）中，得到重组工程菌HP214-5-HTP；将实例2、实例3中的质粒电转化至实施例5中的宿主细胞HMT115（BL21（DE3）ΔtrpR（DDC），ΔtnaA）中，得到重组工程菌HMT-115-MT。将菌HP214-5-HTP经固体LB培养基平板活化的单菌落接种于装有100 mL液体LB培养基（蛋白胨1 %、酵母粉0.5 %、氯化钠1 %，其余为水，pH 7.0）的500 mL种子瓶内，添加50 mg/L的卡那霉素，在37℃、220 rpm振荡培养12 h；按接菌量5%转接装100 mL TB发酵培养基（酵母粉24 g/L、蛋白胨12 g/L、磷酸氢二钾16.43 g/L、磷酸二氢钾2.31 g/L、葡萄糖10 g/L）的500 mL中，添加50 mg/L的卡那霉素，发酵温度为37℃，转速220 rpm，OD600生长至0.6-0.8时，补加0.1 mM IPTG诱导；将菌HMT115-MT经固体LB培养基平板活化的单菌落接种于装有100 mL液体LB培养基（蛋白胨1 %、酵母粉0.5 %、氯化钠1 %，其余为水，pH 7.0）的500 mL种子瓶内，添加34mg/L的氯霉素、100mg/L的氨苄青霉素，在37℃、220 rpm振荡培养12 h；按接菌量5%转接装100 mL TB发酵培养基（酵母粉24 g/L、蛋白胨12 g/L、磷酸氢二钾16.43 g/L、磷酸二氢钾2.31 g/L、葡萄糖10 g/L）的500 mL中，添加34mg/L的氯霉素、100mg/L的氨苄青霉素，发酵温度为37℃，转速220 rpm，OD600生长至0.6-0.8时，补加0.1 mMIPTG诱导。分别在两菌株不同的单独诱导时间，将两种菌液混合后继续催化培养，通过HPLC检测产物及中间体生产量变化。
表6 各产物及中间体含量
实施例6基因组表达BH4合成酶：folE、PTPS、SPR
出发菌株HP214（BL21（DE3），加强β-吲哚基丙氨酸合成途径，ΔtnaA），以FPS/trpR-F，FPS/trpR-R为引物，pET28a-5-HTP质粒为模板，获得带有trpR上下游同源臂的的folE、PTPS、SPR基因，将此片段电转入HP214感受态中替换基因组上trpR基因，PCR筛选出阳性克隆。命名为HP216
表7 引物序列4
实施例7：pET28a-5-HTP质粒上的BH4合成途径关键酶folE，PTPS，SPR；替换成GDH。
GDH基因经密码子优化，基因序列为SEQ ID NO.23所示，插入到pET28a（+）质粒的NdeI和XhoI位点之间，获得pET28a-GDH质粒（如图15所示）。
以F5和R1为引物，实施例1中pET28a-5-HTP质粒为模板克隆获得含TPH2、PCD和DHPR基因的pETDuet质粒载体；以F11和R11为引物，质粒pET28a-GDH为模板克隆获得GDH基因。
将以上片段通过无缝克隆试剂盒连接在一起，形成质粒pET28a-HGPD（如图16）。
表6 引物序列3
实施例8 改进菌株混合培养方式合成N-乙酰基-5-甲氧基色胺
将实施例7中的质粒电转化至实施例6中的宿主细胞HP216（BL21（DE3），加强β-吲哚基丙氨酸合成途径，ΔtrpR（folE，PTPS，SPR），ΔtnaA）中，得到重组工程菌HP216-5-HTP；将实例2、实例3中的质粒电转化至宿主细胞HMT115（BL21（DE3）ΔtrpR（DDC），ΔtnaA）中，得到重组工程菌HMT-115-MT。将菌HP216-5-HTP经固体LB培养基平板活化的单菌落接种于装有100 mL液体LB培养基（蛋白胨1 %、酵母粉0.5 %、氯化钠1 %，其余为水，pH 7.0）的500 mL种子瓶内，添加50 mg/L的卡那霉素，在37℃、220 rpm振荡培养12 h；按接菌量5%转接装100mL TB发酵培养基（酵母粉24 g/L、蛋白胨12 g/L、磷酸氢二钾16.43 g/L、磷酸二氢钾2.31g/L、葡萄糖10 g/L）的500 mL中，添加50 mg/L的卡那霉素，发酵温度为37℃，转速220 rpm，OD600生长至0.6-0.8时，补加0.1 mM IPTG诱导；将菌HMT-115-MT经固体LB培养基平板活化的单菌落接种于装有100 mL液体LB培养基（蛋白胨1 %、酵母粉0.5 %、氯化钠1 %，其余为水，pH 7.0）的500 mL种子瓶内，添加34mg/L的氯霉素、100mg/L的氨苄青霉素素，在37℃、220 rpm振荡培养12 h；按接菌量5%转接装100 mL TB发酵培养基（酵母粉24 g/L、蛋白胨12g/L、磷酸氢二钾16.43 g/L、磷酸二氢钾2.31 g/L、葡萄糖10 g/L）的500 mL中，添加34mg/L的氯霉素、100mg/L的氨苄青霉素素，发酵温度为37℃，转速220 rpm，OD600生长至0.6-0.8时，补加0.1 mM IPTG诱导。分别在两菌株不同的诱导时间，将两种菌液混合后继续催化培养，通过HPLC检测产物及中间体生产量变化。
表8 各产物及中间体含量
可见，本发明通过将葡萄糖生产N-乙酰基-5-甲氧基色胺路径上的关键酶强化表达，并改变传统的单菌发酵模式，从而增加了N-乙酰基-5-甲氧基色胺的产量，如表8所示。这为利用葡萄糖生产N-乙酰基-5-甲氧基色胺工业化，提高其生产效率、降低生产成本提供了数据支持。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 河北维达康生物科技有限公司
<120> N-乙酰基-5-甲氧基色胺的生物合成方法及其应用
<160> 24
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1473
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
atgcaaccgg ccatgatgat gttcagctcc aaatattggg ctcgtcgtgg tttctctctg 60
gactctgctg ttccggaaga acaccagctg ctgggctcct ctactctgaa caaaccgaac 120
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gaagatgtta gcatgtttct gaaagaacgc agcggtttta ccgttcgtcc ggttgcaggt 840
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tatattcgcc atggtagcga tccgctgtat actccggaac cggatacctg tcatgaactg 960
ctgggtcatg tgccgctgct ggcagatccg aaatttgcac agtttagcca agaaattggt 1020
ctggcaagcc tgggtgcaag tgatgaagat gtgcagaaac tggcaacctg ttatttcttt 1080
accattgaat ttggcctgtg caaacaagag ggtcagctgc gtgcctatgg tgcaggtctg 1140
ctgagcagca ttggtgaact gaaacatgca ctgagcgata aagcatgtgt taaagcattt 1200
gatccgaaaa ccacctgtct gcaagaatgt ctgattacca cctttcaaga agcctatttc 1260
gttagcgaaa gctttgaaga ggccaaagaa aaaatgcgcg attttgccaa aagcattacc 1320
cgtccgttta gcgtttattt caatccgtat acacagagca tcgagatcct gaaagatacc 1380
cgtagcattg aaaatgtggt gcaagacctg cgttccgatc tgaacaccgt atgcgacgcg 1440
ctgaacaaaa tgaaccaata tcttggtatc taa 1473
<210> 2
<211> 573
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
atgaaagaag tgaacaaaga acagatcgaa caggcagtgc gtcagattct ggaagcaatc 60
ggtgaagatc cgaatcgcga aggtctgctg gataccccga aacgcgttgc caaaatgtat 120
gcagaagttt ttagcggtct gaacgaagat ccgaaagaac attttcagac aatttttggt 180
gaaaaccatg aagaactggt gctggttaaa gatattgcat ttcatagtat gtgcgaacat 240
catctggttc cgttttatgg taaagcacat gtggcatata ttccacgtgg tggtaaagta 300
acaggtctga gcaaactggc ccgtgcagtt gaagcagttg caaaacgtcc gcagctgcag 360
gaacgtatta ccagcacaat cgcagaaagc attgtcgaaa ccctggaccc tcatggtgtg 420
atggttgttg ttgaagcaga acacatgtgt atgacaatgc gcggtgtccg taaaccaggt 480
gcaaaaaccg ttaccagcgc agtgcgcggt gtttttaaag atgatgccgc agcacgtgca 540
gaagttctgg aacatattaa acgccaggat taa 573
<210> 3
<211> 438
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
atgagcaccg aaggtggtgg tcgccgctgt caggcgcagg ttagccgccg tattagcttt 60
agcgcgagcc atcgtctgta ttccaaattt ctgagcgatg aagaaaacct gaaactgttt 120
ggtaaatgta ataacccgaa tggtcatggt cataattata aagttgtggt gaccgttcat 180
ggtgaaattg atcctgccac cggtatggtc atgaatctgg cagatttaaa aaaatatatg 240
gaagaagcaa ttatgcagcc gctggatcat aaaaatctgg atatggatgt tccgtatttt 300
gcagatgttg ttagcaccac cgaaaatgtt gcagtttata tttgggataa tctgcagaaa 360
gttctgccgg ttggtgttct gtataaagtt aaagtttatg aaaccgataa taatattgtt 420
gtttataaag gtgaataa 438
<210> 4
<211> 786
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
atggaaggtg gtctgggtcg tgccgtttgt ctgctgacgg gtgcaagccg tggttttggt 60
cgtacactgg caccgctgct ggcgagcctg ctgagccctg gtagcgttct ggttctgagc 120
gcacgtaatg atgaagcact gcgtcagctg gaagcagaac tgggtgcaga acgtagtggt 180
ctgcgcgttg ttcgtgttcc ggcagattta ggtgcagaag caggtctgca gcagctgctg 240
ggtgcactgc gtgaactgcc tcgtcctaaa ggtctgcagc gtctgctgct gattaataat 300
gcaggtagtc tgggtgatgt tagcaaaggt tttgtagatt taagcgattc tactcaggtt 360
aataattatt gggccctgaa tctgacgagt atgctgtgtc tgacttctag cgtactgaaa 420
gcatttcctg atagtccggg tctgaatcgt accgtggtta atatttccag cctgtgtgca 480
ctgcagccgt ttaaaggctg ggcactgtat tgtgccggta aagcagcacg tgatatgctg 540
tttcaggttc tggcactgga agaaccaaat gttcgtgttc tgaattatgc tccgggtccg 600
ctggatacgg atatgcagca gctggcgcgt gaaacatcag ttgatcctga tatgcgtaaa 660
ggtctgcagg aactgaaagc aaaaggtaaa ctggtggatt gtaaagttag cgcacagaaa 720
ctgctgagcc tgctggaaaa agatgaattt aaaagtggtg cacatgtgga tttttatgat 780
aaataa 786
<210> 5
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
atgagcaccc tgaaccaggc acattgtgaa gcctgccgcg cggatgcgcc gcaggttagt 60
gaagcggaac tgccggaact gctgaaacag atcccggatt ggaacattga agtgcgtgat 120
ggtgttatgc agctggaaaa agtttttctg tttaaaaact ttaaatttgc actggcattt 180
accaatgccg ttggtgaaat tgcagaagcg gaaggtcatc atccgggtct gctgaccgaa 240
tggggtaaag ttaccgtgac gtggtggagc catagcatta aaggtctgca tcgtaatgat 300
tttatcatgg cggcacgtac agatggtgtg gcaagcggtg cggaaggtcg taaataa 357
<210> 6
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
atggatatta tcagcgttgc gctgaaacgt catagcacca aagcctttga tgcaagcaaa 60
aagctgaccc cggaacaggc agaacagatt aaaacgctgc tgcagtatag cccgagcagc 120
accaacagcc agccgtggca ttttattgtc gcaagcaccg aagaaggtaa agcacgtgtt 180
gcaaaaagcg cagcaggtaa ttatgttttt aatgaacgta aaatgctgga tgcaagccat 240
gtggttgtat tttgtgcaaa aaccgcaatg gatgatgtgt ggctgaaact ggttgttgat 300
caggaagatg cagatggccg ttttgccacc ccggaagcca aagcagcaaa tgataaaggt 360
cgtaaatttt ttgcagatat gcatcgtaaa gatttacatg atgatgcaga atggatggca 420
aaacaggtat atctgaatgt tggtaacttt ctgctgggtg ttgcagcact gggtctggat 480
gccgttccga ttgaaggttt tgatgcagca attctggatg cagaatttgg tctgaaagaa 540
aaaggttata cctccctggt tgttgttcct gttggtcatc attcagttga agattttaat 600
gcaaccctgc cgaaatctcg tctgccgcag aatattacac tgacggaagt ttaa 654
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
atggaagatg cgctgaccgt tagcggcaaa ccggcggcgt gcccggttga tcaggattgc 60
ccgtacacca tcgaactgat ccagccggaa gatggcgaag cggttatcgc gatgctgaaa 120
accttcttct tcaaagatga accgctgaac accttcctgg atctgggcga atgcaaagaa 180
ctggaaaaat acagcctgaa accgctgccg gataactgca gctacaaagc ggttaacaaa 240
aaaggtgaaa tcatcggcgt tttcctgaac ggcctgatgc gtcgtccgtc cccggatgat 300
gttccggaaa aagcggcgga ttcttgcgaa cacccgaaat tcaagaaaat cctgagcctg 360
atggatcacg ttgaagaaca gttcaacatc ttcgatgttt acccggatga agaactgatc 420
ctggatggta aaatcctgag cgttgatacc aactaccgtg gtctgggcat cgctggtcgt 480
ctgaccgaac gtgcgtacga atacatgcgt gaaaacggta tcaacgttta ccacgttctg 540
tgctcttctc actactctgc gcgtgttatg gaaaaactgg gcttccacga agttttccgt 600
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taa 723
<210> 8
<211> 1959
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
atgagccaga ttcataaaca taccattccg gcgaacattg cggatcgctg cctgattaac 60
ccgcagcagt atgaagcgat gtatcagcag agcattaacg tgccggatac cttttggggc 120
gaacagggca aaattctgga ttggattaaa ccgtatcaga aagtgaaaaa caccagcttt 180
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aacgtggatg atgcgctgaa aaacccgaac gtgaccagcg tggaacatgt ggtggtgctg 660
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tattggtgca ccgcggatgt gggctgggtg accggccata gctatctgct gtatggcccg 960
ctgacctgcg gcgcgaccac cctgatgttt gaaggcgtgc cgaactggcc gaccccggcg 1020
cgcatggcgc aggtggtgga taaacatcag gtgaacattc tgtataccgc gccgaccgcg 1080
attcgcgcgc tgatggcgga aggcgataaa gcgattgaag gcaccgatcg cagcagcctg 1140
cgcattctgg gcagcgtggg cgaaccgatt aacccggaag cgtgggaatg gtattggaaa 1200
aaaattggca acgaaaaatg cccggtggtg gatacctggt ggcagaccga aaccggcggc 1260
tttatgatta ccccgctgcc gggcgcgacc gaactgaaag cgggcagcgc gacccgcccg 1320
ttttttggcg tgcagccggc gctggtggat aacgaaggca acccgctgga aggcgcgacc 1380
gaaggcagcc tggtgattac cgatagctgg ccgggccagg cgcgcaccct gtttggcgat 1440
catgaacgct ttgaacagac ctattttagc acctttaaaa acatgtattt tagcggcgat 1500
ggcgcgcgcc gcgatgaaga tggctattat tggattaccg gccgcgtgga tgatgtgctg 1560
aacgtgagcg gccatcgcct gggcaccgcg gaaattgaaa gcgcgctggt ggcgcatccg 1620
aaaattgcgg aagcggcggt ggtgggcatt ccgcataaca ttaaaggcca ggcgatttat 1680
gcgtatgtga ccctgaacca tggcgaagaa ccgagcccgg aactgtatgc ggaagtgcgc 1740
aactgggtgc gcaaagaaat tggcccgctg gcgaccccgg atgtgctgca ttggaccgat 1800
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ggcgatacca gcaacctggg cgataccagc accctggcgg atccgggcgt ggtggaaaaa 1920
ctgctggaag aaaaacaggc gattgcgatg ccgagctaa 1959
<210> 9
<211> 1083
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
atgggtagca ccgcggcgga tatggcggcg tctgcggatg aagaagcgtg catgttcgcg 60
ctgcagctgg cgagctccag cattctgccg atgaccctga aaaacgcgat cgaactgggc 120
ctgctggaaa tcctggttgc ggcgggcggt aaaagcctga ccccgaccga agttgcggcg 180
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ctggcaagct acaacgttgt gtcctgcctg gtggaagaag gtaaagacgg tcgtctgagc 300
cgtagctacg gtgcagcgcc ggtttgcaaa ttcctgaccc cgaacgaaga tggtgtgtct 360
atggcggcgc tggcgctgat gaaccaggac aaagttctga tggaatcttg gtactacctg 420
aaagatgcgg ttctggacgg tggcatcccg ttcaacaaag cgtacggtat gtctgcgttc 480
gaataccacg gtaccgatcc gcgtttcaac cgtgtgttca acgaaggcat gaaaaaccac 540
agcatcatca tcaccaaaaa actgctggaa ctgtaccacg gcttccaggg cctgggcacc 600
ctggtggatg ttggcggcgg cgttggcgct actgttgctg cgatcaccgc gcactacccg 660
gcgatcaaag gtgttaactt tgacctgccg cacgttatct ctgaagcgcc gccgtttccg 720
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taa 1083
<210> 10
<211> 1179
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
atggaaacct ttctattcac atccgagtca gtgaacgagg gccaccccga caaactatgc 60
gatcagatct ctgatgcggt gctcgatgcc tgccttgagc aggacccaga cagcaaggtt 120
gcttgcgaga catgtacaaa gaccaacatg gtcatggtct ttggagagat caccaccaag 180
ggcaagatag actatgaaaa gattgttcgt gacacatgcc gtaacattgg atttatttct 240
gatgatgttg gtcttgatgc tgacaagtgc aaagtcttgg ttaacattga gcagcagagc 300
cctgatattg ctcagggtgt ccacggtcac tttaccaagc ggccagagga gattggtgct 360
ggtgaccagg gccatatgtt tggttatgcc accgatgaga cccctgagta tatgcctttg 420
agccatgtac ttgccaccaa gctcggggct cgcctcactg aagttaggaa gaatggcacc 480
tgcccttggc taagacctga tggcaagact caggttactg ttgaatacta caatgacaac 540
ggtgcaatgg tccctgtccg tgtccacact gttctcatct ccactcagca tgatgagact 600
gtcacaaatg atgcaattgc tgctgatcta aaggagcatg tcatcaagcc tgtcatccct 660
gagaagtacc ttgatgagaa aactatcttc cacctaaacc catctggccg ttttgttatt 720
ggtggccctc atggtgatgc aggtctcact ggacgcaaga tcattattga cacctacggt 780
ggctggggag cccatggtgg tggtgctttc tcagggaagg acccaactaa ggtggataga 840
agtggtgctt acattgttag gcaggctgcc aagagcatcg tagcaaatgg tcttgctcgt 900
aggtgcattg tgcaagtctc ctatgctatt ggtgtacccg agcctttgtc tgtctttgtg 960
gacacctacg gcactggaaa aattcctgac aaggagattc ttaagattgt gaaggagaac 1020
tttgacttta ggcctggaat gatgaccatc aacctggatc tcaagagggg tggcaatagg 1080
ttcttgaaga cagccgcata cggacatttt ggaagggatg acccagactt cacctgggag 1140
gttgtcaagc ccctcaaatg ggagaagccc caagcttga 1179
<210> 11
<211> 786
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 11
atgtatacag atttaaaaga taaagtagta gtaattacag gtggatcaac aggtttagga 60
cgcgcaatgg ctgttcgttt cggtcaagaa gaagcaaaag ttgttattaa ctattacaac 120
aatgaagaag aagctttaga tgcgaaaaaa gaagtagaag aagcaggcgg acaagcaatc 180
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aaagaattcg gtacattaga cgttatgatt aataacgctg gtgttgaaaa cccagttcct 300
tctcatgagt tatctttaga caactggaat aaagttattg atacaaactt aacaggtgca 360
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attaacatgt ctagtgttca tgaaatgatt ccttggccat tatttgttca ttacgcagca 480
agtaaaggcg gtatgaaact aatgacggaa acattggctc ttgaatatgc gccaaaaggt 540
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ccagaagaag tagcagcagt tgcagcattc ttagcatcat cacaagcaag ctatgtaaca 720
ggtattacat tatttgctga tggtggtatg acgaaatacc catcattcca agcaggacgc 780
ggataa 786
<210> 12
<211> 1428
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 12
atggaagcca accagtttaa agattttgcc aaagagatga tcgattacgt tagcggctat 60
ctggaaaata ttcgtgatcg tcgtgttctg ccgaccgttg aaccgggtta tctgcgtccg 120
ctgattccgg caaccgcacc gcagaaaccg gataaatggg aagatgttat ggcagatatt 180
gaacgcgtta ttatgcctgg tgttacccat tggcatagtc cgcgttttca tgcatatttt 240
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tggctgggta aaatgattgg tctgccggaa gattttctgg catgtagcgg tggtaaaggt 420
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accctggaag tggcaattaa agaagatcgc gaagcaggtc tgattccgtt ttatgttgtt 720
gcgaccctgg gtacaaccag cagctgtacc tttgataatc tggaagaact gggtcctgtt 780
tgcaacagca ataacatttg gctgcatgtt gatgcagcct atgcaggtag cagctttatt 840
tgtccggaat ttcgttatct gatgaaaggt attgatcgcg cagatagctt taactttaat 900
ccgcataaat ggctgctggt gaattttgat tgtagcacca tgtggctgaa agatccgagc 960
tggctggtta atgcatttaa tgttgatccg ctgtatctga aacatgaaca gcagggtgca 1020
gcaccggatt atcgtcattg gcagattccg ctgggtcgtc gttttcgtgc actgaaactg 1080
tggtttgttc tgcgtctgta tggtattgaa aatctgcagg cctttattcg caaacatgtt 1140
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gaagttgttc tgggtttagt ttgctttcgt ctgaaagcca gcaacgaaat taatgaagca 1260
ctgctgaaac gtctgaatgg tcgtggtgtg attcatctgg ttccgagcaa aattcgtgat 1320
gtgtattttc tgcgcctggc aatttgtagc cgttttaccg aaaaagccga tattgacatt 1380
agctggaaag aagttaaaga agcagcagac gaggtcctga aaaaataa 1428
<210> 13
<211> 480
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 13
MQPAMMMFSS KYWARRGFSL DSAVPEEHQL LGSSTLNKPN SGKNDDKGNK GSSKREAATE 60
SGKTAVVFSL KNEVGGLVKA LRLFQEKRVN MVHIESRKSR RRSSEVEIFV DCECGKTEFN 120
ELIQLLKFQT TIVTLNPPEN IWTEEEELED VPWFPRKISE LDKCSHRVLM YGSELDADHP 180
GFKDNVYRQR RKYFVDVAMG YKYGQPIPRV EYTEEETKTW GVVFRELSKL YPTHACREYL 240
KNFPLLTKYC GYREDNVPQL EDVSMFLKER SGFTVRPVAG YLSPRDFLAG LAYRVFHCTQ 300
YIRHGSDPLY TPEPDTCHEL LGHVPLLADP KFAQFSQEIG LASLGASDED VQKLATCYFF 360
TIEFGLCKQE GQLRAYGAGL LSSIGELKHA LSDKACVKAF DPKTTCLQEC LITTFQEAYF 420
VSESFEEAKE KMRDFAKSIT RPFSVYFNPY TQSIEILKDT RSIENVVQDL RSDLNTVCDA 480
LNKMNQYLGI
490
<210> 14
<211> 190
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 14
MKEVNKEQIE QAVRQILEAI GEDPNREGLL DTPKRVAKMY AEVFSGLNED PKEHFQTIFG 60
ENHEELVLVK DIAFHSMCEH HLVPFYGKAH VAYIPRGGKV TGLSKLARAV EAVAKRPQLQ 120
ERITSTIAES IVETLDPHGV MVVVEAEHMC MTMRGVRKPG AKTVTSAVRG VFKDDAAARA 180
EVLEHIKRQD 190
<210> 15
<211> 190
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 15
MSTEGGGRRC QAQVSRRISF SASHRLYSKF LSDEENLKLF GKCNNPNGHG HNYKVVVTVH 60
GEIDPATGMV MNLADLKKYM EEAIMQPLDH KNLDMDVPYF ADVVSTTENV AVYIWDNLQK 120
VLPVGVLYKV KVYETDNNIV VYKGE 145
<210> 16
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 16
MEGGLGRAVC LLTGASRGFG RTLAPLLASL LSPGSVLVLS ARNDEALRQL EAELGAERSG 60
LRVVRVPADL GAEAGLQQLL GALRELPRPK GLQRLLLINN AGSLGDVSKG FVDLSDSTQV 120
NNYWALNLTS MLCLTSSVLK AFPDSPGLNR TVVNISSLCA LQPFKGWALY CAGKAARDML 180
FQVLALEEPN VRVLNYAPGP LDTDMQQLAR ETSVDPDMRK GLQELKAKGK LVDCKVSAQK 240
LLSLLEKDEF KSGAHVDFYD K 261
<210> 17
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 17
MSTLNQAHCE ACRADAPQVS EAELPELLKQ IPDWNIEVRD GVMQLEKVFL FKNFKFALAF 60
TNAVGEIAEA EGHHPGLLTE WGKVTVTWWS HSIKGLHRND FIMAARTDGV ASGAEGRK 118
<210> 18
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 18
MDIISVALKR HSTKAFDASK KLTPEQAEQI KTLLQYSPSS TNSQPWHFIV ASTEEGKARV 60
AKSAAGNYVF NERKMLDASH VVVFCAKTAM DDVWLKLVVD QEDADGRFAT PEAKAANDKG 120
RKFFADMHRK DLHDDAEWMA KQVYLNVGNF LLGVAALGLD AVPIEGFDAA ILDAEFGLKE 180
KGYTSLVVVP VGHHSVEDFN ATLPKSRLPQ NITLTEV 217
<210> 19
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 19
MEDALTVSGK PAACPVDQDC PYTIELIQPE DGEAVIAMLK TFFFKDEPLN TFLDLGECKE 60
LEKYSLKPLP DNCSYKAVNK KGEIIGVFLN GLMRRPSPDD VPEKAADSCE HPKFKKILSL 120
MDHVEEQFNI FDVYPDEELI LDGKILSVDT NYRGLGIAGR LTERAYEYMR ENGINVYHVL 180
CSSHYSARVM EKLGFHEVFR MQFADYKPQG EVVFKPAAPH VGIQVMAKEV GPAKAAQTKL 240
<210> 20
<211> 652
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 20
MSQIHKHTIP ANIADRCLIN PQQYEAMYQQ SINVPDTFWG EQGKILDWIK PYQKVKNTSF 60
APGNVSIKWY EDGTLNLAAN CLDRHLQENG DRTAIIWEGD DASQSKHISY KELHRDVCRF 120
ANTLLELGIK KGDVVAIYMP MVPEAAVAML ACARIGAVHS VIFGGFSPEA VAGRIIDSNS 180
RLVITSDEGV RAGRSIPLKK NVDDALKNPN VTSVEHVVVL KRTGGKIDWQ EGRDLWWHDL 240
VEQASDQHQA EKMNAEDPLF ILYTSGSTGK PKGVLHTTGG YLVYAALTFK YVFDYHPGDI 300
YWCTADVGWV TGHSYLLYGP LTCGATTLMF EGVPNWPTPA RMAQVVDKHQ VNILYTAPTA 360
IRALMAEGDK AIEGTDRSSL RILGSVGEPI NPEAWEWYWK KIGNEKCPVV DTWWQTETGG 420
FMITPLPGAT ELKAGSATRP FFGVQPALVD NEGNPLEGAT EGSLVITDSW PGQARTLFGD 480
HERFEQTYFS TFKNMYFSGD GARRDEDGYY WITGRVDDVL NVSGHRLGTA EIESALVAHP 540
KIAEAAVVGI PHNIKGQAIY AYVTLNHGEE PSPELYAEVR NWVRKEIGPL ATPDVLHWTD 600
SLPKTRSGKI MRRILRKIAA GDTSNLGDTS TLADPGVVEK LLEEKQAIAM PS 652
<210> 21
<211> 360
<212> PRT
<213> 人
21
MGSTAADMAA SADEEACMFA LQLASSSILP MTLKNAIELG LLEILVAAGG KSLTPTEVAA 60
KLPSAANPEA PDMVDRMLRL LASYNVVSCL VEEGKDGRLS RSYGAAPVCK FLTPNEDGVS 120
MAALALMNQD KVLMESWYYL KDAVLDGGIP FNKAYGMSAF EYHGTDPRFN RVFNEGMKNH 180
SIIITKKLLE LYHGFQGLGT LVDVGGGVGA TVAAITAHYP AIKGVNFDLP HVISEAPPFP 240
GVTHVGGDMF KEVPSGDAIL MKWILHDWSD QHCATLLKNC YDALPAHGKV VLVECILPVN 300
PEAKPSSQGV FHVDMIMLAH NPGGRERYER EFEALARGAG FTGVKSTYIY ANAWAIEFTK 360
<210> 22
<211> 392
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 22
METFLFTSES VNEGHPDKLC DQISDAVLDA CLEQDPDSKV ACETCTKTNM VMVFGEITTK 60
GKIDYEKIVR DTCRNIGFIS DDVGLDADKC KVLVNIEQQS PDIAQGVHGH FTKRPEEIGA 120
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GAMVPVRVHT VLISTQHDET VTNDAIAADL KEHVIKPVIP EKYLDEKTIF HLNPSGRFVI 240
GGPHGDAGLT GRKIIIDTYG GWGAHGGGAF SGKDPTKVDR SGAYIVRQAA KSIVANGLAR 300
RCIVQVSYAI GVPEPLSVFV DTYGTGKIPD KEILKIVKEN FDFRPGMMTI NLDLKRGGNR 360
FLKTAAYGHF GRDDPDFTWE VVKPLKWEKP QA 392
<210> 23
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 23
MYTDLKDKVV VITGGSTGLG RAMAVRFGQE EAKVVINYYN NEEEALDAKK EVEEAGGQAI 60
IVQGDVTKEE DVVNLVQTAI KEFGTLDVMI NNAGVENPVP SHELSLDNWN KVIDTNLTGA 120
FLGSREAIKY FVENDIKGNV INMSSVHEMI PWPLFVHYAA SKGGMKLMTE TLALEYAPKG 180
IRVNNIGPGA MNTPINAEKF ADPVQRADVE SMIPMGYIGK PEEVAAVAAF LASSQASYVT 240
GITLFADGGM TKYPSFQAGR G 261
<210> 24
<211> 475
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 24
MEANQFKDFA KEMIDYVSGY LENIRDRRVL PTVEPGYLRP LIPATAPQKP DKWEDVMADI 60
ERVIMPGVTH WHSPRFHAYF PTANSYPAIV ADILSGAIAC IGFSWIASPA CTELEVVMLD 120
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PHKWLLVNFD CSTMWLKDPS WLVNAFNVDP LYLKHEQQGA APDYRHWQIP LGRRFRALKL 360
WFVLRLYGIE NLQAFIRKHV ELAHYFESLV RGDERFEITE EVVLGLVCFR LKASNEINEA 420
LLKRLNGRGV IHLVPSKIRD VYFLRLAICS RFTEKADIDI SWKEVKEAAD EVLKK 475

Claims (5)

1.一种N-乙酰基-5-甲氧基色胺的合成方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）利用重组基因工程菌用于合成N-乙酰基-5-甲氧基色胺，所述的重组基因工程菌能够表达合成N-乙酰基-5-甲氧基色胺所有蛋白编码基因，包括色氨酸羟化途径关键酶TPH2基因；BH4合成途径关键酶folE，PTPS，SPR基因和BH4再生关键酶PCD，DHPR基因；5-羟基β-吲哚基丙氨酸产N-乙酰-5-羟色胺途径关键酶AANAT、ACS基因；N-乙酰-5-羟色胺产N-乙酰基-5-甲氧基色胺途径关键酶COMT、MAT基因和DDC基因，
或包括色氨酸羟化途径关键酶TPH2基因；BH4合成途径关键酶folE，PTPS，SPR基因和BH4再生关键酶PCD，DHPR基因；5-羟基β-吲哚基丙氨酸产N-乙酰-5-羟色胺途径关键酶AANAT、ACS基因，N-乙酰-5-羟色胺产N-乙酰基-5-甲氧基色胺途径关键酶COMT、MAT基因，DDC基因和GDH基因，
色氨酸羟化途径关键酶TPH2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：01所示；BH4合成途径关键酶folE，PTPS，SPR基因核苷酸序列依次如SEQ ID NO：02-04所示，BH4再生关键酶PCD，DHPR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：05-06所示；5-羟基β-吲哚基丙氨酸产N-乙酰-5-羟色胺途径关键酶AANAT核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示、ACS基因核苷酸序列依次如SEQ IDNO：8所示；N-乙酰-5-羟色胺产N-乙酰基-5-甲氧基色胺途径关键酶COMT基因核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示、MAT基因核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；DDC基因的核苷酸序列为SEQID NO：12所示；GDH基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：11所示；
2）从1）的体系中分离得到N-乙酰基-5-甲氧基色胺，
所述步骤1）采用下述两种方法之一：方法一：
S1将色氨酸羟化途径关键酶TPH2基因；BH4合成途径关键酶folE，PTPS，SPR基因和BH4再生关键酶PCD，DHPR基因放入同一质粒串连表达；将上述质粒转化到宿主细胞中，获得第一重组基因工程菌；
S2将5-羟基β-吲哚基丙氨酸产N-乙酰-5-羟色胺途径关键酶AANAT、ACS基因放入同一质粒串连表达；将N-乙酰-5-羟色胺产N-乙酰基-5-甲氧基色胺途径关键酶COMT、MAT基因放入同一质粒串连表达；将上述质粒转化至宿主细胞中，得到第二重组工程菌；
S3将第一重组基因工程菌和第二重组基因工程菌经多菌株培养方式，进行N-乙酰基-5-甲氧基色胺的合成；
方法二：
S1构建表达氨酸羟化途径关键酶TPH2；BH4合成途径关键酶folE，PTPS，SPR和BH4再生关键酶PCD，DHPR基因的质粒，将质粒上的BH4合成途径关键酶folE，PTPS，SPR替换成GDH酶基因，获得质粒；将质粒转化至基因组上表达了BH4合成途径关键酶folE，PTPS，SPR基因的宿主细胞中，得到第一重组基因工程菌；
S2将5-羟基β-吲哚基丙氨酸产N-乙酰-5-羟色胺途径关键酶AANAT、ACS放入同一质粒串连表达；将N-乙酰-5-羟色胺产N-乙酰基-5-甲氧基色胺途径关键酶COMT、MAT放入同一质粒串连表达；将上述质粒转化至宿主细胞中，得到第二重组工程菌；
S3将第一重组基因工程菌和第二重组基因工程菌经多菌株培养方式，进行N-乙酰基-5-甲氧基色胺的合成；
其中方法一中：构建第一重组基因工程菌的宿主细胞为大肠杆菌宿主细胞，具体为大肠杆菌宿主细胞BL21（DE3），加强β-吲哚基丙氨酸合成途径，ΔtnaA，所述的加强β-吲哚基丙氨酸合成途径为将trpE的启动子替换为tac启动子；
构建第二重组基因工程菌的宿主细胞为大肠杆菌宿主细胞BL21（DE3），ΔtrpR（DDC），ΔtnaA；
方法二中：构建第一重组基因工程菌中用的宿主细胞为大肠杆菌宿主细胞，具体为大肠杆菌宿主细胞BL21（DE3），加强β-吲哚基丙氨酸合成途径，ΔtrpR（folE，PTPS，SPR），ΔtnaA，所述的加强β-吲哚基丙氨酸合成途径为trpE的启动子替换为tac启动子；
构建第二重组基因工程菌用的宿主细胞为大肠杆菌宿主细胞BL21（DE3），ΔtrpR（DDC），ΔtnaA；
方法一和方法二的S3中：第一重组基因工程菌和第二重组基因工程菌的培养体系单独培养6-36h然后混合，进行N-乙酰基-5-甲氧基色胺的合成。
2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于：
将所构建的重组基因工程菌分别经过LB培养基活化培养后，转接至TB发酵培养基诱导表达酶并生成一定量的中间产物，经过一定时间的发酵后，再混合以葡萄糖为底物从头合成N-乙酰基-5-甲氧基色胺。
3.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于：所述方法一和方法二的S3为：第一重组基因工程菌和第二重组基因工程菌的培养体系单独培养12-30h，然后混合，进行N-乙酰基-5-甲氧基色胺的合成。
4.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于：所述方法一和方法二的S3为：第一重组基因工程菌和第二重组基因工程菌的培养体系单独培养12-24h，然后混合，进行N-乙酰基-5-甲氧基色胺的合成。
5.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于：所述方法一和方法二的S3为：第一重组基因工程菌和第二重组基因工程菌的培养体系单独培养18-24h，然后混合，进行N-乙酰基-5-甲氧基色胺的合成。
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