CN114134186A - 以葡萄糖为底物生物法合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸的方法 - Google Patents

以葡萄糖为底物生物法合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了以葡萄糖为底物生物法合成5‑羟基β‑吲哚基丙氨酸的方法。本发明利用所述的合成5‑羟基β‑吲哚基丙氨酸蛋白编码基因或能够表达合成5‑羟基β‑吲哚基丙氨酸蛋白编码基因的重组基因工程菌合成5‑羟基β‑吲哚基丙氨酸；通过不同路径的多路径有机整合提高了产量5‑羟基β‑吲哚基丙氨酸。过程易实施，条件易于控制，适宜推广工业化生产。

Description

以葡萄糖为底物生物法合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种新的以葡萄糖为底物生物法合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸的方法。
背景技术
5-羟基β-吲哚基丙氨酸(5-hydroxytryptophan，5-HTP)于1958年被发现，是β-吲哚基丙氨酸羟化酶(tryptophan hydroxylase，TPH，也称β-吲哚基丙氨酸单加氧酶，tryptophan 5-monooxygenase)氧化β-吲哚基丙氨酸(tryptophan，人体必需氨基酸之一)后形成的氨基酸衍生物。
5-羟基β-吲哚基丙氨酸广泛存在于豆科植物的种子中，其中非洲植物加纳的种子中含量最高。加纳树的树叶和种子自古以来就被非洲地区人民作为药物治疗伤口、肾病及灌肠等，其树皮做成的膏剂也可以治疗皮肤病，其主要活性成分即为5-羟基β-吲哚基丙氨酸。
我国采用醇法提取5-羟基β-吲哚基丙氨酸。从加纳籽中提取和精制5-羟基β-吲哚基丙氨酸的基本工艺路线为：加纳籽粉碎—萃取—过滤离心—物理脱色—真空浓缩—结晶、重结晶—真空干燥。整个过程中一般仅用醇和水提炼，避免了有机溶剂的污染。此外，通过离子交换树脂吸附分离和超滤膜分离等技术也可以从加纳籽中得到高纯度的5-羟基β-吲哚基丙氨酸。
但随着非洲加纳树数量不断减少，传统提取法获得5-羟基β-吲哚基丙氨酸变得越来越困难。5-羟基β-吲哚基丙氨酸，作为人体神经代谢途径中抵抗抑郁、缓解情感性精神障碍的天然药物，近年来其市场需求越来越大，仅依靠天然产物提取己难以满足市场需求，越来越多的企业开始从化学合成与生物发酵等方面研究5-羟基β-吲哚基丙氨酸的生产。
目前所报道的生物合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸的方法，大部分是先合成β-吲哚基丙氨酸后再羟化其生成5-羟基β-吲哚基丙氨酸。β-吲哚基丙氨酸的生物合成方法目前已经比较成熟，但是由于人类以及其他来源的β-吲哚基丙氨酸羟化酶在大肠杆菌等原核宿主中为异源表达，羟化效率较低羟化条件苛刻等原因，导致5-羟基β-吲哚基丙氨酸产量较低，无法满足工业化生产需求。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为提供5-羟基β-吲哚基丙氨酸高产菌株、构建以及以葡萄糖为底物生物法合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸的方法，以实现发酵法高效大规模工业化生产5-羟基β-吲哚基丙氨酸。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
提供一种以葡萄糖为底物生物法合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸的方法，包括以下步骤：
1)利用所述的合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸蛋白编码基因或能够表达合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸蛋白编码基因的重组基因工程菌，以葡萄糖为底物，生物发酵合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸，所述的能够表达合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸蛋白编码基因包括β-吲哚基丙氨酸羟化途径关键酶TPH2；邻氨基苯甲酸羟化途径关键酶nagGH；β-吲哚基丙氨酸路径上的关键酶trpEDCBA；BH4合成途径关键酶folE，PTPS，SPR基因；
2)从1)的体系中分离得到5-羟基β-吲哚基丙氨酸。
上述合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸蛋白编码基因表达如下蛋白，所述蛋白是如下任一所述的氨基酸序列：
a：氨基酸序列由如SEQ ID NO：07-17所示的序列，具体地：β-吲哚基丙氨酸羟化途径关键酶TPH2的氨基酸序列如SEQ ID NO：07所示；邻氨基苯甲酸羟化途径关键酶nagGH的氨基酸序列如SEQ ID NO：08-09所示；β-吲哚基丙氨酸路径上的关键酶trpEDCBA的氨基酸序列如SEQ ID NO：10-14所示(trpE，trpD,trpC,trpB,trpA五个酶的氨基酸序列依次如SEQID NO：10-14所示)；BH4合成途径关键酶folE，PTPS，SPR基因的氨基酸序列依次如SEQ IDNO：15-17所示。
或b：为具有与a所述的各氨基酸序列至少95％以上的序列同一性。
进一步地，为具有与a所述的氨基酸序列98％以上的序列同一性；更优选为具有与a所述的氨基酸序列99％以上的序列同一性；
或c：由a所述的各氨基酸序列的C末端和/或N末端取代、添加或缺失一个或几个氨基酸残基而形成；
进一步地，由a所述的氨基酸序列的C末端和/或N末端添加或缺失1-30个，更优选1-10个，还要优选1-6个，最优选1-3个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的具有所述蛋白的功能的衍生蛋白。
按上述方案，β-吲哚基丙氨酸羟化途径关键酶TPH2基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：01所示；邻氨基苯甲酸羟化途径关键酶nagGH如SEQ ID NO：02所示；β-吲哚基丙氨酸路径上的关键酶trpEDCBA如SEQ ID NO：03所示；BH4合成途径关键酶folE，PTPS，SPR基因的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：04-06所示。
按上述方案，所述步骤2)的具体步骤为：将步骤1)所构建的重组菌，经过LB培养基活化培养后，转接至发酵罐诱导表达酶后，以葡萄糖为底物从头合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸。具体地，将所构建的重组基因工程菌分别经过LB培养基活化培养后，得到种子液，将种子液转接至发酵罐，发酵至OD600生长至1-50时，补加IPTG诱导转化并开始分批补料发酵，以葡萄糖为底物从头合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸。
进一步地，所述种子液OD600＝5-10；
所述种子液的培养条件为28-40℃，160-230rpm，优选为37℃，225rpm；
所述种子液的培养时间为10-15h，优选为12h；
所述种子液接入发酵培养基的比例为1％-10％，优选比例为5％；
所述种子培养基(质量百分比)为1％胰蛋白胨、1％氯化钠和0.5％酵母提取物；
所述发酵培养基的组成为：酵母粉24g/L、蛋白胨12g/L、磷酸氢二钾16.43g/L、磷酸二氢钾2.31g/L、葡萄糖10g/L，
所述发酵培养基的培养条件为28-40℃，160-500rpm，优选为37℃，300rpm；
所述发酵中pH控制在5-9，优选为7.0；
所述诱导OD600为1-50，优选为10；
所述IPTG的终浓度为0.1-10mM，优选为1mM；
所述诱导表达的条件为16-37℃，优选为30℃；
所述反应体系葡萄糖浓度为1-100g/L，优选10g/L；
所述发酵时间为18-72h，优选为24-66h，更优选为48-60h。
本发明还提供一种包含所述合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸所有酶编码基因的重组载体，所述合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸所有酶编码基因序列如SEQ ID NO：1-6所示。
本发明还提供一种以葡萄糖为底物生物法合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸的重组基因工程菌，所述重组基因工程菌为包含如SEQ ID NO：1-6所示所述的合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸酶编码基因的重组载体的重组基因工程菌，或将部分酶基因整合入宿主细胞的基因组表达，其余酶基因在质粒中表达后转入前述宿主细胞中得到的重组基因工程菌。
按上述方案，BH4合成途径关键酶folE，PTPS，SPR基因在宿主细胞的基因组上表达，其他目的酶基因在质粒中表达后转入基因组表达了BH4合成途径关键酶folE，PTPS，SPR基因的宿主细胞中。
提供一种重组基因工程菌的构建方法：将β-吲哚基丙氨酸羟化途径关键酶TPH2基因，邻氨基苯甲酸羟化途径关键酶nagGH和β-吲哚基丙氨酸路径上的关键酶trpEDCBA酶基因在质粒中表达，获得重组载体；将重组载体转入基因组上表达BH4合成途径关键酶folE，PTPS，SPR基因的宿主细胞中，得到重组基因工程菌。
本发明重组基因工程菌的构建方法具体包括以下步骤：
将β-吲哚基丙氨酸羟化途径关键酶TPH2基因、邻氨基苯甲酸羟化途径关键酶nagGH基因放入同一质粒串连表达；β-吲哚基丙氨酸路径上的关键酶trpEDCBA基因放入同一质粒串连表达；将上述质粒共同转化至宿主细胞中，得到重组基因工程菌。
进一步地，所述的宿主细胞为大肠杆菌宿主细胞，优选为BL21(DE3)，ΔtrpR(folE，PTPS，SPR)，ΔtnaA大肠杆菌宿主细胞；即以BL21(DE3)为出发菌株，将基因组上的trpR基因替换为folE，PTPS，SPR基因，并敲除tnaA基因。
本发明提供的一个具体实施方式为：
宿主菌的改造：出发菌株BL21(DE3)，以FPS/trpR-F，FPS/trpR-R为引物，pET28a-FPS质粒为模板，获得带有trpR上下游同源臂的folE、PTPS、SPR基因片段，将此片段电转入BL21感受态中替换基因组上trpR基因，PCR筛选出阳性克隆。命名为5HT-09。
再分别以tnaAup-F、tnaAup-R，tnaAdown-F，tnaAdown-R为引物，BL21(DE3)基因组为模板，获得tnaA基因上游片段和tnaA基因下游片段。将两片段以tnaAup-F、tnaAdown-R为引物进行融合PCR连接，得到ΔtnaA片段。将此片段电转入5HT-09感受态中替换基因组tnaA基因，PCR筛选出阳性克隆。命名为5HT-10。
本发明还提供上述所述的合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸所有酶编码基因、所述的重组载体或所述的基因工程菌在生产合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸路径中的酶的应用。
本发明还提供所述的合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸所有酶编码基因、所述的重组载体或所述的重组基因工程菌在生产5-羟基β-吲哚基丙氨酸中的应用。
本发明还提供了一系列合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸的酶、几种酶的表达质粒、几种表达宿主以及合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸重组基因工程菌株。
本发明的有益效果：
(1)本发明公开了包含合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸的一系列酶编码基因的重组载体以及重组基因工程菌。通过发酵培养的方式，表达重组载体中编码所合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸的一系列酶编码基因，以获取合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸的一系列酶。该过程易实施，条件易于控制，适宜推广工业化生产。
(2)本发明通过不同合成路径的多路径有机整合，并将葡萄糖生产5-羟基β-吲哚基丙氨酸路径上的关键酶强化表达，提高了5-羟基β-吲哚基丙氨酸的产量。这为利用葡萄糖生产5-羟基β-吲哚基丙氨酸工业化，提高其生产效率、降低生产成本提供了数据支持。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1：质粒pET28a-H2GH图谱
图2：质粒pACYCDuet-TRP图谱
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1质粒的构建
不同羟化路径关键酶的串连表达：
β-吲哚基丙氨酸羟化途径关键酶TPH2；邻氨基苯甲酸羟化途径关键酶nagGH经密码子优化，将TPH2、nagGH基因分别插入到pET28a(+)质粒的NdeI和XhoI位点之间，获得pET28a-TPH2、pET28a-nagGH质粒。
以H2-F和H2-R为引物，pET28a-TPH2质粒为模板克隆获得含TPH2基因的pET28a质粒载体；以nagGH-F和nagGH-R为引物，质粒pET28a-nagGH为模板克隆获得nagGH基因；将以上两片段通过无缝克隆试剂盒连接在一起，形成质粒pET28a-H2GH。
β-吲哚基丙氨酸路径上的关键酶表达质粒的构建：
以trp-F和trp-R为引物，BL21(DE3)基因组为模板克隆获得trpEDCBA基因片段；以pACYCDuet-F和pACYCDuet-R为引物，pACYCDuet空载质粒为模板，将trpEDCBA基因插入到pACYCDuet质粒的NcoI和EcoRI位点之间，获得pACYCDuet-TRP质粒。
表1引物序列1
Figure BDA0003338051130000071
实施例2宿主菌的改造
BH4合成基因的获得：BH4合成途径关键酶folE，PTPS，SPR，经密码子优化，人工合成优化后的folE，PTPS，SPR基因序列，如SEQ ID No：1-3所示，将folE，PTPS，SPR基因插入到pET28a(+)质粒的NdeI和XhoI位点之间，获得pET28a-FPS表达载体；
出发菌株BL21(DE3)，以FPS/trpR-F，FPS/trpR-R为引物，pET28a-FPS质粒为模板，获得带有trpR上下游同源臂的的folE、PTPS、SPR基因片段，将此片段电转入BL21感受态中替换基因组上trpR基因，PCR筛选出阳性克隆。命名为5HT-09。再分别以tnaAup-F、tnaAup-R，tnaAdown-F，tnaAdown-R为引物，BL21(DE3)基因组为模板，获得tnaA基因上游片段和tnaA基因下游片段。将两片段以tnaAup-F、tnaAdown-R为引物进行融合PCR连接，得到ΔtnaA片段。将此片段电转入5HT-09感受态中替换基因组tnaA基因，PCR筛选出阳性克隆。命名为5HT-10。
表2引物序列2
Figure BDA0003338051130000072
Figure BDA0003338051130000081
实施例3葡萄糖产5-羟基β-吲哚基丙氨酸菌株的构建与发酵
将实例1中的质粒pET28a-HG和pACYCDuet-TRP电转化至实施例2的宿主细胞5HT-10(BL21(DE3)，ΔtrpR(folE，PTPS，SPR)，ΔtnaA)中，得到重组工程菌5HT108。工程菌5HT108，经固体LB培养基平板活化的单菌落接种于装有100mL液体LB培养基(蛋白胨1％、酵母粉0.5％、氯化钠1％，其余为水，pH 7.0)的500mL种子瓶内，添加50mg/L的卡那霉素、34mg/L的氯霉素，在37℃、220rpm振荡培养12h；按接菌量5％接种至3L的发酵培养基中，其中发酵培养基的组成成分为：酵母粉24g/L、蛋白胨12g/L、磷酸氢二钾16.43g/L、磷酸二氢钾2.31g/L、葡萄糖10g/L。添加50mg/L的卡那霉素、34mg/L的氯霉素，发酵温度为37℃，转速300rpm，OD600生长至10时，补加0.1mM IPTG诱导转化并开始分批补料发酵。分批发酵温度为30℃,使用氨水控制pH至7.0，分批补料葡萄糖控制至其浓度在10g/L。发酵过程检测产物的生成。发酵时间一般选择为48-60h，在发酵至56h其产量达到最大值。最终5HT108菌株发酵最高能达到25g/L的5-羟基β-吲哚基丙氨酸，β-吲哚基丙氨酸剩余在1g/L以下。
传统单一生物途径合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸的方法，由于其羟化步骤效率低、条件苛刻等因素，导致其产量低，且β-吲哚基丙氨酸有大量剩余，导致产物难于分离提纯。为此，现有技术一般往往采取弱化β-吲哚基丙氨酸合成，这虽然能一定程度上缓解剩余，但也会降低最终产物5-羟基β-吲哚基丙氨酸的产量。
本发明将以葡萄糖为底物合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸路径上的中间产物邻氨基苯甲酸经5-羟化反应、成环反应、聚合反应，以及同时经成环反应、聚合反应、5-羟化反应合成目标产物，设计多路径合成路线，通过不同合成路径的多路径有机整合合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸，达到了明显提升5-羟基β-吲哚基丙氨酸的产量，克服了多途径合成的融合问题，并可以将β-吲哚基丙氨酸控制在易于分离的浓度之内的目的。对5-羟基β-吲哚基丙氨酸的工业化有重要的影响。为利用葡萄糖生产5-羟基β-吲哚基丙氨酸工业化，提高其生产效率、降低生产成本提供了新的思路。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 河北维达康生物科技有限公司
<120> 以葡萄糖为底物生物法合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸的方法及其应用
<160> 17
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1473
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
atgcaaccgg ccatgatgat gttcagctcc aaatattggg ctcgtcgtgg tttctctctg 60
gactctgctg ttccggaaga acaccagctg ctgggctcct ctactctgaa caaaccgaac 120
tccggtaaaa acgatgacaa aggcaacaag ggtagctcta aacgcgaagc agccacggag 180
tctggcaaaa ccgcggtagt tttttccctg aagaacgaag tgggcggtct ggttaaagca 240
ctgcgcctgt tccaggagaa acgtgtcaat atggtacaca tcgaaagccg taaatcccgc 300
cgtcgctcct ccgaagtgga aatctttgtt gactgcgaat gtggtaaaac cgaatttaac 360
gagctgattc agctgctgaa attccagacc actattgtca ccctgaaccc accagagaac 420
atctggactg aagaagaaga actggaagat gttccgtggt ttccgcgtaa aattagcgaa 480
ctggataaat gtagccatcg tgttctgatg tatggtagtg aactggatgc agatcatccg 540
ggttttaaag ataatgttta tcgtcagcgt cgcaagtatt ttgttgatgt tgcaatgggt 600
tacaaatacg gtcagccgat tccgcgtgtt gaatataccg aagaagaaac caaaacctgg 660
ggtgttgttt ttcgtgaact gagcaaactg tatccgacac atgcctgtcg tgaatatctg 720
aaaaactttc cgctgctgac caaatattgt ggttatcgtg aagataacgt tccgcagtta 780
gaagatgtta gcatgtttct gaaagaacgc agcggtttta ccgttcgtcc ggttgcaggt 840
tatctgagtc cgcgtgattt tctggcaggt ctggcatatc gtgtttttca ttgtacccag 900
tatattcgcc atggtagcga tccgctgtat actccggaac cggatacctg tcatgaactg 960
ctgggtcatg tgccgctgct ggcagatccg aaatttgcac agtttagcca agaaattggt 1020
ctggcaagcc tgggtgcaag tgatgaagat gtgcagaaac tggcaacctg ttatttcttt 1080
accattgaat ttggcctgtg caaacaagag ggtcagctgc gtgcctatgg tgcaggtctg 1140
ctgagcagca ttggtgaact gaaacatgca ctgagcgata aagcatgtgt taaagcattt 1200
gatccgaaaa ccacctgtct gcaagaatgt ctgattacca cctttcaaga agcctatttc 1260
gttagcgaaa gctttgaaga ggccaaagaa aaaatgcgcg attttgccaa aagcattacc 1320
cgtccgttta gcgtttattt caatccgtat acacagagca tcgagatcct gaaagatacc 1380
cgtagcattg aaaatgtggt gcaagacctg cgttccgatc tgaacaccgt atgcgacgcg 1440
ctgaacaaaa tgaaccaata tcttggtatc taa 1473
<210> 2
<211> 1760
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
atgagtgaac cccaacgatt aaaacccgtg tttccccaag atccgaaatg gccgggcgaa 60
ggtagcagcc gcgttccctt ctgggcctac acccgcgaag acctgtacaa gcgcgaattg 120
gagcgcctgt tctatgcaaa ccactggtgc tatgtaggcc tggaagccga gattccgaat 180
ccaggcgact tcaagcgaac ggtgatcggt gagcgctcgg tcatcatggt gcgtgatccg 240
gatggcggca tcaacgtggt ggagaacgtc tgcgcccacc gtggcatgcg cttttgccgc 300
gagcgccacg gcaacgccaa ggacttcttc tgcccctacc accagtggaa ctacagcctc 360
aagggtgacc tgcagggcgt gcccttccgc cgtggcgtca agcaggacgg caaggtcaac 420
ggcggcatgc ccaaggactt caaactcgaa gaacacggcc tgaccaagct caaggtggcc 480
gcccgaggcg gtgcagtgtt tgcctctttt gaccacgatg tcgagccctt cgaggagttc 540
ctgggcccaa ccatcctgca ttacttcgac cgcgtcttca acggccgcaa gctcaagatc 600
ctgggctacc gccgccagcg catcccgggc aactggaagc tgatgcagga gaacatcaag 660
gacccctacc acccgggcct gctgcacacc tggttctcga ccttcgggct ctggcgcgcc 720
gacaacaagt cggaactgaa gatggacgcc aagttccgcc acgccgcaat gatctccacg 780
cgcggtcagg gcggcaagaa cgaggaggtc gtgtccggcg tggacagctt caaggaacag 840
atgaaggtga acgacccgcg cctgctcgac atcgtgcccg agccctggtg gggcggtccg 900
actgcggtga tgaccacgat cttccccagc gtgatcatcc agcagcaggt caacagcgta 960
tcgacccgcc acatccagcc caacggtcac ggctccttcg atttcgtctg gacccacttc 1020
ggcttcgagg acgacaacga ggagtggacc cagcgccgcc tgatccaggc caacctgttc 1080
gggccggcgg gcttcgtgtc ggccgatgac ggcgaggtga tcgagtggtc gcaggaaggc 1140
tttgagcaaa aaccgacgca ccgcaccgtg atcgagatgg gcggtcacga aatcggcgac 1200
acggaccaca tggtcaccga gacgctgatc cgcggcatgt acgactactg gcgcaaggtg 1260
atgggggaat aaacatggtc gacttcaaaa cctatttcga actgctgaac ctgtacagcg 1320
actacgccat ggtgtgcgac tccgccaatt gggagaagtg gcctgatttc ttcatcgaga 1380
ccggcaccta ccgcctgcag ccgcgcgaga actttgagca gggcctgccg ctgtgcctgc 1440
tggcgctgga gagcaaggca atgatccgcg accgggtgta cggcgtcaag gaaaccatgt 1500
accacgaccc ctactaccag cgccacatcg tgggcacgcc gcgcgtgctg tcagtggagc 1560
gtgacgcgga tggcgagcgc atcaccgccg aagccagcta tgccgtgatt cgcaccaagt 1620
acgacggcga ttccacgatt ttcaacgccg gctattaccg agacgtgatc gtgcgcacgc 1680
ccgagggcct caagctgaag tcgcgcctgt gcgtttacga cagcgaaatg atccccaact 1740
ctgtgatcta tccaatctga 1760
<210> 3
<211> 6531
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 3
atgcaaacac aaaaaccgac tctcgaacta ctaacctgcg aaggcgctta tcgcgacaac 60
ccgaccgcgc tttttcacca gttgtgtggg gatcgtccgg caacgctgct gctggaatcc 120
gcagatatcg acagcaaaga tgatttaaaa agcctgctac tggtagacag tgcgctgcgc 180
attacagcat taggtgacac tgtcacaatt aaggcgttat ccggcaatgg tgaagccctg 240
ctggcactac tggataacgc cctgcctgcg ggtgtggaaa atgaacaatc accaaactgc 300
cgtgtgctgc gcttcccccc tgtcagtcca ctgctggatg aagacgctcg cttatgctcc 360
ctttcggttt ttgacgcttt ccgtttattg cagaatctgt tgaatgtacc gaaggaagaa 420
cgagaagcca tgttcttcgg cggcctgttc tcttatgacc ttgtggcggg atttgaagat 480
ttaccgcaac tgtcagcgga aaataactgc cctgatttct gtttttatct cgctgaaacg 540
ctgatggtga ttgaccatca gaaaaaaagc acccgtattc aggccagcct gtttgctccg 600
aatgaagaag aaaaacaacg tctcactgct cgcctgaacg aactacgtca gcaactgacc 660
gaagccgcgc cgccgctgcc agtggtttcc gtgccgcata tgcgttgtga atgtaatcag 720
agcgatgaag agttcggtgg cgtagtgcgt ttgttgcaaa aagcgattcg cgctggagaa 780
attttccagg tggtgccatc tcgccgtttc tctctgccct gcccgtcacc gctggcggcc 840
tattacgtgc tgaaaaagag taatcccagc ccgtacatgt tttttatgca ggataatgat 900
ttcaccctat ttggcgcgtc gccggaaagc tcgctcaagt atgatgccac cagccgccag 960
attgagatct acccgattgc cggaacacgc ccacgcggtc gtcgcgccga tggttcactg 1020
gacagagatc tcgacagccg tattgaactg gaaatgcgta ccgatcataa agagctgtct 1080
gaacatctga tgctggttga tctcgcccgt aatgatctgg cacgcatttg cacccccggc 1140
agccgctacg tcgccgatct caccaaagtt gaccgttatt cctatgtgat gcacctcgtc 1200
tctcgcgtag tcggcgaact gcgtcacgat cttgacgccc tgcacgctta tcgcgcctgt 1260
atgaatatgg ggacgttaag cggtgcgccg aaagtacgcg ctatgcagtt aattgccgag 1320
gcggaaggtc gtcgccgcgg cagctacggc ggcgcggtag gttatttcac cgcgcatggc 1380
gatctcgaca cctacattgt gatccgctcg gcgctggtgg aaaacggtat cgccaccgtg 1440
caagcgggtg ctggtgtagt ccttgattct gttccgcagt cggaagccga cgaaacccgt 1500
aacaaagccc gcgctgtact gcgcgctatt gccaccgcgc atcatgcaca ggagactttc 1560
tgatggctga cattctgctg ctcgataata tcgactcttt tacgtacaac ctggcagatc 1620
agttgcgcag caatgggcat aacgtggtga tttaccgcaa ccatattccg gcgcaaacct 1680
taattgaacg cctggcgacc atgagcaatc cggtgctgat gctttctcct ggccccggtg 1740
tgccgagcga agccggttgt atgccggaac tcctcacccg cttgcgtggc aagctgccca 1800
ttattggcat ttgcctcgga catcaggcga ttgtcgaagc ttacgggggc tatgtcggtc 1860
aggcgggcga aattctccac ggtaaagcct ccagcattga acatgacggt caggcgatgt 1920
ttgccggatt aacaaacccg ctgccggtgg cgcgttatca ctcgctggtt ggcagtaaca 1980
ttccggccgg tttaaccatc aacgcccatt ttaatggcat ggtgatggca gtacgtcacg 2040
atgcggatcg cgtttgtgga ttccagttcc atccggaatc cattctcacc acccagggcg 2100
ctcgcctgct ggaacaaacg ctggcctggg cgcagcagaa actagagcca gccaacacgc 2160
tgcaaccgat tctggaaaaa ctgtatcagg cgcagacgct tagccaacaa gaaagccacc 2220
agctgttttc agcggtggtg cgtggcgagc tgaagccgga acaactggcg gcggcgctgg 2280
tgagcatgaa aattcgcggt gagcacccga acgagatcgc cggggcagca accgcgctac 2340
tggaaaacgc agcgccgttc ccgcgcccgg attatctgtt tgctgatatc gtcggtactg 2400
gcggtgacgg cagcaacagt atcaatattt ctaccgccag tgcgtttgtc gccgcggcct 2460
gtgggctgaa agtggcgaaa cacggcaacc gtagcgtctc cagtaaatct ggttcgtccg 2520
atctgctggc ggcgttcggt attaatcttg atatgaacgc cgataaatcg cgccaggcgc 2580
tggatgagtt aggtgtatgt ttcctctttg cgccgaagta tcacaccgga ttccgccacg 2640
cgatgccggt tcgccagcaa ctgaaaaccc gcaccctgtt caatgtgctg gggccattga 2700
ttaacccggc gcatccgccg ctggcgttaa ttggtgttta tagtccggaa ctggtgctgc 2760
cgattgccga aaccttgcgc gtgctggggt atcaacgcgc ggcggtggtg cacagcggcg 2820
ggatggatga agtttcatta cacgcgccga caatcgttgc cgaactgcat gacggcgaaa 2880
ttaaaagcta tcagctcacc gcagaagact ttggcctgac accctaccac caggagcaac 2940
tggcaggcgg aacaccggaa gaaaaccgtg acattttaac acgtttgtta caaggtaaag 3000
gcgacgccgc ccatgaagca gccgtcgctg cgaacgtcgc catgttaatg cgcctgcatg 3060
gccatgaaga tctgcaagcc aatgcgcaaa ccgttcttga ggtactgcgc agtggttccg 3120
cttacgacag agtcaccgca ctggcggcac gagggtaaat gatgcaaacc gttttagcga 3180
aaatcgtcgc agacaaggcg atttgggtag aagcccgcaa acagcagcaa ccgctggcca 3240
gttttcagaa tgaggttcag ccgagcacgc gacattttta tgatgcgcta cagggtgcgc 3300
gcacggcgtt tattctggag tgcaagaaag cgtcgccgtc aaaaggcgtg atccgtgatg 3360
atttcgatcc agcacgcatt gccgccattt ataaacatta cgcttcggca atttcggtgc 3420
tgactgatga gaaatatttt caggggagct ttaatttcct ccccatcgtc agccaaatcg 3480
ccccgcagcc gattttatgt aaagacttca ttatcgaccc ttaccagatc tatctggcgc 3540
gctattacca ggccgatgcc tgcttattaa tgctttcagt actggatgac gaccaatatc 3600
gccagcttgc cgccgtcgct cacagtctgg agatgggggt gctgaccgaa gtcagtaatg 3660
aagaggaaca ggagcgcgcc attgcattgg gagcaaaggt cgttggcatc aacaaccgcg 3720
atctgcgtga tttgtcgatt gatctcaacc gtacccgcga gcttgcgccg aaactggggc 3780
acaacgtgac ggtaatcagc gaatccggca tcaatactta cgctcaggtg cgcgagttaa 3840
gccacttcgc taacggtttt ctgattggtt cggcgttgat ggcccatgac gatttgcacg 3900
ccgccgtgcg ccgggtgttg ctgggtgaga ataaagtatg tggcctgacg cgtgggcaag 3960
atgctaaagc agcttatgac gcgggcgcga tttacggtgg gttgattttt gttgcgacat 4020
caccgcgttg cgtcaacgtt gaacaggcgc aggaagtgat ggctgcggca ccgttgcagt 4080
atgttggcgt gttccgcaat cacgatattg ccgatgtggt ggacaaagct aaggtgttat 4140
cgctggcggc agtgcaactg catggtaatg aagaacagct gtatatcgat acgctgcgtg 4200
aagctctgcc agcacatgtt gccatctgga aagcattaag cgtcggtgaa accctgcccg 4260
cccgcgagtt tcagcacgtt gataaatatg ttttagacaa cggccagggt ggaagcgggc 4320
aacgttttga ctggtcacta ttaaatggtc aatcgcttgg caacgttctg ctggcggggg 4380
gcttaggcgc agataactgc gtggaagcgg cacaaaccgg ctgcgccgga cttgatttta 4440
attctgctgt agagtcgcaa ccgggcatca aagacgcacg tcttttggcc tcggttttcc 4500
agacgctgcg cgcatattaa ggaaaggaac aatgacaaca ttacttaacc cctattttgg 4560
tgagtttggc ggcatgtacg tgccacaaat cctgatgcct gctctgcgcc agctggaaga 4620
agcttttgtc agtgcgcaaa aagatcctga atttcaggct cagttcaacg acctgctgaa 4680
aaactatgcc gggcgtccaa ccgcgctgac caaatgccag aacattacag ccgggacgaa 4740
caccacgctg tatctcaagc gtgaagattt gctgcacggc ggcgcgcata aaactaacca 4800
ggtgctgggg caggcgttgc tggcgaagcg gatgggtaaa accgaaatca tcgccgaaac 4860
cggtgccggt cagcatggcg tggcgtcggc ccttgccagc gccctgctcg gcctgaaatg 4920
ccgtatttat atgggtgcca aagacgttga acgccagtcg cctaacgttt ttcgtatgcg 4980
cttaatgggt gcggaagtga tcccggtgca tagcggttcc gcgacgctga aagatgcctg 5040
taacgaggcg ctgcgcgact ggtccggtag ttacgaaacc gcgcactata tgctgggcac 5100
cgcagctggc ccgcatcctt atccgaccat tgtgcgtgag tttcagcgga tgattggcga 5160
agaaaccaaa gcgcagattc tggaaagaga aggtcgcctg ccggatgccg ttatcgcctg 5220
tgttggcggc ggttcgaatg ccatcggcat gtttgctgat ttcatcaatg aaaccaacgt 5280
cggcctgatt ggtgtggagc caggtggtca cggtatcgaa actggcgagc acggcgcacc 5340
gctaaaacat ggtcgcgtgg gtatctattt cggtatgaaa gcgccgatga tgcaaaccga 5400
agacgggcag attgaagaat cttactccat ctccgccgga ctggatttcc cgtctgtcgg 5460
cccacaacac gcgtatctta acagcactgg acgcgctgat tacgtgtcta ttaccgatga 5520
tgaagccctt gaagccttca aaacgctgtg cctgcacgaa gggatcatcc cggcgctgga 5580
atcctcccac gccctggccc atgcgttgaa aatgatgcgc gaaaacccgg ataaagagca 5640
gctactggtg gttaaccttt ccggtcgcgg cgataaagac atcttcaccg ttcacgatat 5700
tttgaaagca cgaggggaaa tctgatggaa cgctacgaat ctctgtttgc ccagttgaag 5760
gagcgcaaag aaggcgcatt cgttcctttc gtcacgctcg gtgatccggg cattgagcag 5820
tcattgaaaa ttatcgatac gctaattgaa gccggtgctg acgcgctgga gttaggtatc 5880
cccttctccg acccactggc ggatggcccg acgattcaaa acgccactct gcgcgccttt 5940
gcggcaggtg tgactccggc acaatgtttt gaaatgctgg cactgattcg ccagaaacac 6000
ccgaccattc ccattggcct gttgatgtat gccaatctgg tgtttaacaa aggcattgat 6060
gagttttatg cccagtgcga aaaagtcggc gtcgattcgg tgctggttgc cgatgtgcca 6120
gttgaagagt ccgcgccctt ccgccaggcc gcgttgcgtc ataatgtcgc acctatcttc 6180
atctgcccgc caaatgccga tgacgacctg ctgcgccaga tagcctctta cggtcgtggt 6240
tacacctatt tgctgtcacg agcaggcgtg accggcgcag aaaaccgcgc cgcgttaccc 6300
ctcaatcatc tggttgcgaa gctgaaagag tacaacgctg cacctccatt gcagggattt 6360
ggtatttccg ccccggatca ggtaaaagca gcgattgatg caggagctgc gggcgcgatt 6420
tctggttcgg ccattgttaa aatcatcgag caacatatta atgagccaga gaaaatgctg 6480
gcggcactga aagtttttgt acaaccgatg aaagcggcga cgcgcagtta a 6531
<210> 4
<211> 573
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
atgaaagaag tgaacaaaga acagatcgaa caggcagtgc gtcagattct ggaagcaatc 60
ggtgaagatc cgaatcgcga aggtctgctg gataccccga aacgcgttgc caaaatgtat 120
gcagaagttt ttagcggtct gaacgaagat ccgaaagaac attttcagac aatttttggt 180
gaaaaccatg aagaactggt gctggttaaa gatattgcat ttcatagtat gtgcgaacat 240
catctggttc cgttttatgg taaagcacat gtggcatata ttccacgtgg tggtaaagta 300
acaggtctga gcaaactggc ccgtgcagtt gaagcagttg caaaacgtcc gcagctgcag 360
gaacgtatta ccagcacaat cgcagaaagc attgtcgaaa ccctggaccc tcatggtgtg 420
atggttgttg ttgaagcaga acacatgtgt atgacaatgc gcggtgtccg taaaccaggt 480
gcaaaaaccg ttaccagcgc agtgcgcggt gtttttaaag atgatgccgc agcacgtgca 540
gaagttctgg aacatattaa acgccaggat taa 573
<210> 5
<211> 438
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
atgagcaccg aaggtggtgg tcgccgctgt caggcgcagg ttagccgccg tattagcttt 60
agcgcgagcc atcgtctgta ttccaaattt ctgagcgatg aagaaaacct gaaactgttt 120
ggtaaatgta ataacccgaa tggtcatggt cataattata aagttgtggt gaccgttcat 180
ggtgaaattg atcctgccac cggtatggtc atgaatctgg cagatttaaa aaaatatatg 240
gaagaagcaa ttatgcagcc gctggatcat aaaaatctgg atatggatgt tccgtatttt 300
gcagatgttg ttagcaccac cgaaaatgtt gcagtttata tttgggataa tctgcagaaa 360
gttctgccgg ttggtgttct gtataaagtt aaagtttatg aaaccgataa taatattgtt 420
gtttataaag gtgaataa 438
<210> 6
<211> 786
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
atggaaggtg gtctgggtcg tgccgtttgt ctgctgacgg gtgcaagccg tggttttggt 60
cgtacactgg caccgctgct ggcgagcctg ctgagccctg gtagcgttct ggttctgagc 120
gcacgtaatg atgaagcact gcgtcagctg gaagcagaac tgggtgcaga acgtagtggt 180
ctgcgcgttg ttcgtgttcc ggcagattta ggtgcagaag caggtctgca gcagctgctg 240
ggtgcactgc gtgaactgcc tcgtcctaaa ggtctgcagc gtctgctgct gattaataat 300
gcaggtagtc tgggtgatgt tagcaaaggt tttgtagatt taagcgattc tactcaggtt 360
aataattatt gggccctgaa tctgacgagt atgctgtgtc tgacttctag cgtactgaaa 420
gcatttcctg atagtccggg tctgaatcgt accgtggtta atatttccag cctgtgtgca 480
ctgcagccgt ttaaaggctg ggcactgtat tgtgccggta aagcagcacg tgatatgctg 540
tttcaggttc tggcactgga agaaccaaat gttcgtgttc tgaattatgc tccgggtccg 600
ctggatacgg atatgcagca gctggcgcgt gaaacatcag ttgatcctga tatgcgtaaa 660
ggtctgcagg aactgaaagc aaaaggtaaa ctggtggatt gtaaagttag cgcacagaaa 720
ctgctgagcc tgctggaaaa agatgaattt aaaagtggtg cacatgtgga tttttatgat 780
aaataa 786
<210> 7
<211> 490
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 7
MQPAMMMFSS KYWARRGFSL DSAVPEEHQL LGSSTLNKPN SGKNDDKGNK GSSKREAATE 60
SGKTAVVFSL KNEVGGLVKA LRLFQEKRVN MVHIESRKSR RRSSEVEIFV DCECGKTEFN 120
ELIQLLKFQT TIVTLNPPEN IWTEEEELED VPWFPRKISE LDKCSHRVLM YGSELDADHP 180
GFKDNVYRQR RKYFVDVAMG YKYGQPIPRV EYTEEETKTW GVVFRELSKL YPTHACREYL 240
KNFPLLTKYC GYREDNVPQL EDVSMFLKER SGFTVRPVAG YLSPRDFLAG LAYRVFHCTQ 300
YIRHGSDPLY TPEPDTCHEL LGHVPLLADP KFAQFSQEIG LASLGASDED VQKLATCYFF 360
TIEFGLCKQE GQLRAYGAGL LSSIGELKHA LSDKACVKAF DPKTTCLQEC LITTFQEAYF 420
VSESFEEAKE KMRDFAKSIT RPFSVYFNPY TQSIEILKDT RSIENVVQDL RSDLNTVCDA 480
LNKMNQYLGI 490
<210> 8
<211> 423
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 8
MSEPQRLKPV FPQDPKWPGE GSSRVPFWAY TREDLYKREL ERLFYANHWC YVGLEAEIPN 60
PGDFKRTVIG ERSVIMVRDP DGGINVVENV CAHRGMRFCR ERHGNAKDFF CPYHQWNYSL 120
KGDLQGVPFR RGVKQDGKVN GGMPKDFKLE EHGLTKLKVA ARGGAVFASF DHDVEPFEEF 180
LGPTILHYFD RVFNGRKLKI LGYRRQRIPG NWKLMQENIK DPYHPGLLHT WFSTFGLWRA 240
DNKSELKMDA KFRHAAMIST RGQGGKNEEV VSGVDSFKEQ MKVNDPRLLD IVPEPWWGGP 300
TAVMTTIFPS VIIQQQVNSV STRHIQPNGH GSFDFVWTHF GFEDDNEEWT QRRLIQANLF 360
GPAGFVSADD GEVIEWSQEG FEQKPTHRTV IEMGGHEIGD TDHMVTETLI RGMYDYWRKV 420
MGE 423
<210> 9
<211> 161
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 9
MVDFKTYFEL LNLYSDYAMV CDSANWEKWP DFFIETGTYR LQPRENFEQG LPLCLLALES 60
KAMIRDRVYG VKETMYHDPY YQRHIVGTPR VLSVERDADG ERITAEASYA VIRTKYDGDS 120
TIFNAGYYRD VIVRTPEGLK LKSRLCVYDS EMIPNSVIYP I 161
<210> 10
<211> 520
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 10
MQTQKPTLEL LTCEGAYRDN PTALFHQLCG DRPATLLLES ADIDSKDDLK SLLLVDSALR 60
ITALGDTVTI KALSGNGEAL LALLDNALPA GVENEQSPNC RVLRFPPVSP LLDEDARLCS 120
LSVFDAFRLL QNLLNVPKEE REAMFFGGLF SYDLVAGFED LPQLSAENNC PDFCFYLAET 180
LMVIDHQKKS TRIQASLFAP NEEEKQRLTA RLNELRQQLT EAAPPLPVVS VPHMRCECNQ 240
SDEEFGGVVR LLQKAIRAGE IFQVVPSRRF SLPCPSPLAA YYVLKKSNPS PYMFFMQDND 300
FTLFGASPES SLKYDATSRQ IEIYPIAGTR PRGRRADGSL DRDLDSRIEL EMRTDHKELS 360
EHLMLVDLAR NDLARICTPG SRYVADLTKV DRYSYVMHLV SRVVGELRHD LDALHAYRAC 420
MNMGTLSGAP KVRAMQLIAE AEGRRRGSYG GAVGYFTAHG DLDTYIVIRS ALVENGIATV 480
QAGAGVVLDS VPQSEADETR NKARAVLRAI ATAHHAQETF 520
<210> 11
<211> 531
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 11
MADILLLDNI DSFTYNLADQ LRSNGHNVVI YRNHIPAQTL IERLATMSNP VLMLSPGPGV 60
PSEAGCMPEL LTRLRGKLPI IGICLGHQAI VEAYGGYVGQ AGEILHGKAS SIEHDGQAMF 120
AGLTNPLPVA RYHSLVGSNI PAGLTINAHF NGMVMAVRHD ADRVCGFQFH PESILTTQGA 180
RLLEQTLAWA QQKLEPANTL QPILEKLYQA QTLSQQESHQ LFSAVVRGEL KPEQLAAALV 240
SMKIRGEHPN EIAGAATALL ENAAPFPRPD YLFADIVGTG GDGSNSINIS TASAFVAAAC 300
GLKVAKHGNR SVSSKSGSSD LLAAFGINLD MNADKSRQAL DELGVCFLFA PKYHTGFRHA 360
MPVRQQLKTR TLFNVLGPLI NPAHPPLALI GVYSPELVLP IAETLRVLGY QRAAVVHSGG 420
MDEVSLHAPT IVAELHDGEI KSYQLTAEDF GLTPYHQEQL AGGTPEENRD ILTRLLQGKG 480
DAAHEAAVAA NVAMLMRLHG HEDLQANAQT VLEVLRSGSA YDRVTALAAR G 531
<210> 12
<211> 453
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 12
MMQTVLAKIV ADKAIWVEAR KQQQPLASFQ NEVQPSTRHF YDALQGARTA FILECKKASP 60
SKGVIRDDFD PARIAAIYKH YASAISVLTD EKYFQGSFNF LPIVSQIAPQ PILCKDFIID 120
PYQIYLARYY QADACLLMLS VLDDDQYRQL AAVAHSLEMG VLTEVSNEEE QERAIALGAK 180
VVGINNRDLR DLSIDLNRTR ELAPKLGHNV TVISESGINT YAQVRELSHF ANGFLIGSAL 240
MAHDDLHAAV RRVLLGENKV CGLTRGQDAK AAYDAGAIYG GLIFVATSPR CVNVEQAQEV 300
MAAAPLQYVG VFRNHDIADV VDKAKVLSLA AVQLHGNEEQ LYIDTLREAL PAHVAIWKAL 360
SVGETLPARE FQHVDKYVLD NGQGGSGQRF DWSLLNGQSL GNVLLAGGLG ADNCVEAAQT 420
GCAGLDFNSA VESQPGIKDA RLLASVFQTL RAY 453
<210> 13
<211> 397
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 13
MTTLLNPYFG EFGGMYVPQI LMPALRQLEE AFVSAQKDPE FQAQFNDLLK NYAGRPTALT 60
KCQNITAGTN TTLYLKREDL LHGGAHKTNQ VLGQALLAKR MGKTEIIAET GAGQHGVASA 120
LASALLGLKC RIYMGAKDVE RQSPNVFRMR LMGAEVIPVH SGSATLKDAC NEALRDWSGS 180
YETAHYMLGT AAGPHPYPTI VREFQRMIGE ETKAQILERE GRLPDAVIAC VGGGSNAIGM 240
FADFINETNV GLIGVEPGGH GIETGEHGAP LKHGRVGIYF GMKAPMMQTE DGQIEESYSI 300
SAGLDFPSVG PQHAYLNSTG RADYVSITDD EALEAFKTLC LHEGIIPALE SSHALAHALK 360
MMRENPDKEQ LLVVNLSGRG DKDIFTVHDI LKARGEI 397
<210> 14
<211> 268
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 14
MERYESLFAQ LKERKEGAFV PFVTLGDPGI EQSLKIIDTL IEAGADALEL GIPFSDPLAD 60
GPTIQNATLR AFAAGVTPAQ CFEMLALIRQ KHPTIPIGLL MYANLVFNKG IDEFYAQCEK 120
VGVDSVLVAD VPVEESAPFR QAALRHNVAP IFICPPNADD DLLRQIASYG RGYTYLLSRA 180
GVTGAENRAA LPLNHLVAKL KEYNAAPPLQ GFGISAPDQV KAAIDAGAAG AISGSAIVKI 240
IEQHINEPEK MLAALKVFVQ PMKAATRS 268
<210> 15
<211> 190
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 15
MKEVNKEQIE QAVRQILEAI GEDPNREGLL DTPKRVAKMY AEVFSGLNED PKEHFQTIFG 60
ENHEELVLVK DIAFHSMCEH HLVPFYGKAH VAYIPRGGKV TGLSKLARAV EAVAKRPQLQ 120
ERITSTIAES IVETLDPHGV MVVVEAEHMC MTMRGVRKPG AKTVTSAVRG VFKDDAAARA 180
EVLEHIKRQD 190
<210> 16
<211> 145
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 16
MSTEGGGRRC QAQVSRRISF SASHRLYSKF LSDEENLKLF GKCNNPNGHG HNYKVVVTVH 60
GEIDPATGMV MNLADLKKYM EEAIMQPLDH KNLDMDVPYF ADVVSTTENV AVYIWDNLQK 120
VLPVGVLYKV KVYETDNNIV VYKGE 145
<210> 17
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 17
MEGGLGRAVC LLTGASRGFG RTLAPLLASL LSPGSVLVLS ARNDEALRQL EAELGAERSG 60
LRVVRVPADL GAEAGLQQLL GALRELPRPK GLQRLLLINN AGSLGDVSKG FVDLSDSTQV 120
NNYWALNLTS MLCLTSSVLK AFPDSPGLNR TVVNISSLCA LQPFKGWALY CAGKAARDML 180
FQVLALEEPN VRVLNYAPGP LDTDMQQLAR ETSVDPDMRK GLQELKAKGK LVDCKVSAQK 240
LLSLLEKDEF KSGAHVDFYD K 261

Claims (9)

1.一种以葡萄糖为底物生物法合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸的方法，包括以下步骤：
1)利用所述的合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸蛋白编码基因或能够表达合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸蛋白编码基因的重组基因工程菌，以葡萄糖为底物，生物发酵合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸，所述的能够表达合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸蛋白编码基因包括β-吲哚基丙氨酸羟化途径关键酶TPH2；邻氨基苯甲酸羟化途径关键酶nagGH；β-吲哚基丙氨酸路径上的关键酶trpEDCBA；BH4合成途径关键酶folE，PTPS，SPR基因；
2)从1)的体系中分离得到5-羟基β-吲哚基丙氨酸。
2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于：所述合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸蛋白编码基因表达如下蛋白，所述蛋白是如下任一所述的氨基酸序列：
a：氨基酸序列由如SEQ ID NO：07-17所示的序列，具体地：β-吲哚基丙氨酸羟化途径关键酶TPH2的氨基酸序列如SEQ ID NO：07所示；邻氨基苯甲酸羟化途径关键酶nagGH的氨基酸序列如SEQ ID NO：08-09所示；β-吲哚基丙氨酸路径上的关键酶trpEDCBA的氨基酸序列如SEQ ID NO：10-14所示(trpE，trpD,trpC,trpB,trpA五个酶的氨基酸序列依次如10-14所示)；BH4合成途径关键酶folE，PTPS，SPR基因的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：15-17所示。
或b：为具有与a所述的各氨基酸序列至少95％以上的序列同一性；
或c：由a所述的各氨基酸序列的C末端和/或N末端取代、添加或缺失一个或几个氨基酸残基而形成。
3.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于：β-吲哚基丙氨酸羟化途径关键酶TPH2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：01所示；邻氨基苯甲酸羟化途径关键酶nagGH如SEQ IDNO：02所示；β-吲哚基丙氨酸路径上的关键酶trpEDCBA如SEQ ID NO：03所示；BH4合成途径关键酶folE，PTPS，SPR基因的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：04-06所示。
4.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于：步骤2)为：将步骤1)所构建的重组菌经过LB培养基活化培养后，转接至发酵罐诱导表达后，以葡萄糖为底物从头合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸。
5.根据权利要求4所述的合成方法，其特征在于：将所构建的重组基因工程菌分别经过LB培养基活化培养后，得到种子液，将种子液转接至发酵罐，发酵至OD600生长至1-50时，补加IPTG诱导转化并开始分批补料发酵，以葡萄糖为底物从头合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸。
6.根据权利要求4所述的合成方法，其特征在于：所述种子液OD600＝5-10；
所述种子液接入发酵培养基的比例为1％-10％；
所述发酵培养基的培养条件为28-40℃，160-500rpm；
所述发酵中pH控制在5-9；
所述IPTG的终浓度为0.1-10mM；
所述诱导表达的条件为16-37℃；
所述反应体系葡萄糖浓度为1-100g/L；
所述发酵时间为18-72h。
7.一种重组基因工程菌，所述重组基因工程菌为包含如SEQ ID NO：1-6所示所述的合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸酶编码基因的重组载体的重组基因工程菌，或将部分酶基因整合入宿主细胞的基因组表达，其余酶基因在质粒中表达后转入前述宿主细胞中得到的重组基因工程菌。
8.根据权利要求7所述的重组基因工程菌，其特征在于：BH4合成途径关键酶folE，PTPS，SPR基因在宿主细胞的基因组上表达，其他目的酶基因在质粒中表达后转入基因组表达了BH4合成途径关键酶folE，PTPS，SPR基因的宿主细胞中。
9.权利要求7所述的重组基因工程菌的构建方法，其特征在于：将β-吲哚基丙氨酸羟化途径关键酶TPH2基因，邻氨基苯甲酸羟化途径关键酶nagGH和β-吲哚基丙氨酸路径上的关键酶trpEDCBA酶基因在质粒中表达，获得重组载体；将重组载体转入基因组上表达BH4合成途径关键酶folE，PTPS，SPR基因的宿主细胞中，得到重组基因工程菌。
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