CN110468092B - 一株高产l-缬氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一株通过改造大肠杆菌的代谢途径构建的高产L‑缬氨酸的基因工程菌，从大肠杆菌W3110出发，在其基因组上整合了枯草芽孢杆菌乙酰乳酸合酶的编码基因alsS并使其强表达；并在基因组上整合了大肠杆菌ppGpp 3′‑焦磷酸水解酶突变体[R290E，K292D]的编码基因spoT并使其强表达；还敲除了硫胺磷酸合酶的编码基因thiE，构建基因工程菌。本发明解决了L‑缬氨酸合成代谢流偏弱、关键前体物丙酮酸供应不足导致L‑缬氨酸产率较低的问题。

Description

一株高产L-缬氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于微生物领域和分子生物学领域，其中涉及一株高产L-缬氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

L-缬氨酸属于支链氨基酸，是一种人体必需氨基酸。L-缬氨酸在医学、食品及饲料领域有广泛的应用，具有很高的商业价值。L-缬氨酸在医学方面可以用作抗肿瘤药物，在食品方面可以用作食品添加剂。另外L-缬氨酸已经成为一种重要的饲料用氨基酸。

目前L-缬氨酸的生产方法主要采用以葡萄糖为原料的微生物发酵法。L-缬氨酸合成支路途径从丙酮酸开始，经过以下几步反应形成L-缬氨酸。丙酮酸在乙酰乳酸合酶催化下形成α-乙酰乳酸，α-乙酰乳酸在二羧酸还原异构酶的催化下形成α、β-二羟基异戊酸，该产物经二羟酸脱水酶催化后形成α-乙酰异戊酸，α-乙酰异戊酸在转氨酶作用下形成L-缬氨酸。

系统代谢工程作为一种菌株改良和工艺优化方法，已成功应用于包括L-缬氨酸在内的多种氨基酸代谢育种。在L-缬氨酸产生菌的育种中，谷氨酸棒杆菌是最常见的出发菌株之一。2013年，Hasegawa S等通过重构谷氨酸棒杆菌L-缬氨酸代谢途径，构建了L-缬氨酸生产菌。首先通过化学诱变，选育了突变的关键酶——乙酰乳酸合酶AHAS(G156E)，解除了L-缬氨酸的反馈抑制。随后将L-缬氨酸合成途径中，两步需要以NADPH为辅酶的代谢酶通过点突变和基因替换的方式转变为以NADH为辅酶，平衡了细胞代谢的辅酶需求。该菌株可通过好氧生长结合厌氧代谢的双阶段发酵模式实现L-缬氨酸的积累。虽然这种发酵方式的L-缬氨酸产率高，但该菌株在发酵前期要进行细胞悬液培养、细胞浓缩，对发酵设备要求较高，并且整个发酵过程较复杂，发酵周期较长。

大肠杆菌具有遗传背景清晰，操作较简单等优点，也是一种主要的工业微生物，但应用于L-缬氨酸生产的研究较少。大肠杆菌生产L-缬氨酸的乙酰乳酸合酶有三个同工酶(AHASⅠ、Ⅱ、Ⅲ)，分别由基因ilvBN、ilvGM和ilvIH编码，AHAS受L-缬氨酸的反馈抑制，若不及时把胞内L-缬氨酸运输到胞外，会影响L-缬氨酸合成。2007年，Park JH等在大肠杆菌W3110中引入了突变的AHASⅢ，解除了L-缬氨酸的反馈抑制。随后，过表达了全局调控因子Lrp和转运蛋白YgaZH，构建的菌株可以产生L-缬氨酸7.61g/L。2011年，Park JH等在大肠杆菌W中过表达基因ilvBN^mut、ilvCDE、ygaZH和lrp，L-缬氨酸产量达到60.7g/L。这是目前通过基因工程方法改造大肠杆菌生产L-缬氨酸的最高产量，但与谷氨酸棒杆菌发酵相比，L-缬氨酸合成效率仍较低，不能满足日益增长的市场需求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于现有技术中L-缬氨酸合成代谢流偏弱、关键前体物丙酮酸供应不足导致L-缬氨酸产率较低。

为解决上述技术问题，本发明提供一株通过改造大肠杆菌的代谢途径构建的高产L-缬氨酸的基因工程菌。

本发明的技术方案概述如下：

从大肠杆菌W3110出发，在其基因组上整合了枯草芽孢杆菌乙酰乳酸合酶(NCBI-Protein ID:NP_391482.2)的编码基因alsS并使其强表达；并在其基因组上整合了大肠杆菌ppGpp 3′-焦磷酸水解酶(NCBI-Protein ID:BAE77643)突变体[R290E，K292D]的编码基因spoT并使其强表达；并敲除其基因组上硫胺磷酸合酶(NCBI-Protein ID:BAE77326.1)的编码基因thiE，构建基因工程菌。

其中突变体的标识：ppGpp 3′-焦磷酸水解酶突变体[R290E，K292D]，表示第290位和第292位的氨基酸都发生了突变，第290位的精氨酸(R)替换成谷氨酸(E)，并且第292位的赖氨酸(K)替换成天冬氨酸(D)，位置的编号对应于NCBI-Protein ID:NP_391482.2中ppGpp3′-焦磷酸水解酶的氨基酸序列编号。

进一步地，本发明可以通过构建强启动子实现目的基因的强表达。

作为本发明一种较佳实施方式，所述乙酰乳酸合酶编码基因alsS整合在假基因ydeU位点，并由启动子P_trc启动。

作为本发明一种较佳实施方式，所述ppGpp 3′-焦磷酸水解酶突变体[R290E，K292D]的编码基因spoT整合在假基因yeeP位点，并由启动子P_trc启动。

作为本发明一种较佳实施方式，所述基因工程菌的构建方法采用CRISPR/Cas 9介导的基因编辑技术，包括如下步骤：

(1)以大肠杆菌W3110出发，构建启动子P_trc与乙酰乳酸合酶编码基因alsS的连接片段P_trc-alsS，并将其整合在假基因ydeU位点；

(2)构建启动子P_trc与ppGpp 3′-焦磷酸水解酶突变体[R290E，K292D]的编码基因spoT的连接片段，并将其整合在假基因yeeP位点。

(3)敲除基因组上硫胺磷酸合酶的编码基因thiE，构建基因工程菌。

有益效果：

本发明提供了一种L-缬氨酸工程菌构建的新思路。大肠杆菌L-缬氨酸合成的关键酶乙酰乳酸合酶活力不足，且受到产物L-缬氨酸的反馈抑制。本发明研究发现，引入枯草芽孢杆菌中天然的乙酰乳酸合酶效果最好，该酶对高浓度L-缬氨酸不敏感，因此可以显著增强L-缬氨酸合成支路代谢流。丙酮酸是L-缬氨酸的直接前体物，丙酮酸的供应直接决定L-缬氨酸的产率。本发明研究发现，增强ppGpp 3′-焦磷酸水解酶突变体[R290E，K292D]的表达，可以调整中心代谢流量，增强丙酮酸胞内含量，从而提高L-缬氨酸合成。胞内的丙酮酸主要的分解代谢是通过丙酮酸脱氢酶作用生产乙酰辅酶A，敲除丙酮酸脱氢酶或者通过突变降低丙酮酸脱氢酶活性，可以减少丙酮酸分解，但会严重影响细胞的生长。丙酮酸脱氢酶的辅酶是V_B1，本发明通过敲除硫胺磷酸合酶基因thiE，阻断大肠杆菌自身的V_B1合成。通过在培养基中加入适量V_B1进行发酵，添加的V_B1可维持细胞适度生长。随着发酵的进行，V_B1含量逐渐降低，降低了丙酮酸脱氢酶的活力，减少丙酮酸的分解代谢，从而提高L-缬氨酸的合成。

附图说明

图1：P_trc-alsS整合片段的构建及验证电泳图。M：Marker，1：ydeU上游同源臂，2：alsS目的片段3：ydeU下游同源臂，4：整合目的片段，5：阴性对照，6：整合后鉴定片段。

图2：P_trc-spoT整合片段的构建及验证电泳图。M：Marker，1：yeeP上游同源臂，2：spoT目的片段，3：yeeP下游同源臂，4：重叠片段5：阴性对照6：整合后鉴定片段。

图3：thiE基因敲除片段的构建及验证电泳图。M：Marker，1：thiE上游同源臂2：thiE下游同源臂4：重叠片段5：阴性对照6：敲除后鉴定片段。

图4：菌株VHY03发酵罐发酵过程曲线图。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

实施例1：

构建L-缬氨酸高效生产菌株VHY01、VHY02、VHY03，采用的基因编辑方法参照文献(Li Y,Lin Z,Huang C,et al.Metabolic engineering of Escherichia coli usingCRISPR–Cas9 meditated genome editing.Metabolic engineering,2015,31:13-21.)，进行具体方法如下：

1乙酰乳酸合酶编码基因alsS整合至假基因位点ydeU，构建菌株VHY01

1.1重组DNA片段的制备

将alsS基因整合至ydeU假基因位点。以枯草芽孢杆菌B.subtilis 168基因组为模板，通过PCR扩增得到基因alsS(SEQ ID NO：1)；以大肠杆菌W3110基因组为模板，扩增ydeU上下游同源臂片段(引物UP-ydeU-S、UP-ydeU-A、DN-ydeU-S、DN-ydeU-A)；启动子P_trc设计在上游同源臂的下游引物和alsS基因的上游引物中。分别以上下游同源臂及目的基因alsS为模板进行重叠PCR得到整合片段P_trc-alsS(引物P_trc-alsS-S、P_trc-alsS-A)。整合片段P_trc-alsS的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图1。PCR反应条件(宝生物PrimeSTAR HS酶)：预变性(95℃)5min；30个循环：变性(98℃)10s，退火15s；72℃延伸10min；降温维持(4℃)。利用重叠PCR将上游同源臂UP-ydeU、大肠杆菌P_trc启动子、目的片段alsS、下游同源臂DN-ydeU连接，PCR扩增及重叠PCR体系如下表所示。

PCR扩增体系

重叠PCR扩增体系

1.2构建gRNA质粒

构建gRNA质粒的目的是为了使Cas9蛋白与tracrRNA的复合体通过碱基配对和PAM识别目的基因靶位点，实现目的DNA双链断裂。使用CRISPR RGEN Tools设计靶序列。质粒pGRB-ydeU中的靶序列DNA片段通过引物gRNA-ydeU-S和gRNA-ydeU-A的退火制得。反应条件：预变性95℃，5min；退火30-50℃，1min。退火体系如下：

退火体系

将含靶序列的DNA片段与线性化载体pGRB同源重组。重组体系如下表。所用重组酶均为

II One Step Cloning Kit系列的酶，重组条件：37℃，30min。

重组体系

取全部重组体系均匀加入到100μL DH5α化转感受态细胞中，冰浴30min，42℃热击90s后，加入900μL复苏液，37℃复苏1h。8000rmp离心2min，弃部分上清，留100μL左右菌体重悬后，均匀涂布到含氨苄青霉素的平板，37℃过夜培养。待平板长出单菌落后通过菌落PCR鉴定，挑选阳性重组子，提取质粒，通过酶切鉴定。

1.3质粒和重组DNA片段的电转化

将pGRB-ydeU质粒和供体P_trc-alsS片段同时电转化至含有pREDCas9的电转感受态中。将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养。用鉴定引物(ydeU-鉴定-S、ydeU-鉴定-A)进行菌落PCR，筛选阳性重组子。

1.4质粒的消除

gRNA质粒的消除：将阳性重组子置于含有0.2％阿拉伯糖的LB培养基过夜培养，再用接种环于含奇霉素抗性LB平板上划三区，挑选单菌落分别对点含有氨苄青霉素和奇霉素的LB平板，挑选氨苄青霉素平板不长，奇霉素抗性平板生长的单菌落。

PREDCas9质粒的消除：将阳性重组子转接到无抗性的LB液体培养基中，42℃过夜培养，再用接种环于无抗性LB平板上划三区，挑选单菌落分别对点含有奇霉素和无抗性的LB平板，挑选奇霉素平板不长，无抗性平板生长的单菌落。

2基因spoT整合至假基因yeeP位点，构建菌株VHY02

2.1突变基因spoT的制备

利用引物设计软件primer5，以大肠杆菌W3110基因组为模板，将突变点设计在第一个片段下游引物中，扩增突变体spoT基因(SEQ ID NO：2)分为两段分别扩增(引物UP-spoT-S、UP-spoT-A、DN-spoT-S、DN-spoT-A)，再以这两个片段为模板进行重叠PCR得到spoT突变基因(引物UP-spoT-S、DN-spoT-A)。

2.2重组DNA片段的制备

以大肠杆菌W3110基因组为模板，扩增yeeP上下游同源臂片段(引物UP-yeeP-S、UP-yeeP-A、DN-yeeP-S、DN-yeeP-A)启动子P_trc设计在上游同源臂的下游引物和spoT基因的上游引物中。再分别以上下游同源臂及目的基因spoT突变基因为模板进行重叠PCR(引物P_trc-spoT-S、P_trc-spoT-A)。整合片段P_trc-spoT的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图2。PCR扩增及重叠体系与1.1相同。

2.3构建gRNA质粒

质粒pGRB-yeeP中的靶序列DNA片段通过引物gRNA-yeeP-S和gRNA-yeeP-A的退火制得，构建方法与1.2相同。

2.4质粒和重组DNA片段的电转化

将pGRB-yeeP质粒和供体P_trc-spoT片段同时电转化至含有pREDCas9的电转感受态中。将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养。以重叠片段上游同源臂上游引物和下游同源臂下游引物为鉴定引物，进行菌落PCR，筛选阳性重组子。

2.5质粒的消除

方法同1.4所述。

3基因thiE的敲除，构建菌株VHY03

3.1重组DNA片段的制备

以大肠杆菌W3110基因组为模板，根据其基因thiE(SEQ ID NO：3)的上下游序列设计上游同源臂引物(UP-thiE-S、UP-thiE-A)和下游同源臂引物(DN-thiE-S、DN-thiE-A)，并PCR扩增其上下游同源臂片段。再以上下游同源臂为模板进行重叠PCR获得基因thiE的敲除片段(上游同源臂-下游同源臂)。敲除片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图3。PCR扩增及重叠体系与1.1相同。

3.2构建gRNA质粒

质粒pGRB-thiE中的靶序列DNA片段通过引物gRNA-thiE-S和gRNA-thiE-A的退火制得，构建方法与1.2相同。

3.3质粒和重组DNA片段的电转化

将pGRB-thiE质粒和供体thiE片段共电转化至含有P_trc-alsS、P_trc-spoT的电转感受态中。将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养。将重叠片段上游同源臂上游引物和下游同源臂下游引物当做鉴定引物，用鉴定引物进行菌落PCR，筛选阳性重组子，保菌。

3.4质粒的消除

方法同1.4所述。

4上述菌株构建过程涉及的引物见下表

实施例2：

利用基因工程菌VHY01、VHY02、VHY03发酵生产L-缬氨酸的方法如下：

(1)菌株VHY01、VHY02、VHY03摇瓶发酵：

斜面培养：取-80℃保藏菌种划线接种于活化斜面，37℃培养12h，并传代两次；

摇瓶种子培养：用接种环刮取两环斜面种子接种于装有30mL种子培养基的500mL三角瓶中，37℃，200rpm培养8-10h；

摇瓶发酵培养：按10-15％接种量接种到装有发酵培养基的500mL三角瓶中(终体积为30mL)，37℃，200r/min振荡培养，发酵过程中通过补加氨水维持pH在6.7-7.0；补加60％(m/v)葡萄糖溶液维持发酵进行；

斜面培养基组成为：葡萄糖5g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，NaCl2.5g/L，琼脂21-25g/L，pH 7.0-7.2；

种子培养基组成为：葡萄糖18g/L，酵母粉1％，蛋白胨0.6％，KH₂PO₄ 0.12％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，FeSO₄·7H₂O 10mg/L，MnSO₄·H₂O 10mg/L，V_B1 1.3mg/L，V_H 0.3mg/L，苯酚红20ml/L，消泡剂两滴，pH 7.0-7.2；

发酵培养基组成为：葡萄糖18g/L，酵母粉1g/L，蛋白胨2g/L，KH₂PO₄ 2g/L，柠檬酸钠1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.7g/L，FeSO₄·7H₂O 100mg/L，MnSO₄·H₂O 100mg/L，V_B1 0.8mg/L，V_H0.3mg/L，苯酚红20mL/L，消泡剂两滴，pH 7.0-7.2；

摇瓶发酵24h后，菌株VHY03 L-缬氨酸的产量可达40g/L。

(2)菌株VHY03发酵罐发酵：

将菌种在斜面上活化两代，按照15-20％接种量接入发酵培养基，开始发酵，发酵过程中控制pH稳定在6.7左右，温度维持在35℃，控制溶氧在25-30％之间；当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加80％(m/v)的葡萄糖溶液，维持发酵培养基中的葡萄糖浓度在0.1-5g/L。

种子培养基组成为：葡萄糖60-90g/L，酵母粉5g/L，K₂HPO₄ 4g/L，(NH₄)₂SO₄ 2.5g/L，柠檬酸2g/L，MgSO₄·7H₂O 1.5g/L，V_B1、V_B3、V_B5、V_B12、V_H各1-3mg/L，FeSO₄·7H₂O 2.8mg/L，MnSO₄ 1.2mg/L。

发酵培养基组成为：葡萄糖30g/L，酵母粉2g/L，K₂HPO₄ 7g/L，(NH₄)₂SO₄ 3g/L，柠檬酸2g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，蛋氨酸1g/L，FeSO₄·7H₂O 30mg/L，MnSO₄ 10mg/L，V_B1、VB₃、VB₅、VB₁₂、V_H各1mg/L，pH 6.5-7.0。

在5L发酵罐中培养48h后，L-缬氨酸的积累量达到115g/L，生产强度为2.4g/L/h。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一株高产L-缬氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用

<141> 2019-08-26

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1713

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<400> 1

ttgacaaaag caacaaaaga acaaaaatcc cttgtgaaaa acagaggggc ggagcttgtt 60

gttgattgct tagtggagca aggtgtcaca catgtatttg gcattccagg tgcaaaaatt 120

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<210> 2

<211> 2109

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 2

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<213> Escherichia coli

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tatggcgtcc atttggggca ggaagatttg caagccaccg atctcaatgc catccgcgcg 300

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cagttgctgg aaattgcagg agttggcg 628

Claims (5)

1.一株高产L-缬氨酸的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是在大肠杆菌（Escherichia coli ） W3110的基因组上整合了强表达的枯草芽孢杆菌乙酰乳酸合酶的编码基因alsS，和强表达的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的大肠杆菌ppGpp 3′-焦磷酸水解酶突变体R290E、K292D的编码基因spoT，并敲除大肠杆菌W3110基因组上硫胺磷酸合酶的编码基因thiE获得。

2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述乙酰乳酸合酶编码基因alsS整合在假基因ydeU位点，并由启动子P_trc启动；所述核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的ppGpp 3′-焦磷酸水解酶突变体R290E、K292D的编码基因spoT整合在假基因yeeP位点，并由启动子P_trc启动。

3.权利要求1或2所述基因工程菌用于发酵生产L-缬氨酸的用途，其特征在于，利用所述基因工程菌进行摇瓶发酵：

将菌种活化后制备种子液，按10-15%接种量接种到装有发酵培养基的三角瓶中，37℃，200 r/min振荡培养，发酵过程中通过补加氨水维持pH在6.7-7.0；补加60% m/v葡萄糖溶液维持发酵进行；

所述发酵培养基组成为：葡萄糖 18 g/L，酵母粉 1 g/L，蛋白胨 2 g/L，KH₂PO₄ 2 g/L，柠檬酸钠 1 g/L，MgSO₄•7H₂O 0.7 g/L，FeSO₄•7H₂O 100 mg/L，MnSO₄•H₂O 100 mg/L，V_B1 0.8mg/L，V_H 0.3 mg/L，苯酚红20 mL/L，消泡剂两滴，pH 7.0-7.2。

4.权利要求1或2所述基因工程菌用于发酵生产L-缬氨酸的用途，其特征在于，利用所述基因工程菌进行发酵罐发酵：

将菌种活化后制备种子液，按照15-20%接种量接入发酵培养基，开始发酵，发酵过程中控制pH稳定在6.7左右，温度维持在35℃，控制溶氧在25-30%之间；当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加80% m/v的葡萄糖溶液，维持发酵培养基中的葡萄糖浓度在0.1-5 g/L；

所述发酵培养基组成为：葡萄糖 30 g/L，酵母粉2 g/L，K₂HPO₄ 7 g/L，（NH₄）₂SO₄ 3 g/L，柠檬酸 2 g/L，MgSO₄•7H₂O 1 g/L，蛋氨酸 1 g/L，FeSO₄•7H₂O 30 mg/L，MnSO₄ 10 mg/L，V_B1、VB₃、VB₅、VB₁₂、V_H各1 mg/L，pH 6.5-7.0。

5.一种高产L-缬氨酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述方法是采用CRISPR/Cas 9介导的基因编辑技术，包括如下步骤：

（1）以大肠杆菌W3110出发，在大肠杆菌W3110的假基因ydeU位点整合了启动子P_trc与乙酰乳酸合酶编码基因alsS的连接片段P_trc-alsS；

（2）在大肠杆菌W3110的假基因yeeP位点整合了启动子P_trc与核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的ppGpp 3′-焦磷酸水解酶突变体R290E、K292D的编码基因spoT的连接片段；

（3）敲除大肠杆菌W3110基因组上硫胺磷酸合酶的编码基因thiE，获得基因工程菌。

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