CN112812985B - 一种提高谷氨酰胺发酵产酸的方法 - Google Patents

一种提高谷氨酰胺发酵产酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于氨基酸生产技术领域，公开了一种提高谷氨酰胺发酵产酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将谷氨酸棒杆菌种子液以5‑10％接种量接种到发酵培养基中，控制发酵温度34‑38℃，溶氧控制18%‑22％，罐压0.03‑0.07MPa，并通过流加蔗糖溶液将残糖控制在不低于1.0％，通过流加氨水控制在pH为6.8‑7.2，发酵至48h停止，得到谷氨酰胺发酵液。本发明提高了谷氨酰胺发酵产酸率，降低了发酵成本，有效地解决了谷氨酰胺产酸率低，产量提高难题。

Description

一种提高谷氨酰胺发酵产酸的方法
技术领域
本发明属于氨基酸发酵领域，具体涉及一种提高谷氨酰胺发酵产酸的方法。
技术背景
在氨基酸生产过程中，常规的生产方法中，菌落不经过挑选优化、传代、改良等，容易导致种子老化甚至衰败，产酸率低、产量不达标，严重影响规模化生产经济效益。
但是，筛选得到发酵性能优异的菌株是难点，需要付出大量的时间，并且具备较大的不确定性。本领域研究人员致力筛选发酵效率高、发酵成本低的菌株。
发明内容
为解决上述问题，克服现有技术的不足之处，本发明提供了一种产谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌，发酵成本低，发酵效率高。本发明还提供了一种提高谷氨酰胺发酵产酸的方法。
本发明的目的是通过下述技术方案实现的。
一种提高谷氨酰胺发酵产酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将谷氨酸棒杆菌种子液以5-10％接种量接种到发酵培养基中，控制发酵温度34-38℃，溶氧控制18％-22 ％，罐压0.03-0.07MPa，并通过流加蔗糖溶液将残糖控制在不低于1.0％，通过流加氨水控制在pH为6.8-7.2，发酵至48h停止，得到谷氨酰胺发酵液。
进一步地，所述发酵培养基的组分为：蔗糖18-22g/L、玉米浆8-12g/L、甲醇5-10g/L、硫酸铵3-7g/L、磷酸氢二钾1-3g/L、磷酸二氢钾1-3g/L、硫酸镁0.5-1.5g/L、柠檬酸0.5-2.5g/L、硫酸亚铁50-90mg/L、硫酸钠15-20mg/L、硫酸锰5-9mg/L、硫酸锌5-9mg/L、氯化钴3-6mg/L、硫酸铜0.6-1.2mg/L。
进一步地，所述谷氨酸棒杆菌种子液的制备方法为：将谷氨酸棒杆菌转接到装有种子培养基的种子瓶中进行摇瓶种子培养，控制转速150-200r/min、温度35-36℃、培养48h。
更进一步地，所述种子培养基为：葡萄糖10g/L、甲醇5g/L、酵母膏5g/L、硫酸铵5g/L、磷酸氢二钾1g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸亚铁20mg/L、硫酸锰5mg/L。
更进一步地，所述种子培养基为：蔗糖10g/L、甲醇5g/L、酵母膏5g/L、硫酸铵5g/L、磷酸氢二钾1g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸亚铁20mg/L、硫酸锰5mg/L。
具体地，所述谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的保藏号为CGMCCNo.18932，于2019年11月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
进一步地，所述方法还包括从谷氨酰胺发酵液分离提取谷氨酰胺的步骤。
本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：
本发明通过一系列筛选、诱变条件，偶然地筛选出一株高产谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌，较出发菌株产谷氨酰胺大幅提升，该菌株能够利用甲醇，并且采用甲醇替代部分糖，产谷氨酰胺的能力更强，甲醇成本较糖类大幅降低，可以明显降低发酵成本，而蔗糖和葡萄糖的差异并不大，蔗糖价格成本较葡萄糖低。因此，选择蔗糖+甲醇的组合最为经济，提高了工业价值，有利于规模化生产，从而解决谷氨酰胺规模化生产过程产酸率低、成本过高的问题。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1
1.一种提高谷氨酰胺发酵产酸的方法，其包括：
1、种子的活化、诱导以及优化：
1)本试验采用新疆阜丰生物科技有限公司菌种研究室保存的谷氨酰胺菌种作为出发菌株；
2)对无菌室按照《无菌室消毒操作标准》进行严格消毒，对环境要求零污染、零染菌，主要包括酒精消毒、紫外线、臭氧消毒等；
3)将原始出发菌种通过活化、稀释，涂在适合细菌生长的培养基上；
4)将培养基器皿倒置放于32℃恒温箱中，培养5后观察其生长情况；
5)器皿上长出的许多单个菌落，选取优良菌种，经分离后即为各种纯种菌株；
6)将菌株采用紫外15W，30cm，20min进行诱变处理，然后用亚硝基胍(1mg/ml，30℃， 60min)进行诱变处理，再涂布到诱导培养基(葡萄糖10g/L、甲醇设置为1-10g/L共10个浓度梯度、酵母膏5g/L、硫酸铵5g/L、磷酸氢二钾1g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸锰5mg/L、琼脂20g/L)中进行筛选培养，温度为32℃，培养3d。获得一株能够高效利用甲醇、谷氨酰胺产率高的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)VJ1911-02，保藏号为CGMCC No.18932，于2019年11月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该菌株的主要理化性质为：肉汁琼脂平板培养，外观圆形，培养24小时菌落白色，继续培养一周，淡黄色，中央隆起，表面湿润，光滑有光泽，边缘整齐半透明，无粘性，不产生色素，不液化明胶，不水解淀粉。
2.种子培养：
将谷氨酸棒杆菌VJ1911-02由斜面菌种转接到装有玻璃珠的三角圆形种子瓶，进行摇瓶种子培养，控制转速150-200r/min、温度35-36℃、培养48h。
种子培养基1为：葡萄糖10g/L、甲醇5g/L、酵母膏5g/L、硫酸铵5g/L、磷酸氢二钾1g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸亚铁20mg/L、硫酸锰5mg/L。
种子培养基2为：蔗糖10g/L、甲醇5g/L、酵母膏5g/L、硫酸铵5g/L、磷酸氢二钾1g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸亚铁20mg/L、硫酸锰5mg/L。
种子培养基3：葡萄糖16g/L、酵母膏5g/L、硫酸铵5g/L、磷酸氢二钾1g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸亚铁20mg/L、硫酸锰5mg/L。
种子培养基4：蔗糖16g/L、酵母膏5g/L、硫酸铵5g/L、磷酸氢二钾1g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸亚铁20mg/L、硫酸锰5mg/L。
对照菌株采用出发菌株。测定发酵液中谷氨酰胺的含量。具体见表1：
表1
Figure RE-GDA0003006986880000031
可见，VJ1911-02较出发菌株产谷氨酰胺大幅提升，出乎预料的是，VJ1911-02能够利用甲醇，并且采用甲醇替代部分糖，产谷氨酰胺的能力更强，甲醇成本较低，可以大幅降低发酵成本，而蔗糖和葡萄糖的差异并不大，因此，选择蔗糖+甲醇的组合最为经济。
实施例2
谷氨酰胺发酵：
1)发酵配方：
蔗糖18g/L、玉米浆12g/L、甲醇6g/L、硫酸铵5g/L、磷酸氢二钾2g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸镁0.5g/L、柠檬酸0.5g/L、硫酸亚铁50mg/L、硫酸钠15mg/L、硫酸锰5mg/L、硫酸锌5mg/L、氯化钴3mg/L、硫酸铜0.6mg/L。
2)发酵过程控制：
将实施例1制备的谷氨酸棒杆菌种子液以6％接种量接种到发酵培养基中，控制发酵温度35℃，溶氧控制18％，罐压0.04MPa，并通过流加蔗糖溶液浓度为100g/L，将残糖控制在不低于1.0％，通过流加氨水控制在pH为6.9，发酵至48h停止，得到谷氨酰胺发酵液，经检测谷氨酰胺含量为48.6g/L。
实施例3
谷氨酰胺发酵：
1)发酵配方：
蔗糖22g/L、玉米浆8g/L、甲醇5g/L、硫酸铵4g/L、磷酸氢二钾1g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁1g/L、柠檬酸1g/L、硫酸亚铁80mg/L、硫酸钠20mg/L、硫酸锰9mg/L、硫酸锌9 mg/L、氯化钴6mg/L、硫酸铜1.2mg/L。
2)发酵过程控制：
将实施例1制备的谷氨酸棒杆菌种子液以6％接种量接种到发酵培养基中，控制发酵温度36℃，溶氧控制22％，罐压0.06MPa，并通过流加蔗糖溶液浓度为120g/L，将残糖控制在不低于1.0％，通过流加氨水控制在pH为7.2，发酵至48h停止，得到谷氨酰胺发酵液，经检测谷氨酰胺含量为49.7g/L。
上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了介绍，但并非对本发明保护范围的限值，所属领域技术人员应该明白，这对本领域技术人员而言应该很明确，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明保护的范围。

Claims (6)

1.一种提高谷氨酰胺发酵产酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将谷氨酸棒杆菌种子液以5-10％接种量接种到发酵培养基中，控制发酵温度34-38℃，溶氧控制18-22％，罐压0.03-0.07MPa，并通过流加蔗糖溶液将残糖控制在不低于1.0％，通过流加氨水控制在pH为6.8-7.2，发酵至48h停止，得到谷氨酰胺发酵液；所述谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum ） 的保藏号为CGMCC No.18932，于2019年11月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；所述发酵培养基的组分为：蔗糖18-22g/L、玉米浆8-12g/L、甲醇5-10g/L、硫酸铵3-7g/L、磷酸氢二钾1-3g/L、磷酸二氢钾1-3g/L、硫酸镁0.5-1.5g/L、柠檬酸0.5-2.5g/L、硫酸亚铁50-90mg/L、硫酸钠15-20mg/L、硫酸锰5-9mg/L、硫酸锌5-9mg/L、氯化钴3-6mg/L、硫酸铜0.6-1.2mg/L。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述谷氨酸棒杆菌种子液的制备方法为：将谷氨酸棒杆菌转接到装有种子培养基的种子瓶中进行摇瓶种子培养，控制转速150-200r/min、温度35-36℃、培养48h。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述种子培养基为：葡萄糖10g/L、甲醇5g/L、酵母膏5g/L、硫酸铵5g/L、磷酸氢二钾1g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸亚铁20mg/L、硫酸锰5mg/L。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述种子培养基为：蔗糖10g/L、甲醇5g/L、酵母膏5g/L、硫酸铵5g/L、磷酸氢二钾1g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸亚铁20mg/L、硫酸锰5mg/L。
5.根据权利要求1-4任其一所述的方法，其特征在于，所述方法还包括从谷氨酰胺发酵液分离提取谷氨酰胺的步骤。
6.一株产谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌 ，其特征在于，所述谷氨酸棒杆菌的保藏号为CGMCC No.18932，于2019年11月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
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