CN106701649B

CN106701649B - 生产l-谷氨酰胺的菌株和生产l-谷氨酰胺的方法

Info

Publication number: CN106701649B
Application number: CN201611250325.0A
Authority: CN
Inventors: 胡丹; 王成; 刁刘洋; 毛贤军
Original assignee: Langfang Meihua Bio Technology Development Co Ltd
Current assignee: Langfang Meihua Bio Technology Development Co Ltd
Priority date: 2016-12-29
Filing date: 2016-12-29
Publication date: 2021-06-22
Anticipated expiration: 2036-12-29
Also published as: CN106701649A

Abstract

本发明涉及食品工业技术领域，尤其涉及生产L‑谷氨酰胺的菌株和生产L‑谷氨酰胺的方法。本发明研究表明，单独pyc改造不能提高谷氨酸棒杆菌积累谷氨酰胺的能力，但pyc改造与odhA弱化改造配合，则可以大幅提高谷棒产谷氨酰胺的水平。说明，pyc高表达与odhA弱化表达，对合成谷氨酰胺具有协同促进作用。本发明以保藏编号为CGMCC No.13404的谷氨酸棒杆菌为出发，通过弱化odhA及增强pyc的表达水平，构建得到L‑谷氨酰胺基因工程改造菌。该菌株能够实现发酵过程中L‑谷氨酰胺的高效积累，L‑谷氨酰胺可达28.9g/L。

Description

生产L-谷氨酰胺的菌株和生产L-谷氨酰胺的方法

技术领域

本发明涉及食品工业技术领域，尤其涉及生产L-谷氨酰胺的菌株和生产L-谷氨酰胺的方法。

背景技术

谷氨酰胺不仅是合成蛋白质的基本氨基酸之一，还是许多重要化合物如嘌呤、嘧啶，及其它氨基酸合成的氨基供体。谷氨酰胺能够对抗消化道溃疡，维持正常的肠胃功能，保证氮代谢平衡，及调节人体正常的酸碱平衡，具有重要的免疫和营养功能。

目前，谷氨酰胺的主要生产方法为微生物发酵法，微生物发酵法反应条件温和，产品原料丰富，逐步取代了传统的酶法和化学合成法。在高NH⁴⁺、低pH的的情况下，谷氨酸经谷氨酰胺合成酶催化生成谷氨酰胺。人们在从谷氨酸生产菌中筛选谷氨酰胺生产菌方面做了许多研究。事实上，现在的谷氨酰胺生产菌有很多都是从谷氨酸生产菌谷氨酸棒杆菌改造而来。

近年来，随着谷氨酸棒杆菌模式菌株ATCC 13032基因组测序的完成，以及棒杆菌基因操作技术的不断完善，使得通过分子生物学手段对谷氨酸棒杆菌进行相关改造成为现实。谷氨酰胺在生物体内的合成途径也已相继报道。

腺苷酰转移酶(ATase)是谷氨酰胺合成酶(GS)的腺苷酰化修饰酶。所谓腺苷酰化修饰就是AMP以共价键方式与肽链上的酪氨酸残基结合产生GS(AMP)的过程，GS的腺苷酰化和去腺苷酰化都由腺苷酰转移酶催化。腺苷酰化会使GS的活性降低或丧失。另外，GS的腺苷酰化修饰失活及其逆过程也受到铵离子浓度的调控。在限制铵盐的培养条件下，生长到稳定期的细胞内的GS是未被腺苷酰化修饰的。而在过量铵盐的培养条件下，腺苷酰化程度增强，GS酶活力下降甚至失活(黄星，过程工程学报.2008,8(1):135-139)。因此，解除对GS的腺苷酰化修饰作用可以很大程度提高L-谷氨酰胺的产量。

谷氨酸棒杆菌中存在谷氨酰胺酶(GLS)，该酶可分解谷氨酰胺成为谷氨酸。高铵离子浓度和低pH可抑制该酶的活性。传统谷氨酰胺发酵中，通过降低发酵中后期培养基的pH，可实现高谷氨酰胺积累。在谷氨酸棒杆菌中缺失该基因，可减少谷氨酰胺的分解代谢。

虽然上述举措都实现里利用谷氨酸棒杆菌来生产L-谷氨酰胺，但谷氨酰胺的产量仍有待进一步的提高。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供生产L-谷氨酰胺的菌株和生产L-谷氨酰胺的方法，本发明提供的生产L-谷氨酰胺的菌株能够将谷氨酰胺的产量提高至28.9g/L。

本发明提供了弱化odhA表达的重组菌株；其起始菌株为谷氨酸棒杆菌；弱化为使odhA基因的起始密码子由ATG突变为GTG。

α-酮戊二酸是谷氨酸的直接前体，而后者又是谷氨酰胺的直接前体。本发明将odhA的表达弱化，以期使更多代谢流从TCA循环的α-酮戊二酸节点通往谷氨酸合成方向，继而在增强的谷氨酰胺合成酶的作用下，积累更高量的谷氨酰胺。本发明通过进一步修饰该谷氨酰胺产生菌的odhA基因(编码α-酮戊二酸脱氢酶E1o亚基)，降低该基因的表达水平，从而减弱了α-酮戊二酸的进一步氧化脱羧，导致更多代谢流从TCA循环进入谷氨酸及谷氨酰胺合成方向。修饰手段为将odhA编码基因的起始密码子由ATG改为GTG，降低该基因的起始翻译效率。

本发明中，重组菌株包括编码突变pyc蛋白的DNA分子，所述突变pyc蛋白具有P458S突变。

草酰乙酸与乙酰辅酶A的缩合是TCA循环的第一步反应，由于odhA基因的弱化，TCA循环被减弱，造成草酰乙酸供应不足，后者的缺乏限制了乙酰辅酶A继续进入TCA循环。丙酮酸羧化酶(由pyc编码)催化丙酮酸一步羧化为草酰乙酸，是回补途径的关键酶。本发明通过增强回补途径，以期缓解odhA弱化后引起的草酰乙酸匮乏所带来的负效应，并且促进代谢流从糖酵解途径快速进入TCA循环及谷氨酰胺合成支路。因此，本发明进一步强化丙酮酸羧化酶基因(Pyc)的表达水平，以回补TCA循环的中间产物草酰乙酸。强化丙酮酸羧化酶基因表达水平是通过点突变改造来实现。已有文献报道(J.Ohnishi et al,2002)，通过点突变改造将丙酮酸羧化酶第458位的氨基酸脯氨酸改变成丝氨酸，可以显著提高该酶的活性水平。但该改造常用于增加以天冬氨酸为前体的代谢产物的合成，如赖氨酸或苏氨酸的合成，但此前尚不明确，pyc^P458S突变表达是否会对谷氨酰胺的代谢途径中的关键酶表达产生影响，也无法明确这一点突变的引入是否能够提高谷氨酰胺的产量。而本发明对不同基因背景的菌株进行pyc改造，其结果截然不同。在保藏编号为CGMCC No.13404的谷氨酸棒杆菌的菌株上进行pyc改造，并没有造成谷氨酰胺产量的提升。但在经odhA弱化后的谷氨酸棒杆菌菌株上进行pyc改造，则能够显著增加的谷氨酰胺产量(p<0.05)。

本发明中，谷氨酸棒杆菌为保藏编号为CGMCC No.13404的谷氨酸棒杆菌。

本发明中，重组菌株的保藏编号为CGMCC No.13405。

本发明提供的重组菌株在L-谷氨酰胺生产中的应用。

用于L-谷氨酰胺生产的重组菌株中odhA基因表达被弱化，基因型为MHZ-0512-3((G1A)odhA)。该重组菌株中还可以包括pyc突变，pyc突变为pyc^P458S。包括pyc突变且odhA基因被弱化的重组菌株的基因型为MHZ-0512-3((G1A)odhA，pyc(P458S))。MHZ-0512-3即为保藏编号为CGMCC No.13404的谷氨酸棒杆菌，该菌株为谷氨酸棒杆菌ATCC14067经腺苷酰转移酶敲低和谷氨酰胺酶敲低后构得。

本发明研究表明，单独pyc改造不能提高谷氨酸棒杆菌积累谷氨酰胺的能力，但pyc改造与odhA弱化改造相互配合，则可以大幅提高谷棒产谷氨酰胺的水平。说明，pyc高表达与odhA弱化表达，对合成谷氨酰胺具有协同促进作用。由于odhA基因的弱化，TCA循环被减弱，造成草酰乙酸供应不足，后者的缺乏限制了乙酰辅酶A继续进入TCA循环。pyc基因的增强表达，可以及时回补生成草酰乙酸，加快乙酰辅酶A进入TCA循环，并减少了TCA循环还原阶段的碳流量，减少能量损失，进而提高了底物到产物的转化效率。

本发明还提供了重组菌株的构建方法，包括：

以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，拼接PCR获得起始密码子突变为GTG的odhA基因片段，构建入质粒载体后，电穿孔法转化入谷氨酸棒杆菌，获得重组菌株。

起始密码子突变为GTG的odhA基因片段的获得方法为：

采用SEQ ID NO:1～2所示引物对和SEQ ID NO:3～4所示引物对分别对保藏编号为CGMCC No.13404的谷氨酸棒杆菌的基因组DNA进行扩增，获得上游片段(odhA-up)和下游片段(odhA-dn)；

以odhA-up、odhA-dn两片段混合物为模板，以SEQ ID NO:1所示引物和SEQ ID NO:4所示引物进行扩增，获得突变的odhA^A1G片段(SEQ ID NO:9)。

所述质粒载体为pK18mobsacB。所述构建入质粒载体的酶切位点为BamHI、NheI。

所述谷氨酸棒杆菌的保藏编号为CGMCC No.13404；其感受态细胞的获得方式参照谷棒经典方法。

电转化后，细胞经过选择培养基培养和普通液体脑心浸液培养，获得重组菌株。

所述选择性培养基中，含有浓度为15mg/L的卡那霉素；培养的温度为33℃，倒置培养。所述普通液体脑心浸液培养的培养温度为33℃，回转摇床220rpm振荡培养。

在选择培养基培养的过程中，odhA^A1G基因由于同源性被插入到染色体中。液体脑心浸液培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。

普通液体脑心浸液培养后，将培养物做连续梯度稀释(10^-2连续稀释至10^-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h，获得目的重组菌株

蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列，和核苷酸测序分析，鉴定重组菌株。

获得odhA表达弱化的重组菌株后，将该菌株以谷棒经典方法制备感受态，导入编码突变pyc^P458S蛋白的DNA分子。

具体为：以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，拼接PCR获得编码突变pyc^P458S蛋白的DNA分子，构建入质粒载体后，电穿孔法转化入谷氨酸棒杆菌，获得重组菌株。

编码突变pyc^P458S蛋白的DNA分子获得方法为：

采用SEQ ID NO:5～6所示引物对和SEQ ID NO:7～8所示引物对分别对保藏编号为CGMCC No.13404的谷氨酸棒杆菌的基因组DNA进行扩增，获得上游片段(pyc458-up)和下游片段(pyc458-dn)；

以pyc458-up、pyc458-dn两片段混合物为模板，以SEQ ID NO:5所示引物和SEQ IDNO:8所示引物进行扩增，获得突变的pyc^P458S片段(SEQ ID NO:10)。

所述质粒载体为pK18mobsacB。所述构建入质粒载体的酶切位点为SphI、NheI。

将重组质粒pK18mobsacB-pyc^P458S转化入odhA表达弱化的重组菌株的感受态细胞。

在选择培养基培养的过程中，pyc^P458S基因由于同源性被插入到染色体中。液体脑心浸液培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。

本发明还提供了一种生产L-谷氨酰胺的方法，发酵本发明提供的重组菌株。

本发明中，发酵前经过种子活化的步骤；所述活化的培养基包括水和：

所述发酵的培养基包括水和：

本发明中，发酵的温度为33℃，时间48小时。摇瓶培养转速为150rpm。

活化后种子液的接种量为10％。

本发明研究表明，单独pyc改造不能提高谷氨酸棒杆菌积累谷氨酰胺的能力，但pyc改造与odhA弱化改造配合，则可以大幅提高谷棒产谷氨酰胺的水平。说明，pyc高表达与odhA弱化表达，对合成谷氨酰胺具有协同促进作用。本发明以保藏编号为CGMCC No.13404的谷氨酸棒杆菌为出发，通过弱化odhA及增强pyc的表达水平，构建得到L-谷氨酰胺基因工程改造菌，对其中一株进行保藏，保藏编号为CGMCC No.13405。该菌株能够实现发酵过程中L-谷氨酰胺的高效积累，L-谷氨酰胺可达28.9g/L。

生物保藏说明

生物材料MHZ-0512-3，分类命名：谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum，于2016年11月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.13404。

生物材料MHZ-0513-3，分类命名：谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum，于2016年11月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.13405。

附图说明

图1示重组质粒pK18mobsacB-odhA^A1G；

图2示重组质粒pK18mobsacB-pyc^P458S；

图3示本发明所构建基因工程菌的L-谷氨酰胺产量。

具体实施方式

本发明提供了生产L-谷氨酰胺的菌株和生产L-谷氨酰胺的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

本发明中涉及的基因名称解释如下：

glnA：谷氨酰胺合成酶(GS)；

glnE：腺苷酰转移酶(ATase)；

glsA：谷氨酰胺酶(GLS)；

odhA：α-酮戊二酸脱氢酶E1o亚基(ODHC)；

pyc：丙酮酸羧化酶(Pyc)。

以下实施例中使用的引物序列信息如表1所示：

表1、引物序列信息

引物名称	序列(5’-3’)
			odhA-1f	gaGGATCCaagcacacttgtttagtgga	SEQ ID NO:1
odhA-1r	gccccagttgtagcactaatttgttgacag	SEQ ID NO:2
			odhA-2f	ctgtcaacaaattagtgctacaactggggc	SEQ ID NO:3
odhA-2r	ctaGCTAGCcgaaccgaggttgcggttgg	SEQ ID NO:4
			pyc-1f	gaGCATGCgggcaaccacgtcttcatcgaaa	SEQ ID NO:5
pyc-1r	ctgaaggaggtgcgagtgatcggcaatga	SEQ ID NO:6
			pyc-2f	tcattgccgatcactcgcacctccttcag	SEQ ID NO:7
pyc-2r	ctaGCTAGCggggtgtatcccacggtgttgcg	SEQ ID NO:8

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1 重组质粒pK18mobsacB-odhA^A1G的构建及引入

以保藏编号为CGMCC No.13404谷氨酸棒杆菌(记为MHZ-0512-3)基因组为模板，分别以odhA-1f/odhA-1r引物对和odhA-2f/odhA-2r引物对进行PCR扩增，得到上游片段odhA-up和下游片段odhA-dn；以odhA-up、odhA-dn两片段混合物为模板，以odhA-1f/odhA-2r引物对进行PCR扩增，得到突变的odhA^A1G片段。odhA^A1G片段用BamHI、NheI进行双酶切，pK18mobsacB用同样的酶双切。两酶切产物以T4 DNA Ligase进行连接，转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-odhA^A1G(图1)。

按照(C.glutamicum Handbook,Charpter 23)制备保藏编号为CGMCC No.13404谷氨酸棒杆菌感受态细胞。重组质粒pK18mobsacB-odhA^A1G以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为33℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10^-2连续稀释至10^-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列，和核苷酸测序分析，验证获得的为目的突变菌株，并命名为MHZ-0513-1。

实施例2 重组质粒pK18mobsacB-pyc^P458S的构建及引入

以保藏编号为CGMCC No.13404谷氨酸棒杆菌(记为MHZ-0512-3)基因组为模板，分别以pyc-1f/pyc-1r引物对和pyc-2f/pyc-2r引物对进行PCR扩增，得到上游片段pyc458-up和下游片段pyc458-dn。以pyc458-up、pyc458-dn两片段混合物为模板，以pyc-1f/pyc-2r引物对进行PCR扩增，得到突变的pyc^P458S片段。pyc^P458S片段用SphI、NheI进行双酶切，pK18mobsacB用同样的酶双切。两酶切产物以T4 DNA Ligase进行连接，转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-pyc^P458S(图2)。

按照谷棒经典方法制备保藏编号为CGMCC No.13404谷氨酸棒杆菌和MHZ-0513-1的感受态细胞。pK18mobsacB-pyc^P458S重组质粒以电穿孔方法分别转化两种感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中目的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为33℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10^-2连续稀释至10^-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列，和核苷酸测序分析，获得目的突变菌株。分别将以保藏编号为CGMCC No.13404谷氨酸棒杆菌(记为MHZ-0512-3)和MHZ-0513-1为出发菌株，所获得的叠加改造菌株命名为MHZ-0513-2和MHZ-0513-3。其中，对MHZ-0513-3进行保藏，保藏编号为CGMCC No.13405。

实施例1-2所获得的产谷氨酰胺基因改造菌株如下表2所示。

表2：本发明构建的基因工程菌

菌株编号	改造位点
		MHZ-0512-3	---
MHZ-0513-1	MHZ-0512-3((G1A)odhA)
		MHZ-0513-2	MHZ-0512-3(pyc(P458S))
MHZ-0513-3	MHZ-0512-3((G1A)odhA，pyc(P458S))

实施例3 L-谷氨酰胺基因工程菌发酵生产L-谷氨酰胺

将所构建的基因工程菌株MHZ-0513-1、MHZ-0513-2、MHZ-0513-3进行摇瓶发酵测试。于200ml三角瓶进行种子培养，装液量50ml/瓶。于500ml三角摇瓶中进行发酵培养，装液量20ml/瓶。接种量10％，培养温度33℃，培养时间48小时。

所述种子培养基成分如下：葡萄糖50g/L，尿素5g/L，KH₂PO₄ 2.0g/L，MgSO₄·7H₂O1.0g/L，玉米浆30g/L，NaOH调pH7.0。

所述发酵培养基组分如下：葡萄糖90g/L，(NH₄)₂SO₄40g/L，KH₂PO₄2.0g/L，MgSO₄·7H₂O 1.0g/L，玉米浆10g/L，CaCO₃50g/L，NaOH调pH7.0。

每组实验设置三个平行，稀释100倍后检测OD562值。谷氨酰胺产量以液相色谱法进行分析，最终结果取三组实验的平均值。各基因工程菌株发酵产L-谷氨酰胺结果见表3。产酸提高率的计算方法为，以对照菌株为参考，实验菌株比对照菌株产酸提高的程度，以百分比表示。负值表示实验菌株比对照菌株产酸降低。

表3：基因工程菌株发酵产L-谷氨酰胺

菌株	OD<sub>562</sub>	L-谷氨酰胺(g/L)	产酸提高率(％)
				MHZ-0512-3	55.1	22.1	--
MHZ-0513-1	44.9	25.6	15.8％
				MHZ-0513-2	56.6	21.4	-3.2％
MHZ-0513-3	43.5	28.9	30.8％

由表3可知，odhA的弱化改造菌MHZ-0513-1比之出发菌株MHZ-0512-3生长优势略有下降，但谷氨酰胺的产量有较大提升，产酸提高15.8％，具有显著性差异。说明，odhA的弱化改造在以α-酮戊二酸为前体的氨基酸合成中具有关键作用。α-酮戊二酸是谷氨酸的直接前体，而后者又是谷氨酰胺的直接前体。odhA的弱化可以使更多代谢流从TCA循环的α-酮戊二酸节点通往谷氨酸合成方向，继而在增强的谷氨酰胺合成酶的作用下，积累更高量的谷氨酰胺。

MHZ-0513-2、MHZ-0513-3是关于提高pyc基因表达水平的改造菌。从表3中可以看出，对不同基因背景的菌株进行pyc改造，其结果截然不同。在MHZ-0512-3菌株上进行pyc改造，并没有造成谷氨酰胺产量的提升。但在MHZ-0513-1菌株上进行pyc改造，具有显著增加的谷氨酰胺产量。与出发菌株MHZ-0513-1相比，MHZ-0513-3菌株的产酸水平提高了12.9％，具有显著性差异(p<0.05)。

本研究表明，单独pyc改造不能提高谷氨酸棒杆菌积累谷氨酰胺的能力，但pyc改造与odhA弱化改造偶联，则可以大幅提高谷棒产谷氨酰胺的水平。说明，pyc高表达与odhA弱化表达，对合成谷氨酰胺具有协同促进作用。

由于odhA基因的弱化，TCA循环被减弱，造成草酰乙酸供应不足，后者的缺乏限制了乙酰辅酶A继续进入TCA循环。pyc基因的增强表达，可以及时回补生成草酰乙酸，加快乙酰辅酶A进入TCA循环，并减少了TCA循环还原阶段的碳流量，减少能量损失，进而提高了底物到产物的转化效率。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 廊坊梅花生物技术开发有限公司

<120> 生产L-谷氨酰胺的菌株和生产L-谷氨酰胺的方法

<130> MP1623783

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gaggatccaa gcacacttgt ttagtgga 28

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gccccagttg tagcactaat ttgttgacag 30

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctgtcaacaa attagtgcta caactggggc 30

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctagctagcc gaaccgaggt tgcggttgg 29

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gagcatgcgg gcaaccacgt cttcatcgaa a 31

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ctgaaggagg tgcgagtgat cggcaatga 29

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tcattgccga tcactcgcac ctccttcag 29

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ctagctagcg gggtgtatcc cacggtgttg cg 32

<210> 9

<211> 3774

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gtgctacaac tggggcttag gcataatcag ccaacgacca acgttacagt ggataaaata 60

aagctcaata aaccctcaag aagcaaggaa aagaggcgag tacctgccgt gagcagcgct 120

agtactttcg gccagaatgc gtggctggta gacgagatgt tccagcagtt ccagaaggac 180

cccaagtccg tggacaagga atggagagaa ctctttgagg cgcagggggg accaaatgct 240

acccccgcta caacagaagc acagccttca gcgcccaagg agtctgcgaa accagcacca 300

aaggctgccc ctgcagccaa ggcagcaccg cgcgtagaaa ccaagccggc cgccaagacc 360

gcccctaagg ccaaggagtc ctcagtgcca cagcaaccta agcttccgga gccaggacaa 420

accccaatca ggggtatttt caagtccatc gcgaagaaca tggatatctc cctggaaatc 480

ccaaccgcaa cctcggttcg cgatatgcca gctcgcctca tgttcgaaaa ccgcgcgatg 540

gtcaacgatc agctcaagcg cacccgcggt ggcaagatct ccttcaccca catcattggc 600

tacgccatgg tgaaggcagt catggctcac ccggacatga acaactccta cgacgtcatc 660

gacggcaagc caaccctgat cgtgcctgag cacatcaacc tgggccttgc catcgacctt 720

cctcagaagg acggctcccg cgcacttgtc gtagcagcca tcaaggaaac cgagaagatg 780

aacttctccg agttcctcgc agcatacgaa gacatcgtga cacgctcccg caagggcaag 840

ctcaccatgg atgactacca gggcgttacc gtttccttga ccaacccagg tggcatcggt 900

acccgccact ctgtcccacg tctgaccaag ggccagggca ccatcatcgg tgtcggttcc 960

atggattacc cagcagagtt ccagggcgct tccgaagacc gccttgcaga gctcggcgtt 1020

ggcaagcttg tcaccatcac ctccacctac gatcaccgcg tgatccaggg tgctgtgtcc 1080

ggtgaattcc tgcgtaccat gtctcgcctg ctcaccgatg attccttctg ggatgagatc 1140

ttcgacgcaa tgaacgttcc ttacacccca atgcgttggg cacaggacgt tccaaacacc 1200

ggtgttgata agaacacccg cgtcatgcag ctcattgagg cataccgctc ccgtggacac 1260

ctcatcgctg acaccaaccc actttcatgg gttcagcctg gcatgccagt tccagaccac 1320

cgcgacctcg acatcgagac ccacagcctg accatctggg atctggaccg taccttcagc 1380

gtcggtggct tcggcggcaa ggagaccatg accctgcgcg aggtactgtc ccgcctgcgc 1440

gctgcctaca ccttgaaggt cggctccgaa tacacccaca tcctggaccg cgacgagcgc 1500

acctggctgc aggaccgcct cgaagccgga atgccaaagc caacccaggc agagcagaag 1560

tacatcctgc agaagctgaa cgccgcagag gctttcgaga acttcctgca gaccaagtac 1620

gtcggccaga agcgcttctc cctcgaaggt gcagaagctc tcatcccact gatggactcc 1680

gccatcgaca ccgccgcagg ccagggcctc gacgaagttg tcatcggtat gccacaccgt 1740

ggtcgcctca acgtgctgtt caacatcgtg ggcaagccac tggcatccat cttcaacgag 1800

tttgaaggcc aaatggagca gggccagatc ggtggctccg gtgacgtgaa gtaccacctc 1860

ggttccgaag gccagcacct gcagatgttc ggcgacggcg agatcaaggt ctccctgact 1920

gctaacccgt cccacctgga agctgttaac ccagtgatgg aaggtatcgt ccgcgcaaag 1980

caggactacc tggacaaggg cgtagacggc aagactgttg tgccactgct gctccacggt 2040

gacgctgcat tcgcaggcct gggcatcgtg ccagaaacca tcaacctggc taagctgcgt 2100

ggctacgacg tcggaggcac catccacatc gtggtgaaca accagatcgg cttcaccacc 2160

accccagact ccagccgctc catgcactac gcaaccgact acgccaaggc attcggctgc 2220

ccagtcttcc acgtcaatgg tgatgaccca gaggcagttg tctgggttgg ccagctggca 2280

accgagtacc gtcgtcgctt cggcaaggac gtcttcatcg acctcgtttg ctaccgcctc 2340

cgcggccaca acgaagctga tgatccttcc atgacccagc caaagatgta tgagctcatc 2400

accggccgcg agaccgttcg tgctcagtac accgaagacc tgctcggacg tggagacctc 2460

tccaacgaag atgcagaagc agtcgtccgc gacttccacg accagatgga atctgtgttc 2520

aacgaagtca aggaaggcgg caagaagcag gctgaggcac agaccggcat caccggctcc 2580

cagaagcttc cacacggcct tgagaccaac atctcccgtg aagagctcct ggaactggga 2640

caggctttcg ccaacacccc agaaggcttc aactaccacc cacgtgtggc tccagttgct 2700

aagaagcgcg tctcctctgt caccgaaggt ggcatcgact gggcatgggg cgagctcctc 2760

gccttcggtt ccctggctaa ctccggccgc ttggttcgcc ttgcaggtga agattcccgc 2820

cgcggtacct tcacccagcg ccacgcagtt gccatcgacc cagcgaccgc tgaagagttc 2880

aacccactcc acgagcttgc acagtccaag ggcaacaacg gtaagttcct ggtctacaac 2940

tccgcactga ccgagtacgc aggcatgggc ttcgagtacg gctactccgt aggaaacgaa 3000

gactccgtcg ttgcatggga agcacagttc ggcgacttcg ccaacggcgc tcagaccatc 3060

atcgatgagt acgtctcctc aggcgaagct aagtggggcc agacctccaa gctgatcctt 3120

ctgctgcctc acggctacga aggccagggc ccagaccact cttccgcacg tatcgagcgc 3180

ttcctgcagc tgtgcgctga gggttccatg actgttgctc agccatccac cccagcaaac 3240

cacttccacc tgctgcgtcg tcacgctctg tccgacctga agcgtccact ggttatcttc 3300

accccgaagt ccatgctgcg taacaaggct gctgcctccg caccagaaga cttcactgag 3360

gtcaccaagt tccaatccgt gatcgacgat ccaaacgttg cagatgcagc caaggtgaag 3420

aaggtcatgc tggtctccgg caagctgtac tacgaattgg caaagcgcaa ggagaaggac 3480

ggacgcgacg acatcgcgat cgttcgtatc gaaatgctcc acccaattcc gttcaaccgc 3540

atctccgagg ctcttgccgg ctaccctaac gctgaggaag tcctcttcgt tcaggatgag 3600

ccagcaaacc agggcccatg gccgttctac caggagcacc tcccagagct gatcccgaac 3660

atgccaaaga tgcgccgcgt ttcccgccgc gctcagtcct ccaccgcaac tggtgttgct 3720

aaggtgcacc agctggagga gaagcagctt atcgacgagg ctttcgaggc ttaa 3774

<210> 10

<211> 3423

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gtgtcgactc acacatcttc aacgcttcca gcattcaaaa agatcttggt agcaaaccgc 60

ggcgaaatcg cggtccgtgc tttccgtgca gcactcgaaa ccggtgcagc cacggtagct 120

atttaccccc gtgaagatcg gggatcattc caccgctctt ttgcttctga agctgtccgc 180

attggtaccg aaggctcacc agtcaaggcg tacctggaca tcgatgaaat tatcggtgca 240

gctaaaaaag ttaaagcaga tgccatttac ccgggatacg gcttcctgtc tgaaaatgcc 300

cagcttgccc gcgagtgtgc ggaaaacggc attactttta ttggcccaac cccagaggtt 360

cttgatctca ccggtgataa gtctcgcgcg gtaaccgccg cgaagaaggc tggtctgcca 420

gttttggcgg aatccacccc gagcaaaaac atcgatgaga tcgttaaaag cgctgaaggc 480

cagacttacc ccatctttgt gaaggcagtt gccggtggtg gcggacgcgg tatgcgtttt 540

gttgcttcac ctgatgagct tcgcaaatta gcaacagaag catctcgtga agctgaagcg 600

gctttcggcg atggcgcggt atatgtcgaa cgtgctgtga ttaaccctca gcatattgaa 660

gtgcagatcc ttggcgatca cactggagaa gttgtacacc tttatgaacg tgactgctca 720

ctgcagcgtc gtcaccaaaa agttgtcgaa attgcgccag cacagcattt ggatccagaa 780

ctgcgtgatc gcatttgtgc ggatgcagta aagttctgcc gctccattgg ttaccagggc 840

gcgggaaccg tggaattctt ggtcgatgaa aagggcaacc acgtcttcat cgaaatgaac 900

ccacgtatcc aggttgagca caccgtgact gaagaagtca ccgaggtgga cctggtgaag 960

gcgcagatgc gcttggctgc tggtgcaacc ttgaaggaat tgggtctgac ccaagataag 1020

atcaagaccc acggtgcagc actgcagtgc cgcatcacca cggaagatcc aaacaacggc 1080

ttccgcccag ataccggaac tatcaccgcg taccgctcac caggcggagc tggcgttcgt 1140

cttgacggtg cagctcagct cggtggcgaa atcaccgcac actttgactc catgctggtg 1200

aaaatgacct gccgtggttc cgactttgaa actgctgttg ctcgtgcaca gcgcgcgttg 1260

gctgagttca ccgtgtctgg tgttgcaacc aacattggtt tcttgcgtgc gttgctgcgg 1320

gaagaggact tcacttccaa gcgcatcgcc accggattca ttgccgatca ctcgcacctc 1380

cttcaggctc cacctgctga tgatgagcag ggacgcatcc tggattactt ggcagatgtc 1440

accgtgaaca agcctcatgg tgtgcgtcca aaggatgttg cagctcctat cgataagctg 1500

cctaacatca aggatctgcc actgccacgc ggttcccgtg accgcctgaa gcagcttggc 1560

ccagccgcgt ttgctcgtga tctccgtgag caggacgcac tggcagttac tgataccacc 1620

ttccgcgatg cacaccagtc tttgcttgcg acccgagtcc gctcattcgc actgaagcct 1680

gcggcagagg ccgtcgcaaa gctgactcct gagcttttgt ccgtggaggc ctggggcggc 1740

gcgacctacg atgtggcgat gcgtttcctc tttgaggatc cgtgggacag gctcgacgag 1800

ctgcgcgagg cgatgccgaa tgtaaacatt cagatgctgc ttcgcggccg caacaccgtg 1860

ggatacaccc cgtacccaga ctccgtctgc cgcgcgtttg ttaaggaagc tgccagctcc 1920

ggcgtggaca tcttccgcat cttcgacgcg cttaacgacg tctcccagat gcgtccagca 1980

atcgacgcag tcctggagac caacaccgcg gtagccgagg tggctatggc ttattctggt 2040

gatctctctg atccaaatga aaagctctac accctggatt actacctaaa gatggcagag 2100

gagatcgtca agtctggcgc tcacatcttg gccattaagg atatggctgg tctgcttcgc 2160

ccagctgcgg taaccaagct ggtcaccgca ctgcgccgtg aattcgatct gccagtgcac 2220

gtgcacaccc acgacactgc gggtggccag ctggcaacct actttgctgc agctcaagct 2280

ggtgcagatg ctgttgacgg tgcttccgca ccactgtctg gcaccacctc ccagccatcc 2340

ctgtctgcca ttgttgctgc attcgcgcac acccgtcgcg ataccggttt gagcctcgag 2400

gctgtttctg acctcgagcc gtactgggaa gcagtgcgcg gactgtacct gccatttgag 2460

tctggaaccc caggcccaac cggtcgcgtc taccgccacg aaatcccagg cggacagttg 2520

tccaacctgc gtgcacaggc caccgcactg ggccttgcgg atcgtttcga actcatcgaa 2580

gacaactacg cagccgttaa tgagatgctg ggacgcccaa ccaaggtcac cccatcctcc 2640

aaggttgttg gcgacctcgc actccacctc gttggtgcgg gtgtggatcc agcagacttt 2700

gctgccgatc cacaaaagta cgacatccca gactctgtca tcgcgttcct gcgcggcgag 2760

cttggtaacc ctccaggtgg ctggccagag ccactgcgca cccgcgcact ggaaggccgc 2820

tccgaaggca aggcacctct gacggaagtt cctgaggaag agcaggcgca cctcgacgct 2880

gatgattcca aggaacgtcg caatagcctc aaccgcctgc tgttcccgaa gccaaccgaa 2940

gagttcctcg agcaccgtcg ccgcttcggc aacacctctg cgctggatga tcgtgaattc 3000

ttctacggcc tggtcgaagg ccgcgagact ttgatccgcc tgccagatgt gcgcacccca 3060

ctgcttgttc gcctggatgc gatctctgag ccagacgata agggtatgcg caatgttgtg 3120

gccaacgtca acggccagat ccgcccaatg cgtgtgcgtg accgctccgt tgagtctgtc 3180

accgcaaccg cagaaaaggc agattcctcc aacaagggcc atgttgctgc accattcgct 3240

ggtgttgtca ccgtgactgt tgctgaaggt gatgaggtca aggctggaga tgcagtcgca 3300

atcatcgagg ctatgaagat ggaagcaaca atcactgctt ctgttgacgg caaaatcgat 3360

cgcgttgtgg ttcctgctgc aacgaaggtg gaaggtggcg acttgatcgt cgtcgtttcc 3420

taa 3423

Claims

1.保藏编号为CGMCC No.13405的谷氨酸棒杆菌。

2.权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌在L-谷氨酰胺生产中的应用。

3.一种生产L-谷氨酰胺的方法，其特征在于，发酵权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵前经过种子活化的步骤；所述活化的培养基包括水和：

葡萄糖 50g/L；

尿素 5 g/L；

KH₂PO₄ 2.0g/L；

MgSO₄·7H₂O 1.0 g/L；

玉米浆 30 g/L；

所述发酵的培养基包括水和：

葡萄糖 90g/L；

(NH₄)₂SO₄ 40 g/L；

KH₂PO₄ 2.0g/L；

MgSO₄·7H₂O 1.0 g/L；

玉米浆 10 g/L；

CaCO₃ 50g/L。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵的温度为33℃，时间48小时。