CN102031238A

CN102031238A - 产生l-氨基酸的细菌和产生l-氨基酸的方法

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Publication number: CN102031238A
Application number: CN2010105050901A
Authority: CN
Inventors: 福井启太; 中村纯; 児岛宏之
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2004-11-25
Filing date: 2005-11-25
Publication date: 2011-04-27
Anticipated expiration: 2025-11-25
Also published as: AU2005308023A1; JP2006149214A; KR101186128B1; CN101065484B; BRPI0518589A2; CN102031238B; AU2005308023B2; PE20061165A1; EP1814987B1; MY141980A; KR20070091303A; US8628941B2; EP1814987A1; ES2375650T3; CN101065484A; JP4595506B2; US20070254345A1; BRPI0518589B1; ATE526404T1; WO2006057450A1

Abstract

本发明涉及产生L-氨基酸的细菌和产生L-氨基酸的方法，更具体地，本发明描述了具有产生L-氨基酸的能力且被修饰使得乙酰辅酶A水解酶活性减少的棒状杆菌型细菌。该细菌被用于产生通过使用丙酮酸作为中间物的生物合成途径产生的L-氨基酸，如L-谷氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸和L-赖氨酸。

Description

产生L-氨基酸的细菌和产生L-氨基酸的方法

本申请是申请日为2005年11月25日、申请号为200580040475.2(国际申请号为PCT/JP2005/022137)、发明名称为“产生L-氨基酸的细菌和产生L-氨基酸的方法”的发明申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及在棒状杆菌型细菌发酵期间，通过使用丙酮酸作为中间物的生物合成途径产生L-氨基酸的方法，所述L-氨基酸具体为L-谷氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-缬氨酸、L-丙氨酸和L-赖氨酸。

背景技术

L-氨基酸如L-谷氨酸是通过使用丙酮酸作为中间物的生物合成途径产生的，且通常以利用棒状杆菌型细菌的发酵方法以工业规模产生，棒状杆菌型细菌包括具有产生L-氨基酸的能力的短杆菌属(Brevibacterium)和棒杆菌属(Corynebacterium)。为了改进棒状杆菌型细菌的L-氨基酸生产力，已使用从自然界分离的菌株或其人工突变体(JP07-121228B，JP07-121228B，JP06-237779A，Adv Biochem Eng Biotechnol.2003；79：59-112.J Biotechnol.2003Sep 4；104(1-3)：155-72.和WO95/34672)。

当需氧细菌(aerobic bacteria)，特别是棒状杆菌型细菌，在限氧(oxygen-limited)条件下培养时，除目标物质(target substance)以外的有机酸如乳酸和乙酸作为副产物过量积累。这种积累抑制细菌的生长，并大大地降低发酵过程中细菌的生产力。此外，中和这些有机酸的过量的反荷离子(counterion)是必需的，这增加了生产成本。因此，希望创造出在培养过程中产生更少乙酸的菌株，如催化乙酸产生的酶的活性被减少或消除的菌株。

使用催化乙酸产生的酶的活性被减少或消除的菌株的发酵方法实例包括，使用乙酰磷酸转移酶(pta)和乳酸脱氢酶(ldh)活性缺陷的大肠杆菌(Escherichia coli)来产生L-氨基酸(WO99/06532)，利用丙酮酸氧化酶(poxB)活性缺陷的肠细菌科(Enterobacteriaceae family)来产生L-氨基酸，和利用丙酮酸氧化酶(poxB)活性缺陷的肠杆菌科可来产生D-泛酸(D-panthotheic acid)(WO02/36797)。

已将乙酸激酶(ack)和乙酰磷酸转移酶(pta)报导为参与棒状杆菌型细菌中乙酸的同化作用(assimilation)的酶(Microbiology，1999 Feb；145(Pt2)：503-13)。同样，已报导了棒状杆菌型细菌，其中产生乙酸的酶丙酮酸氧化酶(poxB)被破坏(EP1096013A)。

乙酰辅酶A水解酶是一种从乙酰辅酶A和水产生乙酸的酶(3.1.2.1)，且已公开了预测编码谷氨酸棒杆菌的乙酰辅酶A水解酶的核苷酸序列(EP1108790A)。但是，还没有关于该基因实际克隆和表达分析的报导；因此该基因的实际(actual)功能也还未确认。

发明内容

本发明的目的是提供棒状杆菌型细菌，所述棒状杆菌型细菌具有改进的、通过使用丙酮酸作为中间物的生物合成途径产生L-氨基酸的能力，并提供使用这种细菌有效地产生上述L-氨基酸的方法。

本发明的发明者进行了广泛的研究以完成上述目的。结果，他们发现通过减少棒状杆菌型细菌中乙酰辅酶A水解酶的活性，提高了产生L-氨基酸，尤其是L-谷氨酸、L-缬氨酸和L-丙氨酸的能力，并因此完成了本发明。

本发明的一个目的是提供具有产生L-氨基酸能力的棒状杆菌型细菌，其中所述棒状杆菌型细菌被修饰以使乙酰辅酶A水解酶活性减少，而且其中所述L-氨基酸是通过使用丙酮酸作为中间物的生物合成途径产生的一种或多种L-氨基酸。

本发明的另一个目的是提供如上所述的棒状杆菌型细菌，其中通过在染色体的乙酰辅酶A水解酶基因的编码区或表达调控区引入突变来减少所述乙酰辅酶A水解酶活性。

本发明的另一个目的是提供如上所述的棒状杆菌型细菌，其中是通过破坏染色体乙酰辅酶A水解酶基因来减少所述乙酰辅酶A水解酶活性。

本发明的另一个目的是提供如上所述的棒状杆菌型细菌，其中所述乙酰辅酶A水解酶选自下组：

(A)包含SEQ ID NO：24所示氨基酸序列的蛋白质；和

(B)包含SEQ ID NO：24所示氨基酸序列的蛋白质，其中在所述蛋白质中取代、缺失、插入或添加一个或几个氨基酸，且其中所述蛋白质具有乙酰辅酶A水解酶活性。

本发明的另一个目的是提供如上所述的棒状杆菌型细菌，其中所述乙酰辅酶A水解酶基因选自下组：

(a)包含SEQ ID NO：23的核苷酸1037到2542的基因；和

(b)DNA，其能够在严紧条件下与包含SEQ ID NO：23的核苷酸1037至2542的多核苷酸或由所述多核苷酸制备的探针杂交，并编码了具有乙酰辅酶A水解酶活性的蛋白。

本发明的另一个目的是提供如上所述的棒状杆菌型细菌，其中所述棒状杆菌型细菌被进一步地修饰，以提高谷氨酸脱氢酶活性。

本发明的另一个目的是提供如上所述的棒状杆菌型细菌，其中所述L-氨基酸是一种或多种选自下组的L-氨基酸：L-谷氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸和L-赖氨酸。

本发明的另一个目的是提供一种产生L-氨基酸的方法，包括：

在培养基中培养如上所述的棒状杆菌型细菌；和

从培养基中收集L-氨基酸，其中所述L-氨基酸是通过使用丙酮酸作为中间物的生物合成途径产生的一种或多种L-氨基酸。

本发明的另一个目的是提供如上所述的方法，其中所述L-氨基酸是一种或多种选自下组的L-氨基酸：L-谷氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸和L-赖氨酸。

本发明还涉及如下方面：

1.具有产生L-氨基酸的能力的棒状杆菌型细菌，其中所述棒状杆菌型细菌被修饰使得乙酰辅酶A水解酶活性减少，并且其中所述L-氨基酸是通过使用丙酮酸作为中间物的生物合成途径产生的一种或多种L-氨基酸。

2.根据项1的棒状杆菌型细菌，其中通过将突变引入染色体乙酰辅酶A水解酶基因的编码区或表达调控区来减少所述乙酰辅酶A水解酶活性。

3.根据项1的棒状杆菌型细菌，其中通过破坏染色体乙酰辅酶A水解酶基因来减少所述乙酰辅酶A水解酶活性。

4.根据项1至3中任一项的棒状杆菌型细菌，其中所述乙酰辅酶A水解酶选自下组：

(A)包含SEQ ID NO：24所示氨基酸序列的蛋白质；和

(B)包含SEQ ID NO：24所示氨基酸序列的蛋白质，其中在所述蛋白质中取代、缺失、插入、或添加了一个或几个氨基酸，并且其中所述蛋白质具有乙酰辅酶A水解酶的活性。

5.根据项1至3中任一项的棒状杆菌型细菌，其中所述乙酰辅酶A水解酶基因选自下组：

(a)包含SEQ ID NO：23的核苷酸1037至2542的基因；和

(b)DNA，其能够在严紧条件下与包含SEQ ID NO：23的核苷酸1037至2542的多核苷酸或由所述多核苷酸制备的探针杂交，并编码具有乙酰辅酶A水解酶活性的蛋白。

6.根据项1至5中任一项的棒状杆菌型细菌，其中所述棒状杆菌型细菌被进一步修饰以提高谷氨酸脱氢酶活性。

7.根据项1至6中任一项的棒状杆菌型细菌，其中所述L-氨基酸是一种或多种选自下组的L-氨基酸：L-谷氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-丙氨酸和L-缬氨酸。

8.产生L-氨基酸的方法，其包括：

在培养基中培养根据项1至7中任一项的棒状杆菌型细菌；和

从培养基中收集L-氨基酸，且其中所述L-氨基酸是一种或多种经由丙酮酸为中间物产生的L-氨基酸。

9.根据项8的方法，其中所述L-氨基酸是一种或多种选自下组的氨基酸：L-谷氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸和L-赖氨酸。

附图简述

图1显示了构建质粒pBS3的方法。

图2显示了构建质粒pBS4的方法。

图3显示了构建质粒pBS5T的方法。

图4显示了构建质粒pΔldh56-1的方法。

图5显示了构建质粒pBS4S::Δach的方法。

优选实施方案描述

以下将对本发明的实施方案进行详细地描述。

<1>具有通过使用丙酮酸作为中间物的生物合成途径产生L-氨基酸的能力的棒状杆菌型细菌

在本发明中，棒状杆菌型细菌的实例包括常规的棒状杆菌型细菌，也包括曾经被归入短杆菌属，但现在被归入棒杆菌属的细菌(Int.J.Syst.Bacteriol.，41，255(1991))，以及与棒杆菌属细菌非常接近的(close)短杆菌属细菌。这些棒状杆菌型细菌的实例包括如下：

嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)

醋谷棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)

烷醇棒杆菌(Corynebacterium alkanolyticum)

美棒杆菌(Corynebacterium callunae)

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)

百合花棒杆菌(Corynebacterium lilium)

栖糖蜜棒杆菌(Corynebacterium melassecola)

嗜热产氨棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)(Corynebacteriumefficiens)

力士棒杆菌(Corynebacterium herculis)

二歧短杆菌(Brevibacterium divaricatum)

黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)

Brevibacterium immariophilum

乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)(谷氨酸棒杆菌)

玫瑰色短杆菌(Brevibacterium roseum)

解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)

生硫短杆菌(Brevibacterium thiogenitalis)

产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)

白色短杆菌(Brevibacterium album)

蜡状短杆菌(Brevibacterium cerinum)

嗜氨微杆菌(Microbacterium ammoniaphilum)

棒状杆菌型细菌的具体实例如下：

嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870

醋谷棒杆菌ATCC15806

烷醇棒杆菌ATCC21511

美棒杆菌ATCC15991

谷氨酸棒杆菌ATCC13020，ATCC13032，ATCC13060，ATCC13869

百合花棒杆菌ATCC15990

栖糖蜜棒杆菌ATCC17965

嗜热产氨棒杆菌AJ12340(FERM BP-1539)

力士棒杆菌ATCC13868

二歧短杆菌ATCC14020

黄色短杆菌ATCC13826，ATCC14067，AJ12418(FERM BP-2205)

Brevibacterium immariophilum ATCC14068

乳发酵短杆菌(谷氨酸棒杆菌)ATCC13869

玫瑰色短杆菌ATCC13825

解糖短杆菌ATCC14066

生硫短杆菌ATCC19240

产氨短杆菌ATCC6871，ATCC6872

白色短杆菌ATCC15111

蜡状短杆菌ATCC15112

嗜氨微杆菌ATCC15354

这些菌株可从美国典型培养物保藏中心(ATCC，地址：P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108，United States ofAmerica)获得。即，给予每个菌株唯一的登记号，该登记号列于ATCC的目录中。可以利用这个登记号定购菌株。根据布达佩斯条约(Budapest Treaty)的规定，将嗜热产氨棒杆菌(Corynebacteriumthermoaminogenes)AJ12340菌株于1987年03月13日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(National Institute of Bioscience and Human Technology，Agency of Industrial Science and Technology，Ministry of International Trade and Industry(目前为，独立行政法人产业技术综合研究所特许微生物保藏中心(International Patent Organism Depositary，NationalInstitute of Advanced Industrial Science and Technology)，地址：Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-5466，Japan)，并给予登录号FERM BP-1539。根据布达佩斯条约的规定，将黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)AJ12418菌株于1988年12月24日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所，并给予登录号FERM BP-2205。

“通过使用丙酮酸作为中间物的生物合成途径产生的L-氨基酸”优选指具有衍生自丙酮酸的碳骨架的L-氨基酸。这类L-氨基酸的实例包括L-谷氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸和L-赖氨酸。如本文所用的，“通过使用丙酮酸作为中间物的生物合成途径产生L-氨基酸的能力”，指在培养基中培养本发明的棒状杆菌型细菌时，导致在培养基中积累一种或多种上述L-氨基酸的能力。

产生L-氨基酸的能力可以是棒状杆菌型细菌的野生型菌株的原始能力，或是通过培育被赋予的能力。此外，产生L-氨基酸的能力可以通过修饰被赋予，所述修饰导致乙酰辅酶A水解酶活性的减少，如后文所述。

为了赋予产生L-氨基酸的能力，可以使用培育棒状杆菌型细菌所用的常规方法，例如创造代谢调节突变菌株，或创造目标物质的生物合成酶的活性增强的重组菌株(见“Amino Acid Fermentation”，Center for AcademicPublications Japan Co.，Ltd.，1st ed.Published on May 30，1986，p.77to 100)。在这些方法中，可以单独或组合使用引入代谢调节突变和增强目标物质生物合成酶的方法。此外，可以引入两个或两个以上的突变，且可以增强两个或两个以上的酶活性。

赋予产生L-谷氨酸的能力的实例是增强编码L-谷氨酸生物合成酶的基因的表达。涉及L-谷氨酸生物合成的酶的实例包括谷氨酸脱氢酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶、乌头酸水合酶、柠檬酸合酶、磷酸烯醇丙酮酸羧酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸脱氢酶、丙酮酸激酶、磷酸烯醇丙酮酸合酶、烯醇化酶、磷酸甘油酸变位酶、磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、果糖二磷酸醛缩酶、果糖磷酸激酶和葡糖磷酸异构酶。

增强这些基因的表达可以通过以下方法完成，将含有所述基因的DNA插入适当的质粒，该质粒能够在棒状杆菌型细菌中自主复制，然后用所得质粒转化细菌细胞；或通过同源重组、接合(conjugation)、转座(transposition)等将所述基因整合到染色体上(EP0756007B，EP0332488A EP0771879A)；或在所述基因的启动子区域引入突变(WO/0018935)，或以强启动子取代。

当上述基因通过质粒引入或整合到染色体上时，用于表达这些基因的启动子可以是任何启动子，只要该启动子能够在棒状杆菌型细菌中起作用。这类启动子的实例包括lac启动子、trp启动子、trc启动子、PS2启动子和pL启动子。也可以使用每个基因的天然(native)启动子。

通过修饰以使柠檬酸合成酶基因、磷酸烯醇丙酮酸羧酶基因，和/或谷氨酸脱氢酶基因表达增强的微生物的实例包括，在JP2001-333769A(EP1078989A)、JP2000-106869A(EP955368A)、JP2000-189169A(EP952221A)和JP2001-333769A (EP1078989A)中所公开的微生物。

赋予产生L-谷氨酸的能力的修饰也包括减少或消除酶的活性，所述的酶催化除L-谷氨酸之外的化合物的合成，和从L-谷氨酸生物合成途径分支。这类酶的实例包括异柠檬酸裂合酶、α-酮戊二酸脱氢酶、磷酸转乙酰酶、乙酸激酶、乙酰羟酸合酶、乙酰乳酸合酶(acetolactate synthase)、甲酸乙酰转移酶(formate acetyltransferase)，乳酸脱氢酶和谷氨酸脱羧酶。

为了减少或消除上述酶的活性，可以在染色体上这些酶的基因处，引入导致酶活性减少或丧失的突变或缺失。这可以通过以下方法实现，例如，破坏染色体上编码这些酶的基因，或修饰所述基因的表达控制序列如启动子和/或Shine Dargarno(SD)序列。另外，可以通过引入导致氨基酸取代的错义突变、产生终止密码子的无义突变、或在编码区添加或缺失一个或两个核苷酸的移码突变；或通过缺失该基因的一部分来减少或消除这些酶的活性(Journalof Biological Chemistry 272：8611-8617(1997))。此外，可以通过如下方法减少或消除这些酶的活性：构建编码突变酶的基因，所述基因的编码区缺失，并通过同源重组用所得基因取代染色体基因。α-酮戊二酸脱氢酶活性被减少的棒状杆菌型细菌的实例包括在JP7-834672A和JP06-237779中公开的菌株。

此外，赋予产生L-谷氨酸的能力的方法实例包括：修饰菌株以增强编码yggB基因的基因表达，或修饰菌株以在YggB中引入突变的方法(NCgl 1221；NP_600492.Reports small-conductance...[gi：19552490])(美国专利申请No.60/715131)。

也可以通过下方法赋予产生L-谷氨酸的能力：筛选对有机酸类似物、呼吸抑制剂、或超氧化物产生物具有抗性的菌株，或筛选对细胞壁合成的抑制剂具有敏感性的菌株。这类方法的实例包括赋予对苯并吡喃酮(benzopirone)或萘醌(naphtoquinone)的抗性(JP56-1889A)，赋予对单氟乙酸(monofluoroaceticacid)的抗性(JP 50-113209A)，赋予对腺嘌呤和胸腺嘧啶的抗性(JP57-065198)，赋予对HOQNO的抗性(JP56-140895A)，赋予对α-酮丙二酸(α-ketomalonic acid) 的抗性(JP57-2689A)，赋予对胍的抗性(JP56-35981A)，赋予对道诺霉素(daunomicin)的抗性(JP58-158192A)，以及赋予对青霉素的敏感性(JP04-88994A)。

这类细菌的具体实例包括下列菌株：

黄色短杆菌AJ3949(FERM BP-2632；JP 50-113209A)

谷氨酸棒杆菌AJ11628(FERM P-5736；JP 57-065198A)

黄色短杆菌AJ11355(FERM P-5007；JP56-1889A)

谷氨酸棒杆菌AJ11355(FERM P-5020；JP56-1889A)

黄色短杆菌AJ11217(FERM P-4318；JP57-2689A)

谷氨酸棒杆菌AJ11218(FERM P-4319；JP57-2689A)

黄色短杆菌AJ11564(FERM P-5472；JP56-140895A)

黄色短杆菌AJ11439(FERM P-5136；JP56-35981A)

谷氨酸棒杆菌H7684(FERM BP-3004；JP04-88994A)

乳发酵短杆菌AJ11426(FERM P5123；JP56-048890A)

谷氨酸棒杆菌AJ11440(FERM P5137；JP56-048890A)

乳发酵短杆菌AJ11796(FERM P6402；JP58-158192A)

赋予产生L-缬氨酸的能力的方法实例包括：修饰菌株以增强编码L-缬氨酸生物合成酶的基因的表达的方法。L-缬氨酸生物合成酶的实例包括由ilvBNC操纵子编码的酶，即，由ilvBN编码的乙酰羟酸合成酶和由ilvC编码的异构还原酶(isomero-reductase)(WO00/50624)。ilvBNC操纵子受到L-缬氨酸、L-异亮氨酸和L-亮氨酸的任何组合的转录阻抑(transcriptional repression)，所以最好进行释放稀释(release attenuation)，以避免作为产物的L-缬氨酸的转录阻抑。

可以通过减少或消除至少一种酶的活性将产生L-缬氨酸的能力赋予棒状杆菌型细菌，所述酶催化减少L-缬氨酸的产生量的反应。例如，可以通过减少催化异亮氨酸合成的苏氨酸脱水酶的活性，或通过减少催化D-泛酸(D-panthothenate)合成的酶的活性赋予产生L-缬氨酸的能力(WO00/50624)。

也可以通过将对氨基酸类似物等的抗性赋予棒状杆菌型细菌来赋予产生L-缬氨酸的能力。

例如，可以使用对于L-异亮氨酸和L-甲硫氨酸是营养缺陷的，并对D- 核糖、嘌呤核糖核苷或嘧啶核糖核苷有抗性的产生L-缬氨酸的突变菌株(FERM P-1841，FERM P-29，JP-B-53-025034)，对聚酮化合物有抗性的产生L-缬氨酸的突变菌株(FERM P-1763，FERM P-1764；JP-B006-065314)，对L-缬氨酸有抗性，且对丙酮酸类似物如β-氟丙酮酸(β-fluoropyruvic acid)敏感的产生L-缬氨酸的突变菌株(FERM BP-3006，BP-3007，Patent 3006929)。

具有产生L-丙氨酸的能力的棒状杆菌型细菌的实例包括H⁺-腺苷三磷酸酶(H⁺-ATPase)活性缺陷的棒状杆菌型细菌(Appl Microbiol Biotechnol.2001Nov；57(4)：534-40)，以及扩增的具有(amplified with)编码天冬氨酸β-脱羧酶结构基因的棒状杆菌型细菌(JP-A-7-163383)。

可以通过修饰棒状杆菌型细菌以增强编码L-精氨酸生物合成酶的基因的表达来赋予产生L-精氨酸的能力。L-精氨酸生物合成酶的实例包括N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶(argC)、鸟氨酸乙酰转移酶(argJ)、N-乙酰谷氨酸激酶(argB)、乙酰鸟氨酸转氨酶(argD)、鸟氨酸氨甲酰基转移酶(argF)、精氨琥珀酸合成酶(argG)、精氨琥珀酸裂合酶(argH)和氨甲酰磷酸合成酶。这些精氨酸生物合成基因存在于Arg操纵子(argCJBDFRGH)上，且受到由argR编码的精氨酸抑制剂(repressor)的调控(J Bacteriol.2002Dec；184(23)：6602-14)。因此，精氨酸抑制剂的破坏导致Arg操纵子表达的增加，因此增强产生L-精氨酸的酶的活性(US2002-0045223)。

赋予产生L-精氨酸的能力的另一种方法是，例如通过赋予对氨基酸类似物的抗性。棒状杆菌型细菌的实例包括对2-噻唑丙氨酸(2-thiazolealanine)有抗性，并且对于L-组氨酸、L-脯氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸或L-色氨酸营养缺陷的棒状杆菌型细菌(JP-A-54-044096)；对酮丙二酸、氟丙二酸(fluoromalonic acid)或单氟乙酸有抗性的棒状杆菌型细菌(JP-A-57-18989)；对精氨醇(argininol)有抗性的棒状杆菌型细菌(JP-B-62-024075)；对x-胍有抗性的棒状杆菌型细菌(x是脂肪酸或脂肪链衍生物)(JP-A-2-186995)；和对精氨酸氧肟酸(arginine hydroxamate)和6-氮尿嘧啶有抗性的棒状杆菌型细菌(JP-A-57-150381)。

赋予产生L-谷氨酰胺的能力的方法实例是通过修饰棒状杆菌型细菌来增强编码L-谷氨酰胺生物合成酶的基因的表达。L-谷氨酰胺生物合成酶的实例包括谷氨酰胺合成酶和谷氨酸脱氢酶(US2003-0003550)。

也可以通过减少或消除催化反应的酶的活性来赋予产生L-谷氨酰胺的能力，所述反应从L-谷氨酰胺生物合成途径分支、且产生其它化合物。例如，可以通过减少谷氨酰胺酶的活性来赋予产生L-谷氨酰胺的能力(US2004-0152175)。

也可以通过赋予对L-氨基酸类似物的抗性来赋予产生L-谷氨酰胺的能力。这些方法的实例包括，赋予对于6-重氮-5-氧-正亮氨酸(6-diazo-5-oxo-norleucine)的抗性的方法(JP-A-3-232497)，赋予对于嘌呤类似物和/或甲硫氨酸亚砜(methionine sulfoxide)的抗性的方法(JP-A-61-202694)，赋予对于α-酮丙二酸的抗性的方法(JP-A-56-151495)，以及赋予对于含谷氨酸的肽的抗性的方法(JP-2-186994)。

产生L-谷氨酰胺的棒状杆菌型细菌的具体实例包括以下菌株：

黄色短杆菌AJ11573(FERM P-5492，JP56-161495A)

黄色短杆菌AJ11576(FERM BP-10381，JP56-161495A)

黄色短杆菌AJ12212(FERM P-8123，JP61-202694A)

黄色短杆菌AJ12418(FERM BP-2205，JP02-186994A)

黄色短杆菌DH18(FERM P-11116，JP03-232497A)

栖糖蜜棒杆菌DH344(FERM P-11117，JP3-232497A)

谷氨酸棒杆菌AJ11574(FERM P-5493，JP56-151495A)

赋予产生L-脯氨酸的能力的方法实例包括修饰棒状杆菌型细菌以增强编码L-脯氨酸生物合成酶的基因的表达的方法。L-脯氨酸生物合成酶的实例包括谷氨酸激酶、γ-谷氨酰磷酸还原酶(γ-glutamyl phosphate reductase)和脯氨酸-5-羧化物还原酶(pyroline-5-carboxylate reductase)(J Bacteriol.1996Aug；178(15)：4412-9.)。

也可以通过减少或消除催化反应的酶的活性赋予产生L-脯氨酸的能力，所述反应从L-脯氨酸生物合成途径分支、并产生其它化合物。例如，可以通过减少鸟氨酸转氨酶(ornithine-aminotransferase)的活性来赋予产生L-脯氨酸的能力(J Bacteriol.1996 Aug；178(15)：4412-9.)。

同时，因为L-精氨酸、L-谷氨酰胺和L-脯氨酸含有L-谷氨酸作为碳骨架，所以可以通过扩增编码酶的基因赋予产生这些氨基酸的能力，所述酶在上述产生L-谷氨酸的细菌中，催化导致从L-谷氨酸产生上述每种L-氨基酸的反应。

此外，由于L-丙氨酸是通过L-天冬氨酸的β-脱羧合成的，所以可以通过修饰产生L-天冬氨酸的细菌以使乙酰辅酶A水解酶活性减少来获得产生L- 丙氨酸的细菌。

通过育种赋予或增强L-赖氨酸生产力可以通过引入一个或多个下列的突变来进行。这样的人工突变体如下所示：对于S-(2-氨乙基)-半胱氨酸(在下文中称为“AEC”)具有抗性的突变体；生长需要氨基酸例如L-高丝氨酸的突变体(参见日本专利公布号4828078和566499)；对于AEC具有抗性且需要氨基酸例如L-亮氨酸、L-高丝氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-精氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸等的突变体(参见美国专利3,708,395和3,825,472)；对于DL-氨基己内酰胺、氨基月桂基内酰胺(aminolauryllactam)、天冬氨酸类似物、磺胺类药、醌型化合物和N-月桂基亮氨酸(N-lauroylleucine)具有抗性的产生L-赖氨酸的突变体，和对于草酰乙酸脱羧酶或呼吸系统酶抑制剂具有抗性的产生L-赖氨酸的突变体(参见日本专利Laid-Open编号5053588，5031093，52102498，539394，5386089，559783，559759，5632995和5639778，日本专利公布号5343591和531833)；需要肌醇或乙酸的产生L-赖氨酸的突变体(见日本专利Laid-Open编号559784和568692)；对于氟丙酮酸或对34℃或更高的温度敏感的生产L-赖氨酸的突变体(见日本专利LaidOpen编号5386090)；对于乙二醇具有抗性的短杆菌和棒杆菌的产生L-赖氨酸的突变体(见美国专利4,411,997)。

赋予产生L-赖氨酸的能力的方法实例是增强编码L-赖氨酸生物合成酶的基因的表达。参与了L-赖氨酸生物合成的酶的实例包括，但不限于：二氨基庚二酸途径酶，如二氢吡啶二羧酸合酶(dihydrodipicolinate synthase)基因(dapA)、天冬氨酸激酶基因(lysC)、二氢吡啶二羧酸还原酶(dihydrodipicolinatedreductase)基因(dapB)、二氨基庚二酸脱羧酶基因(lysA)、二氨基庚二酸脱氢酶基因(ddh)(上述所有；国际公布号96/40934)、磷酸烯醇丙酮酸羧酶基因(ppc)(日本专利申请Laid-Open编号60-87788)、天冬氨酸转氨酶基因(aspC)(日本专利公布号6-102028)、二氨基庚二酸差向异构酶基因(dapF)(日本专利申请Laid-Open编号2003-135066)和天冬氨酸半醛脱氢酶(aspartate semialdehydedehydrogenease)基因(asd)(国际公布号00/61723)；和氨基己二酸途径酶，如同型乌头酸水合酶(homoaconitate hydratase)基因(日本专利申请Laid-Open编号2000-157276)。

此外，本发明的细菌可具有减少的催化反应的酶的活性，或者可使所述酶具有缺陷，所述反应通过从L-赖氨酸生物合成途径分支，生成除L-赖氨酸之外的产物。催化反应的酶包括高丝氨酸脱氢酶和赖氨酸脱羧酶，所述反应通过从L-赖氨酸生物合成途径分支生成除L-赖氨酸之外的产物。这些酶的活性减少的菌株在WO95/23864和WO96/178930中有所描述。

<2>减少乙酰辅酶A水解酶活性的修饰

如上所述本发明的棒状杆菌型细菌具有产生L-氨基酸的能力，所述L-氨基酸是通过使用丙酮酸作为中间物的生物合成途径产生的，且经过修饰以使乙酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.1)活性减少。

本发明的棒状杆菌型细菌可以通过以下方法获得，修饰上述的具有通过使用丙酮酸作为中间物的生物合成途径产生L-氨基酸的能力的棒状杆菌型细菌，以使乙酰辅酶A水解酶活性减少。培育本发明的棒状杆菌型细菌时，赋予细菌产生L-氨基酸的能力，或修饰细菌以使乙酰辅酶A水解酶活性减少，可以以任何顺序进行。

“乙酰辅酶A水解酶(ACH)活性”指催化从乙酰辅酶A和水产生乙酸的活性。“修饰以使乙酰辅酶A水解酶活性减少”的含义是乙酰辅酶A水解酶活性低于未修饰的菌株，包括野生型棒状杆菌型细菌。与未修饰的菌株相比，每单位细胞重量的ACH活性优选减少到50％或以下，更优选30％或以下，还更优选10％或以下。在此，作为对照的野生型棒状杆菌型细菌包括，例如，乳发酵短杆菌2256菌株(ATCC 13869)或谷氨酸棒杆菌ATCC 13032；(被用作对照的)未修饰的菌株包括乳发酵短杆菌Δldh菌株。乙酰辅酶A水解酶活性可以根据Gergely，J.等的方法测量(Gergely，J.，Hele，P.& Ramkrishnan，C.V.(1952)J.Biol.Chem.198p323-334)。“减少”包括活性完全消失的情况。优选的是，本发明的棒状杆菌型细菌具有的乙酰辅酶A水解酶活性比野生型或未修饰的菌株低，且引起的L-氨基酸积累比野生型或未修饰的菌株高。

ACH的实例包括含有SEQ ID NO：24所示氨基酸序列的蛋白质，和包含SEQ ID NO：24所示氨基酸序列，其中在一个或多个位置取代、缺失、插入或添加一个或多个氨基酸，但保留了ACH活性的蛋白质。尽管此处所指的“几个”氨基酸残基的数量可能依据蛋白质氨基酸残基的三维结构中的位置或种类而不同，但可以优选为2到20个，更优选2到10个，特别优选2到5个。在保留ACH活性的同时，ACH基因编码的蛋白质与SEQ ID NO：24所示氨基酸序列的同源性优选不低于80％，更优选不低于90％，还更优选不低于95％，特别优选不低于97％。这些ACH同源物中的氨基酸取代优选为保守取代，包括以ser或thr取代ala，以gln、his或lys取代arg，以glu、gln、lys、his或asp取代asn，以asn、glu或gln取代asp，以ser或ala取代cys，以asn、glu、lys、his、asp或arg取代gln，以gly、asn、gln、lys或asp取代glu，以pro取代gly，以asn、lys、gln、arg或tyr取代his，以leu、met、val或phe取代ile，以ile、met、val或phe取代leu，以asn、glu、gln、his或arg取代lys，以ile、leu、val或phe取代met，以trp、tyr、met、ile或leu取代phe，以thr或ala取代ser，以ser或ala取代thr，以phe或tyr取代trp，以his、phe或trp取代tyr和以met、ile或leu取代val。

“修饰以使乙酰辅酶A水解酶活性减少”包括每个细胞中乙酰辅酶A水解酶分子数量减少的情况，和每分子辅酶A水解酶活性减少的情况。具体地说，这些修饰可以通过以下方法完成，例如，破坏染色体上编码乙酰辅酶A水解酶的基因，或修饰表达调控序列，如启动子和/或Shine-Dalgarno(SD)序列。染色体上的乙酰辅酶A水解酶基因包括，例如，包含SEQ ID NO：23的核苷酸1037到2542的DNA。此外，乙酰辅酶A水解酶基因包括，例如，通过使用引物SEQ ID 7和8用PCR方法可获得的DNA。另外，染色体上的乙酰辅酶A水解酶基因可以是在严紧条件下能够与SEQ ID No.23的核苷酸1037到2542或可由所述核苷酸制备的探针杂交的DNA，只要其编码具有乙酰辅酶A水解酶活性的蛋白质。“严紧条件”指这样的条件，在该条件下，形成所谓的特异性杂交，而不形成所谓的非特异性的杂交。尽管难以用数值清晰地说明这些条件，但这些条件的实例包括，在60℃，并在对应于1×SSC，0.1％SDS，优选0.1×SSC，0.1％SDS的盐浓度，进行一次，优选两次或三次洗涤。

可以通过合成基于谷氨酸棒杆菌的核苷酸序列(例如，SEQ ID No.23，NCgl2480 of Gen Bank登录号NC_003450(NC_003450的2729376到2730884的互补链))的合成寡核苷酸，并使用谷氨酸棒杆菌的染色体DNA作为模板进行PCR来克隆乙酰辅酶A水解酶基因(在下文中称为“ach基因”)。另外，源自棒状杆菌型细菌如乳发酵短杆菌的另一个核苷酸序列也是可用的。可以由棒状杆菌型细菌作为DNA供体，通过例如Saito和Miura的方法(H.Saitoand K.Miura，Biochem.Biophys.Acta，72，619(1963)，“BiotechnologyExperiments Handbook”，ed.By The Society for Biotechnology Japan，p.97 to 98， Baifukan，1992)制备染色体DNA。

由此制备的ach基因或其部分可用于破坏染色体ach基因。另外，用于破坏染色体ach基因的ach基因也可以是具有足够同源性以导致与目标棒状杆菌型细菌染色体上的ach基因同源重组的基因(例如，具有SEQ ID NO：23的核苷酸1037到2542的基因)。这里，足够引起同源重组的同源性优选80％或以上，更优选90％或以上，还更优选95％或以上，特别优选97％或以上。此外，在严紧条件下可以与上述基因杂交的DNA也可以被用于基因破坏。

可通过如下方法破坏ach基因，例如，制备“缺失型ach基因”，其中ach基因的部分序列缺失，以至于不产生功能正常的乙酰辅酶A水解酶，用含有此缺失型ach基因的DNA转化棒状杆菌型细菌，以导致缺失型ach基因和染色体上ach基因之间的重组。这种利用同源重组进行基因置换的基因破坏已经被建立，并包括使用线性DNA的方法，或使用含温度敏感性复制起点的质粒的方法(美国专利6,303,383或JP-A-05-007491)。利用同源重组进行基因置换的基因破坏也可以通过使用在棒状杆菌型细菌中无法复制的质粒来进行。优选使用在棒状杆菌型细菌中无法复制，但在埃希氏菌属细菌(Escherichiabacteria)中能够复制的质粒。这种质粒的实例包括pHSG299(Takara Bio)和pHSG399(Takara Bio)。

可以用缺失型ach基因，例如，通过使用sacB(Schafer，A.et al.，Gene 145(1994)69-73)的同源重组来替换染色体ach基因。sacB基因编码果聚糖蔗糖酶，且用于有效地选择菌株，在所述菌株中染色体目标基因被突变基因所取代，并将载体部分从染色体中消除(cured)。

首先，可以通过以下方法制备重组质粒：在具有温度敏感性复制起点的质粒中，插入缺失型(突变体)ach基因、sacB基因和选择标记，如氯霉素抗性基因。将所得质粒引入棒状杆菌型细菌的宿主菌株。当果聚糖蔗糖酶在棒状杆菌型细菌的细胞中表达时，由蔗糖转化产生的果聚糖对于细菌是致死的，因此该细菌无法在含有蔗糖的培养基中生长。所以，通过在含有蔗糖的平板中培养，可选择菌株，所述菌株中在质粒的突变体ach基因和染色体ach基因之间发生取代，并由此将质粒的其他部分从细胞中消除。

sacB基因的实例包括下列：

枯草芽孢杆菌(Bacillus subillus)：sacB GenBank登录号X02730(SEQ IDNO：19)

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliqufaciens)：sacB GenBank登录号X52988

运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)：sacB GenBank登录号L33402

嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacilus stearothermophilus)：surB GenBank登录号U34874

Lactobacillus sanfranciscensis：frfA GenBank登录号AJ508391

Acetobacter xvlinus：lsxA GenBank登录号AB034152

Gluconacetobacter diazotrophicus：lsdA GenBank登录号L41732

可以通过常规方法进行转化。例如，可以使用以氯化钙处理受体细胞从而增加DNA通透性的方法，其已被报导用于大肠杆菌(Mandel，M.and Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))，以及使用由生长细胞制备的感受态细胞以引入DNA的方法，其以被报导用于枯草芽孢杆菌(Duncan，C.H.，Wilson，G.A.andYoung，F.E.，Gene，1，153(1977))。除了这些方法之外，可以使用将重组DNA引入到原生质体-样或原生质球-样(protoplast-or spheroplast-like)受体细胞中的方法，其已被报导可用于枯草芽孢杆菌、放线菌类(actinomytetes)和酵母(Chang，S.and Choen，S.N.，Molec.Gen.Genet.，168，111(1979)；Bibb，M.J.，Ward，J.M.and Hopwood，O.A.，Nature，274，398(1978)；Hinnen，.A.Hicks，J.B.and Fink，G.R.，Proc.Natl.Sci.USA，75，1929(1978))。此外，棒状杆菌型细菌的转化还可以通过电脉冲法进行(Sugimoto et al.，JP2-207791A)。

用于棒状杆菌型细菌的温度敏感性质粒的实例包括p48K和pSFKT2(EP1038966)、pHSC4(法国专利Laid-open公布号2667875，1992和JP5-7491A)、pBS5T等等。在棒状杆菌型细菌中，这些质粒可以在至少为25℃的温度自主复制，但不能在37℃的温度自主复制。含有pHSC4的大肠杆菌(Escherichia coli)AJ12571菌株依据布达佩斯条约的规定于1990年10月11日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(National Institute ofBioscience and Human Technology，Agency of Industrial Science and Technology，Ministry ofInternational Trade and Industry)(目前为独立行政法人产业技术综合研究所特许微生物保藏中心(International Patent Organism Depositary，NationalInstitute of Advanced Industrial Science and Technology)，其地址为Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-5466，Japan)，并给予保藏号FERM BP-3524。

在温度敏感性复制起点不起作用的温度(例如25℃)培养转化的菌株，以获得已引入所述质粒的菌株。然后，在高温下培养转化体以消除温度敏感性质粒，并涂布在含抗生素药物如卡那霉素的平板培养基上。虽然消除了所述质粒的菌株不能在含这种抗生素药物的平板上生长，但其中染色体ach基因用突变的ach基因取代的少数菌株能够生长并作为菌落出现。

在这种将含突变ach基因的重组DNA整合到染色体DNA的菌株中，重组DNA导致了与原来存在于染色体上的ach基因的重组，并将染色体ach基因与突变ach基因的融合基因插入到染色体，以使重组DNA的其它部分(载体区段、温度敏感性复制起点和药物抗性标记)存在于融合基因之间。然后，为了在染色体DNA上只留下突变的ach基因，将一个拷贝的ach基因连同载体区段(包括温度敏感性复制起点和药物抗性标记)从染色体DNA消除。在这种情况下，正常ach基因被留在染色体DNA上，并将突变的ach基因从染色体DNA中消除，或者相反，将突变的ach基因留在染色体DNA上，并将正常的ach基因从染色体DNA中消除。然后，可以通过使用PCR、Southern杂交等选择在染色体上只留下突变ach基因的菌株。

减少乙酰辅酶A水解酶活性也可以通过修饰表达调控序列，如启动子、Shine-Dalgarno(SD)序列、操纵子、终止子或衰减子(attenuator)来实现。染色体上的表达调控序列可以通过基因分析软件如Genetix，通过用于表达分析的载体如启动子搜索载体(promoter-searching vector)，以及通过已知的信息，如Genbank数据库鉴定。例如，减少乙酰辅酶A水解酶活性的突变实例包括，修饰乙酰辅酶A水解酶基因的启动子区以使其效力减少的突变，和破坏乙酰辅酶A水解酶基因启动子区共有序列的突变。可以通过使用不能在宿主细胞中进行复制的温度敏感性质粒或自杀载体(suicide vector)来引入这些突变。

减少乙酰辅酶A水解酶活性也可以通过以下方法完成：在染色体上乙酰辅酶A水解酶基因的编码区引入氨基酸取代(错义突变)；引入终止密码子(无义突变)；通过添加或缺失一个或两个核苷酸引入移码突变；或缺失基因的一部分(Journal of Biologial Chemistry 272：8611-8617(1997))。

减少乙酰辅酶A水解酶活性的实例还包括如下方法：用紫外线照射或用在常规突变处理中使用的致突变源(mutagen)如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)和亚硝酸处理棒状杆菌型细菌，以选择乙酰辅酶A水解活性减少的菌株(“Amino Acid Fermentation”，Center for Academic Publications Japan Co.，Ltd.， 1st ed.Published on May 30，1986，p.77至100)。

同时，本发明中优选使用被进一步修饰以使谷氨酸脱氢酶(以下称为“GDH”)活性增强的菌株。

为使具有产生L-氨基酸的能力、且经修饰以减少ACH活性的棒状杆菌型细菌中的GDH活性得到扩增，将编码GDH的基因片段连接到可在棒状杆菌型细菌中起作用的载体，优选连接到多拷贝型载体上以制备重组DNA，再用得到的DNA转化棒状杆菌型细菌。由于转化体细胞中编码GDH的基因拷贝数增加，GDH活性得到扩增。

编码GDH的基因可以源自棒状杆菌型细菌或可源自其他生物体如大肠杆菌。

已经鉴定了编码棒状杆菌型细菌的GDH的基因(gdh基因)的核苷酸序列(例如，SEQ ID NO：25：Molecular Microbiology(1992)6(3)，317-3261999，NC_003450的2194739..2196082的互补链)，所以gdh基因可以使用基于所述核苷酸序列设计的引物和棒状杆菌型细菌的染色体DNA作为模板通过PCR获得(PCR：聚合酶链式反应；White，T.J.et al.；Trends Genet.5，185(1989))。编码其他微生物的GDH的基因也可以以相同方式获得。

<3>使用本发明的棒状杆菌型细菌产生L-氨基酸

可通过在培养基中培养如上所述得到的棒状杆菌型细菌以产生所述L-氨基酸，并导致所述L-氨基酸的积累，和从培养基中收集所述L-氨基酸，从而有效地产生使用丙酮酸作为中间物产生的L-氨基酸。

为了使用本发明的棒状杆菌型细菌产生这些L-氨基酸，可以通过常规方法用普通培养基进行培养，所述普通培养基含有碳源、氮源、无机盐和(如果需要的话，)痕量的有机营养物，如氨基酸和维生素。可以使用合成培养基或天然培养基。培养基中使用的碳源和氮源可以是任何种类的，只要它们能够被本发明中菌株所利用。

碳源的实例包括糖类，如葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、淀粉水解物和糖蜜。此外，有机酸类如柠檬酸和苹果酸，和醇类如乙醇，可以单独使用或与其他碳源组合使用。

氮源的实例包括氨，铵盐如硫酸铵、碳酸铵、氯化铵、磷酸铵和乙酸铵，以及硝酸盐。

可以痕量存在的有机营养物的实例包括氨基酸、维生素、脂肪酸和核酸，并可以使用含有这些营养物的蛋白胨(peptone)、酪蛋白氨基酸、酵母提取物和大豆蛋白水解物。在使用其生长需要氨基酸等的营养缺陷型突变菌株的情况下，优选补充所需的营养物。

无机盐的实例包括磷酸盐、镁盐、钙盐、铁盐和锰盐。

在需氧条件下在20到45℃的发酵温度、同时将pH调整为5到9进行培养。如果培养过程中pH降低，可以在培养基中加入碳酸钙或碱，如氨气来中和。大约10到120小时的培养导致可观量的L-氨基酸的积累。

培养完成后，通过公知的回收方法从培养基中收集L-氨基酸。例如，将细胞从培养液中去除后，通过浓缩和结晶来收集L-氨基酸。

实施例

在下文中，通过下列非限制性实施例更加具体地解释本发明。

实施例1

<1>构建携带sacB基因的破坏载体

(A)构建pBS3

使用枯草芽孢杆菌的染色体DNA作为模板，和SEQ ID NOS：1和2的寡核苷酸作为引物，通过PCR获得了sacB基因(SEQ ID NO：19)。使用LA taq(由TaKaRa制造)如下进行PCR：在94℃贮热(heat retention)5分钟的一个循环；和94℃变性30秒、49℃退火30秒和72℃延伸2分钟的25个循环。用常规方法纯化所得PCR产物，然后用BglII和BamHI消化并平端化。将所述片段插入到已用AvaII消化且平端化的pHSG299中。所得DNA用于转化大肠杆菌JM109(由TAKARABIO INC.制造)的感受态细胞。然后，将转化的细菌细胞涂布到含25μg/ml卡那霉素(以下缩写为″Km″)的LB琼脂培养基上，温育一夜。此后，分离单菌落作为转化体。从所得转化体中提取质粒，并将具有目的PCR产物的插入物的质粒命名为pBS3。图1显示了构建pBS3的方法。

(B)构建pBS4S

使用不引起氨基酸取代的交换(cross-over)PCR通过核苷酸取代来修饰pBS3上卡那霉素抗性基因中的SmaI识别位点，从而使pBS3不被内切酶 (endnuclease)SmaI切断。首先，使用pBS3作为模板和SEQ ID NOS：3和4的合成DNA作为引物进行PCR，以由此获得卡那霉素抗性基因的N末端片段。另一方面，为了获得卡那霉素抗性基因的C末端片段，使用pBS3作为模板和SEQ ID NOS：5和6的合成DNA作为引物进行PCR。使用PyrobestDNA聚合酶(由TAKARA BIO INC.制造)如下进行PCR以获得目标PCR产物：在98℃贮热5分钟的一个循环；以及98℃变性10秒、57℃退火30秒、72℃延伸1分钟的25个循环。SEQ ID NOS：4和5彼此部分互补，且不包含SmaI识别位点。然后，为了获得不含SmaI识别位点的突变卡那霉素抗性基因的全长片段，将上述N末端和C末端基因产物以基本上等摩尔量混合在一起。使用所述基因产物作为模板和SEQ ID NOS：3和6的合成DNA作为引物进行PCR，以获得SmaI位点修饰的卡那霉素抗性基因片段。使用Pyrobest DNA聚合酶(由TAKARA BIO INC.制造)如下进行PCR以获得目标PCR产物：在98℃贮热5分钟的一个循环；以及98℃变性10秒、57℃退火30秒、72℃延伸1.5分钟的25个循环。

用常规方法纯化PCR产物，然后用BanII消化，然后插入到pBS3的上述BanII识别位点中。将所得质粒用于转化大肠杆菌JM109的感受态细胞(可由Takara Bio得到)。即，将转化的细菌细胞涂布到含有25μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基上，并温育一夜。此后，选择出现的菌落作为转化体。从所得转化体中分离质粒，并将具有目的PCR产物的插入物的质粒命名为pBS4S。图2显示了构建pBS4S的方法。

(C)构建pBS5T

通过利用BamHI和SmaI消化棒状杆菌型细菌中的温度敏感性复制起点和平端化，将其从pHSC4(JP-A-5-7491)中切除，并插入pBS4S的平端化的NdeI位点。使用所得DNA转化大肠杆菌JM109的感受态细胞(由TAKARABIO INC.制造)，并涂布到含有25μg/ml Km的LB琼脂培养基上，然后培养过夜。然后，分离单菌落作为转化体。从所得转化体中提取质粒，并将具有目的PCR产物的插入物的质粒命名为pBS5T。图3显示了构建pBS5T的方法。

实施例2

<构建ldh-破坏的菌株>

(A)克隆破坏乳酸脱氢酶基因的片段

使用基于谷氨酸棒杆菌ATCC13032菌株(SEQ ID NO：21：GenBank数据库登录号NC_003450)的乳酸脱氢酶基因(以下缩写为“ldh基因”)的核苷酸序列设计的合成DNA通过交换PCR得到含有源自缺失了ORF的乳发酵短杆菌2256菌株的ldh基因的基因片段。具体来说，使用乳发酵短杆菌2256菌株的染色体DNA作为模板和SEQ ID NOS：7和8的合成DNA作为引物通过常规方法进行PCR，以获得ldh基因的N末端片段。另一方面，为了获得ldh基因的C末端片段，使用乳发酵短杆菌2256菌株的染色体DNA作为模板和SEQ ID NOS：9和10的合成DNA作为引物，通过常规方法进行PCR。SEQ IDNOS：8和9彼此互补，且被设计以导致ldh基因的ORF全部序列的缺失。

然后，为了获得缺失内部序列的ldh基因片段，将ldh的N末端和C末端基因产物以基本上等摩尔量混合，且使用所述混合物作为模板和SEQ IDNOS：11和12的合成DNA作为引物，通过常规方法进行PCR。在以常规方式纯化PCR产物之后，用SalI消化PCR产物。其后，将该PCR产物插入上述pBS4S的SalI位点。用所得DNA转化大肠杆菌感受态细胞(由TAKARABIO INC.制造)，并涂布到含有100μM IPTG、40μg/ml X-Gal和25ug/ml Km的LB琼脂培养基上，然后过夜培养。其后分离单菌落作为转化体。从所得转化体中提取质粒，并将具有目的PCR产物的插入物的质粒命名为pΔldh56-1。图4显示了所述质粒的构建方法。

(B)制备ldh-破坏的菌株

由于上述(A)中所制备的pΔldh56-1不含有使其能够在棒状杆菌型细菌中自主复制的区域，当以此质粒转化棒状杆菌型细菌时，通过同源重组将所述质粒整合入染色体的转化体菌株所出现的频率极低。因此，使用含有高浓度pΔldh56-1质粒的溶液通过电脉冲法转化乳发酵短杆菌2256菌株，然后涂布到含有25μg/ml卡那霉素的CM-Dex琼脂培养基(5g/L葡萄糖、10g/L聚胨、10g/L酵母提取物、1g/L KH₂PO₄、0.4g/L MgSO₄·7H₂O、0.01g/L FeSO₄·7H₂O、0.01g/L MnSO₄·7H₂O、3g/L尿素和1.2g/L大豆水解物，和pH 7.5(KOH))上，在31.5℃培养约30小时。出现在此培养基上的菌落是这样的菌株，其中在质粒的ldh基因片段和乳发酵短杆菌2256菌株的染色体上的ldh基因之间发生了同源重组，并将卡那霉素抗性基因和源自质粒的SacB基因插入该染色体。

然后，在不含卡那霉素的CM-Dex液体培养基中，于31.5℃将这些第一次重组体(first recombinant)培养一夜。在适当的稀释后，将重组体涂布到含蔗糖10％的Dex-S10琼脂培养基(10g/L蔗糖、10g/L聚胨、10g/L酵母提取物、1g/L KH₂PO₄、0.4g/L MgSO₄·7H₂O、0.01g/L FeSO₄·7H₂O、0.01g/LMnSO₄·4H₂O、3g/L尿素、1.2g/L大豆水解物和10μg/L生物素，和pH 7.5(KOH))上并在31.5℃培养约30小时。结果，获得约50个菌株，其中通过二次重组消除sacB基因，且成为蔗糖非敏感性的。

由此获得的菌株包括染色体ldh基因被源自pΔldh56-1的突变型取代的菌株，以及保留了染色体野生型ldh基因的菌株。通过将在Dex-S10琼脂培养基上培养获得的细胞进行直接PCR(direct PCR)，容易地检查ldh基因是突变型还是野生型。使用PCR扩增的引物(SEQ ID NOS：7和10)分析ldh基因，选择其PCR产物小于野生型ldh基因的菌株作为ldh破坏的菌株，并被命名为2256Δ(ldh)菌株，所述野生型ldh基因是使用野生型2256菌株的染色体DNA作为模板扩增的。所得菌株被用作亲本菌株用于制备下述ach基因破坏的菌株。

当发酵在厌氧条件下进行时，积累相当大量的乳酸作为副产品，所以乳酸脱氢酶活性缺乏是优选的(JP 11-206385；J Mol Microbio Biotechnol.2004；7(4)：182-96.)。然而，L-谷氨酸通常在乳酸脱氢酶不起作用的有氧条件下产生，并且无需在乙酰辅酶A水解酶基因破坏的菌株中破坏ldh基因而用于产生L-谷氨酸。

实施例3

<构建乙酰辅酶A水解酶破坏的菌株>

(A)克隆用于破坏乙酰辅酶A水解酶基因的片段

使用基于谷氨酸棒杆菌ATCC13032(SEQ ID NO：23：GenBank数据库登录号NC_003450)乙酰辅酶A水解酶基因(以下该基因缩写为“ach”)的核苷酸序列设计的合成DNA，通过交换PCR获得含有ach基因的基因片段，所述ach基因源自缺失ORF的乳发酵短杆菌2256菌株。具体来说，使用乳发酵短杆菌2256菌株的染色体DNA作为模板和SEQ ID NOS：13和14的合成DNA 作为引物通过常规方法进行PCR，以获得ach基因的C末端片段。另一方面，为了获得N末端片段，使用乳发酵短杆菌2256菌株的染色体DNA作为模板和SEQ ID NOS：15和16的合成DNA作为引物通过常规方法进行PCR。SEQID NOS：14和15彼此部分互补。利用KOD-plus(由TOYOBO Co.，LTD.制造)进行PCR反应。在进行了94℃贮热2分钟的一个循环之后，将如下步骤重复30个循环：在94℃变性10秒、55℃退火30秒、68℃延伸50秒。然后，为了获得缺失内部序列的ach基因片段，将ach基因的N末端片段和C末端片段以基本上等摩尔量混合在一起。使用所述混合产物作为模板和SEQ ID NOS：17和18的合成DNA作为引物通过常规方法进行PCR。用KOD-plus(由TOYOBO Co.，LTD.制造)进行PCR反应。进行了在94℃保持(retention)2分钟的一个循环之后，将如下步骤重复30个循环：94℃变性10秒、55℃退火30秒、68℃延伸90秒。在通过常规方式纯化扩增的PCR产物之后，用XbaI消化PCR产物，并将其插入到上述实施例1(B)中所构建的pBS4S的XbaI位点中。用所得DNA转化大肠杆菌JM 109的感受态细胞(由TAKARA BIO INC.制造)，并涂布到含有100μM IPTG、40μg/ml X-Gal和25μg/ml Km的LB琼脂培养基中，然后培养一夜。此后，分离白色单菌落作为转化体。从所得转化体中提取质粒，并将具有目的PCR产物的插入物的质粒命名为pBS4S::Δach。图5显示了构建pBS4S::Δach的方法。

(B)制备ach破坏的菌株

由于上述(A)中所制备的pBS4S::Δach不含使其能够在棒状杆菌型细菌的细胞中自主复制的区域，当以该质粒转化棒状杆菌型细菌时，通过同源重组将所述质粒并入其染色体的菌株作为转化体出现的频率极低。因此，使用含有高浓度pBS4S::Δach质粒的溶液通过电脉冲法转化乳发酵短杆菌2256Δ(ldh)菌株，并涂布到含有25μg/ml卡那霉素的CM-Dex琼脂培养基上，在31.5℃培养约30小时。出现在此培养基上的菌株是这样的菌株，其中在质粒的缺失型(deletion-type)ach基因片段和乳发酵短杆菌2256Δ(ldh)菌株的染色体上的ach基因之间发生了同源重组，并将卡那霉素抗性基因和源自质粒的SacB基因插入染色体中。

然后，在不含卡那霉素的CM-Dex液体培养基中，于31.5℃将这些第一次重组体培养一夜。在适当的稀释后，将重组体涂布到含蔗糖10％的Dex-S10 琼脂培养基上，并在31.5℃培养约30小时。结果，获得约50个菌株，其中通过二次重组从染色体消除sacB基因，且成为蔗糖非敏感性的。

由此获得的菌株包括染色体ach基因被源自pBS4S::Δach的突变型取代的菌株，以及保留了染色体野生型ach基因的菌株。通过将在Dex-S10琼脂培养基上培养获得的细胞进行直接PCR，容易地确定ach基因是突变型还是野生型。使用引物(SEQ ID NOS：13和16)分析ach基因后，对于野生型ach基因扩增2.9kb的DNA片段和对于突变型ach基因扩增1.4kb的DNA片段。作为通过上述方法分析蔗糖非敏感性菌株的结果，选择出只含有突变型ach基因的菌株，并将从2256Δ(ldh)获得的ach破坏的菌株命名为2256Δ(ldh，ach)菌株。

实施例4

<利用ach破坏的菌株产生L-谷氨酸>

(1)评价ach破坏的菌株的产生L-谷氨酸的能力

如下在S型釜(S-type jar)中培养乳发酵短杆菌2256Δ(ldh)菌株和2256Δ(ldh，ach)菌株用于产生L-谷氨酸。将各一环(loop)在CMDex琼脂平板上培养的2256Δ(ldh)菌株和2256Δ(ldh，ach)菌株接种到300ml的种子培养基(seed medium)(每1L纯化水(purified water)中60g葡萄糖、1.54g H₃PO₄、1.45g KOH、0.9g MgSO₄·7H₂O、0.01g FeSO₄·7H₂O、670μg VB1·HCl、40μg生物素、1.54g大豆水解物、0.28g DL-甲硫氨酸和0.1ml AZ-20R(用氨水调节至pH 7.2))，以1/1vvm通气培养直到残糖被完全消耗，同时控制pH为7.2(NH₃)，温度为31.5℃，且PL＞0。

将30ml培养液接种到270ml主培养基(main culture medium)(每1L纯化水中80g葡萄糖、3.46g KH₂PO₄、1g MgSO₄·7H₂O、0.01g FeSO₄·7H₂O、0.01g MnSO₄·4-5H₂O、230μg VB1·HCl、0.35g大豆水解物、和0.2ml AZ-20R(用氨调节至pH 7.3))中，在1/1vvm通气条件下培养，同时控制温度为31.5℃，pH为7.3，且PL＞0。在残糖被完全消耗之前，加入70至80ml料液(feedsolution)，培养液由每1L纯化水500g葡萄糖和0.2ml AZ-20R组成，并继续培养到残糖完全被消耗。

结束培养之后，对培养液进行适当的稀释后，在Biotech Analyzer AS210(由Asahi Kasei Corporation制造)中分析培养液中所积累的L-谷氨酸(Glu)的量。表1显示了结果。

表1 通过ach缺陷型菌株产生L-谷氨酸

与2256Δ(ldh)菌株(亲本菌株)相比，2256Δ(ldh，ach)菌株在产率上显示约2％的改进。此外，作为L-谷氨酸前体的α-酮戊二酸(α-KG)的积累量改进了约三倍。此结果显示，减少或消除ACH活性在L-谷氨酸的产生中是有效的。

实施例5

<通过ach缺陷型菌株产生L-丙氨酸和L-缬氨酸>

(1)评价ach缺陷型菌株的培养

如下在S型釜中培养乳发酵短杆菌2256Δ(ldh)菌株和2256Δ(ldh，ach)菌株用于产生L-丙氨酸和L-缬氨酸。将各一环在CMDex琼脂平板上培养的2256Δ(ldh)菌株和2256Δ(ldh，ach)菌株，接种到300ml种子培养基(每1L纯化水60g葡萄糖、1.54g H₃PO₄、1.45g KOH、0.9g MgSO₄·7H₂O、0.01gFeSO₄·7H₂O、670μg VB1·HCl、40μg生物素、1.54g大豆水解物、0.28g DL-甲硫氨酸和0.1ml AZ-20R(用氨水调节至pH 7.2))中，并以1/1vvm通气培养直到残糖完全消耗，同时用氨控制pH为7.2，温度为31.5℃，且PL＞0。

将30ml培养液接种到270ml主培养基(每1L纯化水80g葡萄糖、3.46g KH₂PO₄、1g MgSO₄·7H₂O、0.01g FeSO₄·7H₂O、0.01g MnSO₄·4-5H₂O、230μg VB1·HCl、0.35g大豆水解物和0.2ml AZ-20R(用氨调节至pH 7.3))中，并在1/1vvm通气条件下培养，同时控制温度为31.5℃，pH为7.3，且PL＞0。在残糖被完全消耗之前，加入70至80ml料液，所述料液由每1L纯化水500g葡萄糖和0.2ml AZ-20R组成，并继续培养直到残糖被完全消耗。

完全培养之后，对培养液进行适当的稀释后，用Amino Acid AnalyzerL8500(由Hitachi，Ltd.制造)分析培养液中所积累的L-丙氨酸(Ala)和L-缬氨酸(Val)的量。表2显示了结果。

表2 通过ach缺陷型菌株产生Ala和Vla

2256Δ(ldh，ach)显示L-丙氨酸积累量的约2.2倍的改进，和L-缬氨酸积累量的约四倍的改进。此结果显示，减少或消除ACH活性在L-缬氨酸和L-丙氨酸的产生中是有效的。

工业适用性

根据本发明，改进了L-氨基酸的发酵产量(fermentation yield)，所述L-氨基酸是通过使用丙酮酸作为中间物的生物合成途径产生的。

Claims

1.具有产生L-氨基酸的能力的谷氨酸棒杆菌，其中所述谷氨酸棒杆菌被修饰使得乙酰辅酶A水解酶活性减少，并且其中所述L-氨基酸是通过使用丙酮酸作为中间物的生物合成途径产生的一种或多种L-氨基酸。

2.根据权利要求1的谷氨酸棒杆菌，其中通过将突变引入染色体乙酰辅酶A水解酶基因的编码区或表达调控区来减少所述乙酰辅酶A水解酶活性。

3.根据权利要求1的谷氨酸棒杆菌，其中通过破坏染色体乙酰辅酶A水解酶基因来减少所述乙酰辅酶A水解酶活性。

4.根据权利要求1至3中任一项的谷氨酸棒杆菌，其中所述乙酰辅酶A水解酶选自下组：

(A)包含SEQ ID NO：24所示氨基酸序列的蛋白质；和

5.根据权利要求1至3中任一项的谷氨酸棒杆菌，其中所述乙酰辅酶A水解酶基因选自下组：

(a)包含SEQ ID NO：23的核苷酸1037至2542的基因；和

(b)DNA，其能够在包括在0.1×SSC、0.1％SDS在60℃洗涤的严紧条件下，与包含SEQ ID NO：23的核苷酸1037至2542的多核苷酸杂交，并编码具有乙酰辅酶A水解酶活性的蛋白质。

6.根据权利要求1至3中任一项的谷氨酸棒杆菌，其中所述谷氨酸棒杆菌被进一步修饰以提高谷氨酸脱氢酶活性。

7.根据权利要求1至3中任一项的谷氨酸棒杆菌，其中所述L-氨基酸是一种或多种选自下组的L-氨基酸：L-谷氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-丙氨酸和L-缬氨酸。

8.产生L-氨基酸的方法，其包括：

在培养基中培养根据权利要求1至7中任一项的谷氨酸棒杆菌；和

9.根据权利要求8的方法，其中所述L-氨基酸是一种或多种选自下组的氨基酸：L-谷氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸和L-赖氨酸。