CN114540261A - 一种产氨基己二酸的基因工程菌 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种产氨基己二酸的基因工程菌。该基因工程菌是采用谷氨酸棒状杆菌为宿主细胞，通过导入编码赖氨酸脱氢酶与氨基己二酸半醛脱氢酶的基因，并通过强化前体合成途径、敲除或弱化竞争代谢途径相关基因对谷氨酸棒状杆菌进行底盘微生物改造而得，该菌为高产氨基己二酸的基因工程菌。

Description

一种产氨基己二酸的基因工程菌
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种产氨基己二酸的基因工程菌，具体涉及一种产氨基己二酸的基因工程菌及其在生产氨基己二酸中的应用。
背景技术
氨基己二酸(α-aminoadipic acid)分子式为C6H11NO4，化学式量为161.16。它是一种非蛋白质氨基酸，可用作有价值的医药中间体，例如可用作抗风湿药，牛皮癣和抗癌药物的甲氨蝶呤衍生物，也可用作生理活性肽(如肽抗生素和肽激素)的末端修饰剂。此外，它是以青霉素和头孢菌素为代表的β-内酰胺抗生素的前体。综上，氨基己二酸在医药、食品和化工合成领域具有重要的应用价值。
目前，氨基己二酸主要以化学合成的方法生产。然而化学合成法存在需要光学拆分和多阶段反应的问题，造成其成本高、产率低。随着合成生物学的大力发展，生物法合成氨基己二酸是替代化学合成最具潜力的策略。
因此，目前需要研究开发一种转化率高，经济性好，易于工业化生产的氨基己二酸生物合成技术。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种产氨基己二酸的基因工程菌，该菌为高产氨基己二酸的基因工程菌，利用该基因工程菌生产氨基己二酸，转化率高，经济性好，易于工业化生产。
为此，本发明第一方面提供了一种产氨基己二酸的基因工程菌。
根据本发明的一些实施方式，所述产氨基己二酸的基因工程菌为包含编码赖氨酸脱氢酶的基因lysDH和编码氨基己二酸半醛脱氢酶的基因Psefu_1272的重组宿主菌。
在本发明的一些实施例中，所述编码赖氨酸脱氢酶的基因lysDH为来源于芽孢杆菌12AMOR1的编码赖氨酸脱氢酶的基因lysDH或来源于芽孢杆菌12AMOR1且经过密码子优化的编码赖氨酸脱氢酶的基因lysDH。
在本发明的另一些实施例中，所述编码氨基己二酸半醛脱氢酶的基因Psefu_1272为来源于假单胞菌12-X的编码氨基己二酸半醛脱氢酶的基因Psefu_1272或源于假单胞菌12-X且经过密码子优化的编码氨基己二酸半醛脱氢酶的基因Psefu_1272。
根据本发明的另一些实施方式，所述基因工程菌为经过底盘微生物改造的产氨基己二酸的基因工程菌；优选地，所述底盘微生物改造包括前体合成途径的强化和竞争代谢途径相关基因的敲除或弱化。
本发明中，所述前体合成途径的强化包括在基因工程菌中过表达前体合成途径的关键基因。
在本发明的一些实施例中，所述前体合成途径的关键基因包括编码天冬氨酸激酶的基因lysC或其突变体基因lysC-Q298G和lysC-T311I、编码二氢吡啶二羧酸还原酶的基因dapB、编码二氨基庚二酸脱氢酶的基因ddh、编码二氨基庚二酸脱羧酶的基因lysA、编码丙酮酸羧化酶的基因pyc、编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因ppc。
在本发明的一些具体的实施例中，编码天冬氨酸激酶的lysC基因的突变体基因lysC-Q298G为在lysC基因编码的天冬氨酸激酶的第298位的谷氨酰胺突变为甘氨酸的编码基因。
在本发明的一些具体的实施例中，编码天冬氨酸激酶的lysC基因的突变体基因lysC-T311I为lysC基因编码的天冬氨酸激酶的第311位的苏氨酸突变为异亮氨酸的编码基因。
本发明中，所述竞争代谢途径相关基因包括三羧酸循环(TCA循环)相关基因、乳酸途径相关基因和乙酸途径相关基因。
在本发明的一些实施例中，所述三羧酸循环相关基因优选为编码柠檬酸合酶的基因gltA。
在本发明的另一些实施例中，所述乳酸途径相关基因优选为编码乳酸脱氢酶的基因ldh。
在本发明的又一些实施例中，所述乙酸途径相关基因包括编码磷酸乙酰基转移酶的基因pta、编码酰基磷酸酶的基因acyP和编码丙酮酸脱氢酶的基因poxB。
根据本发明，所述宿主菌包括大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌、酵母、以及经过改造的细菌、真菌。
在本发明的一些优选的实施例中，所述宿主菌为谷氨酸棒状杆菌。
在本发明的一些进一步优选的实施例中，所述宿主菌为谷氨酸棒状杆菌ATCC13032或者谷氨酸棒状杆菌ATCC21543。
在本发明的一些具体的实施例中，当所述宿主菌为谷氨酸棒状杆菌ATCC21543时，所述基因工程菌为敲除了谷氨酸棒状杆菌ATCC21543的赖氨酸外排转运蛋白编码基因lysE和/或过表达来源于大肠杆菌的赖氨酸摄取转运蛋白编码基因lysP或来源于谷氨酸棒状杆菌内源的赖氨酸摄取转运蛋白编码基因lysI的重组谷氨酸棒状杆菌ATCC21543。
本发明第二方面提供了一种如本发明第一方面所述的基因工程菌在生产氨基己二酸中的应用。
根据本发明，所述应用包括将产氨基己二酸的基因工程菌接入发酵培养基，进行发酵培养，然后对所获得的发酵培养液进行分离纯化，制得氨基己二酸。
在本发明的一些实施例中，所述发酵培养条件为：发酵培养基为LBG培养基，发酵温度为30-32℃，发酵培养时间为48h，IPTG诱导浓度为0.8-1.2mM；进一步优选地，体外添加赖氨酸，且赖氨酸添加量为2-10g/L，更进一步优选为5-10g/L。
在本发明的另一些实施方式中，对所获得的发酵培养液进行分离纯化包括：
步骤S1，对发酵培养液进行第Ⅰ次离心分离，获得第Ⅰ上清液；
步骤S2，用含有0.1％甲酸的甲醇将第Ⅰ上清液稀释10倍，混匀后，进行第Ⅱ次离心分离，获得第Ⅱ上清液；
步骤S3，用0.22μm的有机相滤膜过滤第Ⅱ上清液，获得氨基己二酸。
本发明人采用谷氨酸棒状杆菌为宿主细胞，通过导入编码赖氨酸脱氢酶与氨基己二酸半醛脱氢酶的基因，并通过强化前体合成途径和敲除或弱化竞争代谢途径相关基因对谷氨酸棒状杆菌进行底盘微生物改造，构建并获得一种氨基己二酸的基因工程菌，该菌为高产氨基己二酸的基因工程菌，利用该基因工程菌生产氨基己二酸，转化率高，经济性好，易于工业化生产。
附图说明
下面结合附图来对本发明作进一步详细说明：
图1示出生物合成氨基己二酸的反应机理；
图2为添加5/L赖氨酸时，氨基己二酸产量图；
图3示出不同赖氨酸添加量对氨基己二酸产量的影响；
图4为菌株cgLN发酵生产氨基己二酸产量图。
具体实施方式
为使本发明容易理解，下面将结合附图详细说明本发明。但在详细描述本发明前，应当理解本发明不限于描述的具体实施方式。还应当理解，本文中使用的术语仅为了描述具体实施方式，而并不表示限制性的。
除非另有定义，本文中使用的所有术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可以在本发明的实施或测试中使用，但是现在描述了优选的方法和材料。
Ⅰ、术语
本发明所述用语“底盘微生物”亦称为“底盘微生物细胞”是指利用微生物细胞作为平台，置入功能化的生物系统，使该细胞能够具备人类需要的功能，用于生物合成。就好比汽车有了底盘才有基础，在这个基础上可以制造各种各样的车体，安装各种功能组件。所以，底盘微生物细胞需要本身的功能精简，但是要具备最基本的自我复制和代谢能力，这样就能成为一个可以不断添加功能的空白平台。
本发明所述用语“基因工程菌”是指将目的基因导入宿主生物体(即宿主细胞或底盘微生物或细菌体)内使其表达，或者对其进行包括前体合成途径的强化和竞争代谢途径相关基因的敲除或弱化的底盘微生物改造产生所需要的蛋白的细菌，如谷氨酸棒状杆菌等。基因工程的核心技术是DNA的重组技术，因此，本发明中也将基因工程菌称为重组微生物。
本发明所述用语“重组”是指利用供体生物的遗传物质或人工合成的基因，经过体外或离体的限制酶切割后与适当的载体连接起来形成重组DNA分子，然后再将重组DNA分子导入到受体细胞或受体生物构建转基因生物，该种生物就可以按人类事先设计好的蓝图表现出另外一种生物的某种性状。
Ⅱ、实施方案
针对目前生物法合成氨基己二酸仍存在转化率低，经济性差等缺点，难以实现工业化的问题，本发明对生物法合成氨基己二酸的工艺技术进行了大量的研究。为实现上述生物合成氨基己二酸的目标，本发明人发现采用谷氨酸棒状杆菌为宿主细胞，通过导入编码赖氨酸脱氢酶与氨基己二酸半醛脱氢酶的基因，以及强化前体合成途径，敲除或弱化竞争代谢途径相关基因对谷氨酸棒状杆菌进行底盘微生物改造，成功构建并获得一种高产氨基己二酸的基因工程菌，利用该基因工程菌生产氨基己二酸转化率高，经济性好，易于工业化生产。由此获得本发明。
因此，本发明第一方面提供了一种氨基己二酸合成的新途径，其通过一种高产氨基己二酸的基因工程菌，实现以赖氨酸为前体的氨基己二酸的高效合成。
为实现上述技术方案，本发明提供了能够产氨基己二酸的宿主菌株，其在原始或改造过的细菌、真菌细胞中表达氨基己二酸合成路径中的基因，制备能够合成氨基己二酸的宿主。
在本发明的一些实施方式中，本发明提供了一种产氨基己二酸的基因工程菌，其为表达了氨基己二酸合成路径中的基因的重组宿主菌。
本发明中，所述氨基己二酸合成路径中的基因包括编码赖氨酸脱氢酶的基因lysDH和编码氨基己二酸半醛脱氢酶的基因Psefu_1272基因的重组宿主菌。
基于上述容易理解，本发明中所涉及的产氨基己二酸的基因工程菌为包含编码赖氨酸脱氢酶的基因lysDH和编码氨基己二酸半醛脱氢酶的基因Psefu_1272的重组宿主菌。
在本发明的一些实施例中，所述编码赖氨酸脱氢酶的基因lysDH为来源于芽孢杆菌12AMOR1的编码赖氨酸脱氢酶的基因lysDH或来源于芽孢杆菌12AMOR1且经过密码子优化的编码赖氨酸脱氢酶的基因lysDH，优选为来源于芽孢杆菌12AMOR1且经过密码子优化的编码赖氨酸脱氢酶的基因lysDH。
在本发明的一些具体实施例中，所述来源于芽孢杆菌12AMOR1的编码赖氨酸脱氢酶的基因lysDH(GenBank:AKM17750.1)的核苷酸序列如SEQ No.1所示。
在本发明的另一些具体的实施例中，所述来源于芽孢杆菌12AMOR1且经过密码子优化的编码赖氨酸脱氢酶的基因lysDH的核苷酸序列如SEQ No.2所示。
在本发明的另一些实施例中，所述编码氨基己二酸半醛脱氢酶的基因Psefu_1272为来源于假单胞菌12-X的编码氨基己二酸半醛脱氢酶的基因Psefu_1272或源于假单胞菌12-X且经过密码子优化的编码氨基己二酸半醛脱氢酶的基因Psefu_1272，优选为源于假单胞菌12-X且经过密码子优化的编码氨基己二酸半醛脱氢酶的基因Psefu_1272。
在本发明的一些具体实施例中，所述来源于假单胞菌12-X的编码氨基己二酸半醛脱氢酶的基因Psefu_1272(GenBank:AEF21248.1)的核苷酸序列如SEQ No.3所示。
在本发明的另一些具体的实施例中，所述源于假单胞菌12-X且经过密码子优化的编码氨基己二酸半醛脱氢酶的基因Psefu_1272的核苷酸序列如SEQ No.4所示。
在本发明的一些具体实施例中，通过在宿主菌(例如，原始或改造过的细菌，真菌)中高效表达氨基己二酸合成途径中相关酶的基因，优选来源于芽孢杆菌12AMOR1(Geobacillus sp.12AMOR1)的编码赖氨酸脱氢酶的基因lysDH(GenBank:AKM17750.1)和来源于假单胞菌12-X(Pseudomonas fulva 12-X)的编码氨基己二酸半醛脱氢酶的基因Psefu_1272(GenBank:AEF21248.1)。通过这些酶在宿主中的高效表达，实现以赖氨酸为前体的氨基己二酸合成。
根据本发明，所述宿主菌包括大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌、酵母、以及经过改造的细菌、真菌；优选地，所述宿主菌为谷氨酸棒状杆菌；具体优选地，所述宿主菌为谷氨酸棒状杆菌ATCC13032或者谷氨酸棒状杆菌ATCC21543。
在本发明的一些优选的实施例中，利用高产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌ATCC21543(保藏编号为ATCC21543的谷氨酸棒状杆菌)作为宿主生产氨基己二酸时，通过敲除谷氨酸棒状杆菌ATCC21543的赖氨酸外排转运蛋白编码基因lysE和/或增强赖氨酸摄取转运蛋白相关基因的表达(例如，过表达来源于大肠杆菌的赖氨酸摄取转运蛋白编码基因lysP或来源于谷氨酸棒状杆菌内源的赖氨酸摄取转运蛋白编码基因lysI)，能够减少赖氨酸的积累进而提高氨基己二酸的产量。
这可以理解为，当所述宿主菌为谷氨酸棒状杆菌ATCC21543时，所述基因工程菌可以是单独敲除了谷氨酸棒状杆菌ATCC21543的赖氨酸外排转运蛋白编码基因lysE，也可以是在敲除谷氨酸棒状杆菌ATCC21543的赖氨酸外排转运蛋白编码基因lysE的同时过表达来源于大肠杆菌的赖氨酸摄取转运蛋白编码基因lysP或来源于谷氨酸棒状杆菌内源的赖氨酸摄取转运蛋白编码基因lysI的重组谷氨酸棒状杆菌ATCC21543。
在本发明的一些优选的实施例中，所述赖氨酸摄取转运蛋白编码基因lysP(GenBank:M89774.1)的核苷酸序列如SEQ No.17所示。
在本发明的另一些优选的实施例中，所述赖氨酸摄取转运蛋白编码基因lysI(GenBank:X60312.1)的核苷酸序列如SEQ No.18所示。
在本发明的另一些优选的实施例中，所述赖氨酸外排转运蛋白编码基因lysE(GenBank:X96471.1)的核苷酸序列如SEQ No.24所示。
本发明中对表达质粒的种类没有特殊要求，可根据宿主的选择进行相应的调整，可认为在大肠杆菌中表达目的基因的构建方法可以采用本领域常用的各种方法，如将目的基因和表达载体经过酶切处理后连接，之后不再赘述。
在一些具体优选的实施例中，大肠杆菌菌株Trans10用于载体构建，谷氨酸棒状杆菌ATCC13032(菌种保藏编号为ATCC13032)、谷氨酸棒状杆菌ATCC21543(菌种保藏编号为ATCC21543)及其衍生菌株则作为发酵用菌株。
本发明第一方面的实施方式所涉及的产氨基己二酸的基因工程菌为能表达赖氨酸脱氢酶与氨基己二酸半醛脱氢酶的谷氨酸棒状杆菌ATCC13032(菌种保藏编号为ATCC13032)。
在一些例子中，例如，可以利用基因lysDH和Psefu_1272构建基因工程菌，用于构建重组质粒的相关引物如表1所示，相应的序列如SEQ No.5-8所示。
表1构建重组质粒的相关引物(基因lysDH和Psefu_1272)
Figure BDA0002794383540000071
注：下划线处为限制性内切酶内切位点序列。
在本发明的另一些实施方式中，所述基因工程菌为经过底盘微生物改造的产氨基己二酸的基因工程菌，其中，所述底盘微生物改造包括前体合成途径的强化和竞争代谢途径相关基因的敲除或弱化。
本发明中，所述前体合成途径的强化包括在基因工程菌中过表达前体合成途径的关键基因，其通过增强前体赖氨酸的合成，进而实现氨基己二酸从葡萄糖或木糖等简单碳源的高效合成。
在本发明的一些实施例中，所述前体合成途径的关键基因包括编码天冬氨酸激酶的基因lysC或其突变体基因lysC-Q298G和lysC-T311I、编码二氢吡啶二羧酸还原酶的基因dapB、编码二氨基庚二酸脱氢酶的基因ddh、编码二氨基庚二酸脱羧酶的基因lysA、编码丙酮酸羧化酶的基因pyc、编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因ppc。
在本发明的一些具体优选的实施例中，所述编码天冬氨酸激酶的基因lysC(GenBank:X57226.1)的核苷酸序列如SEQ No.9所示。
在本发明的一些具体的实施例中，编码天冬氨酸激酶的lysC基因的突变体基因lysC-Q298G为在基因lysC编码的天冬氨酸激酶的第298位的谷氨酰胺突变为甘氨酸的编码基因，具体为lysC基因的第892至894位的碱基CAG突变为GGC/GGT/GGA/GGG，并且将第一位碱基G变换为A。
在本发明的一些具体优选的实施例中，所述编码天冬氨酸激酶的基因lysC的突变体基因lysC-Q298G的核苷酸序列如SEQ No.10所示。
在本发明的一些具体的实施例中，编码天冬氨酸激酶的lysC基因的突变体基因lysC-T311I为基因lysC编码的天冬氨酸激酶的第311位的苏氨酸突变为异亮氨酸的编码基因，具体为lysC基因的第931至933位的碱基ACC突变为ATT/ATC/ATA，并且将第一位碱基G变换为A。
在本发明的一些具体优选的实施例中，所述编码天冬氨酸激酶的基因lysC的突变体基因lysC-T311I的核苷酸序列如SEQ No.11所示。
在本发明的一些具体优选的实施例中，所述编码二氢吡啶二羧酸还原酶的基因dapB(GenBank:X67737.1)的核苷酸序列如SEQ No.12所示。
在本发明的一些具体优选的实施例中，所述编码二氨基庚二酸脱氢酶的基因ddh(GenBank:Y00151.1)的核苷酸序列如SEQ No.13所示。
在本发明的一些具体优选的实施例中，所述编码二氨基庚二酸脱羧酶的基因lysA(GenBank:X07563.1)的核苷酸序列如SEQ No.14所示。
在本发明的一些具体优选的实施例中，所述编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因ppc(GenBank:BX927152.1)的核苷酸序列如SEQ No.15所示。
本发明中，所述编码丙酮酸羧化酶的基因pyc(GenBank:BAB98082.1)的核苷酸序列如SEQ No.16所示。
本发明中，通过敲除或弱化竞争代谢途径相关基因进行底盘微生物改造，由此可以调控碳代谢流向，使代谢通量更多的流向氨基己二酸的合成，籍此使更多的底物流向氨基己二酸的合成，从而获得高产氨基己二酸的谷氨酸棒状杆菌基因工程菌。
在本发明的一些实施例中，所述竞争代谢途径相关基因包括三羧酸循环(TCA循环)相关基因、乳酸途径相关基因和乙酸途径相关基因；其中，所述三羧酸循环相关基因优选为编码柠檬酸合酶的基因gltA；所述乳酸途径相关基因优选为编码乳酸脱氢酶的基因ldh；所述乙酸途径相关基因包括编码磷酸乙酰基转移酶的基因pta、编码酰基磷酸酶的基因acyP和编码丙酮酸脱氢酶的基因poxB。
在本发明的一些具体实施例中，所述编码柠檬酸合酶的基因gltA(GenBank:X66112.1)的核苷酸序列如SEQ No.19所示。
在本发明的一些具体实施例中，所述编码乳酸脱氢酶的基因ldh(GenBank:BAC00305.1)的核苷酸序列如SEQ No.20所示。
在本发明的一些具体实施例中，所述编码磷酸乙酰基转移酶的基因pta(GenBank:X89084.1)的核苷酸序列如SEQ No.21所示。
在本发明的一些具体实施例中，所述编码酰基磷酸酶的基因acyP(GenBank:BAB99459.1)的核苷酸序列如SEQ No.22所示。
在本发明的一些具体实施例中，所述编码丙酮酸脱氢酶的基因poxB(GenBank:BAC00004.1)的核苷酸序列如SEQ No.23所示。
本发明利用上述第一和第二方面的实施方式调控碳代谢流向，从而达到调控氨基己二酸合成的目的。
本发明采用谷氨酸棒状杆菌为宿主细胞，通过导入编码赖氨酸脱氢酶与氨基己二酸半醛脱氢酶的基因，以及强化前体合成途径，敲除或弱化竞争代谢途径相关基因对谷氨酸棒状杆菌进行底盘微生物改造，成功构建并获得了高产氨基己二酸的基因工程菌。
实际上，采用启动子工程、RBS调控策略或者酶修饰等手段调控谷氨酸棒状杆菌或产氨基己二酸的基因工程菌中编码赖氨酸脱氢酶与氨基己二酸半醛脱氢酶的酶活，可以进一步构建并获得一种新的高产氨基己二酸的基因工程菌；例如，通过启动子工程，筛选高效的启动子来增强编码赖氨酸脱氢酶的基因lysDH和编码氨基己二酸半醛脱氢酶的基因Psefu_1272的转录，进而增强赖氨酸到氨基己二酸的转化。
本发明第二方面所涉及的如本发明第一方面所述的基因工程菌在生产氨基己二酸中的应用，可以理解为利用如本发明第一方面所述的基因工程菌生产氨基己二酸的方法。
根据本发明，所述应用包括将产氨基己二酸的基因工程菌接入发酵培养基，进行发酵培养，然后对所获得的发酵培养液进行分离纯化，制得氨基己二酸。
在本发明的一些实施例中，将产氨基己二酸的基因工程菌接入发酵培养基进行发酵培养包括：将产氨基己二酸的基因工程菌接入发酵培养基，在30-32℃，优选为30℃下，200rpm，培养48小时，获得发酵培养液；在OD600＝2.5左右时，加入终浓度为0.8-1.2mM，优选为0.8mM的IPTG进行诱导；需要时培养基中添加赖氨酸，且赖氨酸添加量为2-10g/L，优选为5-10g/L，更优选为5g/L。
在本发明的另一些实施方式中，对所获得的发酵培养液进行分离纯化包括：
步骤S1，以12000rpm的转速对发酵培养液进行第Ⅰ次离心分离，获得第Ⅰ上清液；
步骤S2，用含有0.1％甲酸的甲醇将第Ⅰ上清液稀释10倍，混匀后，以15000rpm的转速进行第Ⅱ次离心分离，获得第Ⅱ上清液；
步骤S3，用0.22μm的有机相滤膜过滤第Ⅱ上清液，获得氨基己二酸。
本发明中对于发酵培养基没有特别的限定，只要是用于生产氨基己二酸的发酵培养基即可，优选地，所述发酵培养基配方为：葡萄糖50g/L，酵母粉15g/L，(NH)2SO4 15g/L，KH2PO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，MnSO4·H2O 0.01g/L，FeSO4·7H2O，CaCO3 15g/L。
Ⅲ、实施例
以下通过具体实施例对于本发明进行具体说明。下文所述实验方法，如无特殊说明，均为实验室常规方法。下文所述实验材料，如无特别说明，均可由商业渠道获得。
实施例1：重组质粒构建
本实施例中所用到的引物及限制性内切酶酶切位点如前文中表1所示。
委托华大基因对来源于芽孢杆菌12AMOR1(Geobacillus sp.12AMOR1)的编码赖氨酸脱氢酶的基因lysDH(GenBank:AKM17750.1，密码子优化后的核苷酸序列为SEQ No.2所示)和来源于假单胞菌12-X(Pseudomonas fulva 12-X)的编码氨基己二酸半醛脱氢酶的基因Psefu_1272(GenBank:AEF21248.1，密码子优化后的核苷酸序列为SEQ No.4所示)进行全基因合成，获得携带有lysDH基因的pUC57质粒(pUC57-lysDH)和携带有Psefu_1272基因的pUC57质粒(pUC57-Psefu_1272)。分别利用lysDH-HindIII-F/lysDH-HindIII-R和Psefu_1272-BamHI-F/Psefu_1272-BamHI-R作为引物，以pUC57-lysDH和pUC57-Psefu_1272作为模板，进行目的基因lysDH与Psefu_1272的扩增。接着用相应的限制性内切酶对目的基因片段和载体进行酶切，将酶切后的片段进行切胶回收，之后将目的基因插入到大肠杆菌-谷氨酸棒状杆菌穿梭质粒PXMJ19中，获得质粒PXMJ19-L与PXMJ19-L-P(见表1)。
实施例2：重组菌株的制备
制备谷氨酸棒状杆菌ATCC13032和谷氨酸棒状杆菌ATCCATCC21543的感受态细胞，并分装100μL于1.5mL的EP管用于电转化。将构建好的PXMJ19-L-P重组质粒2-4μL加入到含有100μL感受态细胞的1.5mL离心管中，混合均匀，冰浴5-10min。接着利用电转仪将质粒电转进入感受态细胞中。电转完成后，快速加入LBHIS培养基[蛋白胨5g/L，酵母粉2.5g/L，NaCl 5g/L，脑心浸提物(BHI)18.5g/L，山梨醇91g/L，116℃灭菌25min。对应的固体培养基添加1.8％-2％琼脂。]，并将混合物转移到1.5mL离心管中，46℃水浴或金属浴6min后置于30℃复苏2-3h。之后将菌液涂到含有相应抗生素的平板上，30℃培养24-36h。制备成生产氨基己二酸的菌株cgN和cgLN(见表2)。
表2质粒和菌株
Figure BDA0002794383540000111
表2中，tac启动子为PXMJ19质粒的原始启动子；pBL复制子为PXMJ19质粒的复制子；PXMJ19质粒为商购获得。
实施例3：生产氨基己二酸菌株的发酵
(1)产氨基己二酸基因工程菌株的摇瓶培养
在生产氨基己二酸的菌株cgN或者菌株cgLN的平板上挑取单菌落，接到4mL的带有抗性的液体LBHIS中，30℃下培养12h，之后将菌液转接到20mL的LBG种子培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，葡萄糖20g/L，116℃灭菌25min)中培养12h，再按5％的接种量，转接至50ml发酵培养基中，需要时培养基中添加不同浓度的赖氨酸，在OD600＝2.5左右时，加入终浓度0.8mM的IPTG进行诱导。发酵培养条件为30℃，200rpm，培养时间为48小时。取样并用液相色谱-质谱联用测定氨基己二酸的浓度。菌株cgN的最终产量如图2和图3所示，体外添加5g/L赖氨酸及从头合成产量分别达到565mg/L和22mg/L。菌株cgLN的最终产量如图4所示，
(2)生物量测定
取发酵液加入适量无菌蒸馏水稀释至OD600＝0.2～0.8之间，取200μL稀释后的发酵液至于96孔板中，利用酶标仪在600nm波长下进行吸光度测定。
(3)样品处理与检测
将上述发酵液在4℃，12000rpm条件下离心10min。取100μL上清液加入含有0.1％甲酸的甲醇900μL，稀释10倍，混匀后在4℃，15000rpm条件下离心15min。上清液过0.22μm的有机相滤膜。之后利用气相色谱-质谱联用进行产物鉴定，利用液相色谱-质谱联用或者高效液相色谱进行定量检测。
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明做出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。
序列表
<110> 北京化工大学
<120> 一种产氨基己二酸的基因工程菌
<130> RB2004561-FF
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1161
<212> DNA
<213> （编码赖氨酸脱氢酶的基因lysDH）
<400> 1
atgaaagtgc tcgtgcttgg agcggggctg atgggaaaag aagcggcgcg cgatttagtg 60
caaagccaag atgttgaggc ggtgacgttg gcggatgtcg atttggccaa ggcggagcag 120
acggtgcggc agcttcattc cgaaaagctt gccgctgtgc gggtggatgc cggcgatccg 180
caacaactgg cagcggccat gcaagggcat gatgtcgtcg tcaatgcctt gttttaccgc 240
ttcaatgaaa cggtggcgaa aacagcgatc gaaacgggtg ttcattccgt tgatttaggc 300
ggccatatcg gccatattac cgatcgggtg cttgaaatgc acgaggaggc tcagaaagcg 360
ggggtgacga tcattccgga tcttggcgtc gcgccgggga tgatcaacat tttatccggc 420
tatggggcga gtcaactcga tgaggtggaa tccatcttgc tgtatgttgg cggcatcccc 480
gtccgccctg agccgccgct cgagtacaac catgtgtttt cgctcgaggg gctgcttgac 540
cattacaccg atccgtctct cattatccgc gacggccaaa agcaggaagt gccgtcgctt 600
tcggaagtcg agccgattta tttcgaccgg ttcgggccgc ttgaagcgtt tcacacctca 660
ggcgggacgt cgacgctctc gcgctcgttt ccgaacttga agcggctcga gtacaaaacg 720
atccgctacc gcggccatgc agaaaaattt aagctgctcg tcgatttgaa cttgacgcgc 780
cacgatgtgg aagtggaggt caatggatgc aaagtcaaac cgcgcgatgt gctgctttcc 840
gtcctgaagc cgctgcttga tttgaaaggg aaagatgatg tggtgttgct tcgggtcatc 900
gtcggcggta gaaaagatgg aaaagaaacg gtgctggaat acgaaaccgt cacgttcaat 960
gaccgcgaaa ataaggtgac ggcgatggcg cgtacgacgg cctacaccat ttccgctgtc 1020
gcccagctca tcggccgtgg ggtgatcaca aagcgcggcg tctatccgcc ggagcaagcc 1080
gtgccaggag aggtgtatat tgaggaaatg aaaaggcgcg gggtcgtgat tagcgagaaa 1140
caaacgattc gcccttgcta a 1161
<210> 2
<211> 1161
<212> DNA
<213> （经过密码子优化的编码赖氨酸脱氢酶的基因lysDH）
<400> 2
atgaaggtcc tggtgctggg cgcaggcctg atgggcaagg aggctgcacg cgacctggtc 60
cagtcccagg atgtcgaggc agtgaccctg gcagatgtcg acctggctaa ggcagaacag 120
accgtccgcc agctgcactc cgaaaagctg gcagcagtgc gcgtggatgc tggcgaccca 180
cagcagctgg ctgctgcaat gcagggccac gatgtggtgg tgaacgcact gttctaccgc 240
ttcaacgaga ccgtcgcaaa gaccgcaatc gaaaccggcg tgcactccgt cgatctgggc 300
ggccacatcg gccacatcac cgaccgcgtc ctggaaatgc acgaagaggc tcagaaggca 360
ggcgtgacca tcatcccaga tctgggcgtc gctccaggca tgatcaacat cctgtccggc 420
tacggcgcat cccagctgga cgaggtcgaa tccatcctgc tgtacgtcgg cggcatccca 480
gtgcgcccag aaccaccact ggagtacaac cacgtcttct ccctggaggg cctgctggat 540
cactacaccg acccatccct gatcatccgc gacggccaga agcaggaagt gccatccctg 600
tccgaggtgg aaccaatcta cttcgatcgc ttcggcccac tggaggcttt ccacacctcc 660
ggcggcacct ccaccctgtc ccgttccttc ccaaacctga agcgcctgga gtacaagacc 720
atccgctacc gcggccacgc agagaagttc aagctgctgg tggatctgaa cctgacccgc 780
cacgatgtgg aggtcgaggt gaacggctgc aaggtgaagc cacgcgacgt cctgctgtcc 840
gtgctgaagc cactgctgga cctgaagggc aaggatgacg tcgtcctgct gcgcgtgatc 900
gtgggcggcc gtaaggacgg caaggaaacc gtgctggaat acgagaccgt caccttcaac 960
gaccgcgaga acaaggtcac cgctatggct cgcaccaccg cttacaccat ctccgcagtg 1020
gcacagctga tcggccgcgg cgtcatcacc aagcgcggcg tttacccacc agaacaggct 1080
gtgccaggcg aagtgtacat cgaggagatg aagcgccgcg gcgtggtcat ttccgaaaag 1140
cagaccatcc gcccatgcta a 1161
<210> 3
<211> 1494
<212> DNA
<213> （编码氨基己二酸半醛脱氢酶的基因Psefu_1272）
<400> 3
atggtcaact cgctactcga acgtctcggt gtcagcgcca gcgcctacca gaacggcagt 60
cacgcggttc atacgccgat cgacggcagc cagatcggca gcctgaccct tgagggcgca 120
gacgccgtgc gtgccaagat caccgccggc cacgacgcct ttctggcctg gcgcaaggtg 180
ccggcgccgc ggcgtggcga gctggtgcgt ctgttcggcg aggtgctgcg tgagcacaag 240
gccgatctcg gcgagctggt gtccatcgaa gccggcaaga tcactcagga aggcctgggc 300
gaagtgcagg aaatgatcga catctgcgac ttcgccgtcg gcctgtcgcg ccagctctac 360
ggcctgacca tcgcctccga gcgctcgggc caccatatgc gtgaaacctg gcacccgctg 420
ggcgtggtcg gcgtgatcag cgccttcaac ttcccggtcg ccgtgtgggc gtggaacacc 480
accctggccc tggtcgccgg caacgcggtg atctggaagc cgtcggaaaa gaccccgctg 540
accgccctgg cctcccaggc actgttcgac aaggccctcg agcgcttcgg cagcgacgcc 600
ccgcaaggcc tggcgcaact ggtgatcggt gatcgcgaag ccggcgaagt gctggtcgac 660
gacccgcgcg tgccgctgat cagcgcgacc ggcagcaccc gcatgggccg cgaagtcgcc 720
ccgcgggtgg ctgcccgctt cggccgcagc attctggaac tgggcggcaa caacgccatg 780
atcctcgccc ccagcgccga cctcgacctg gccgtgcgcg gcatcctgtt cagcgccgtc 840
ggcaccgccg gccagcgttg caccaccctg cgccgcctga tcgtccatcg ttcgatcaag 900
gacgaggtgg tcgcccgcgt caaagccgcc tacgccaagg tacgcatcgg cgacccgcgc 960
cagggcaacc tgatcggccc gctgatcgac aagcaggcgt tcagcgccat gcaggacgcc 1020
ctcgccaagg cccgcgacga aggcggccag gtgttcggtg gcgagcgcca gctggccgac 1080
accttcccca acggctacta cgtgagccct gccatcgtcg agatgccggg ccagactgca 1140
gtggtgcgcc atgaaacctt cgcgccgatc ctctacgtgc tcgcctacga cgacttcgaa 1200
gaggcgctgc gcctgaacaa cgaagtgccc cagggcctgt cctcgtgcat cttcaccacc 1260
gacgtgcgtg aagccgaagc cttccagggc gcggccggca gcgactgcgg catcgccaac 1320
gtcaacatcg gcaccagcgg tgcggaaatc ggcggcgcct ttggcggcga gaaggaaacc 1380
ggtggcggtc gcgagtccgg ctccgatgcc tggaaggcct acatgcgccg ccagaccaat 1440
accgtcaact actcccgaga gttgccgctg gcccagggca tcgtgttcga ctga 1494
<210> 4
<211> 1494
<212> DNA
<213> （经过密码子优化的编码氨基己二酸半醛脱氢酶的基因Psefu_1272）
<400> 4
atggtgaact ccctgctgga acgcctgggc gtgtccgcat ccgcatacca gaacggctcc 60
cacgcagtcc acaccccaat cgacggctcc cagatcggct ccctgaccct ggagggcgca 120
gatgcagtcc gcgcaaagat caccgctggc cacgacgcat tcctggcttg gcgcaaggtg 180
ccagctccac gccgcggtga gctggtccgt ctgttcggcg aagtcctgcg cgaacacaag 240
gctgatctgg gcgaactggt gtccatcgaa gctggcaaga tcacccagga gggcctgggc 300
gaagtgcagg agatgatcga catctgcgat ttcgctgtcg gcctgtcccg ccagctgtac 360
ggcctgacca tcgcttccga acgctccggc caccacatgc gcgaaacctg gcacccactg 420
ggcgtcgtgg gcgtgatctc cgcattcaac ttcccagtgg ctgtctgggc ttggaacacc 480
accctggcac tggtggcagg caacgctgtg atctggaagc catccgagaa gaccccactg 540
accgcactgg catcccaggc actgttcgac aaggctctgg aacgcttcgg ctccgatgct 600
ccacagggcc tggctcagct ggtcatcggc gatcgcgaag ctggcgaggt gctggtcgac 660
gatccacgcg tcccactgat ctccgcaacc ggctccaccc gcatgggccg tgaggtggct 720
ccacgcgtgg ctgcacgctt cggccgttcc atcctggaac tgggcggcaa caacgctatg 780
atcctggctc catccgcaga tctggatctg gcagtccgcg gcatcctgtt ctccgctgtc 840
ggcaccgctg gccagcgctg taccaccctg cgccgtctga tcgtgcaccg ctccatcaag 900
gatgaagtcg tcgcacgcgt gaaggcagca tacgcaaagg tgcgcatcgg cgacccacgc 960
cagggcaacc tgatcggccc actgatcgat aagcaggcat tctccgctat gcaggacgca 1020
ctggctaagg cacgcgatga aggcggccag gtcttcggcg gcgaacgcca actggctgat 1080
accttcccaa acggctacta cgtgtcccca gcaatcgtgg agatgccagg ccagaccgct 1140
gtggtccgcc acgaaacctt cgcaccaatc ctgtacgtgc tggcttacga tgacttcgaa 1200
gaggctctgc gcctgaacaa cgaggtccca cagggcctct cctcctgcat cttcaccacc 1260
gatgtccgcg aggctgaagc tttccagggc gcagcaggct ccgactgcgg catcgctaac 1320
gtcaacatcg gcacctccgg cgctgagatc ggcggcgcat tcggcggtga gaaggagacc 1380
ggcggcggcc gtgaatccgg ctctgatgca tggaaggcat acatgcgccg ccagaccaac 1440
accgtgaact actcccgcga actgccactg gcacagggca tcgtcttcga ttaa 1494
<210> 5
<211> 42
<212> DNA
<213> （引物lysDH-HindIII-F）
<400> 5
cccaagctta aggaggatat acatatgaag gtcctggtgc tg 42
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> （引物lysDH-HindIII-R）
<400> 6
cccaagcttt tagcatgggc ggatggtc 28
<210> 7
<211> 42
<212> DNA
<213> （引物Psefu_1272-BamHI-F）
<400> 7
cgcggatcca aggaggatat acatatggtg aactccctgc tg 42
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> （引物Psefu_1272-BamHI-R）
<400> 8
cgcggatcct taatcgaaga cgatgccctg 30
<210> 9
<211> 1266
<212> DNA
<213> （编码天冬氨酸激酶的基因lysC）
<400> 9
gtggccctgg tcgtacagaa atatggcggt tcctcgcttg agagtgcgga acgcattaga 60
aacgtcgctg aacggatcgt tgccaccaag aaggctggaa atgatgtcgt ggttgtctgc 120
tccgcaatgg gagacaccac ggatgaactt ctagaacttg cagcggcagt gaatcccgtt 180
ccgccagctc gtgaaatgga tatgctcctg actgctggtg agcgtatttc taacgctctc 240
gtcgccatgg ctattgagtc ccttggcgca gaagcccaat ctttcacggg ctctcaggct 300
ggtgtgctca ccaccgagcg ccacggaaac gcacgcattg ttgatgtcac tccaggtcgt 360
gtgcgtgaag cactcgatga gggcaagatc tgcattgttg ctggtttcca gggtgttaat 420
aaagaaaccc gcgatgtcac cacgttgggt cgtggtggtt ctgacaccac tgcagttgcg 480
ttggcagctg ctttgaacgc tgatgtgtgt gagatttact cggacgttga cggtgtgtat 540
accgctgacc cgcgcatcgt tcctaatgca cagaagctgg aaaagctcag cttcgaagaa 600
atgctggaac ttgctgctgt tggctccaag attttggtgc tgcgcagtgt tgaatacgct 660
cgtgcattca atgtgccact tcgcgtacgc tcgtcttata gtaatgatcc cggcactttg 720
attgccggct ctatggagga tattcctgtg gaagaagcag tccttaccgg tgtcgcaacc 780
gacaagtccg aagccaaagt aaccgttctg ggtatttccg ataagccagg cgaggctgcg 840
aaggttttcc gtgcgttggc tgatgcagaa atcaacattg acatggttct gcagaacgtc 900
tcttctgtag aagacggcac caccgacatc accttcacct gccctcgttc cgacggccgc 960
cgcgcgatgg agatcttgaa gaagcttcag gttcagggca actggaccaa tgtgctttac 1020
gacgaccagg tcggcaaagt ctccctcgtg ggtgctggca tgaagtctca cccaggtgtt 1080
accgcagagt tcatggaagc tctgcgcgat gtcaacgtga acatcgaatt gatttccacc 1140
tctgagattc gtatttccgt gctgatccgt gaagatgatc tggatgctgc tgcacgtgca 1200
ttgcatgagc agttccagct gggcggcgaa gacgaagccg tcgtttatgc aggcaccgga 1260
cgctaa 1266
<210> 10
<211> 1266
<212> DNA
<213> （编码天冬氨酸激酶的基因lysC的突变体基因lysC-Q298G）
<400> 10
atggccctgg tcgtacagaa atatggcggt tcctcgcttg agagtgcgga acgcattaga 60
aacgtcgctg aacggatcgt tgccaccaag aaggctggaa atgatgtcgt ggttgtctgc 120
tccgcaatgg gagacaccac ggatgaactt ctagaacttg cagcggcagt gaatcccgtt 180
ccgccagctc gtgaaatgga tatgctcctg actgctggtg agcgtatttc taacgctctc 240
gtcgccatgg ctattgagtc ccttggcgca gaagcccaat ctttcacggg ctctcaggct 300
ggtgtgctca ccaccgagcg ccacggaaac gcacgcattg ttgatgtcac tccaggtcgt 360
gtgcgtgaag cactcgatga gggcaagatc tgcattgttg ctggtttcca gggtgttaat 420
aaagaaaccc gcgatgtcac cacgttgggt cgtggtggtt ctgacaccac tgcagttgcg 480
ttggcagctg ctttgaacgc tgatgtgtgt gagatttact cggacgttga cggtgtgtat 540
accgctgacc cgcgcatcgt tcctaatgca cagaagctgg aaaagctcag cttcgaagaa 600
atgctggaac ttgctgctgt tggctccaag attttggtgc tgcgcagtgt tgaatacgct 660
cgtgcattca atgtgccact tcgcgtacgc tcgtcttata gtaatgatcc cggcactttg 720
attgccggct ctatggagga tattcctgtg gaagaagcag tccttaccgg tgtcgcaacc 780
gacaagtccg aagccaaagt aaccgttctg ggtatttccg ataagccagg cgaggctgcg 840
aaggttttcc gtgcgttggc tgatgcagaa atcaacattg acatggttct gggcaacgtc 900
tcttctgtag aagacggcac caccgacatc accttcacct gccctcgttc cgacggccgc 960
cgcgcgatgg agatcttgaa gaagcttcag gttcagggca actggaccaa tgtgctttac 1020
gacgaccagg tcggcaaagt ctccctcgtg ggtgctggca tgaagtctca cccaggtgtt 1080
accgcagagt tcatggaagc tctgcgcgat gtcaacgtga acatcgaatt gatttccacc 1140
tctgagattc gtatttccgt gctgatccgt gaagatgatc tggatgctgc tgcacgtgca 1200
ttgcatgagc agttccagct gggcggcgaa gacgaagccg tcgtttatgc aggcaccgga 1260
cgctaa 1266
<210> 11
<211> 1266
<212> DNA
<213> （编码天冬氨酸激酶的基因lysC的突变体基因lysC-T311I）
<400> 11
atggccctgg tcgtacagaa atatggcggt tcctcgcttg agagtgcgga acgcattaga 60
aacgtcgctg aacggatcgt tgccaccaag aaggctggaa atgatgtcgt ggttgtctgc 120
tccgcaatgg gagacaccac ggatgaactt ctagaacttg cagcggcagt gaatcccgtt 180
ccgccagctc gtgaaatgga tatgctcctg actgctggtg agcgtatttc taacgctctc 240
gtcgccatgg ctattgagtc ccttggcgca gaagcccaat ctttcacggg ctctcaggct 300
ggtgtgctca ccaccgagcg ccacggaaac gcacgcattg ttgatgtcac tccaggtcgt 360
gtgcgtgaag cactcgatga gggcaagatc tgcattgttg ctggtttcca gggtgttaat 420
aaagaaaccc gcgatgtcac cacgttgggt cgtggtggtt ctgacaccac tgcagttgcg 480
ttggcagctg ctttgaacgc tgatgtgtgt gagatttact cggacgttga cggtgtgtat 540
accgctgacc cgcgcatcgt tcctaatgca cagaagctgg aaaagctcag cttcgaagaa 600
atgctggaac ttgctgctgt tggctccaag attttggtgc tgcgcagtgt tgaatacgct 660
cgtgcattca atgtgccact tcgcgtacgc tcgtcttata gtaatgatcc cggcactttg 720
attgccggct ctatggagga tattcctgtg gaagaagcag tccttaccgg tgtcgcaacc 780
gacaagtccg aagccaaagt aaccgttctg ggtatttccg ataagccagg cgaggctgcg 840
aaggttttcc gtgcgttggc tgatgcagaa atcaacattg acatggttct gcagaacgtc 900
tcttctgtag aagacggcac caccgacatc atcttcacct gccctcgttc cgacggccgc 960
cgcgcgatgg agatcttgaa gaagcttcag gttcagggca actggaccaa tgtgctttac 1020
gacgaccagg tcggcaaagt ctccctcgtg ggtgctggca tgaagtctca cccaggtgtt 1080
accgcagagt tcatggaagc tctgcgcgat gtcaacgtga acatcgaatt gatttccacc 1140
tctgagattc gtatttccgt gctgatccgt gaagatgatc tggatgctgc tgcacgtgca 1200
ttgcatgagc agttccagct gggcggcgaa gacgaagccg tcgtttatgc aggcaccgga 1260
cgctaa 1266
<210> 12
<211> 747
<212> DNA
<213> （编码二氢吡啶二羧酸还原酶的基因dapB）
<400> 12
atgggaatca aggttggcgt tctcggagcc aaaggccgtg ttggtcaaac tattgtggca 60
gcagtcaatg agtccgacga tctggagctt gttgcagaga tcggcgtcga cgatgatttg 120
agccttctgg tagacaacgg cgctgaagtt gtcgttgact tcaccactcc taacgctgtg 180
atgggcaacc tggagttctg catcaacaac ggcatttctg cggttgttgg aaccacgggc 240
ttcgatgatg ctcgtttgga gcaggttcgc gactggcttg aaggaaaaga caatgtcggt 300
gttctgatcg cacctaactt tgctatctct gcggtgttga ccatggtctt ttccaagcag 360
gctgcccgct tcttcgaatc agctgaagtt attgagctgc accaccccaa caagctggat 420
gcaccttcag gcaccgcgat ccacactgct cagggcattg ctgcggcacg caaagaagca 480
ggcatggacg cacagccaga tgcgaccgag caggcacttg agggttcccg tggcgcaagc 540
gtagatggaa tcccggttca tgcagtccgc atgtccggca tggttgctca cgagcaagtt 600
atctttggca cccagggtca gaccttgacc atcaagcagg actcctatga tcgcaactca 660
tttgcaccag gtgtcttggt gggtgtgcgc aacattgcac agcacccagg cctagtcgta 720
ggacttgagc attacctagg cctgtaa 747
<210> 13
<211> 963
<212> DNA
<213> （编码二氨基庚二酸脱氢酶的基因ddh）
<400> 13
atgaccaaca tccgcgtagc tatcgtgggc tacggaaacc tgggacgcag cgtcgaaaag 60
cttattgcca agcagcccga catggacctt gtaggaatct tctcgcgccg ggccaccctc 120
gacacaaaga cgccagtctt tgatgtcgcc gacgtggaca agcacgccga cgacgtggac 180
gtgctgttcc tgtgcatggg ctccgccacc gacatccctg agcaggcacc aaagttcgcg 240
cagttcgcct gcaccgtaga cacctacgac aaccaccgcg acatcccacg ccaccgccag 300
gtcatgaacg aagccgccac cgcagccggc aacgttgcac tggtctctac cggctgggat 360
ccaggaatgt tctccatcaa ccgcgtctac gcagcggcag tcttagccga gcaccagcag 420
cacaccttct ggggcccagg tttgtcacag ggccactccg atgctttgcg acgcatccct 480
ggcgttcaaa aggcagtcca gtacaccctc ccatccgaag acgccctgga aaaggcccgc 540
cgcggcgaag ccggcgacct taccggaaag caaacccaca agcgccaatg cttcgtggtt 600
gccgacgcgg ccgatcacga gcgcatcgaa aacgacatcc gcaccatgcc tgattacttc 660
gttggctacg aagtcgaagt caacttcatc gacgaagcaa ccttcgactc cgagcacacc 720
ggcatgccac acggtggcca cgtgattacc accggcgaca ccggtggctt caaccacacc 780
gtggaataca tcctcaagct ggaccgaaac ccagatttca ccgcttcctc acagatcgct 840
ttcggtcgcg cagctcaccg catgaagcag cagggccaaa gcggagcttt caccgtcctc 900
gaagttgctc catacctgct ctccccagag aacttggacg atctgatcgc acgcgacgtc 960
taa 963
<210> 14
<211> 1338
<212> DNA
<213> （编码二氨基庚二酸脱羧酶的基因lysA）
<400> 14
atggctacag ttgaaaattt caatgaactt cccgcacacg tatggccacg caatgccgtg 60
cgccaagaag acggcgttgt caccgtcgct ggtgtgcctc tgcctgacct cgctgaagaa 120
tacggaaccc cactgttcgt agtcgacgag gacgatttcc gttcccgctg tcgcgacatg 180
gctaccgcat tcggtggacc aggcaatgtg cactacgcat ctaaagcgtt cctgaccaag 240
accattgcac gttgggttga tgaagagggg ctggcactgg acattgcatc catcaacgaa 300
ctgggcattg ccctggccgc tggtttcccc gccagccgta tcaccgcgca cggcaacaac 360
aaaggcgtag agttcctgcg cgcgttggtt caaaacggtg tgggacacgt ggtgctggac 420
tccgcacagg aactagaact gttggattac gttgccgctg gtgaaggcaa gattcaggac 480
gtgttgatcc gcgtaaagcc aggcatcgaa gcacacaccc acgagttcat cgccactagc 540
cacgaagacc agaagttcgg attctccctg gcatccggtt ccgcattcga agcagcaaaa 600
gccgccaaca acgcagaaaa cctgaacctg gttggcctgc actgccacgt tggttcccag 660
gtgttcgacg ccgaaggctt caagctggca gcagaacgcg tgttgggcct gtactcacag 720
atccacagcg aactgggcgt tgcccttcct gaactggatc tcggtggcgg atacggcatt 780
gcctataccg cagctgaaga accactcaac gtcgcagaag ttgcctccga cctgctcacc 840
gcagtcggaa aaatggcagc ggaactaggc atcgacgcac caaccgtgct tgttgagccc 900
ggccgcgcta tcgcaggccc ctccaccgtg accatctacg aagtcggcac caccaaagac 960
gtccacgtag acgacgacaa aacccgccgt tacatcgccg tggacggagg catgtccgac 1020
aacatccgcc cagcactcta cggctccgaa tacgacgccc gcgtagtatc ccgcttcgcc 1080
gaaggagacc cagtaagcac ccgcatcgtg ggctcccact gcgaatccgg cgatatcctg 1140
atcaacgatg aaatctaccc atctgacatc accagcggcg acttccttgc actcgcagcc 1200
accggcgcat actgctacgc catgagctcc cgctacaacg ccttcacacg gcccgccgtc 1260
gtgtccgtcc gcgctggcag ctcccgcctc atgctgcgcc gcgaaacgct cgacgacatc 1320
ctctcactag aggcataa 1338
<210> 15
<211> 2760
<212> DNA
<213> （编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因ppc）
<400> 15
atgactgatt ttttacgcga tgacatcagg ttcctcggtc aaatcctcgg tgaggtaatt 60
gcggaacaag aaggccagga ggtttatgaa ctggtcgaac aagcgcgcct gacttctttt 120
gatatcgcca agggcaacgc cgaaatggat agcctggttc aggttttcga cggcattact 180
ccagccaagg caacaccgat tgctcgcgca ttttcccact tcgctctgct ggctaacctg 240
gcggaagacc tctacgatga agagcttcgt gaacaggctc tcgatgcagg cgacacccct 300
ccggacagca ctcttgatgc cacctggctg aaactcaatg agggcaatgt tggcgcagaa 360
gctgtggccg atgtgctgcg caatgctgag gtggcgccgg ttctgactgc gcacccaact 420
gagactcgcc gccgcactgt ttttgatgcg caaaagtgga tcaccaccca catgcgtgaa 480
cgccacgctt tgcagtctgc ggagcctacc gctcgtacgc aaagcaagtt ggatgagatc 540
gagaagaaca tccgccgtcg catcaccatt ttgtggcaga ccgcgttgat tcgtgtggcc 600
cgcccacgta tcgaggacga gatcgaagta gggctgcgct actacaagct gagccttttg 660
gaagagattc cacgtatcaa ccgtgatgtg gctgttgagc ttcgtgagcg tttcggcgag 720
ggtgttcctt tgaagcccgt ggtcaagcca ggttcctgga ttggtggaga ccacgacggt 780
aacccttatg tcaccgcgga aacagttgag tattccactc accgcgctgc ggaaaccgtg 840
ctcaagtact atgcacgcca gctgcattcc ctcgagcatg agctcagcct gtcggaccgc 900
atgaataagg tcaccccgca gctgcttgcg ctggcagatg cagggcacaa cgacgtgcca 960
agccgcgtgg atgagcctta tcgacgcgcc gtccatggcg ttcgcggacg tatcctcgcg 1020
acgacggccg agctgatcgg cgaggacgcc gttgagggcg tgtggttcaa ggtctttact 1080
ccatacgcat ctccggaaga attcttaaac gatgcgttga ccattgatca ttctctgcgt 1140
gaatccaagg acgttctcat tgccgatgat cgtttgtctg tgctgatttc tgccatcgag 1200
agctttggat tcaaccttta cgcactggat ctgcgccaaa actccgaaag ctacgaggac 1260
gtcctcaccg agcttttcga acgcgcccaa gtcaccgcaa actaccgcga gctgtctgaa 1320
gcagagaagc ttgaggtgct gctgaaggaa ctgcgcagcc ctcgtccgct gatcccgcac 1380
ggttcagatg aatacagcga ggtcaccgac cgcgagctcg gcatcttccg caccgcgtcg 1440
gaggctgtta agaaattcgg gccacggatg gtgcctcact gcatcatctc catggcatca 1500
tcggtcaccg atgtgctcga gccgatggtg ttgctcaagg aattcggact catcgcagcc 1560
aacggcgaca acccacgcgg caccgtcgat gtcatcccac tgttcgaaac catcgaagat 1620
ctccaggccg gcgccggaat cctcgacgaa ctgtggaaaa ttgatctcta ccgcaactac 1680
ctcctgcagc gcgacaacgt ccaggaagtc atgctcggtt actccgattc caacaaggat 1740
ggcggatatt tctccgcaaa ctgggcgctt tacgacgcgg aactgcagct cgtcgaacta 1800
tgccgatcag ccggggtcaa gcttcgcctg ttccacggcc gtggtggcac cgtcggccgc 1860
ggtggcggac cttcctacga cgcgattctt gcccagccca ggggggctgt ccaaggttcc 1920
gtgcgcatca ccgagcaggg cgagatcatc tccgctaagt acggcaaccc cgaaaccgcg 1980
cgccgaaacc tcgaagccct ggtctcagcc acgcttgagg catcgcttct cgacgtctcc 2040
gaactcaccg atcaccaacg cgcgtacgac atcatgagtg agatctctga gctcagcttg 2100
aagaagtacg cctccttggt gcacgaggat caaggcttca tcgattactt cacccagtcc 2160
acgccgctgc aggagattgg atccctcaac atcggatcca ggccttcctc acgcaagcag 2220
acctcctcgg tggaagattt gcgagccatc ccatgggtgc tcagctggtc acagtctcgt 2280
gtcatgctgc caggctggtt tggtgtcgga accgcattag agcagtggat tggcgaaggg 2340
gagcaggcca cccaacgcat tgccgagctg caaacactca atgagtcctg gccatttttc 2400
acctcagtgt tggataacat ggctcaggtg atgtccaagg cagagctgcg tttggcaaag 2460
ctctacgcag acctgatccc agatacggaa gtagccgagc gagtctattc cgtcatccgc 2520
gaggagtact tcctgaccaa gaagatgttc tgcgtaatca ccggctctga tgatctgctt 2580
gatgacaacc cacttctcgc acgctctgtc cagcgccgat acccctacct gcttccactc 2640
aacgtgatcc aggtagagat gatgcgacgc taccgaaaag gcgaccaaag cgagcaagtg 2700
tcccgcaaca ttcagctgac catgaacggt ctttccactg cgctgcgcaa ctccggctag 2760
<210> 16
<211> 3423
<212> DNA
<213> （编码丙酮酸羧化酶的基因pyc）
<400> 16
gtgtcgactc acacatcttc aacgcttcca gcattcaaaa agatcttggt agcaaaccgc 60
ggcgaaatcg cggtccgtgc tttccgtgca gcactcgaaa ccggtgcagc cacggtagct 120
atttaccccc gtgaagatcg gggatcattc caccgctctt ttgcttctga agctgtccgc 180
attggtaccg aaggctcacc agtcaaggcg tacctggaca tcgatgaaat tatcggtgca 240
gctaaaaaag ttaaagcaga tgccatttac ccgggatacg gcttcctgtc tgaaaatgcc 300
cagcttgccc gcgagtgtgc ggaaaacggc attactttta ttggcccaac cccagaggtt 360
cttgatctca ccggtgataa gtctcgcgcg gtaaccgccg cgaagaaggc tggtctgcca 420
gttttggcgg aatccacccc gagcaaaaac atcgatgaga tcgttaaaag cgctgaaggc 480
cagacttacc ccatctttgt gaaggcagtt gccggtggtg gcggacgcgg tatgcgtttt 540
gttgcttcac ctgatgagct tcgcaaatta gcaacagaag catctcgtga agctgaagcg 600
gctttcggcg atggcgcggt atatgtcgaa cgtgctgtga ttaaccctca gcatattgaa 660
gtgcagatcc ttggcgatca cactggagaa gttgtacacc tttatgaacg tgactgctca 720
ctgcagcgtc gtcaccaaaa agttgtcgaa attgcgccag cacagcattt ggatccagaa 780
ctgcgtgatc gcatttgtgc ggatgcagta aagttctgcc gctccattgg ttaccagggc 840
gcgggaaccg tggaattctt ggtcgatgaa aagggcaacc acgtcttcat cgaaatgaac 900
ccacgtatcc aggttgagca caccgtgact gaagaagtca ccgaggtgga cctggtgaag 960
gcgcagatgc gcttggctgc tggtgcaacc ttgaaggaat tgggtctgac ccaagataag 1020
atcaagaccc acggtgcagc actgcagtgc cgcatcacca cggaagatcc aaacaacggc 1080
ttccgcccag ataccggaac tatcaccgcg taccgctcac caggcggagc tggcgttcgt 1140
cttgacggtg cagctcagct cggtggcgaa atcaccgcac actttgactc catgctggtg 1200
aaaatgacct gccgtggttc cgactttgaa actgctgttg ctcgtgcaca gcgcgcgttg 1260
gctgagttca ccgtgtctgg tgttgcaacc aacattggtt tcttgcgtgc gttgctgcgg 1320
gaagaggact tcacttccaa gcgcatcgcc accggattca ttgccgatca cccgcacctc 1380
cttcaggctc cacctgctga tgatgagcag ggacgcatcc tggattactt ggcagatgtc 1440
accgtgaaca agcctcatgg tgtgcgtcca aaggatgttg cagctcctat cgataagctg 1500
cctaacatca aggatctgcc actgccacgc ggttcccgtg accgcctgaa gcagcttggc 1560
ccagccgcgt ttgctcgtga tctccgtgag caggacgcac tggcagttac tgataccacc 1620
ttccgcgatg cacaccagtc tttgcttgcg acccgagtcc gctcattcgc actgaagcct 1680
gcggcagagg ccgtcgcaaa gctgactcct gagcttttgt ccgtggaggc ctggggcggc 1740
gcgacctacg atgtggcgat gcgtttcctc tttgaggatc cgtgggacag gctcgacgag 1800
ctgcgcgagg cgatgccgaa tgtaaacatt cagatgctgc ttcgcggccg caacaccgtg 1860
ggatacaccc cgtacccaga ctccgtctgc cgcgcgtttg ttaaggaagc tgccagctcc 1920
ggcgtggaca tcttccgcat cttcgacgcg cttaacgacg tctcccagat gcgtccagca 1980
atcgacgcag tcctggagac caacaccgcg gtagccgagg tggctatggc ttattctggt 2040
gatctctctg atccaaatga aaagctctac accctggatt actacctaaa gatggcagag 2100
gagatcgtca agtctggcgc tcacatcttg gccattaagg atatggctgg tctgcttcgc 2160
ccagctgcgg taaccaagct ggtcaccgca ctgcgccgtg aattcgatct gccagtgcac 2220
gtgcacaccc acgacactgc gggtggccag ctggcaacct actttgctgc agctcaagct 2280
ggtgcagatg ctgttgacgg tgcttccgca ccactgtctg gcaccacctc ccagccatcc 2340
ctgtctgcca ttgttgctgc attcgcgcac acccgtcgcg ataccggttt gagcctcgag 2400
gctgtttctg acctcgagcc gtactgggaa gcagtgcgcg gactgtacct gccatttgag 2460
tctggaaccc caggcccaac cggtcgcgtc taccgccacg aaatcccagg cggacagttg 2520
tccaacctgc gtgcacaggc caccgcactg ggccttgcgg atcgtttcga actcatcgaa 2580
gacaactacg cagccgttaa tgagatgctg ggacgcccaa ccaaggtcac cccatcctcc 2640
aaggttgttg gcgacctcgc actccacctc gttggtgcgg gtgtggatcc agcagacttt 2700
gctgccgatc cacaaaagta cgacatccca gactctgtca tcgcgttcct gcgcggcgag 2760
cttggtaacc ctccaggtgg ctggccagag ccactgcgca cccgcgcact ggaaggccgc 2820
tccgaaggca aggcacctct gacggaagtt cctgaggaag agcaggcgca cctcgacgct 2880
gatgattcca aggaacgtcg caatagcctc aaccgcctgc tgttcccgaa gccaaccgaa 2940
gagttcctcg agcaccgtcg ccgcttcggc aacacctctg cgctggatga tcgtgaattc 3000
ttctacggcc tggtcgaagg ccgcgagact ttgatccgcc tgccagatgt gcgcacccca 3060
ctgcttgttc gcctggatgc gatctctgag ccagacgata agggtatgcg caatgttgtg 3120
gccaacgtca acggccagat ccgcccaatg cgtgtgcgtg accgctccgt tgagtctgtc 3180
accgcaaccg cagaaaaggc agattcctcc aacaagggcc atgttgctgc accattcgct 3240
ggtgttgtca ccgtgactgt tgctgaaggt gatgaggtca aggctggaga tgcagtcgca 3300
atcatcgagg ctatgaagat ggaagcaaca atcactgctt ctgttgacgg caaaatcgat 3360
cgcgttgtgg ttcctgctgc aacgaaggtg gaaggtggcg acttgatcgt cgtcgtttcc 3420
taa 3423
<210> 17
<211> 1470
<212> DNA
<213> （赖氨酸摄取转运蛋白编码基因lysP）
<400> 17
atggtttccg aaactaaaac cacagaagcg ccgggcttac gccgtgaatt aaaggcgcgt 60
cacctgacga tgattgccat tggcggttcc atcggtacag gtctttttgt tgcctctggc 120
gcaacgattt ctcaggcagg tccgggcggg gcattgctct cgtatatgct gattggcctg 180
atggtttact tcctgatgac cagtctcggt gaactggctg catatatgcc ggtttccggt 240
tcgtttgcca cttacggtca gaactatgtt gaagaaggct ttggcttcgc gctgggctgg 300
aactactggt acaactgggc ggtgactatc gccgttgacc tggttgcagc tcagctggtc 360
atgagctggt ggttcccgga tacaccgggc tggatctgga gtgcgttgtt cctcggcgtt 420
atcttcctgc tgaactacat ctcagttcgt ggctttggtg aagcggaata ctggttctca 480
ctgatcaaag tcacgacagt tattgtcttt atcatcgttg gcgtgctgat gattatcggt 540
atcttcaaag gcgcgcagcc tgcgggctgg agcaactgga caatcggcga agcgccgttt 600
gctggtggtt ttgcggcgat gatcggcgta gctatgattg tcggcttctc tttccaggga 660
accgagctga tcggtattgc tgcaggcgag tccgaagatc cggcgaaaaa cattccacgc 720
gcggtacgtc aggtgttctg gcgaatcctg ttgttctatg tgttcgcgat cctgattatc 780
agcctgatta ttccgtacac cgatccgagc ctgctgcgta acgatgttaa agacatcagc 840
gttagtccgt tcaccctggt gttccagcac gcgggtctgc tctctgcggc ggcggtgatg 900
aacgcagtta ttctgacggc ggtgctgtca gcgggtaact ccggtatgta tgcgtctact 960
cgtatgctgt acaccctggc gtgtgacggt aaagcgccgc gcattttcgc taaactgtcg 1020
cgtggtggcg tgccgcgtaa tgccctgtat gcgacgacgg tgattgccgg tctgtgcttc 1080
ctgacctcca tgtttggcaa ccagacggta tacctgtggc tgctgaacac ctccgggatg 1140
acgggtttta tcgcctggct ggggattgcc attagccact atcgcttccg tcgcggttac 1200
gtattgcagg gacacgacat taacgatctg ccgtaccgtt caggtttctt cccactgggg 1260
ccgatcttcg cattcattct gtgtctgatt atcactttgg gccagaacta cgaagcgttc 1320
ctgaaagata ctattgactg gggcggcgta gcggcaacgt atattggtat cccgctgttc 1380
ctgattattt ggttcggcta caagctgatt aaaggaactc acttcgtacg ctacagcgaa 1440
atgaagttcc cgcagaacga taagaaataa 1470
<210> 18
<211> 1506
<212> DNA
<213> （赖氨酸摄取转运蛋白编码基因lysI）
<400> 18
gtgaatactc aatcagattc tgcggggtct caaggtgcag cggccacaag tcgtactgta 60
tctattagaa ccctcatcgc gctgatcatc ggatcgaccg tcggcgcggg aattttctcc 120
atccctcaaa acatcggctc agtcgcaggt cccggcgcga tgctcatcgg ctggctgatc 180
gccggtgtgg gcatgttgtc cgtagcgttc gtgttccatg ttcttgcccg ccgtaaacct 240
cacctcgatt ctggcgtcta cgcatatgcg cgtgttggat tgggcgatta tgtaggtttc 300
tcctccgctt ggggttattg gctgggttca gtcatcgccc aagttggcta cgcaacgtta 360
tttttctcca cgttgggcca ctacgtaccg ctgttttccc aagatcatcc atttgtgtca 420
gcgttggcag ttagcgcttt gacctggctg gtgtttggag ttgtttcccg aggaattagc 480
caagctgctt tcttgacaac ggtcaccacc gtggccaaaa ttctgcctct gttgtgcttc 540
atcatccttg ttgcattctt gggctttagc tgggagaagt tcactgttga tttatgggcg 600
cgtgatggtg gcgtgggcag catttttgat caggtgcgcg gcatcatggt gtacaccgtg 660
tgggtgttca tcggtatcga aggtgcatcg gtatattccc gccaggcacg ctcacgcagt 720
gatgtcagcc gagctaccgt gattggtttt gtggctgttc tccttttgct ggtgtcgatt 780
tcttcgctga gcttcggtgt actgacccaa caagagctcg ctgcgttacc agataattcc 840
atggcgtcgg tgctcgaagc tgttgttggt ccatggggtg ccgcattgat ttcgttgggt 900
ctgtgtcttt cggttcttgg ggcctatgtg tcctggcaga tgctctgcgc agaaccactg 960
gcgttgatgg caatggatgg cctcattcca agcaaaatcg gggccatcaa cagccgcggt 1020
gctgcctgga tggctcagct gatctccacc atcgtgattc agattttcat catcattttc 1080
ttcctcaacg agaccaccta cgtctccatg gtgcaattgg ctaccaacct atacttggtg 1140
ccttacctgt tctctgcctt ttatctggtc atgctggcaa cacgtggaaa aggaatcacc 1200
cacccacatg ccggcacacg ttttgatgat tccggtccag agatatcccg ccgagaaaac 1260
cgcaaacacc tcatcgtcgg tttagtagca acggtgtatt cagtgtggct gttttacgct 1320
gcagaaccgc agtttgtcct cttcggagcc atggcgatgc ttcccggctt aatcccctat 1380
gtgtggacaa ggatttatcg tggcgaacag gtgtttaacc gctttgaaat cggcgtggtt 1440
gttgtcctgg tcgttgctgc cagcgcgggc gttattggtt tggtcaacgg atcactatcg 1500
ctttaa 1506
<210> 19
<211> 1314
<212> DNA
<213> （编码柠檬酸合酶的基因gltA）
<400> 19
atgtttgaaa gggatatcgt ggctactgat aacaacaagg ctgtcctgca ctaccccggt 60
ggcgagttcg aaatggacat catcgaggct tctgagggta acaacggtgt tgtcctgggc 120
aagatgctgt ctgagactgg actgatcact tttgacccag gttatgtgag cactggctcc 180
accgagtcga agatcaccta catcgatggc gatgcgggaa tcctgcgtta ccgcggctat 240
gacatcgctg atctggctga gaatgccacc ttcaacgagg tttcttacct acttatcaac 300
ggtgagctac caaccccaga tgagcttcac aagtttaacg acgagattcg ccaccacacc 360
cttctggacg aggacttcaa gtcccagttc aacgtgttcc cacgcgacgc tcacccaatg 420
gcaaccttgg cttcctcggt taacattttg tctacctact accaggacca gctgaaccca 480
ctcgatgagg cacagcttga taaggcaacc gttcgcctca tggcaaaggt tccaatgctg 540
gctgcgtacg cacaccgcgc acgcaagggt gctccttaca tgtacccaga caactccctc 600
aatgcgcgtg agaacttcct gcgcatgatg ttcggttacc caaccgagcc atacgagatc 660
gacccaatca tggtcaaggc tctggacaag ctgctcatcc tgcacgctga ccacgagcag 720
aactgctcca cctccaccgt tcgtatgatc ggttccgcac aggccaacat gtttgtctcc 780
atcgctggtg gcatcaacgc tctgtccggc ccactgcacg gtggcgcaaa ccaggctgtt 840
ctggagatgc tcgaagacat caagagcaac cacggtggcg acgcaaccga gttcatgaac 900
aaggtcaaga acaaggaaga cggcgtccgc ctcatgggct tcggacaccg cgtttacaag 960
aactacgatc cacgtgcagc aatcgtcaag gagaccgcac acgagatcct cgagcacctc 1020
ggtggcgacg atcttctgga tctggcaatc aagctggaag aaattgcact ggctgatgat 1080
tacttcatct cccgcaagct ctacccgaac gtagacttct acaccggcct gatctaccgc 1140
gcaatgggct tcccaactga cttcttcacc gtattgttcg caatcggtcg tctgccagga 1200
tggatcgctc actaccgcga gcagctcggt gcagcaggca acaagatcaa ccgcccacgc 1260
caggtctaca ccggcaacga atcccgcaag ttggttcctc gcgaggagcg ctaa 1314
<210> 20
<211> 945
<212> DNA
<213> （编码乳酸脱氢酶的基因ldh）
<400> 20
atgaaagaaa ccgtcggtaa caagattgtc ctcattggcg caggagatgt tggagttgca 60
tacgcatacg cactgatcaa ccagggcatg gcagatcacc ttgcgatcat cgacatcgat 120
gaaaagaaac tcgaaggcaa cgtcatggac ttaaaccatg gtgttgtgtg ggccgattcc 180
cgcacccgcg tcaccaaggg cacctacgct gactgcgaag acgcagccat ggttgtcatt 240
tgtgccggcg cagcccaaaa gccaggcgag acccgcctcc agctggtgga caaaaacgtc 300
aagattatga aatccatcgt cggcgatgtc atggacagcg gattcgacgg catcttcctc 360
gtggcgtcca acccagtgga tatcctgacc tacgcagtgt ggaaattctc cggcttggaa 420
tggaaccgcg tgatcggctc cggaactgtc ctggactccg ctcgattccg ctacatgctg 480
ggcgaactct acgaagtggc accaagctcc gtccacgcct acatcatcgg cgaacacggc 540
gacactgaac ttccagtcct gtcctccgcg accatcgcag gcgtatcgct tagccgaatg 600
ctggacaaag acccagagct tgagggccgt ctagagaaaa ttttcgaaga cacccgcgac 660
gctgcctatc acattatcga cgccaagggc tccacttcct acggcatcgg catgggtctt 720
gctcgcatca cccgcgcaat cctgcagaac caagacgttg cagtcccagt ctctgcactg 780
ctccacggtg aatacggtga ggaagacatc tacatcggca ccccagctgt ggtgaaccgc 840
cgaggcatcc gccgcgttgt cgaactagaa atcaccgacc acgagatgga acgcttcaag 900
cattccgcaa ataccctgcg cgaaattcag aagcagttct tctaa 945
<210> 21
<211> 1386
<212> DNA
<213> （编码磷酸乙酰基转移酶的基因pta ）
<400> 21
atgtctgaca caccgacctc agctctgatc accacggtca accgcagctt cgatggattc 60
gatttggaag aagtagcagc agaccttgga gttcggctca cctacctgcc cgacgaagaa 120
ctagaagtat ccaaagttct cgcggcggac ctcctcgctg aggggccagc tctcatcatc 180
ggtgtaggaa acacgttttt cgacgcccag gtcgccgctg ccctcggcgt cccagtgcta 240
ctgctggtag acaagcaagg caagcacgtt gctcttgctc gcacccaggt aaacaatgcc 300
ggcgcagttg ttgcagcagc atttaccgct gaacaagagc caatgccgga taagctgcgc 360
aaggctgtgc gcaaccacag caacctcgaa ccagtcatga gcgccgaact ctttgaaaac 420
tggctgctca agcgcgcacg cgcagagcac tcccacattg tgctgccaga aggtgacgac 480
gaccgcatct tgatggctgc ccaccagctg cttgatcaag acatctgtga catcacgatc 540
ctgggcgatc cagtaaagat caaggagcgc gctaccgaac ttggcctgca ccttaacact 600
gcatacctgg tcaatccgct gacagatcct cgcctggagg aattcgccga acaattcgcg 660
gagctgcgca agtcaaagag cgtcactatc gatgaagccc gcgaaatcat gaaggatatt 720
tcctacttcg gcaccatgat ggtccacaac ggcgacgccg acggaatggt atccggtgca 780
gcaaacacca ccgcacacac cattaagcca agcttccaga tcatcaaaac tgttccagaa 840
gcatccgtcg tttcttccat cttcctcatg gtgctgcgcg ggcgactgtg ggcattcggc 900
gactgtgctg ttaacccgaa cccaactgct gaacagcttg gtgaaatcgc cgttgtgtca 960
gcaaaaactg cagcacaatt tggcattgat cctcgcgtag ccatcttgtc ctactccact 1020
ggcaactccg gcggaggctc agatgtggat cgcgccatcg acgctcttgc agaagcacgc 1080
cgacttaacc cagaactatg cgtcgatgga ccacttcagt tcgacgccgc cgtcgacccg 1140
ggtgtggcgc gcaagaagat gccagactct gacgtcgctg gccaggcaaa tgtgtttatc 1200
ttccctgacc tggaagccgg aaacatcggc tacaaaactg cacaacgcac cggtcacgcc 1260
ctggcagttg gtccgattct gcagggccta aacaaaccag tcaacgacct ttcccgtggc 1320
gcaacagtcc ctgacatcgt caacacagta gccatcacag caattcaggc aggaggacgc 1380
agctaa 1386
<210> 22
<211> 285
<212> DNA
<213> （编码酰基磷酸酶的基因acyP）
<400> 22
atggagaaag ttcgtctgac tgcttttgtt catggtcatg tccagggcgt gggttttcga 60
tggtggacta cctcgcaggc acgagaatta aaacttgcag gttctgccag taatttaagt 120
gacggccggg tgtgcgtggt tgctgaaggg ccacaaacac agtgcgaaga actgctgaga 180
aggttgaagg aaaaccccag ctcgtatcgc agaccaggtc atgtggacac agttattgag 240
caatggggcg agccgcgtga cgttgaaggc tttgtggagc gctag 285
<210> 23
<211> 1740
<212> DNA
<213> （编码丙酮酸脱氢酶的基因poxB）
<400> 23
atggcacaca gctacgcaga acaattaatt gacactttgg aagctcaagg tgtgaagcga 60
atttatggtt tggtgggtga cagccttaat ccgatcgtgg atgctgtccg ccaatcagat 120
attgagtggg tgcacgttcg aaatgaggaa gcggcggcgt ttgcagccgg tgcggaatcg 180
ttgatcactg gggagctggc agtatgtgct gcttcttgtg gtcctggaaa cacacacctg 240
attcagggtc tttatgattc gcatcgaaat ggtgcgaagg tgttggccat cgctagccat 300
attccgagtg cccagattgg ttcgacgttc ttccaggaaa cgcatccgga gattttgttt 360
aaggaatgct ctggttactg cgagatggtg aatggtggtg agcagggtga acgcattttg 420
catcacgcga ttcagtccac catggcgggt aaaggtgtgt cggtggtagt gattcctggt 480
gatatcgcta aggaagacgc aggtgacggt acttattcca attccactat ttcttctggc 540
actcctgtgg tgttcccgga tcctactgag gctgcagcgc tggtggaggc gattaacaac 600
gctaagtctg tcactttgtt ctgcggtgcg ggcgtgaaga atgctcgcgc gcaggtgttg 660
gagttggcgg agaagattaa atcaccgatc gggcatgcgc tgggtggtaa gcagtacatc 720
cagcatgaga atccgtttga ggtcggcatg tctggcctgc ttggttacgg cgcctgcgtg 780
gatgcgtcca atgaggcgga tctgctgatt ctattgggta cggatttccc ttattctgat 840
ttccttccta aagacaacgt tgcccaggtg gatatcaacg gtgcgcacat tggtcgacgt 900
accacggtga agtatccggt gaccggtgat gttgctgcaa caatcgaaaa tattttgcct 960
catgtgaagg aaaaaacaga tcgttccttc cttgatcgga tgctcaaggc acacgagcgt 1020
aagttgagct cggtggtaga gacgtacaca cataacgtcg agaagcatgt gcctattcac 1080
cctgaatacg ttgcctctat tttgaacgag ctggcggata aggatgcggt gtttactgtg 1140
gataccggca tgtgcaatgt gtggcatgcg aggtacatcg agaatccgga gggaacgcgc 1200
gactttgtgg gttcattccg ccacggcacg atggctaatg cgttgcctca tgcgattggt 1260
gcgcaaagtg ttgatcgaaa ccgccaggtg atcgcgatgt gtggcgatgg tggtttgggc 1320
atgctgctgg gtgagcttct gaccgttaag ctgcaccaac ttccgctgaa ggctgtggtg 1380
tttaacaaca gttctttggg catggtgaag ttggagatgc tcgtggaggg acagccagaa 1440
tttggtactg accatgagga agtgaatttc gcagagattg cggcggctgc gggtatcaaa 1500
tcggtacgca tcaccgatcc gaagaaagtt cgcgagcagc tagctgaggc attggcatat 1560
cctggacctg tactgatcga tatcgtcacg gatcctaatg cgctgtcgat cccaccaacc 1620
atcacgtggg aacaggtcat gggattcagc aaggcggcca cccgaaccgt ctttggtgga 1680
ggagtaggag cgatgatcga tctggcccgt tcgaacataa ggaatattcc tactccatga 1740
<210> 24
<211> 702
<212> DNA
<213> （赖氨酸外排转运蛋白编码基因lysE）
<400> 24
atggaaatct tcattacagg tctgcttttg ggggccagtc ttttactgtc catcggaccg 60
cagaatgtac tggtgattaa acaaggaatt aagcgcgaag gactcattgc ggttcttctc 120
gtgtgtttaa tttctgacgt ctttttgttc atcgccggca ccttgggcgt tgatcttttg 180
tccaatgccg cgccgatcgt gctcgatatt atgcgctggg gtggcatcgc ttacctgtta 240
tggtttgccg tcatggcagc gaaagacgcc atgacaaaca aggtggaagc gccacagatc 300
attgaagaaa cagaaccaac cgtgcccgat gacacgcctt tgggcggttc ggcggtggcc 360
actgacacgc gcaaccgggt gcgggtggag gtgagcgtcg ataagcagcg ggtttgggta 420
aagcccatgt tgatggcaat cgtgctgacc tggttgaacc cgaatgcgta tttggacgcg 480
tttgtgttta tcggcggcgt cggcgcgcaa tacggcgaca ccggacggtg gattttcgcc 540
gctggcgcgt tcgcggcaag cctgatctgg ttcccgctgg tgggtttcgg cgcagcagca 600
ttgtcacgcc cgctgtccag ccccaaggtg tggcgctgga tcaacgtcgt cgtggcagtt 660
gtgatgaccg cattggccat caaactgatg ttgatgggtt ag 702

Claims (10)

1.一种产氨基己二酸的基因工程菌，其为包含编码赖氨酸脱氢酶的基因lysDH和编码氨基己二酸半醛脱氢酶的基因Psefu_1272的重组宿主菌。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述编码赖氨酸脱氢酶的基因lysDH为来源于芽孢杆菌12AMOR1的编码赖氨酸脱氢酶的基因lysDH或来源于芽孢杆菌12AMOR1且经过密码子优化的编码赖氨酸脱氢酶的基因lysDH；和/或，所述编码氨基己二酸半醛脱氢酶的基因Psefu_1272为来源于假单胞菌12-X的编码氨基己二酸半醛脱氢酶的基因Psefu_1272或源于假单胞菌12-X且经过密码子优化的编码氨基己二酸半醛脱氢酶的基因Psefu_1272。
3.根据权利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为经过底盘微生物改造的产氨基己二酸的基因工程菌；优选地，所述底盘微生物改造包括前体合成途径的强化和竞争代谢途径相关基因的敲除或弱化。
4.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述前体合成途径的强化包括在基因工程菌中过表达前体合成途径的关键基因；优选地，所述前体合成途径的关键基因包括编码天冬氨酸激酶的基因lysC或其突变体基因lysC-Q298G和lysC-T311I、编码二氢吡啶二羧酸还原酶的基因dapB、编码二氨基庚二酸脱氢酶的基因ddh、编码二氨基庚二酸脱羧酶的基因lysA、编码丙酮酸羧化酶的基因pyc、编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因ppc；进一步优选地，编码天冬氨酸激酶的基因lysC的突变体基因lysC-Q298G为在基因lysC编码的天冬氨酸激酶的第298位的谷氨酰胺突变为甘氨酸的编码基因；和/或，进一步优选地，编码天冬氨酸激酶的基因lysC的突变体基因lysC-T311I为基因lysC编码的天冬氨酸激酶的第311位的苏氨酸突变为异亮氨酸的编码基因。
5.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述竞争代谢途径相关基因包括三羧酸循环相关基因、乳酸途径相关基因和乙酸途径相关基因；优选地，所述三羧酸循环相关基因包括编码柠檬酸合酶的基因gltA；和/或，所述乳酸途径相关基因包括编码乳酸脱氢酶的基因ldh；和/或，所述乙酸途径相关基因包括编码磷酸乙酰基转移酶的基因pta、编码酰基磷酸酶的基因acyP和编码丙酮酸脱氢酶的基因poxB。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述宿主菌包括大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌、酵母、以及经过改造的细菌、真菌；优选地，所述宿主菌为谷氨酸棒状杆菌；进一步优选地，所述宿主菌为谷氨酸棒状杆菌ATCC13032或者谷氨酸棒状杆菌ATCC21543。
7.根据权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，当所述宿主菌为谷氨酸棒状杆菌ATCC21543时，所述基因工程菌为敲除了谷氨酸棒状杆菌ATCC21543的赖氨酸外排转运蛋白编码基因lysE和/或过表达来源于大肠杆菌的赖氨酸摄取转运蛋白编码基因lysP或来源于谷氨酸棒状杆菌内源的赖氨酸摄取转运蛋白编码基因lysI的重组谷氨酸棒状杆菌ATCC21543。
8.一种如1-7中任意一项所述的基因工程菌在生产氨基己二酸中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用包括将产氨基己二酸的基因工程菌接入发酵培养基，进行发酵培养，然后对所获得的发酵培养液进行分离纯化，制得氨基己二酸；优选地，所述发酵培养条件为：发酵温度为30-32℃，发酵培养时间为48h，IPTG诱导浓度为0.8-1.2mM；进一步优选地，体外添加赖氨酸，且赖氨酸添加量为2-10g/L，更进一步优选为5-10g/L。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，对所获得的发酵培养液进行分离纯化包括：
步骤S1，对发酵培养液进行第Ⅰ次离心分离，获得第Ⅰ上清液；
步骤S2，用含有0.1％甲酸的甲醇将第Ⅰ上清液稀释10倍，混匀后，进行第Ⅱ次离心分离，获得第Ⅱ上清液；
步骤S3，用0.22μm的有机相滤膜过滤第Ⅱ上清液，获得氨基己二酸。
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