CN113549588A - 用于产生5-羟基色氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于产生5‑羟基色氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用，首先对大肠杆菌中色氨酸合成途径和整个氨基酸代谢网络中与色氨酸相关的代谢流进行分析重构，加强了5‑HTP前体物色氨酸的供应。之后又引入人源2型色氨酸羟基化酶突变体和四氢蝶呤合成与再生途径，打通色氨酸胞内羟化反应，得到了一株遗传背景清晰、能通过微生物直接发酵法高效稳定生产5‑HTP的无质粒基因工程菌，具有良好的应用价值。

Description

用于产生5-羟基色氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及化合物生物技术生产领域，尤其是一种用于产生5-羟基色氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
5-羟色氨酸(5-hydroxytryptophan，5-HTP)，化学名称为5-羟基-3-吲哚基-α-氨基丙酸，是神经递质5-羟色胺生物合成的前体，可有效治疗多种疾病，如抑郁症、纤维肌痛、肥胖、失眠和慢性头痛等。目前以5-HTP为主要成分的保健药已开发了50多种制剂品种，在全球超过30个国家上市。而随着人们对5-HTP功能研究的逐渐深入，其市场需求还在不断扩大，这使5-HTP成为最具商业价值的小品种氨基酸之一。
目前，我国是5-HTP的主要生产国，且天然产物合成法仍是5-HTP的主要生产方法，该法利用非洲植物加纳的种子作为原料，将其依次经粉碎、萃取、过滤离心、脱色、真空浓缩、结晶、重结晶、真空干燥等工序处理，最终得到5-HTP纯品。该法虽然能得到纯度较高的5-HTP产品，但其原料需从非洲采购，这使原料供应常受季节、供货区域、甚至是国际关系的影响，十分不稳定，进而导致5-HTP市场价格常年居高不下。
可见，自然产物提取法已越来越难以满足5-HTP日益增长的市场需求，各企业也在积极寻找、开发其他更加高效、方便的5-HTP生产方法。而微生物直接发酵法因其具有成本低廉、过程简单、易于工业化等优势，成为替代目前生产方法的首选。大肠杆菌因其遗传背景清晰、基因编辑方法完善，易于培养等优点，成为微生物直接发酵法产5-HTP的最好的选择。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种用于产生5-羟基色氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述基因工程菌的构建方法。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述基因工程菌的应用。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种用于产生5-羟基色氨酸的基因工程菌，命名为E.coli HTP10，为经人工改造的、具有特定基因型的大肠杆菌，是由野生型大肠杆菌经下述方法改造得到的：敲除tnaA基因(NCBI-Gene ID:12933600)以阻止色氨酸及5-羟基色氨酸的分解代谢；在其基因组的lacIZ位点上整合了由木糖启动子PxylF控制的T7RNAP基因，在失活lacI蛋白的同时使细胞可以利用木糖诱导产生RNA聚合酶T7RNAP；用解除反馈抑制的突变体trpEfbr基因替换大肠杆菌原有的trpE基因(NCBI-Gene ID:12931130)，并用Ptrc启动子引导色氨酸操纵子的表达，以强化分支酸途径；将解除反馈抑制的突变体aroGfbr基因serAfbr基因串联整合至大肠杆菌基因组的yjiV位点，并用Ptrc启动子引导表达，以强化莽草酸途径和丝氨酸合成途径；敲除tyrR基因(NCBI-Gene ID:12931156)及trpR基因(NCBI-Gene ID:12931807)，以实现负转录调控蛋白TyrR和TrpR的缺失；在其基因组mbhA位点整合了由T7启动子(强启动子)引导表达的编码人源2型色氨酸羟基化酶短截突变体的TPH150基因，以构建胞内色氨酸羟基化途径；将来源于枯草芽孢杆菌的mtrA基因和来源于人类的PTPS基因、SPR基因、PCD基因和DHPR基因，串联整合至大肠杆菌基因组yghX位点处，以引入辅酶四氢蝶呤的合成途径与再生途径，其中mtrA基因、PTPS基因、SPR基因由同一个Ptrc启动子引导表达，PCD基因、DHPR基因由同一个Ptrc启动子引导表达；其中，
所述野生型大肠杆菌为E.coli W3110，保藏号ATCC 27325；
所述木糖启动子PxylF具有序列表SEQ ID NO.SEQ ID NO.1所示核苷酸序列；
所述RNA聚合酶T7RNAP具有序列表SEQ ID NO.2所示核苷酸序列；
所述trpEfbr基因具有序列表SEQ ID NO.3所示核苷酸序列；
所述Ptrc启动子，具有序列表SEQ ID NO.4所示核苷酸序列；
所述aroGfbr基因具有序列表SEQ ID NO.5所示核苷酸序列；
所述serAfbr基因具有序列表SEQ ID NO.6所示核苷酸序列；
所述强启动子PT7启动子具有序列表SEQ ID NO.7所示核苷酸序列；
所述编码人源2型色氨酸羟基化酶短截突变体的TPH150基因具有序列表SEQ IDNO.8所示核苷酸序列；
所述mtrA基因来源于枯草芽孢杆菌，负责编码GTP环化水解酶Ⅰ(GCHⅠ)，具有序列表SEQ ID NO.9所示核苷酸序列；
所述人源PTPS基因，负责编码6-丙酮酰四氢生物蝶呤合成酶(PTPS)，具有序列表SEQ ID NO.10所示核苷酸序列；
所述人源SPR基因，负责编码鸟蝶呤还原酶(SPR)，具有序列表SEQ ID NO.11所示核苷酸序列；
所述人源PCD基因，负责编码蝶呤-4α-甲醇氨脱水酶(PCD)，具有序列表SEQ IDNO.12所示核苷酸序列；
所述人源DHPR基因，负责编码双氢蝶呤还原酶(DHPR)，具有序列表SEQ ID NO.13所示核苷酸序列。
上述产5-羟基色氨酸的基因工程菌可通过上述方法重复制备得到，于实验室-80℃冰箱保存即可。
上述用于产生5-羟基色氨酸的基因工程菌，所述编码人源2型色氨酸羟基化酶短截突变体的TPH150基因、枯草芽孢杆菌mtrA基因、人源PTPS、SPR、PCD和DHPR等基因，均为经密码子优化后人工合成的核苷酸序列。
上述用于产生5-羟基色氨酸的基因工程菌，为无质粒基因工程菌株，该菌株能够过度产生或积累5-羟基色氨酸的直接前体物色氨酸，并且含有完整的色氨酸羟基化途径，能稳定高效地合成5-羟基色氨酸。
上述用于产生5-羟基色氨酸的基因工程菌，基因工程菌株基因组lacIZ位点上整合有PxylF-T7RNAP基因，使其可以利用木糖诱导产生T7RNA聚合酶，启动PT7启动子。
上述用于产生5-羟基色氨酸的基因工程菌，还含有人源2型羟基化酶突变体TPH150，所述人源2型羟基化酶突变体TPH150由TPH150基因编码，并使用PT7启动子启动，所述TPH150基因整合到基因组的mbhA位点处。
优选的，上述用于产生5-羟基色氨酸的基因工程菌，所述基因工程菌还含有四氢蝶呤合成和再生途径酶系，包括GCHⅠ、PTPS、SPR、PCD和DHPR中的一种或几种，其中，
所述GCHⅠ(GTP环化水解酶Ⅰ)由来源于枯草芽孢杆菌的mtrA基因编码；
所述PTPS(6-丙酮酰四氢生物蝶呤合成酶)由人源PTPS基因编码；
所述SPR(鸟蝶呤还原酶)由人源SPR基因编码；
所述PCD(蝶呤-4α-甲醇氨脱水酶)由人源PCD基因编码；
所述DHPR(双氢蝶呤还原酶)由人源DHPR基因编码；
所述mtrA、PTPS、SPR由同一个Ptrc启动子引导表达，所述的PCD、DHPR由同一个Ptrc启动子引导表达，并整合到基因组的yghX位点处。
一种用于产生5-羟基色氨酸的基因工程菌的构建方法，采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术对野生型大肠杆菌(如E.coli W3110基因组)进行定向改造(基因整合和敲除)，构建重组片段和pGRB质粒，所述构建重组片段包括构建基因整合的重组片段或者构建基因敲除的重组片段；所述pGRB质粒的构建包括：设计靶序列，制备包含靶序列的DNA片段，将包含靶序列的DNA片段与线性化的载体片段重组；将pGRB质粒和上述重组片段同时转化至含有pREDCas9的电转感受态细胞中，还包括质粒消除的步骤，获得重组的基因工程菌株。
优选的，上述用于产生5-羟基色氨酸的基因工程菌的构建方法，所述构建基因整合的重组片段的步骤包括：以出发菌株的基因组为模板，根据目的基因拟插入位点的上下游序列设计上下游同源臂引物，并根据目的基因组设计引物，扩增目的基因片段，再通过PCR重叠技术获得重组片段。
优选的，上述用于产生5-羟基色氨酸的基因工程菌的构建方法，所述构建基因敲除的重组片段的步骤包括：以待敲除基因的上下游序列为模板，设计上下游同源臂引物；通过PCR的方法分别扩增上下游同源臂，再经过重叠PCR制备重组片段。
优选的，上述用于产生5-羟基色氨酸的基因工程菌的构建方法，具体步骤如下：
(1)为了阻断色氨酸及5-羟基色氨酸分解代谢途径，将编码色氨酸酶的tnaA基因敲除；
(2)在野生型大肠杆菌(E.coli W3110，ATCC 27325)基因组上，将来源于T7噬菌体的RNA聚合酶(T7RNAP)基因整合在lacIZ基因位点；
(3)为了解除前导肽对色氨酸操纵子的弱化作用，消除关键酶邻氨基苯甲酸合成酶的反馈抑制作用，强化色酸操纵子合成酶系，将色氨酸操纵子中的trpLE基因替换为Ptrc-trpEfbr基因；
(4)为了强化莽草酸途径和丝氨酸合成途径，同时提高L-丝氨酸的供应，加强3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶(aroG编码)及磷酸甘油酸脱氢酶(serA编码)的表达，引入有利突变aroGfbr、serAfbr，并将二者串联整合至大肠杆菌基因组的yjiV位点，用Ptrc启动子控制转录；
(5)为了解除阻遏蛋白TyrR和TrpR对关键酶的反馈阻遏，将大肠杆菌基因组中对应的编码基因tyrR、tyrR敲除；
(6)为了引入辅酶四氢蝶呤(BH4)的合成途径与再生途径，实现BH4的内源供应，将来源于枯草芽孢杆菌的mtrA基因和来源于人类的PTPS、SPR、PCD和DHPR基因，串联整合至大肠杆菌基因组yghX位点处，其中mtrA、PTPS、SPR由同一个Ptrc启动子引导表达，PCD、DHPR由同一个Ptrc启动子引导表达；
(7)为了实现色氨酸羟基化酶的高效表达，打通色氨酸羟基化途径，在基因组mbhA位点整合了由PT7启动子引导表达的人源2型色氨酸羟基化酶短截突变体TPH150基因。
上述基因工程菌在发酵生产5-羟基色氨酸方面的应用。
优选的，上述基因工程菌的应用，所述基因工程菌株能够过度产生或积累5-羟基色氨酸是通过以下改造实现的：
(1)敲除了编码色氨酸酶的tnaA基因；
(2)用解除反馈抑制的邻氨基苯甲酸合成酶突变体trpEfbr基因替换了原有的trpLE基因，并用Ptrc启动子启动；
(3)在基因组yjiV位点串联整合了酶解除反馈抑制的3-脱氧-σ-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶突变体基因aroGfbr和磷酸甘油酸脱氢酶突变体基因serAfbr基因，并用Ptrc启动子启动；
(4)敲除了编码阻遏蛋白TyrR、TrpR的tyrR、trpR基因。
(5)在基因组yghX位点处串联整合了四氢蝶呤的合成途径与再生途径酶系的相关基因(mtrA、PTPS、SPR基因和PCD、DHPR基因)，实现BH4的内源供应，其中mtrA、PTPS、SPR由同一个Ptrc启动子引导表达，PCD、DHPR由同一个Ptrc启动子引导表达；
(6)在基因组lacIZ位点上整合了来源于T7噬菌体的RNA聚合酶基因；
(7)在基因组mbhA位点整合了由PT7启动子引导表达的人源2型色氨酸羟基化酶短截突变体TPH150基因。
优选的，上述基因工程菌的应用，具体方法为：摇瓶发酵，将菌种活化后制备种子液，按10-15％接种量接种到三角瓶中(终体积为30mL)，九层纱布封口，37℃，220r/min振荡培养，发酵过程中通过补加氨水维持pH在7.0-7.2；补加60％(m/v)葡萄糖溶液维持发酵进行(以苯酚红做指示剂)，发酵液颜色不再变化时即视为缺糖，缺糖时补加1-2mL 60％(m/v)葡萄糖溶液，发酵初始添加60％(m/v)木糖溶液(发酵液中木糖终浓度5-15g/L)诱导目的基因表达，发酵周期22-26h。
优选的，上述基因工程菌的应用，所述摇瓶发酵中采用的发酵培养基组成为：葡萄糖20-40g/L，酵母浸出粉2-5g/L，硫酸铵1-5g/L，磷酸二氢钾1-5g/L，无水硫酸镁0.5-2g/L，七水硫酸亚铁30-60mg/L，一水硫酸锰20-40mg/L，VH 0.1-0.5mg/L，VB1 0.5-1mg/L，微量元素混合液1-2mg/L，苯酚红：需定容体积的2％，用氢氧化钠调pH至7.0-7.2，高压蒸汽锅灭菌115℃，15min。
上述培养基均可采用标准方法制备获得。
有益效果：
上述用于产生5-羟基色氨酸的基因工程菌，是一株无质粒菌株，且具有良好的生长性状，5-羟基色氨酸产率稳定，该菌遗传背景清晰，基因操作简单高效，方便对其进行进一步的性状改良；本发明所提供的用于产生5-羟基色氨酸的基因工程菌的构建方法是一种定向的理性的菌种构建方法，相比传统诱变方法更为高效便捷，可操作性强，使重组的菌株能够利用葡萄糖为原料在胞内完成色氨酸的羟基化，具有良好的应用前景。
附图说明
图1：ΔtnaA敲除构建PCR验证。M：Marker；1：上游同源臂；2：下游同源臂；3：ΔtnaA重叠片段；4：原基因组片段；5：ΔtnaA重叠片段替换原基因组片段。
图2：PxylF T7RNAP重叠片段的构建及PCR验证。M：marker；1：上游同源臂；2：PxylFT7RNAP基因片段；3：下游同源臂；4：P xylFT7RNAP基因整合重叠片段；5：原基因片段；6：PxylFT7RNAP基因整合后片段。
图3：ΔtrpLE敲除(a)及trpEfbr整合(b)PCR验证。(a)M：Marker；1：上游同源臂；2：下游同源臂；3：ΔtrpLE重叠片段；4：原基因组片段；5：ΔtrpLE重叠片段替换原基因组片段。(b)M：Marker；1：原基因组片段；2：trpEfbr重叠片段替换原基因组片段。
图4：Ptrc-aroGfbr-serAfbr重叠片段的构建及PCR验证。M：Marker；1：上游同源臂；2：Ptrc aroGfbr片段；3：serAfbr片段；4：下游同源臂；5：重叠片段；6：原基因组片段长度；7：整合成功的基因组片段。
图5：ΔtyrR敲除片段的构建及PCR验证。M：Marker；1：上游同源臂；2：下游同源臂；3：ΔtyrR片段；4：原基因组片段；5：ΔtyrR替换成功后的基因组片段。
图6：trpR基因敲除PCR验证：M：Marker；1：ΔtrpR替换原基因组片段；2：原基因组片段。
图7：Ptrc-mtrA-PTPS-SPR-Ptrc-PCD-DHPR基因重组片段的构建及PCR验证：M：marker；1：上游同源臂；2：Ptrc-mtrA-PTPS-SPR-Ptrc-PCD-DHPR基因片段；3：下游同源臂；4：Ptrc-mtrA-PTPS-SPR-Ptrc-PCD-DHPR基因整合重叠片段；5：原基因片段；6：鉴定片段。
图8：色氨酸羟化酶基因TPH150重组片段的构建及PCR验证：M：marker；1：上游同源臂；2：TPH150基因片段；3：下游同源臂；4：PT7 TPH150基因整合重叠片段；5：原基因片段；6：E.coli HTP09阳性转化子鉴定片段；7：E.coli HTP10阳性转化子鉴定片段。
图9：一种产生5-羟基色氨酸的基因工程菌的构建方法图解。
图10：pRed-Cas9和pGRB质粒图谱。
图11：质粒pTrcTAS图谱。
具体实施方式
实施方案中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，指质量百分比，溶液的百分比指100mL中含有溶质的克数，液体之间的百分比，是指在25℃时溶液的体积比例。
所述菌株敲除了编码色氨酸酶的tnaA基因；在大肠杆菌基因组lacIZ位点上整合了由木糖启动子PxylF控制的来源于T7噬菌体的RNA聚合酶T7RNAP；将色氨酸操纵子中的trpLE基因替换为Ptrc-trpEfbr序列；在基因组的yjiV位点串联整合了3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶(aroG编码)及磷酸甘油酸脱氢酶(serA编码)的解反馈抑制突变体aroGfbr、serAfbr基因；敲除了tyrR、tyrR基因；引入BH4合成和再生途径，在基因组yghX位点处串联整合了经密码子优化并人工合成的mtrA、PTPS、SPR和PCD、DHPR基因；在基因组mbhA位点处整合了经密码子优化并人工合成的TPH150基因，打通胞内色氨酸羟化途径。aroGfbr-serAfbr、mtrA-PTPS-SPR、PCD-DHPR基因均由Ptrc启动子引导表达，TPH150基因则由强启动子PT7引导表达。从而达到摇瓶发酵22-26h后5-羟基色氨酸的产量达到530-550mg/L，具有较大的产业化应用潜力。其中：
PxylF启动子具有序列表SEQ ID NO.1所示核苷酸序列。
RNA聚合酶T7RNAP具有序列表SEQ ID NO.2所示核苷酸序列。
trpEfbr(trpE(A63V,C465Y))基因具有序列表SEQ ID NO.3所示核苷酸序列。
Ptrc启动子具有序列表SEQ ID NO.4所示核苷酸序列。
aroGfbr(aroG(S211F))基因具有序列表SEQ ID NO.5所示核苷酸序列。
serAfbr(serA(H344A))基因具有序列表SEQ ID NO.6所示核苷酸序列。
PT7启动子具有序列表SEQ ID NO.7所示核苷酸序列。
TPH150基因具有序列表SEQ ID NO.8所示核苷酸序列。
mtrA基因具有序列表SEQ ID NO.9所示核苷酸序列。
PTPS基因具有序列表SEQ ID NO.10所示核苷酸序列。
SPR基因具有序列表SEQ ID NO.11所示核苷酸序列。
PCD基因具有序列表SEQ ID NO.12所示核苷酸序列。
DHPR基因具有序列表SEQ ID NO.13所示核苷酸序列。
实施例1
菌株E.coli HTP10的构建
1.基因编辑的方法
本发明中采用的基因编辑方法参照文献(Li Y，Lin Z，Huang C，et al.Metabolicengineering of Escherichia coli using CRISPR-Cas9 meditated genomeediting.Metabolic Engineering，2015，31：13-21.)进行，该方法所用的两个质粒图谱见图10。其中pREDCas9携带gRNA表达质粒pGRB的消除系统，λ噬菌体的Red重组系统及Cas9蛋白表达系统，奇霉素抗性(工作浓度：100mg/L),32℃培养；pGRB以pUC18为骨架，包括启动子J23100，gRNA-Cas9结合区域序列和终止子序列，氨苄青霉素抗性(工作浓度：100mg/L),37℃培养。
如图9所示，该方法的具体步骤如下：
1.1 pGRB质粒构建
构建质粒pGRB的目的是为了转录相应的gRNA，从而与Cas9蛋白形成的复合体，并通过碱基配对和PAM识别目的基因靶位点，实现目的DNA双链断裂。采用包含靶序列的DNA片段与线性化的载体片段重组的方法构建pGRB质粒。
1.1.1 靶序列设计
使用CRISPR RGEN Tools设计靶序列(PAM：5'-NGG-3')
1.1.2 包含靶序列的DNA片段的制备
设计引物:5'-线性化载体末端序列(15bp)-酶切位点-靶序列(不包括PAM序列)-线性化载体末端序列(15bp)-3'，及其反向互补的引物，通过单链DNA的退火制备包含靶序列的DNA片段。反应条件：预变性95℃，5min；退火30-50℃，1min。退火体系如下表1：
表1 退火体系
Figure BDA0003134166610000111
1.1.3 线性载体的制备
载体的线性化采用反向PCR扩增的方法。
1.1.4 重组连接靶序列与线性化载体
使用
Figure BDA0003134166610000113
II One Step Cloning Kit重组酶重组连接靶序列与线性化的pGRB载体(反应体系见表2)，其中退火得到的含靶序列的片段作为插入片段，线性化的pGRB载体作为克隆载体，化转至E.coli DH5α化转感受态后，筛选阳性转化子，得到含靶序列的pGRB载体。
表2 质粒重组体系
Figure BDA0003134166610000112
1.2 重组DNA片段的制备
用于敲除的重组片段由需敲除基因的上下游同源臂组成(上游同源臂-下游同源臂)；用于整合的重组片段以整合位点的上下游同源臂及待整合的基因片段组成(上游同源臂-目的基因-下游同源臂)。利用引物设计软件primer 5，以待敲除基因或待整合位点的上下游序列为模板，设计上下游同源臂引物(扩增长度约400-500bp)；以待整合基因为模板，设计整合基因的扩增引物。通过PCR的方法分别扩增上下游同源臂和目的基因片段后，再经过重叠PCR制备重组片段。PCR体系及方法见表3：
表3 HS酶PCR扩增体系
Figure BDA0003134166610000121
重叠PCR体系见表4：
表4 重叠PCR扩增体系
Figure BDA0003134166610000122
Figure BDA0003134166610000131
PCR反应条件(宝生物PrimeSTAR HS酶)：预变性(95℃)5min；然后进行30轮循环：变性(98℃)10s，退火((Tm-3/5)℃)15s，72℃延伸；72℃继续延伸10min；维持(4℃)。
1.3 质粒和重组DNA片段的转化
1.3.1 pREDCas9的转化
制备目的菌株的电转感受态，利用电转的方法将pREDCas9质粒电转至目的菌株的电转感受态中，将菌体复苏培养后涂布于含奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养。抗性平板上挑选单菌落用鉴定引物进行菌落PCR验证,筛选阳性转化子。
1.3.2 含pREDCas9的目的菌株电转化感受态制备
32℃培养至OD600＝0.1～0.2时，添加0.1M的IPTG(使其终浓度为0.1mM)，继续培养至OD600＝0.6～0.7时进行感受态制备。添加IPTG的目的是使pREDCas9质粒上的重组酶诱导表达。其他操作与大肠杆菌电转感受态细胞的制备方法一致。
1.3.3 pGRB和重组DNA片段的转化
将含靶序列的pGRB和重组DNA片段同时电转化至含有pREDCas9的电转感受态细胞中。将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养。用上游同源臂上游引物和下游同源臂的下游引物，或设计专门的鉴定引物，进行菌落PCR验证，筛选阳性转化子并保菌。
1.3.4 pGRB的消除
将阳性重组子置于含有0.2％阿拉伯糖的LB培养基中过夜培养，适量稀释后涂布于含有奇霉素抗性的LB平板上，32℃过夜培养。对点含有氨苄青霉素和奇霉素抗性的LB平板，挑选氨苄青霉素平板不生长，奇霉素抗性平板生长的单菌落保菌。
1.3.5 pREDCas9质粒的消除
将阳性重组子转接到无抗性的LB液体培养基中，42℃过夜培养，适量稀释后涂布于无抗性的LB平板上，37℃过夜培养。对点含有奇霉素抗性和无抗性的LB平板，挑选奇霉素抗性平板不生长，无抗性平板生长的单菌落保菌。
2.菌株构建过程中用到的引物见表5
表5 菌株构建过程中所涉及的引物
Figure BDA0003134166610000141
Figure BDA0003134166610000151
Figure BDA0003134166610000161
3.菌株构建的具体过程
3.1 基因tnaA的敲除
以提取并稀释至可用浓度的大肠杆菌W3110基因组为模板，用引物tnaA-1和tnaA-2，tnaA-3和tnaA-4分别进行PCR扩增，得到上游同源臂和下游同源臂，大小分别为490bp和500bp，以回收的上下游同源臂为模板，用引物tnaA-1和tnaA-4进行重叠PCR，得到敲除基因tnaA所需的回补片段，大小在990bp。之后，将引物PGRB-tnaA-1和PGRB-tnaA-2退火制得的DNA片段与质粒pGRB线载连接，构建pGRB-tnaA。制备E.coli W3110/Cas9的感受态细胞，按照1.3.3和1.3.4所示的方法操作，将纯化后的ΔtnaA整合片段质粒pGRB-tnaA同时经电转化方式转入菌株E.coli W3110/pRed-Cas9的感受态细胞中，最终获得菌株E.coli HTP01。过程中片段扩增结果和阳性菌株的PCR验证的电泳图见图1，各片段大小均与理论值大小一致。
3.2 将基因PxylF PT7RANP整合至lacIZ位点
以提取并稀释至可用浓度的大肠杆菌W3110基因组为模板，引物lacIZ-1和lacIZ-2，lacIZ-3和lacIZ-4进行PCR扩增，得到上下游同源臂，其大小分别是404bp和453bp；用引物PxylF-1和PxylF-2进行PCR扩增，获得PxylF片段；以E.coli BL21(DE3)基因组为模板，用引物T7RNAP-1和T7RNAP-2进行PCR扩增，得到PT7RNAP片段。用引物PxylF-1和T7RNAP-2，以PxylF片段和PT7RNAP基因为模板进行重叠PCR，得到PxylF-T7RNAP基因片段，其理论大小为3034bp；再以回收的上下游同源臂和PxylF-T7RNAP基因片段为模板，用引物lacIZ-1和lacIZ-4进行重叠PCR，得到需要整合的目的片段(上游同源臂-PxylF-T7RNAP基因-下游同源臂)，理论大小为3890bp。之后，之后，将引物PGRB-lacIZ-1和PGRB-lacIZ-2退火制得的DNA片段与质粒pGRB线载连接，构建pGRB-lacIZ。制备E.coli HTP01的电转感受态，按照1.3.3和1.3.4所示的方法操作，将质粒pGRB-lacIZ和待整合的PxylF-T7RNAP基因片段一起电转至该感受态中，筛选阳性转化子，得到菌株E.coli HTP02。过程中片段扩增结果和阳性菌株的PCR验证的电泳图见图2，各片段大小均与理论值大小一致。
3.3 基因trpLE的敲除与Ptrc-trpEfbr的整合
在设计引物时，将外源切割位点的DNA序列分段加在引物trpLE-2和trpLE-3上，以提取并稀释至可用浓度的大肠杆菌W3110基因组为模板，用引物trpLE-1和trpLE-2，trpLE-3和trpLE-4分别进行PCR，在设计引物时，将切割效率较高的DNA序列加在引物trpLE-2和trpLE-3上，得到上游同源臂和下游同源臂，理论大小分别为462bp和880bp，以回收的上下游同源臂为模板，用引物trpLE-1和trpLE-4进行重叠PCR，得到敲除基因trpLE同时带有外源切割位点所需的回补片段，理论大小在1342bp。之后，将引物PGRB-trpE-1和PGRB-trpE-2退火制得的DNA片段与质粒pGRB线载连接，构建pGRB-trpE。制备E.coli HTP02的感受态细胞，按照1.3.3和1.3.4所示的方法操作，将纯化后的ΔtrpLE整合片段和质粒pGRB-trpE同时经电转化方式转入菌株E.coli HTP02的感受态细胞中，最终获得菌株E.coli HTP03。过程中片段扩增结果和阳性菌株的PCR验证的电泳图见图3(a)，各片段大小均与理论值大小一致。
以大肠杆菌W3110为模板，用引物trpE-1和trpE-2，trpE-5和trpE-6进行PCR扩增，得到上下游同源臂，其理论大小分别在610bp和502bp，以实验室现存的质粒pTrcTAS(图11)为模板，用引物trpE-3和trpE-4扩增中间目的片段，大小在1880bp，以回收的上下游同源臂和中间目的片段为模板，用引物trpE-1和trpE-6经重叠PCR得到整合需要的目的片段Ptrc-trpEfbr，理论大小在2992bp。之后，将引物PGRB-trpEfbr-1和PGRB-trpEfbr-2退火制得的DNA片段与质粒pGRB线载连接，构建pGRB-trpEfbr。制备E.coli HTP03的感受态细胞，按照1.3.3和1.3.4所示的方法操作，将纯化后的Ptrc-trpEfbr整合片段和质粒pGRB-trpEfbr同时经电转化方式转入菌株E.coli HTP03的感受态细胞中，最终获得菌株E.coli HTP04。过程中片段扩增结果和阳性菌株的PCR验证的电泳图见图3(b)，各片段大小均与理论值大小一致。
3.4 基因Ptrc-aroGfbr-serAfbr的整合
以稀释至可用浓度范围的大肠杆菌W3110基因组为模板，分别用引物GA-1和GA-2，GA-7和GA-8进行PCR得到上下游同源臂，其大小分别在411bp和431bp，以本实验室存放的质粒pTrcTAS为模板，分别用引物GA-3和GA-4，GA-5和GA-6进行PCR扩增，得到中间目的片段Ptrc-aroGfbr和serAfbr，二者理论大小分别为1444bp和1516bp。因基因aroGfbr和serAfbr共用一个启动子因此在设计引物时，将RBS序列加在引物GA-5上，并保证反向互补。以已经回收得到的上下游同源臂和两个中间目的片段为模板，用引物GA-1和GA-8进行重叠PCR，得到需要整合的目的片段Ptrc-aroGfbr-serAfbr，理论大小在3803bp。之后，将引物pGRB-yjiV-1和pGRB-yjiV-2退火制得的DNA片段与质粒pGRB线载连接，构建pGRB-yjiV。制备E.coli HTP04电转感受态，按照1.3.3和1.3.4所示的方法操作，将质粒pGRB-yjiV和纯化后待整合的片段Ptrc-aroGfbr-serAfbr同时经电转导入E.coli HTP04感受态细胞中，最终获得菌株E.coliHTP05。过程中片段扩增结果和阳性菌株的PCR验证的电泳图见图4，各片段大小均与理论值大小一致。
3.5 基因tyrR、trpR的敲除
以经稀释至可用浓度范围的大肠杆菌W3110基因组为模板，用引物tyrR-1和tyrR-2、tyrR-3和tyrR-4进行PCR扩增，获得上下游同源臂，理论大小分别为513bp和502bp。以上下游同源臂为模板进行重叠PCR，获得需要的敲除片段ΔtyrR，其理论大小为1015bp。之后，将引物PGRB-tyrR-1和PGRB-tyrR-2退火制得的DNA片段与质粒pGRB线载连接，构建pGRB-tyrR。制备E.coli HTP05的感受态细胞，按照1.3.3和1.3.4所示的方法操作，将纯化后的ΔtyrR整合片段质粒pGRB-tyrR同时经电转化方式转入菌株E.coli HTP05的感受态细胞中，最终获得菌株E.coli HTP06。过程中片段扩增结果和阳性菌株的PCR验证的电泳图见图5，各片段大小均与理论值大小一致。
以经稀释至可用浓度范围的大肠杆菌W3110基因组为模板，用引物trpR-1和trpR-2、trpR-3和trpR-4进行PCR扩增，获得上下游同源臂，理论大小分别为560bp和532bp。以上下游同源臂为模板进行重叠PCR，获得需要的敲除片段ΔtrpR，其理论大小为1092bp。之后，将引物PGRB-trpR-1和PGRB-trpR-2退火制得的DNA片段与质粒pGRB线载连接，构建pGRB-trpR。制备E.coli HTP06的感受态细胞，按照1.3.3和1.3.4所示的方法操作，将纯化后的ΔtrpR片段与质粒pGRB-trpR同时经电转化方式转入菌株E.coli HTP06的感受态细胞中，最终获得菌株E.coli HTP07。过程中片段扩增结果和阳性菌株的PCR验证的电泳图见图6，各片段大小均与理论值大小一致。
3.6 BH4合成与再生途径关键基因Ptrc-mtrA-PTPS-SPR-Ptrc-PCD-DHPR的整合
以提取并稀释至可用浓度的大肠杆菌W3110基因组为模板，用引物yghX-1和yghX-2，yghX-5和yghX-6进行PCR扩增，得到上下游同源臂，其大小分别为613bp和663bp；以人工合成的基因片段为模板，用引物yghX-3和yghX-4进行PCR扩增，得到中间目的片段，其理论大小分别在3022bp；启动子Ptrc则设计在上游同源臂的下游引物和目的基因的上游引物中。以回收的上下游同源臂和中间目的片段为模板，用引物yghX-1和yghX-6进行重叠PCR，得到需要整合的目的片段(上游同源臂-Ptrc-mtrA-PTPS-SPR-Ptrc-PCD-DHPR-下游同源臂)，理论大小在4243bp。之后，将引物PGRB-yghX-1和PGRB-yghX-2退火制得的DNA片段与质粒pGRB线载连接，构建pGRB-yghX。制备E.coli HTP07的感受态细胞，按照1.3.3和1.3.4所示的方法操作，将质粒pGRB-yghX和待整合的Ptrc-mtrA-PTPS-SPR-Ptrc-PCD-DHPR基因片段同时电转化入E.coli HTP07感受态细胞中，最终获得菌株E.coli HTP08。过程中片段扩增结果和阳性菌株的PCR验证的电泳图见图7，各片段大小均与理论值大小一致。
3.7 色氨酸羟化酶基因TPH150的整合
以提取并稀释至可用浓度的大肠杆菌W3110基因组为模板，用引物mbhA-1和mbhA-2，mbhA-5和mbhA-6进行PCR扩增，得到上下游同源臂，其大小分别为550bp和526bp；以人工合成的基因片段为模板，用引物mbhA-3和mbhA-4进行PCR扩增，得到中间目的片段，其理论大小分别在1033bp；启动子PT7则设计在上游同源臂的下游引物和目的基因的上游引物中。以回收的上下游同源臂和中间目的片段为模板，用引物mbhA-1和mbhA-6进行重叠PCR，得到需要整合的目的片段(上游同源臂-PT7-HTP150-下游同源臂)，理论大小在2054bp。之后，将引物PGRB-mbhA-1和PGRB-mbhA-2退火制得的DNA片段与质粒pGRB线载连接，构建pGRB-mbhA。制备E.coli HTP08的感受态细胞，按照1.3.3和1.3.4所示的方法操作，将质粒pGRB-mbhA和待整合的PT7-HTP150基因片段同时电转化入E.coli HTP08感受态细胞中，获得菌株E.coli HTP09。之后，按1.3.5中的方法消除菌株E.coli HTP09中的pREDCas9质粒，最终得到菌株E.coli HTP10。过程中片段扩增结果和阳性菌株的PCR验证的电泳图见图8，各片段大小均与理论值大小一致。
实施例2
利用实施例1所述大肠杆菌基因工程菌摇瓶发酵生产5-羟基色氨酸
1.培养基
1.1 斜面培养基
葡萄糖1-3g/L，蛋白胨5-10g/L，牛肉膏5-10g/L，酵母浸出粉2-5g/L，氯化钠2-5g/L，琼脂粉15-30g/L，用水溶解并定容至所需体积，用氢氧化钠调pH 7.0-7.2，121℃高压蒸汽锅灭菌20min后分装至试管中。
1.2 种子培养基
葡萄糖20-40g/L，酵母浸出粉2-5g/L，硫酸铵1-5g/L，磷酸二氢钾1-5g/L，无水硫酸镁0.5-2g/L，七水硫酸亚铁10-30mg/L，一水硫酸锰10-30mg/L，VH 0.1-0.5mg/L，VB1 0.5-1mg/L，微量元素混合液1-2mL/L，苯酚红：需定容体积的2％，用氢氧化钠调pH至7.0-7.2，高压蒸汽锅灭菌115℃，15min。
1.3 发酵培养基
葡萄糖20-40g/L，酵母浸出粉2-5g/L，硫酸铵1-5g/L，磷酸二氢钾1-5g/L，无水硫酸镁0.5-2g/L，七水硫酸亚铁30-60mg/L，一水硫酸锰20-40mg/L，VH 0.1-0.5mg/L，VB1 0.5-1mg/L，微量元素混合液1-2mg/L，苯酚红：需定容体积的2％，用氢氧化钠调pH至7.0-7.2，高压蒸汽锅灭菌115℃，15min。
2.培养方法
2.1 斜面培养
取-80℃保藏的实施例1所述用于产生5-羟基色氨酸的基因工程菌E.coli HTP10划线接种于活化斜面，37℃培养12h，并传代一次。
2.2 种子培养
用接种环刮取一环斜面种子接种于装有30mL种子培养基的500mL三角瓶中，九层纱布封口，37℃，200r/min培养7-10h。
2.3 发酵培养
按10-15％接种量接种菌种活化后制备的种子液到装有发酵培养基的500mL三角瓶中(终体积为30mL)，九层纱布封口，37℃，200r/min振荡培养，发酵过程中通过补加氨水维持pH在7.0-7.2；添加加60％(m/v)葡萄糖溶液维持发酵进行(以苯酚红做指示剂，发酵液颜色不再变化时即视为缺糖，缺糖时补加1-2mL 60％(m/v)葡萄糖溶液)，发酵初始添加60％(m/v)木糖溶液(发酵液中木糖终浓度5-15g/L)诱导目的基因表达，发酵周期24-30h。
摇瓶发酵22-26h后5-羟基色氨酸的产量可达530-550mg/L。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 天津科技大学
军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所
<120> 用于产生5-羟基色氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用
<160> 79
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 268
<212> DNA
<213> promoter
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(268)
<400> 1
gagataattc acaagtgtgc gctcgctcgc aaaataaaat ggaatgatga aactgggtaa 60
ttcctcgaag agaaaaatgc aataagtaca attgcgcaac aaaagtaaga tctcggtcat 120
aaatcaagaa ataaaccaaa aatcgtaatc gaaagataaa aatctgtaat tgttttcccc 180
tgtttagttg ctaaaaattg gttacgttta tcgcggtgat tgttacttat taaaactgtc 240
ctctaactac agaaggccct acaccatg 268
<210> 2
<211> 2652
<212> DNA
<213> Bacteriophage T7
<220>
<221> tRNA
<222> (1)..(2652)
<400> 2
atgaacacga ttaacatcgc taagaacgac ttctctgaca tcgaactggc tgctatcccg 60
ttcaacactc tggctgacca ttacggtgag cgtttagctc gcgaacagtt ggcccttgag 120
catgagtctt acgagatggg tgaagcacgc ttccgcaaga tgtttgagcg tcaacttaaa 180
gctggtgagg ttgcggataa cgctgccgcc aagcctctca tcactaccct actccctaag 240
atgattgcac gcatcaacga ctggtttgag gaagtgaaag ctaagcgcgg caagcgcccg 300
acagccttcc agttcctgca agaaatcaag ccggaagccg tagcgtacat caccattaag 360
accactctgg cttgcctaac cagtgctgac aatacaaccg ttcaggctgt agcaagcgca 420
atcggtcggg ccattgagga cgaggctcgc ttcggtcgta tccgtgacct tgaagctaag 480
cacttcaaga aaaacgttga ggaacaactc aacaagcgcg tagggcacgt ctacaagaaa 540
gcatttatgc aagttgtcga ggctgacatg ctctctaagg gtctactcgg tggcgaggcg 600
tggtcttcgt ggcataagga agactctatt catgtaggag tacgctgcat cgagatgctc 660
attgagtcaa ccggaatggt tagcttacac cgccaaaatg ctggcgtagt aggtcaagac 720
tctgagacta tcgaactcgc acctgaatac gctgaggcta tcgcaacccg tgcaggtgcg 780
ctggctggca tctctccgat gttccaacct tgcgtagttc ctcctaagcc gtggactggc 840
attactggtg gtggctattg ggctaacggt cgtcgtcctc tggcgctggt gcgtactcac 900
agtaagaaag cactgatgcg ctacgaagac gtttacatgc ctgaggtgta caaagcgatt 960
aacattgcgc aaaacaccgc atggaaaatc aacaagaaag tcctagcggt cgccaacgta 1020
atcaccaagt ggaagcattg tccggtcgag gacatccctg cgattgagcg tgaagaactc 1080
ccgatgaaac cggaagacat cgacatgaat cctgaggctc tcaccgcgtg gaaacgtgct 1140
gccgctgctg tgtaccgcaa ggacaaggct cgcaagtctc gccgtatcag ccttgagttc 1200
atgcttgagc aagccaataa gtttgctaac cataaggcca tctggttccc ttacaacatg 1260
gactggcgcg gtcgtgttta cgctgtgtca atgttcaacc cgcaaggtaa cgatatgacc 1320
aaaggactgc ttacgctggc gaaaggtaaa ccaatcggta aggaaggtta ctactggctg 1380
aaaatccacg gtgcaaactg tgcgggtgtc gataaggttc cgttccctga gcgcatcaag 1440
ttcattgagg aaaaccacga gaacatcatg gcttgcgcta agtctccact ggagaacact 1500
tggtgggctg agcaagattc tccgttctgc ttccttgcgt tctgctttga gtacgctggg 1560
gtacagcacc acggcctgag ctataactgc tcccttccgc tggcgtttga cgggtcttgc 1620
tctggcatcc agcacttctc cgcgatgctc cgagatgagg taggtggtcg cgcggttaac 1680
ttgcttccta gtgaaaccgt tcaggacatc tacgggattg ttgctaagaa agtcaacgag 1740
attctacaag cagacgcaat caatgggacc gataacgaag tagttaccgt gaccgatgag 1800
aacactggtg aaatctctga gaaagtcaag ctgggcacta aggcactggc tggtcaatgg 1860
ctggcttacg gtgttactcg cagtgtgact aagcgttcag tcatgacgct ggcttacggg 1920
tccaaagagt tcggcttccg tcaacaagtg ctggaagata ccattcagcc agctattgat 1980
tccggcaagg gtctgatgtt cactcagccg aatcaggctg ctggatacat ggctaagctg 2040
atttgggaat ctgtgagcgt gacggtggta gctgcggttg aagcaatgaa ctggcttaag 2100
tctgctgcta agctgctggc tgctgaggtc aaagataaga agactggaga gattcttcgc 2160
aagcgttgcg ctgtgcattg ggtaactcct gatggtttcc ctgtgtggca ggaatacaag 2220
aagcctattc agacgcgctt gaacctgatg ttcctcggtc agttccgctt acagcctacc 2280
attaacacca acaaagatag cgagattgat gcacacaaac aggagtctgg tatcgctcct 2340
aactttgtac acagccaaga cggtagccac cttcgtaaga ctgtagtgtg ggcacacgag 2400
aagtacggaa tcgaatcttt tgcactgatt cacgactcct tcggtaccat tccggctgac 2460
gctgcgaacc tgttcaaagc agtgcgcgaa actatggttg acacatatga gtcttgtgat 2520
gtactggctg atttctacga ccagttcgct gaccagttgc acgagtctca attggacaaa 2580
atgccagcac ttccggctaa aggtaacttg aacctccgtg acatcttaga gtcggacttc 2640
gcgttcgcgt aa 2652
<210> 3
<211> 1563
<212> DNA
<213> gene
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1563)
<400> 3
atgcaaacac aaaaaccgac tctcgaactg ctaacctgcg aaggcgctta tcgcgacaat 60
cccaccgcgc tttttcacca gttgtgtggg gatcgtccgg caacgctgct gctggaatcc 120
gcagatatcg acagcaaaga tgatttaaaa agcctgctgc tggtagacag tgcgctgcgc 180
attacagttt taggtgacac tgtcacaatc caggcacttt ccggcaacgg cgaagccctc 240
ctggcactac tggataacgc cctgcctgcg ggtgtggaaa gtgaacaatc accaaactgc 300
cgtgtgctgc gcttcccccc tgtcagtcca ctgctggatg aagacgctcg cttatgctcc 360
ctttcggttt ttgacgcttt ccgtttattg cagaatctgt tgaatgtacc gaaggaagaa 420
cgagaagcca tgttcttcgg cggcctgttc tcttatgacc ttgtggcggg atttgaagat 480
ttaccgcaac tgtcagcgga aaataactgc cctgatttct gtttttatct cgctgaaacg 540
ctgatggtga ttgaccatca gaaaaaaagc acccgtattc aggccagcct gtttgctccg 600
aatgaagaag aaaaacaacg tctcactgct cgcctgaacg aactacgtca gcaactgacc 660
gaagccgcgc cgccgctgcc agtggtttcc gtgccgcata tgcgttgtga atgtaatcag 720
agcgatgaag agttcggtgg cgtagtgcgt ttgttgcaaa aagcgattcg cgctggagaa 780
attttccagg tggtgccatc tcgccgtttc tctctgccct gcccgtcacc gctggcggcc 840
tattacgtgc tgaaaaagag taatcccagc ccgtacatgt tttttatgca ggataatgat 900
ttcaccctat ttggcgcgtc gccggaaagc tcgctcaagt atgatgccac cagccgccag 960
attgagatct acccgattgc cggaacacgc ccacgcggtc gtcgcgccga tggttcactg 1020
gacagagatc tcgacagccg tattgaactg gaaatgcgta ccgatcataa agagctgtct 1080
gaacatctga tgctggttga tctcgcccgt aatgatctgg cacgcatttg cacccccggc 1140
agccgctacg tcgccgatct caccaaagtt gaccgttatt cctatgtgat gcacctcgtc 1200
tctcgcgtag tcggcgaact gcgtcacgat cttgacgccc tgcacgctta tcgcgcctgt 1260
atgaatatgg ggacgttaag cggtgcgccg aaagtacgcg ctatgcagtt aattgccgag 1320
gcggaaggtc gtcgccgcgg cagctacggc ggcgcggtag gttatttcac cgcgcatggc 1380
gatctcgaca cctacattgt gatccgctcg gcgctggtgg aaaacggtat cgccaccgtg 1440
caagcgggtg ctggtgtagt ccttgattct gttccgcagt cggaagccga cgaaacccgt 1500
aacaaagccc gcgctgtact gcgcgctatt gccaccgcgc atcatgcaca ggagactttc 1560
tga 1563
<210> 4
<211> 74
<212> DNA
<213> promoter
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(74)
<400> 4
ttgacaatta atcatccggc tcgtataatg tgtggaattg tgagcggata acaatttcac 60
acaggaaaca gacc 74
<210> 5
<211> 1053
<212> DNA
<213> gene
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1053)
<400> 5
atgaattatc agaacgacga tttacgcatc aaagaaatca aagagttact tcctcctgtc 60
gcattgctgg aaaaattccc cgctactgaa aatgccgcga atacggttgc ccatgcccga 120
aaagcgatcc ataagatcct gaaaggtaat gatgatcgcc tgttggttgt gattggccca 180
tgctcaattc atgatcctgt cgcggcaaaa gagtatgcca ctcgcttgct ggcgctgcgt 240
gaagagctga aagatgagct ggaaatcgta atgcgcgtct attttgaaaa gccgcgtacc 300
acggtgggct ggaaagggct gattaacgat ccgcatatgg ataatagctt ccagatcaac 360
gacggtctgc gtatagcccg taaattgctg cttgatatta acgacagcgg tctgccagcg 420
gcaggtgagt ttctcgatat gatcacccca caatatctcg ctgacctgat gagctggggc 480
gcaattggcg cacgtaccac cgaatcgcag gtgcaccgcg aactggcatc agggctttct 540
tgtccggtcg gcttcaaaaa tggcaccgac ggtacgatta aagtggctat cgatgccatt 600
aatgccgccg gtgcgccgca ctgcttcctg ttcgtaacga aatgggggca ttcggcgatt 660
gtgaatacca gcggtaacgg cgattgccat atcattctgc gcggcggtaa agagcctaac 720
tacagcgcga agcacgttgc tgaagtgaaa gaagggctga acaaagcagg cctgccagca 780
caggtgatga tcgatttcag ccatgctaac tcgtccaaac aattcaaaaa gcagatggat 840
gtttgtgctg acgtttgcca gcagattgcc ggtggcgaaa aggccattat tggcgtgatg 900
gtggaaagcc atctggtgga aggcaatcag agcctcgaga gcggggagcc gctggcctac 960
ggtaagagca tcaccgatgc ctgcatcggc tgggaagata ccgatgctct gttacgtcaa 1020
ctggcgaatg cagtaaaagc gcgtcgcggg taa 1053
<210> 6
<211> 1233
<212> DNA
<213> gene
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1233)
<400> 6
atggcaaagg tatcgctgga gaaagacaag attaagtttc tgctggtaga aggcgtgcac 60
caaaaggcgc tggaaagcct tcgtgcagct ggttacacca acatcgaatt tcacaaaggc 120
gcgctggatg atgaacaatt aaaagaatcc atccgcgatg cccacttcat cggcctgcga 180
tcccgtaccc atctgactga agacgtgatc aacgccgcag aaaaactggt cgctattggc 240
tgtttctgta tcggaacaaa ccaggttgat ctggatgcgg cggcaaagcg cgggatcccg 300
gtatttaacg caccgttctc aaatacgcgc tctgttgcgg agctggtgat tggcgaactg 360
ctgctgctat tgcgcggcgt gccggaagcc aatgctaaag cgcaccgtgg cgtgtggaac 420
aaactggcgg cgggttcttt tgaagcgcgc ggcaaaaagc tgggtatcat cggctacggt 480
catattggta cgcaattggg cattctggct gaatcgctgg gaatgtatgt ttacttttat 540
gatattgaaa ataaactgcc gctgggcaac gccactcagg tacagcatct ttctgacctg 600
ctgaatatga gcgatgtggt gagtctgcat gtaccagaga atccgtccac caaaaatatg 660
atgggcgcga aagaaatttc actaatgaag cccggctcgc tgctgattaa tgcttcgcgc 720
ggtactgtgg tggatattcc ggcgctgtgt gatgcgctgg cgagcaaaca tctggcgggg 780
gcggcaatcg acgtattccc gacggaaccg gcgaccaata gcgatccatt tacctctccg 840
ctgtgtgaat tcgacaacgt ccttctgacg ccacacattg gcggttcgac tcaggaagcg 900
caggagaata tcggcctgga agttgcgggt aaattgatca agtattctga caatggctca 960
acgctctctg cggtgaactt cccggaagtc tcgctgccac tgcacggtgg gcgtcgtctg 1020
atgcacatcg ccgaaaaccg tccgggcgtg ctaactgcgc tgaacaaaat cttcgccgag 1080
cagggcgtca acatcgccgc gcaatatctg caaacttccg cccagatggg ttatgtggtt 1140
attgatattg aagccgacga agacgttgcc gaaaaagcgc tgcaggcaat gaaagctatt 1200
ccgggtacca ttcgcgcccg tctgctgtac taa 1233
<210> 7
<211> 61
<212> DNA
<213> promoter
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(61)
<400> 7
taatacgact cactataggg tctagaaata attttgttta actttaagaa ggagatatac 60
c 61
<210> 8
<211> 951
<212> DNA
<213> gene
<220>
<221> gene
<222> (1)..(951)
<400> 8
atggttccgt ggtttcctcg caaaatcagc gagctggaca aatgcagcca ccgcgtcctg 60
atgtacggtt ccgaactgga cgccgatcac cctggtttca aagacaacgt ttaccgtcag 120
cgccgtaaat acttcgtaga cgtggccatg ggttacaaat acggtcagcc gatcccgcgc 180
gtcgaataca ctgaagaaga aaccaaaacg tggggcgtag tattccgtga actgtccaaa 240
ctgtacccga cccacgcttg ccgtgaatat ctgaaaaact ttccgctgct gaccaaatac 300
tgcggttacc gtgaagataa cgttccgcag ctggaagatg tttctatgtt cctgaaagag 360
cgttccggtt tcacggttcg tccagttgca ggttacctgt ctccgcgcga ttttctggcg 420
ggcctggctt accgtgtgtt ccactgtacc caatacatcc gtcacggcag cgatccgctg 480
tataccccgg aaccggacac ttgtcatgag ctgctgggcc acgttccact gctggctgac 540
ccaaaattcg cgcagttctc tcaggaaatt ggtctggcat ctctgggcgc gtctgacgaa 600
gacgtccaga aactggcaac ttgctacttc tttactatcg aatttggcct gtgcaagcaa 660
gaaggtcagc tgcgcgcgta tggtgcaggt ctgctgtcta gcatcggtga gctgaaacac 720
gcgctgtctg acaaggcctg cgtgaaggct tttgatccga aaaccacttg cctgcaggaa 780
tgcctgatca ccaccttcca ggaagcctac ttcgtaagcg agtccttcga agaagcgaaa 840
gagaaaatgc gtgatttcgc gaaaagcatt acccgtccgt tctctgtata cttcaacccg 900
tacacccagt ccatcgaaat cctgaaagat actcgttcca tcgaaaacgt t 951
<210> 9
<211> 573
<212> DNA
<213> gene
<220>
<221> gene
<222> (1)..(573)
<400> 9
atgaaagaag ttaataaaga gcaaatcgaa caagctgttc gtcaaatttt agaagcgatc 60
ggagaagacc cgaatagaga agggcttctt gatactccga aaagagtcgc aaagatgtat 120
gccgaagtat tctccggctt gaatgaagat ccaaaagaac atttccagac tatcttcggt 180
gaaaaccatg aggagcttgt tcttgtaaaa gatatagcgt ttcattctat gtgtgagcat 240
caccttgttc ccttttatgg aaaagcacat gttgcatata tcccgcgagg cggaaaggtc 300
acaggactca gcaaactggc acgtgccgtt gaagccgttg caaagcgccc gcagcttcag 360
gaacgcatca cttctacaat tgcagaaagc atcgtagaaa cgcttgatcc gcatggcgta 420
atggtagtgg ttgaagcgga acacatgtgc atgacgatgc gcggtgtaag aaaaccgggt 480
gcgaaaactg tgacttcagc agtcagaggc gtttttaaag atgatgccgc tgcccgtgca 540
gaagtattgg aacatattaa acgccaggac taa 573
<210> 10
<211> 438
<212> DNA
<213> gene
<220>
<221> gene
<222> (1)..(438)
<400> 10
atgagcacgg aaggtggtgg ccgtcgctgc caggcacaag tgtcccgccg catctccttc 60
agcgcgagcc accgattgta cagtaaattt ctaagtgatg aagaaaactt gaaactgttt 120
gggaaatgca acaatccaaa tggccatggg cacaattata aagttgtggt gacagtacat 180
ggagagattg accctgctac gggaatggtt atgaatctgg ctgatctcaa aaaatatatg 240
gaggaggcga ttatgcagcc ccttgatcat aagaatctgg atatggatgt gccatacttt 300
gcagatgtgg tgagcacgac tgaaaatgta gctgtttata tctgggacaa cctccagaaa 360
gttcttcctg taggagttct ttataaagta aaagtatacg aaactgacaa taatattgtg 420
gtttataaag gagaatag 438
<210> 11
<211> 783
<212> DNA
<213> gene
<220>
<221> gene
<222> (1)..(783)
<400> 11
atggaaggtg gtctgggtcg tgctgtttgt ctgctgactg gtgctagccg tggtttcggc 60
cgtaccctgg cacctctgct ggcatctctg ctgtctccag gcagcgtgct ggtactgagc 120
gctcgtaacg atgaagcact gcgtcagctg gaagccgaac tgggtgctga acgttctggt 180
ctgcgtgtcg ttcgtgtacc tgcagatctg ggtgctgaag ctggcctgca acagctgctg 240
ggtgctctgc gtgaactgcc gcgtccaaaa ggcctgcaac gtctgctgct gatcaacaac 300
gctggttccc tgggtgacgt ttccaaaggt ttcgtagacc tgtccgattc cactcaggtt 360
aacaattact gggctctgaa cctgaccagc atgctgtgtc tgaccagctc cgttctgaaa 420
gcattcccag attctccggg cctgaaccgt accgttgtga acatttccag cctgtgcgcg 480
ctgcagccgt tcaagggttg ggcactgtat tgcgcgggta aagcagcccg tgacatgctg 540
ttccaggttc tggcgctgga agaaccaaac gttcgtgttc tgaactatgc tccgggtcct 600
ctggacaccg atatgcagca gctggcgcgt gaaacctccg ttgatccgga catgcgcaag 660
ggtctgcaag aactgaaagc taaaggtaaa ctggttgatt gcaaagtatc tgctcagaaa 720
ctgctgagcc tgctggaaaa agacgaattc aagagcggtg ctcacgtgga cttttacgac 780
aag 783
<210> 12
<211> 315
<212> DNA
<213> gene
<220>
<221> gene
<222> (1)..(315)
<400> 12
atggctggta aagctcatcg tctgagcgcg gaagaacgtg atcagctgct gccaaacctg 60
cgtgcggttg gttggaacga actggaaggt cgtgatgcga tctttaaaca gtttcacttc 120
aaggatttta accgtgcttt cggtttcatg acccgtgtag cactgcaggc tgagaaactg 180
gaccaccacc cggaatggtt caacgtgtat aacaaagttc acatcactct gagcacccac 240
gaatgtgcag gcctgtctga acgtgacatc aacctggctt ctttcatcga acaggttgca 300
gtgtctatga cctag 315
<210> 13
<211> 735
<212> DNA
<213> gene
<220>
<221> gene
<222> (1)..(735)
<400> 13
atggcagcag ctgcagcagc aggtgaagct cgtcgtgttc tggtttacgg tggtcgtggt 60
gcgctgggtt ctcgttgtgt tcaggctttc cgcgctcgta actggtgggt agcttccgtg 120
gatgttgtag agaacgaaga ggcgtctgct tccatcatcg ttaaaatgac cgactctttc 180
acggaacaag cagatcaggt taccgcagaa gttggcaaac tgctgggcga agaaaaagtt 240
gacgctatcc tgtgtgttgc gggtggctgg gctggtggta acgcaaaatc taagtctctg 300
ttcaaaaact gcgatctgat gtggaaacag agcatctgga cttccacgat ctcctcccac 360
ctggcgacta aacacctgaa agaaggcggt ctgctgaccc tggctggtgc aaaagctgct 420
ctggacggca ctccgggtat gattggctat ggtatggcca aaggcgcagt acatcagctg 480
tgccaaagcc tggctggcaa aaactccggt atgccaccgg gtgcagccgc aattgcagtt 540
ctgccagtga ccctggatac cccgatgaac cgtaaaagca tgccggaagc tgatttctct 600
tcttggaccc cgctggaatt cctggttgaa actttccatg actggatcac cggcaaaaat 660
cgcccgtctt ccggttccct gattcaggtt gttactaccg aaggtcgtac tgaactgacc 720
ccggcatact tctag 735
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(23)
<400> 14
attgatggtc ttgaacaatt ggc 23
<210> 15
<211> 48
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(48)
<400> 15
gaagctgtcg tctttcatgc acattttact ggctcaataa cacgaatg 48
<210> 16
<211> 48
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(48)
<400> 16
cattcgtgtt attgagccag taaaatgtgc atgaaagacg acagcttc 48
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(23)
<400> 17
tcatgatgcc acctttagag gaa 23
<210> 18
<211> 56
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(56)
<400> 18
agtcctaggt ataatactag tcactcgcgc ttatcgtgaa ggttttagag ctagaa 56
<210> 19
<211> 56
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(56)
<400> 19
ttctagctct aaaaccttca cgataagcgc gagtgactag tattatacct aggact 56
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(20)
<400> 20
acaacaactg gcgggcaaac 20
<210> 21
<211> 36
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(36)
<400> 21
ttgtgaatta tctccgccga gacagaactt aatggg 36
<210> 22
<211> 32
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(32)
<400> 22
atactgtgcc ggggcgagtt gcgtgactac ct 32
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(20)
<400> 23
cacagcggat ggttcggata 20
<210> 24
<211> 37
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(37)
<400> 24
gttctgtctc ggcggagata attcacaagt gtgcgct 37
<210> 25
<211> 41
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(41)
<400> 25
ttaatcgtgt tcatttagtg cctcttccag ttagtaaatc c 41
<210> 26
<211> 42
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(42)
<400> 26
actggaagag gcactaaatg aacacgatta acatcgctaa ga 42
<210> 27
<211> 33
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(33)
<400> 27
cgcaactcgc cccggcacag tatcaaggta ttt 33
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(23)
<400> 28
ttctgtctgc tgcgcgagga act 23
<210> 29
<211> 68
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(68)
<400> 29
cctagaagaa atcaaccagc gcatcagaaa gtctcctgtg cattgtcgat acccttttta 60
cgtgaact 68
<210> 30
<211> 68
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(68)
<400> 30
tgcgctggtt gatttcttct agggtcatag taatccagca actatggctg acattctgct 60
gctcgata 68
<210> 31
<211> 22
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(22)
<400> 31
gttccagcag gcgagcgccc tg 22
<210> 32
<211> 56
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(56)
<400> 32
agtcctaggt ataatactag tctcgaactg ctaacctgcg agttttagag ctagaa 56
<210> 33
<211> 56
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(56)
<400> 33
ttctagctct aaaactcgca ggttagcagt tcgagactag tattatacct aggact 56
<210> 34
<211> 50
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(50)
<400> 34
tacgagccgg atgattaatt gtcaatgtcg ataccctttt tacgtgaact 50
<210> 35
<211> 50
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(50)
<400> 35
agttcacgta aaaagggtat cgacattgac aattaatcat ccggctcgta 50
<210> 36
<211> 50
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(50)
<400> 36
tatcgagcag cagaatgtca gccattcaga aagtctcctg tgcatgatgc 50
<210> 37
<211> 50
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(50)
<400> 37
gcatcatgca caggagactt tctgaatggc tgacattctg ctgctcgata 50
<210> 38
<211> 56
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(56)
<400> 38
agtcctaggt ataatactag ttgcgctggt tgatttcttc tgttttagag ctagaa 56
<210> 39
<211> 55
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(55)
<400> 39
ttctagctct aaaacagaag aaatcaacca gcgcaactag tattatacct aggat 55
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(21)
<400> 40
gtgctggagg gatgattgtt g 21
<210> 41
<211> 45
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(45)
<400> 41
tacgagccgg atgattaatt gtcaacgcag tacttcctgc tggct 45
<210> 42
<211> 45
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(45)
<400> 42
agccagcagg aagtactgcg ttgacaatta atcatccggc tcgta 45
<210> 43
<211> 38
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(38)
<400> 43
ggtatatctc cttttacccg cgacgcgctt ttactgca 38
<210> 44
<211> 38
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(38)
<400> 44
aaggagatat accatggcaa aggtatcgct ggagaaag 38
<210> 45
<211> 47
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(47)
<400> 45
tatagtgaac gccggtaatt cgttagtaca gcagacgggc gcgaatg 47
<210> 46
<211> 47
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(47)
<400> 46
cattcgcgcc cgtctgctgt actaacgaat taccggcgtt cactata 47
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(20)
<400> 47
tcacctccac cagcacatcc 20
<210> 48
<211> 56
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(56)
<400> 48
agtcctaggt ataatactag tttgtaatga gcctcatctt cgttttagag ctagaa 56
<210> 49
<211> 56
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(56)
<400> 49
ttctagctct aaaacgaaga tgaggctcat tacaaactag tattatacct aggact 56
<210> 50
<211> 21
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(21)
<400> 50
agccgtttgc gtctgtttaa g 21
<210> 51
<211> 42
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(42)
<400> 51
actcagacca tattcccgca acgggcactt cggcgtaaag at 42
<210> 52
<211> 42
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(42)
<400> 52
atctttacgc cgaagtgccc gttgcgggaa tatggtctga gt 42
<210> 53
<211> 22
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(22)
<400> 53
agtgctgaac attttcccga gt 22
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(20)
<400> 54
gcctggtaca gcgacccata 20
<210> 55
<211> 42
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(42)
<400> 55
cgcgtcttat catgcctacc tgctgaatag ggtgattgtt gg 42
<210> 56
<211> 42
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(42)
<400> 56
ccaacaatca ccctattcag caggtaggca tgataagacg cg 42
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(20)
<400> 57
gaccaccaat cccgctaaaa 20
<210> 58
<211> 56
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(56)
<400> 58
agtcctaggt ataatactag tctcgatcta ctcgtgctaa ggttttagag ctagaa 56
<210> 59
<211> 56
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(56)
<400> 59
ttctagctct aaaaccttag cacgagtaga tcgagactag tattatacct aggact 56
<210> 60
<211> 56
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(56)
<400> 60
agtcctaggt ataatactag tgatggcaga acagcgtcac cgttttagag ctagaa 56
<210> 61
<211> 56
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(56)
<400> 61
ttctagctct aaaacggtga cgctgttctg ccatcactag tattatacct aggact 56
<210> 62
<211> 22
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(22)
<400> 62
gagcaggtat ttacgtgaac cg 22
<210> 63
<211> 78
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(78)
<400> 63
ttatccgctc acaattccac acattatacg agccggatga ttaattgtca aagtcatagt 60
aatccagcaa ctcttgtg 78
<210> 64
<211> 78
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(78)
<400> 64
cgtataatgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacag accatgaaag 60
aagttaataa agagcaaa 78
<210> 65
<211> 75
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(75)
<400> 65
acagataaaa cgaaaggccc agtctttcga ctgagccttt cgttttattt gctagaagta 60
tgccggggtc agttc 75
<210> 66
<211> 84
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(84)
<400> 66
agactgggcc tttcgtttta tctgttgttt gtcggtgaac gctctcctga gtaggacaaa 60
tgattgaagc gcctttacta ctcc 84
<210> 67
<211> 21
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(21)
<400> 67
gcgcaacgta gaacaggaat t 21
<210> 68
<211> 22
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(22)
<400> 68
acatactcaa gccccatacg ct 22
<210> 69
<211> 22
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(22)
<400> 69
cgtagcaggg tcaatctctc ca 22
<210> 70
<211> 56
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(56)
<400> 70
agtcctaggt ataatactag tggtgcctga cgaccataaa agttttagag ctagaa 56
<210> 71
<211> 56
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(56)
<400> 71
ttctagctct aaaactttta tggtcgtcag gcaccactag tattatacct aggact 56
<210> 72
<211> 56
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(56)
<400> 72
agtcctaggt ataatactag tgcgtgatgt gaatgagaaa agttttagag ctagaa 56
<210> 73
<211> 56
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(56)
<400> 73
ttctagctct aaaacttttc tcattcacat cacgcactag tattatacct aggact 56
<210> 74
<211> 20
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(20)
<400> 74
gggaagggat ctgcgccacc 20
<210> 75
<211> 68
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(68)
<400> 75
ttcttaaagt taaacaaaat tatttctaga ccctatagtg agtcgtatta cacggtggca 60
ggttttgg 68
<210> 76
<211> 68
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(68)
<400> 76
tagggtctag aaataatttt gtttaacttt aagaaggaga tatacatggt tccgtggttt 60
cctcgcaa 68
<210> 77
<211> 60
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(60)
<400> 77
agacccgttt agaggcccca aggggttatg ctagttaaac gttttcgatg gaacgagtat 60
<210> 78
<211> 55
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(55)
<400> 78
tggggcctct aaacgggtct tgaggggttt tttggaccaa aagtgcgtcc gatac 55
<210> 79
<211> 22
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(22)
<400> 79
gtgacaacgg ttcaatgcgc ga 22

Claims (9)

1.一种用于产生5-羟基色氨酸的基因工程菌，其特征在于：命名为E.coli HTP10，为经人工改造的、具有特定基因型的大肠杆菌，是由野生型大肠杆菌经下述方法改造得到的：敲除tnaA基因以阻止色氨酸及5-羟基色氨酸的分解代谢；在其基因组的lacIZ位点上整合了由木糖启动子PxylF控制的T7RNAP基因，在失活lacI蛋白的同时使细胞可以利用木糖诱导产生RNA聚合酶T7RNAP；用解除反馈抑制的突变体trpEfbr基因替换大肠杆菌原有的trpE基因，并用Ptrc启动子引导色氨酸操纵子的表达，以强化分支酸途径；将解除反馈抑制的突变体aroGfbr基因serAfbr基因串联整合至大肠杆菌基因组的yjiV位点，并用Ptrc启动子引导表达，以强化莽草酸途径和丝氨酸合成途径；敲除tyrR基因及trpR基因，以实现负转录调控蛋白TyrR和TrpR的缺失；在其基因组mbhA位点整合了由T7启动子引导表达的编码人源2型色氨酸羟基化酶短截突变体的TPH150基因，以构建胞内色氨酸羟基化途径；将来源于枯草芽孢杆菌的mtrA基因和来源于人类的PTPS基因、SPR基因、PCD基因和DHPR基因，串联整合至大肠杆菌基因组yghX位点处，以引入辅酶四氢蝶呤的合成途径与再生途径，其中mtrA基因、PTPS基因、SPR基因由同一个Ptrc启动子引导表达，PCD基因、DHPR基因由同一个Ptrc启动子引导表达；其中，
所述野生型大肠杆菌为E.coli W3110，保藏号ATCC 27325；
所述木糖启动子PxylF具有序列表SEQ ID NO.SEQ ID NO.1所示核苷酸序列；
所述RNA聚合酶T7RNAP具有序列表SEQ ID NO.2所示核苷酸序列；
所述trpEfbr基因具有序列表SEQ ID NO.3所示核苷酸序列；
所述Ptrc启动子，具有序列表SEQ ID NO.4所示核苷酸序列；
所述aroGfbr基因具有序列表SEQ ID NO.5所示核苷酸序列；
所述serAfbr基因具有序列表SEQ ID NO.6所示核苷酸序列；
所述强启动子PT7启动子具有序列表SEQ ID NO.7所示核苷酸序列；
所述编码人源2型色氨酸羟基化酶短截突变体的TPH150基因具有序列表SEQ ID NO.8所示核苷酸序列；
所述mtrA基因来源于枯草芽孢杆菌，负责编码GTP环化水解酶Ⅰ，具有序列表SEQ IDNO.9所示核苷酸序列；
所述人源PTPS基因，负责编码6-丙酮酰四氢生物蝶呤合成酶，具有序列表SEQ IDNO.10所示核苷酸序列；
所述人源SPR基因，负责编码鸟蝶呤还原酶，具有序列表SEQ ID NO.11所示核苷酸序列；
所述人源PCD基因，负责编码蝶呤-4α-甲醇氨脱水酶，具有序列表SEQ ID NO.12所示核苷酸序列；
所述人源DHPR基因，负责编码双氢蝶呤还原酶，具有序列表SEQ ID NO.13所示核苷酸序列。
2.一种用于产生5-羟基色氨酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于：采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术对野生型大肠杆菌进行定向改造，构建重组片段和pGRB质粒，所述构建重组片段包括构建基因整合的重组片段或者构建基因敲除的重组片段；所述pGRB质粒的构建包括：设计靶序列，制备包含靶序列的DNA片段，将包含靶序列的DNA片段与线性化的载体片段重组；将pGRB质粒和上述重组片段同时转化至含有pREDCas9的电转感受态细胞中，还包括质粒消除的步骤，获得重组的基因工程菌株。
3.根据权利要求2所述的用于产生5-羟基色氨酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于：所述构建基因整合的重组片段的步骤包括：以出发菌株的基因组为模板，根据目的基因拟插入位点的上下游序列设计上下游同源臂引物，并根据目的基因组设计引物，扩增目的基因片段，再通过PCR重叠技术获得重组片段。
4.根据权利要求2所述的用于产生5-羟基色氨酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于：所述构建基因敲除的重组片段的步骤包括：以待敲除基因的上下游序列为模板，设计上下游同源臂引物；通过PCR的方法分别扩增上下游同源臂，再经过重叠PCR制备重组片段。
5.根据权利要求2所述的用于产生5-羟基色氨酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于：具体步骤如下：
(1)为了阻断色氨酸及5-羟基色氨酸分解代谢途径，将编码色氨酸酶的tnaA基因敲除；
(2)在野生型大肠杆菌基因组上，将来源于T7噬菌体的RNA聚合酶基因整合在lacIZ基因位点；
(3)为了解除前导肽对色氨酸操纵子的弱化作用，消除关键酶邻氨基苯甲酸合成酶的反馈抑制作用，强化色酸操纵子合成酶系，将色氨酸操纵子中的trpLE基因替换为Ptrc-trpEfbr基因；
(4)为了强化莽草酸途径和丝氨酸合成途径，同时提高L-丝氨酸的供应，加强3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶及磷酸甘油酸脱氢酶的表达，引入有利突变aroGfbr、serAfbr，并将二者串联整合至大肠杆菌基因组的yjiV位点，用Ptrc启动子控制转录；
(5)为了解除阻遏蛋白TyrR和TrpR对关键酶的反馈阻遏，将大肠杆菌基因组中对应的编码基因tyrR、tyrR敲除；
(6)为了引入辅酶四氢蝶呤的合成途径与再生途径，实现BH4的内源供应，将来源于枯草芽孢杆菌的mtrA基因和来源于人类的PTPS、SPR、PCD和DHPR基因，串联整合至大肠杆菌基因组yghX位点处，其中mtrA、PTPS、SPR由同一个Ptrc启动子引导表达，PCD、DHPR由同一个Ptrc启动子引导表达；
(7)为了实现色氨酸羟基化酶的高效表达，打通色氨酸羟基化途径，在基因组mbhA位点整合了由PT7启动子引导表达的人源2型色氨酸羟基化酶短截突变体TPH150基因。
6.权利要求1所述基因工程菌在发酵生产5-羟基色氨酸方面的应用。
7.根据权利要求7所述的基因工程菌的应用，其特征在于：所述基因工程菌株能够过度产生或积累5-羟基色氨酸是通过以下改造实现的：
(1)敲除了编码色氨酸酶的tnaA基因；
(2)用解除反馈抑制的邻氨基苯甲酸合成酶突变体trpEfbr基因替换了原有的trpLE基因，并用Ptrc启动子启动；
(3)在基因组yjiV位点串联整合了酶解除反馈抑制的3-脱氧-σ-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶突变体基因aroGfbr和磷酸甘油酸脱氢酶突变体基因serAfbr基因，并用Ptrc启动子启动；
(4)敲除了编码阻遏蛋白TyrR、TrpR的tyrR、trpR基因。
(5)在基因组yghX位点处串联整合了四氢蝶呤的合成途径与再生途径酶系的相关基因(mtrA、PTPS、SPR基因和PCD、DHPR基因)，实现BH4的内源供应，其中mtrA、PTPS、SPR由同一个Ptrc启动子引导表达，PCD、DHPR由同一个Ptrc启动子引导表达；
(6)在基因组lacIZ位点上整合了来源于T7噬菌体的RNA聚合酶基因；
(7)在基因组mbhA位点整合了由PT7启动子引导表达的人源2型色氨酸羟基化酶短截突变体TPH150基因。
8.根据权利要求6所述的基因工程菌的应用，其特征在于：具体方法为：摇瓶发酵，将菌种活化后制备种子液，按10-15％接种量接种到三角瓶中，九层纱布封口，37℃，220r/min振荡培养，发酵过程中通过补加氨水维持pH在7.0-7.2；补加质量体积比为60％的葡萄糖溶液维持发酵进行，发酵液颜色不再变化时即视为缺糖，缺糖时补加1-2mL质量体积比为60％的葡萄糖溶液，发酵初始添加质量体积比为60％的木糖溶液诱导目的基因表达，发酵周期22-26h。
9.根据权利要求8所述的基因工程菌的应用，其特征在于：具所述摇瓶发酵中采用的发酵培养基组成为：葡萄糖20-40g/L，酵母浸出粉2-5g/L，硫酸铵1-5g/L，磷酸二氢钾1-5g/L，无水硫酸镁0.5-2g/L，七水硫酸亚铁30-60mg/L，一水硫酸锰20-40mg/L，VH 0.1-0.5mg/L，VB1 0.5-1mg/L，微量元素混合液1-2mg/L，苯酚红：需定容体积的2％，用氢氧化钠调pH至7.0-7.2，高压蒸汽锅灭菌115℃，15min。
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