KR101947945B1 - L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-아미노산의 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 출원은 Ｌ-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용하여 L-아미노산을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 L-아미노산의 생산방법 {A microorganism of the genus Corynebacterium producing L-amino acids and method for producing L-amino acids using the same}

본 출원은 Ｌ-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용하여 L-아미노산을 생산하는 방법에 관한 것이다.

L-아미노산은 단백질의 기본 구성단위로서, 약품 원료와 식품첨가제, 동물 사료, 영양제, 살충제, 살균제 등의 중요 소재로 사용된다. 그 중에서도, L-라이신은 생체 내에서 전혀 생합성되지 않는 필수 아미노산이며, 성장촉진, 칼슘 대사, 위액분비촉진, 병에 대한 저항력 증가에 필요하다고 알려져 있다. 상기 L-라이신은 사료, 의약품, 식품 등에 다양하게 쓰이고 있다. 또한, L-발린도 필수 아미노산 중 하나이며, 항산화 효과 및 근육세포의 단백질 합성작용을 직접적으로 촉진시키는 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 상기 L-발린은 건강보조제, 의약품, 식품, 사료, 향료, 모발 및 피부의 컨디셔닝제 등으로 사용되고 있다.　

한편, 코리네박테리움 속 균주(Corynebacterium), 특히 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)은 L-아미노산 및 기타 유용물질 생산에 많이 이용되고 있는 그람 양성의 미생물이다. 상기 아미노산의 생산을 위해 고효율 생산 미생물 및 발효공정기술 개발을 위한 다양한 연구들이 수행되고 있다. 예를 들어, 코리네박테리움 속 균주에서 아미노산 생합성에 관여하는 효소를 암호화하는 유전자의 발현을 증가시키거나 또는 아미노산 생합성에 불필요한 유전자를 제거하는 것과 같은 목적 물질 특이적인 접근 방법이 주로 이용되고 있다(한국 등록특허공보 제10-0924065호, 제1208480호,). 또한, 이러한 방법 이외에 아미노산 생산에 관여하지 않는 유전자를 제거하는 방법, 아미노산 생산에 있어 구체적으로 기능이 알려지지 않은 유전자를 제거하는 방법 또한 활용되고 있다. 그러나, 여전히 효율적으로 고수율로 L-아미노산을 생산할 수 있는 방법에 대한 연구의 필요성이 대두되고 있다.

이러한 배경하에, 본 발명자들은 L-아미노산을 고효율로 생산할 수 있는 미생물을 개발하고자 예의 연구한 결과, 특정 유전자를 불활성화 하는 경우 L-아미노산의 생산 수율이 증가한다는 사실을 확인하여 본 출원을 완성하였다.

본 출원의 하나의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 단백질이 불활성화된, Ｌ-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물을 제공하는 것이다.

본 출원의 또 하나의 목적은 상기 미생물을 이용한 Ｌ-아미노산의 생산방법을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 출원은 하나의 양태로서 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 단백질이 불활성화된, Ｌ-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물을 제공한다.

본 출원에서 용어, "L-아미노산"은 미생물이 각종 탄소원으로부터 대사과정을 거쳐 생산될 수 있는 모든 L-아미노산을 포함하며, 구체적으로는. L-라이신, L-아르기닌, L-히스티딘 등의 염기성 아미노산, L-발린, L-류신, L-글리신, L-이소류신, L-알라닌, L-프롤린, L-메티오닌 등의 비극성 아미노산, L-세린, L-트레오닌, L-시스테인, L-아스파라긴산, L-글루타민 등의 극성 아미노산, L-페닐알라닌, L-티로신, L-트립토판 등의 방향족 아미노산, L-글루탐산, L-아스파르트산 등의 산성 아미노산일수 있다. 보다 구체적으로 본 출원에서 L-아미노산은 염기성 아미노산, 분지쇄 아미노산일 수 있다. 보다 더욱 구체적으로는 L-라이신(L-lysine) 또는 L-발린(L-valine)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 출원의 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 단백질이 불활성화된 경우 생산능이 증가하는 아미노산은 제한 없이 포함된다.

본 출원에서 용어, "서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 단백질"은 NCgl0275 유전자에 의해 암호화되는 코리네박테리움 속 미생물에 내재적으로 존재하는 단백질을 의미하며, 구체적으로 코리네박테리움 속 미생물에 내재적으로 존재하는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 조절 단백질(regulatory protein)을 의미한다. 상기 서열번호 1의 아미노산 서열 및 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있으며, 그 예로 NCBI의 GenBank 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 서열번호 1의 아미노산 서열로 필수적으로 구성되는 단백질, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 출원의 상기 단백질은 상기 서열번호 1로 기재한 아미노산 서열뿐만 아니라, 서열번호 1과 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열로 구성될 수 있다. 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산서열로 구성되는 단백질은 상기 서열번호 1의 아미노산 서열에 대해서 적어도 80% 이상, 구체적으로는, 83% 이상, 84% 이상, 88% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 또는 97% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 구성되는 단백질을 포함할 수 있다. 상기 서열과 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 서열번호 1의 아미노산 서열과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 경우도 역시 본 출원의 범주에 포함됨은 자명하다.

아울러, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 단백질은 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자에 의해 암호화되는 것일 수 있다. 또한, 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열로 필수적으로 구성되거나, 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 유전자에 의해 암호화되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열은, 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열뿐만 아니라, 서열번호 2와 적어도 80% 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열도 포함하는 것일 수 있다.

구체적으로, 상기 서열번호 1과 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 암호화할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열이면 본 출원의 범주에 포함되며, 상기 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 80% 이상, 구체적으로는 83% 이상, 84% 이상, 88% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 또는 97% 이상의 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자에 의해 암호화될 수 있다.

또한, 코돈 축퇴성(codon degeneracy)에 의해 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 이와 상동성을 가지는 단백질로 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드 역시 포함될 수 있음은 자명하다. 또한 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화하여, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질의 활성을 가지는 단백질을 암호화하는 서열이라면 제한 없이 포함될 수 있다. 상기 "엄격한 조건"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌(예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성이 높은 유전자끼리, 40% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60℃, 1×SSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다. 혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 폴리뉴클레오티드가 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원은 또한 실질적으로 유사한 폴리뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 폴리뉴클레오티드 단편을 포함할 수 있다.

구체적으로, 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60℃, 63℃ 또는 65℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.

폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).

본 출원에서 용어 "상동성"은 주어진 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열과 동일하거나 유사한 활성을 갖는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다.

상기 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 상동성은 예를 들면, 문헌에 의한 알고리즘 BLAST[참조: Karlin 및 Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]나 Pearson에 의한 FASTA(참조: Methods Enzymol., 183, 63, 1990)을 사용하여 결정할 수 있다. 이러한 알고리즘 BLAST에 기초하여, BLASTN이나 BLASTX라고 불리는 프로그램이 개발되어 있다(참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

본 출원에서 용어 "서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 단백질이 불활성화된"은 상기 단백질의 발현이 모균주 또는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 단백질이 비변형된 균주에 비하여 전혀 발현이 되지 않거나 또는 발현이 되더라도 그 활성이 없거나 감소된 것을 의미한다. 이때, 상기 감소는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 변이, 결손 등으로 단백질의 활성이 본래 미생물이 가지고 있는 단백질의 활성에 비해 감소한 경우와, 이를 암호화하는 유전자의 발현 저해 또는 번역(translation) 저해 등으로 세포 내에서 전체적인 단백질의 활성 정도가 천연형 균주 또는 변형전의 균주에 비하여 낮은 경우, 이들의 조합 역시 포함하는 개념이다.

본 출원에 있어서, 상기 불활성화는 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용으로 달성될 수 있다. 상기 방법의 예로, 1) 상기 단백질을 암호화하는 상기 유전자의 전체 또는 일부를 결실시키는 방법; 2) 상기 단백질을 암호화하는 상기 유전자의 발현이 감소하도록 발현 조절 서열의 변형, 3) 상기 단백질의 활성이 제거 또는 약화되도록 단백질을 암호화하는 상기 유전자 서열의 변형, 4) 상기 단백질을 암호화하는 상기 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)의 도입; 5) 상기 단백질을 암호화하는 상기 유전자의 사인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열 앞단에 사인-달가르노 서열과 상보적인 서열을 부가하여 2차 구조물을 형성시켜 리보솜(ribosome)의 부착을 불가능하게 만드는 방법; 6) 상기 단백질을 암호화하는 상기 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 반대 방향으로 전사되는 프로모터를 부가하는 방법(Reverse transcription engineering, RTE) 등이 있으며, 이들의 조합으로도 달성할 수 있으나, 이에, 특별히 제한되는 것은 아니다.

구체적으로, 상기 단백질을 암호화하는 상기 유전자의 일부 또는 전체를 결실하는 방법은, 미생물 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내 내재적 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 일부 뉴클레오티드 서열이 결실된 폴리뉴클레오티드 또는 마커 유전자로 교체함으로써 수행될 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체를 결실하는 방법의 일례로 상동 재조합에 의하여 폴리뉴클레오티드를 결실시키는 방법을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 또 다른 예로, 상기 유전자의 일부 또는 전체를 결손시키는 방법은 자외선과 같은 빛 또는 화학물질을 이용하여 돌연변이를 유발하고, 얻어진 돌연변이체로부터 목적 유전자가 결손된 균주를 선별하여 수행될 수 있다.

상기 유전자 결손 방법에는 유전자 재조합 기술(Genetic recombination technique)에 의한 방법이 포함된다. 예를 들면, 목적 유전자와 상동성이 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 벡터를 상기 미생물에 주입하여 상동 재조합(homologous recombination)이 일어나게 함으로써 이루어질 수 있다. 또한, 상기 주입되는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 벡터에는 우성 선별 마커를 포함할 수 있다. 그러나 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 발현 조절 서열을 변형하는 방법은 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용으로 달성될 수 있다. 상기 방법의 예로, 상기 발현 조절 서열의 활성을 더욱 약화하도록 폴리뉴클레오티드 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함으로써 수행할 수 있다. 상기 발현 조절서열에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 암호화하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 유전자 서열을 변형하는 방법은 상기 효소의 활성을 더욱 약화하도록 유전자 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 유전자 서열 또는 활성이 없도록 개량된 유전자 서열로 교체함으로써 수행할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 출원에서 용어 "L-아미노산을 생산하는 미생물"은 자연적으로 L-아미노산 생산능을 가지고 있는 미생물 또는 L-아미노산의 생산능이 없는 모균주에 L-아미노산의 생산능이 부여된 미생물을 의미한다. 예를 들어, 상기 L-아미노산을 생산하는 미생물은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 단백질의 활성이 불활성화된 미생물일 수 있다. 또는 이에 추가로 L-아미노산 생합성경로의 효소를 암호화하는 유전자의 발현을 증진시키거나 분해경로의 효소를 불활성화시킨 미생물일 수 있다. 또는 L-아미노산 생합성경로의 효소를 암호화하는 유전자의 발현을 증진시키거나 분해경로의 효소를 불활성화시킨 모균주에 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 단백질이 불활성화된 미생물일 수 있다. 상기의 L-아미노산을 생산하는 미생물은 이는 공지의 다양한 방법을 적용하여 제조될 수 있다.

본 출원에서 "코리네박테리움 속 미생물"은 모든 코리네박테리움 속 미생물을 포함할 수 있다. 구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 크루디락티스(Corynebacterium crudilactis), 코리네박테리움 데세르티(Corynebacterium deserti), 코리네박테리움 이피시엔스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 칼루내(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 스테셔니스(Corynebacterium stationis), 코리네박테리움 싱굴라레(Corynebacterium singulare), 코리네박테리움 할로톨레란스(Corynebacterium halotolerans), 코리네박테리움 스트리아툼(Corynebacterium striatum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 폴루티솔리(Corynebacterium pollutisoli), 코리네박테리움 이미탄스Cxorynebacterium imitans), 코리네박테리움 테스투디노리스(Corynebacterium testudinoris) 또는 코리네박테리움 플라베스센스(Corynebacterium flavescens)일 수 있고, 더욱 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있다.

한편, 코리네박테리움 속 미생물이 L-아미노산을 생산할 수 있음은 이미 알려져 있었으나, 이의 생산능이 현저히 낮으며 생산 기작에 작용하는 유전자나 기작 원리가 모두 밝혀지지는 않은 상태이다. 따라서, 본 출원의 'L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물'은 천연의 야생형 미생물 자체, L-아미노산 생산 기작과 관련된 유전자의 활성을 강화시키거나 불활성시켜 향상된 L-아미노산 생산능을 가지게 된 코리네박테리움 속 미생물, 또는 외부 유전자의 활성을 도입 또는 강화시켜 향상된 L-아미노산 생산능을 가지게 된 코리네박테리움 속 미생물을 의미한다.

본 출원은 다른 하나의 양태로서, 본 출원에 따른 상기 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 미생물 또는 배지로부터 L-아미노산을 회수하는 단계를 포함하는, L-아미노산 생산방법을 제공한다.

본 출원에 따른 상기 미생물은 앞서 설명한 바와 같다.

본 출원의 방법에 있어서, 코리네박테리움 속 미생물의 배양은 당업계에 알려진 임의의 배양 조건 및 배양 방법이 사용될 수 있다.

본 출원에서 용어 "배양"은 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원에서 L-아미노산을 생산하는 미생물을 이용하여 L-아미노산을 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로, 상기 배양은 배치 공정, 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 코리네박테리움 균주에 대한 배양 배지는 공지되어 있다(예를 들면, Manual of Methods for General Bacteriology by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., USA, 1981).

배지 중에서 사용될 수 있는 당원으로는 포도당, 사카로즈, 유당, 과당, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함된다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨을 함유하는 염이 포함될 수 있다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유할 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

상기 미생물의 배양 중 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입할 수 있다. 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃, 구체적으로는 25℃ 내지 40℃일 수 있다. 배양 시간은 원하는 L-아미노산의 생성량이 얻어질 때까지 계속할 수 있으나, 구체적으로는, 10 내지 160시간일 수 있다.

배양물로부터의 L-아미노산의 분리는 당업계에 알려진 통상적인 방법에 의하여 분리될 수 있다. 이러한 분리방법에는, 원심분리, 여과, 크로마토그래피 및 결정화 등의 방법이 이용될 수 있다. 예를 들면, 배양물을 저속 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 얻어진 상등액을, 이온교환 크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 회수 단계는 정제 공정을 추가로 포함할 수 있다.

본 출원의 L-아미노산을 생산하는 미생물은 L-아미노산을 높은 효율로 생산할 수 있다. 또한, 제조된 L-아미노산은 동물 사료 또는 동물 사료 첨가제뿐만 아니라 인간의 식품 또는 식품 첨가제, 의약품 등 다양한 제품에 응용될 수 있다.

이하 본 출원을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 출원의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 트랜스포존을 이용한 무작위적 돌연변이 라이브러리 제작

라이신 생산능이 증가된 균주를 얻기 위하여, 하기의 방법으로 벡터 라이브러리를 제작하였다.

먼저 EZ-Tn5™ <R6Kγori/KAN-2>Tnp Transposome™ 키트(Epicentre)를 사용하여 얻은 플라스미드를 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P(대한민국 등록특허번호 제10-0159812호; 상기 미생물은 KFCC10881로 공개되었다가, 부다페스트 조약하인 국제기탁기관에 재기탁되어 KCCM11016P로 기탁번호를 부여 받음)를 모균주로 하여 전기펄스법(Appl. Microbiol. Biothcenol. 52:541-545, 1999)으로 형질전환하고, 카나마이신(25 ㎎/ℓ)이 포함된 복합평판배지에 도말하여 약 20,000 개의 콜로니를 확보하였다.

<복합평판배지 (pH 7.0)>

포도당 10 g, 펩톤 10 g, 쇠고기 추출물 5 g, 효모 추출물 5 g, 뇌심장 침출액(Brain Heart Infusion) 18.5 g, NaCl 2.5 g, 요소 2 g, 소르비톨 91 g, 한천 20 g (증류수 1 리터 기준)

실시예 2: 트랜스포존을 이용한 무작위적 돌연변이 라이브러리 스크리닝

상기 실시예 1에서 확보된 약 20,000개의 콜로니를 각각 300 ㎕의 하기의 선별배지에 접종하여 96 딥 웰 플레이트(96-deep well plate) 에서 32℃, 1000 rpm 으로 약 24시간 동안 배양하였다.

<선별배지 (pH 8.0)>

포도당 10 g, 5.5 g 암모늄 설페이트(ammonium sulfate), MgSO₄·7H₂O 1.2 g, KH₂PO₄ 0.8 g, K₂HPO₄ 16.4 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1 ㎎, 칼슘-판토텐산 2 ㎎, 니코틴아미드 2 ㎎ (증류수 1 리터 기준)

배양액에 생산된 L-라이신의 생산량을 분석하기 위하여 닌하이드린 방법을 이용하였다(Moore, S., Stein, W.H., Photometric ninhydrin method for use in the chromatography of amino acids. J. Biol. Chem.1948, 176, 367-388).

배양이 완료된 후 배양 상층액 10 ㎕와 닌하이드린 반응용액 190 ㎕를 65℃에서 30분간 반응시킨 후, 파장 570nm에서 분광 광도계(spectrophotometer)로 흡광도를 측정하고, 대조군인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P 균주와 비교하여 높은 흡광도를 보이는 약 60여 종의 콜로니를 선별하였다. 그 외 콜로니들은 대조군로 이용된 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P 균주와 유사하거나 감소한 흡광도를 보임을 확인하였다.

상기 선별된 60여 종의 균주들을 상기와 동일한 방법으로 다시 배양한 후 닌하이드린 반응을 반복 수행하여, 결과적으로 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P 균주 대비 L-라이신 생산능이 향상된 상위 10종의 돌연변이주를 선별하였다.

실시예 3: 선별된 무작위적 돌연변이주들의 L-라이신 생산능 분석

상기 실시예 2에서 선발한 10종의 돌연변이주들을 대상으로 L-라이신 생산능이 재현성 있게 증가된 균주들을 최종 선별하기 위하여, 다음과 같은 방법으로 배양을 실시하였다. 종 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 접종하고, 30℃에서 20시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그런 다음, 생산 배지 24 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 1 ml의 종 배양액을 접종하고 32℃에서 72 시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 상기 종 배지와 생산 배지의 조성은 각각 하기와 같다. 배양이 완료된 후 HPLC(Waters 社, 2478)를 이용하여 배양액 내 L-라이신 농도를 분석하였고, 각 돌연변이주들의 L-라이신 생산 농도를 하기 표 1에 나타내었다.

<종배지 (pH 7.0)>

포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH₂PO₄ 4 g, K₂HPO₄ 8 g, MgSO₄·7H₂O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1 ㎎, 칼슘-판토텐산 2 ㎎, 니코틴아미드 2 ㎎ (증류수 1 리터 기준)

<생산배지 (pH 7.0)>

포도당 100 g, (NH₄)₂SO₄ 40 g, 대두 단백질 2.5 g, 옥수수 침지 고형분(Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, KH₂PO₄ 1 g, MgSO₄·7H₂O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1 ㎎, 칼슘-판토텐산 2 ㎎, 니코틴아미드 3 ㎎, CaCO₃ 30 g (증류수 1리터 기준)

선별된 무작위적 돌연변이주 10종의 L-라이신 생산 농도

	균주	L-라이신 (g/L)
		배치 1	배치 2	배치 3	평균
대조군	KCCM11016P	41.1	40.9	41.5	41.2
1	KCCM11016P/mt-1	40.2	39.9	40.5	40.2
2	KCCM11016P/mt-2	41.8	41.5	41.7	41.7
3	KCCM11016P/mt-3	47.1	46.8	47	47.0
4	KCCM11016P/mt-4	42.3	42.1	42.6	42.3
5	KCCM11016P/mt-5	42.7	42.7	42.9	42.8
6	KCCM11016P/mt-6	41.0	40.7	41.2	41.0
7	KCCM11016P/mt-7	41.7	41.2	41.8	41.6
8	KCCM11016P/mt-8	42.5	42.9	42.9	42.8
9	KCCM11016P/mt-9	43.3	43.5	43.8	43.5
10	KCCM11016P/mt-10	42.0	42.3	42.5	42.3

상기 선별된 10종의 돌연변이주들 중 L-라이신 생산능이 의미있게 향상된 균주로서 KCCM11016P/mt-3을 최종 선별하였다.

실시예 4: 최종 선별주들에서의 L-라이신 생산능 증가 원인 규명

본 실시예에서는 상기 실시예 3으로부터 최종 선별된 돌연변이주를 대상으로 트랜스포존의 무작위적인 삽입에 의해 결손된 유전자를 동정하고자 하였다.

L-라이신의 생산능이 가장 우수한 KCCM11016P/mt-3의 게놈 DNA를 추출하여 절단한 후 연결하여 대장균 DH5α에 형질전환하고, 카나마이신(25 ㎎/ℓ)이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. 형질전환된 콜로니 20종을 선별한 후, 미지의 유전자 일부가 포함된 플라스미드를 획득하였고, EZ-Tn5™<R6Kγori/KAN-2>Tnp Transposome™ 키트의 프라이머 1(서열번호 3) 및 프라이머 2(서열번호 4)를 사용하여 염기서열을 분석하였다.

그 결과, 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열이 결손되어 있음을 확인하였다. 상기 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하고, 미국 국립보건원의 유전자은행(NIH Genbank)에 보고된 염기서열에 근거하여 기능이 명확하게 규명되지 않은 조절 단백질(Regulatory protein)임을 확인하였다.

프라이머 1(서열번호 3): ACCTACAACAAAGCTCTCATCAACC

프라이머 2(서열번호 4): CTACCCTGTGGAACACCTACATCT

이에 따라, 상기 단백질이 불활성화되는 경우, L-라이신 생산능에 영향이 있는지 확인하기 위하여, 상기 유전자를 결손 후보 유전자로 선별하였다.

실시예 5: 유전자 결손을 위한 재조합 벡터 제작

본 실시예에서는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 단백질의 불활성화와 L-라이신 생산의 영향을 확인하기 위해서, 코리네박테리움속 L-라이신을 생산하는 미생물의 염색체 상에서 상기 실시예 4에서 선별한 유전자를 결손시키기 위한 재조합 플라스미드를 제작하였다. 이를 위하여, 하기 표 2에 나타낸 바와 같은 프라이머 3 내지 6을 합성하였다.

유전자의 결손을 위한 단편을 제작하기 위한 프라이머 3 내지 6

프라이머	염기 서열
프라이머 3 (서열번호 5)	GAATTCGCGCCCCACTGGCCCTTC
프라이머 4 (서열번호 6)	ACCCCGGCGGCGCTGCTCTGGAATCAC
프라이머 5 (서열번호 7)	GAGCAGCGCCGCCGGGGTTTAATTAAT
프라이머 6 (서열번호 8)	GCAGGTCGACCTGGTTACCGGTCTGAATC

구체적으로, NCgl0275 유전자 ORF 부위(서열번호 2)를 결손하기 위하여, 5' 말단에 EcoRI과 3' 말단에 SalI 제한효소 부위를 가지도록 프라이머 3(서열번호 5), 프라이머 4(서열번호 6), 프라이머 5(서열번호 7), 프라이머 6(서열번호 8)(표 2)를 합성하고 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 게노믹 DNA를 주형으로 하여 PCR(Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, 1989)을 수행하였다.

그 결과, 상기 유전자 상단 및 하단에 해당하는 DNA 단편들이 각각 500bp씩 증폭됨을 확인하였다. 이때, PCR 조건으로서 변성은 95℃에서 30초; 어닐링은 50℃에서 30초; 및 중합반응은 72℃에서 1분을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 시켜서 수행하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 복제가 불가능한 pDZ 벡터(대한민국 특허 등록번호 제10-0924065호)와 PCR로 증폭된 상기 단편을 염색체 도입용 제한효소 EcoRI과 SalI으로 처리한 뒤, DNA 접합 효소를 이용하여 연결한 후, 대장균 DH5α에 형질전환하고 카나마이신(25 ㎎/ℓ)이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다.

PCR을 통해 상기 목적한 유전자가 삽입된 플라스미드로 형질전환된 콜로니를 선별한 후, 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고, 이 플라스미드를 pDZ-△NCgl0275라 명명하였다.

실시예 6: 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P에서 NCgl0275 유전자가 결손된 균주의 제작 및 이의 L-라이신 생산능 평가

대표적인 L-라이신 생산 코리네박테리움 속 균주인 KCCM11016P 균주를 기반으로 상기에서 선별한 NCgl0275 유전자가 결손된 균주를 제작하였고, 이의 L-라이신 생산능을 평가하고자 하였다.

구체적으로, 상기 실시예 5에서 제작된 재조합 플라스미드 pDZ-△NCgl0275를 염색체 상에서의 상동 재조합에 의해 L-라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P에 형질전환시켰다(van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999).

그 후, 4%의 수크로오스를 포함하는 고체평판배지에서 2차 재조합을 수행하였다. 2차 재조합이 완료된 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 형질전환주를 대상으로 프라이머 3과 프라이머 6을 이용하여 PCR을 통하여 염색체상에서 서열번호 2의 유전자가 결손된 균주를 확인하였다. 상기 재조합 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P-NCgl0275라 명명하였다.

상기 제작된 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P-NCgl0275 균주의 L-라이신 생산능을 분석하기 위해 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P 균주와 함께 아래와 같은 방법으로 배양하였다.

하기의 종배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P와 실시예 6에서 제작된 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P-NCgl0275를 접종하고, 30℃에서 20시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그런 다음, 생산 배지 24 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 1 ㎖의 종배양액을 접종하고 30℃에서 72시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 상기 종 배지와 생산 배지의 조성은 각각 하기와 같다.

<종배지 (pH 7.0)>

포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH₂PO₄ 4 g, K₂HPO₄ 8 g, MgSO₄·7H₂O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1 ㎎, 칼슘-판토텐산 2 ㎎, 니코틴아미드 2 ㎎ (증류수 1 리터 기준)

<생산배지 (pH 7.0)>

포도당 100 g, (NH₄)₂SO₄ 40 g, 대두 단백질 2.5 g, 옥수수 침지 고형분(Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, KH₂PO₄ 1 g, MgSO₄·7H₂O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1 ㎎, 칼슘-판토텐산 2 ㎎, 니코틴아미드 3 ㎎, CaCO₃ 30 g (증류수 1리터 기준)

배양 종료 후 HPLC를 이용하여 L-라이신의 생산량을 측정하였고, 분석한 L-라이신의 농도를 하기 표 3에 나타내었다.

KCCM11016P 및 KCCM11016P-NCgl0275의 L-라이신 생산능 분석

	균주	L-라이신 (g/L)
		배치 1	배치 2	배치 3	평균
대조군	KCCM1106P	40.3	40.0	40.4	40.2
실험군	KCCM1106P-NCgl0275	46.8	47.3	47.1	47.1

상기 결과와 같이, L-라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P으로부터 NCgl0275를 결손시키는 경우, 모균주 대비 L-라이신 생산능이 평균 17.2% 증가함을 확인하였다.

따라서, 코리네박테리움 속 미생물에서 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 단백질을 불활성화함으로써 L-라이신 생산능이 향상됨을 확인하였다.

또한, 상기 균주 KCCM11016P-NCgl0275를 CA01-7512로 명명하고 2017년 11월 7일자로 부다페스트 조약 하의 기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 국제 기탁하여 KCCM12153P로 기탁번호를 부여받았다.

실시예 7: 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11347P에서 NCgl0275 유전자가 결손된 균주의 제작 및 L-라이신 생산능 평가

L-라이신을 생산하는 다른 코리네박테리움 글루타미쿰에 속하는 균주들에서도 상기와 동일한 효과가 있는지 확인하기 위하여, 상기 실시예 6과 같은 방법으로 L-라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11347P(한국 등록특허 제10-0073610호. 상기 미생물은 KFCC10750으로 공개되었다가 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관에 재기탁되어, KCCM11347P를 부여받았음)를 대상으로 NCgl0275 유전자가 결손된 균주를 제작하고 KCCM11347P-NCgl0275로 명명하였다.

이후, 상기 실시예 6과 동일한 방법으로 배양하고, 배양 종료 후 HPLC를 이용하여 L-라이신의 생산량을 측정하였고, 분석한 L-라이신의 농도를 하기 표 4에 나타내었다.

KCCM11347P 및 KCCM11347P-NCgl0275의 L-라이신 생산능 분석

	균주	L-라이신 (g/L)
		배치 1	배치 2	배치 3	평균
대조군	KCCM11347P	38.8	39.1	38.7	38.9
실험군	KCCM11347P-NCgl0275	44.1	44.4	44.2	44.2

상기 결과와 같이, L-라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11347P를 기반으로 NCgl0275 유전자를 결손시키는 경우, L-라이신 생산능이 평균 13.6% 증가함을 확인하였다.

따라서, 실시예 6의 결과와 마찬가지로, 코리네박테리움 속 미생물에서 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 단백질을 불활성화함으로써 비변형 미생물에 비해 L-라이신 생산능이 향상됨을 확인하였다.

실시예 8: 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10770P에서 NCgl0275 유전자가 결손된 균주의 제작 및 L-라이신 생산능 평가

L-라이신을 생산하는 다른 코리네박테리움 글루타미쿰에 속하는 균주들에서도 상기와 동일한 효과가 있는지를 확인하기 위하여, 상기 실시예 6과 같은 방법으로 L-라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10770P(한국등록특허 제 10-0924065호)를 대상으로 NCgl0275 유전자가 결손된 균주를 제작하고 KCCM10770P-NCgl0275로 명명하였다.

이후, 상기 실시예 6과 동일한 방법으로 배양하고, 배양 종료 후 HPLC를 이용하여 L-라이신의 생산량을 측정하였고, 분석한 L-라이신의 농도를 하기 표 5에 나타내었다.

KCCM10770P 및 KCCM10770P-NCgl0275의 L-라이신 생산능 분석

	균주	L-라이신 (g/L)
		배치 1	배치 2	배치 3	평균
대조군	KCCM10770P	45.1	44.9	45.5	45.2
실험군	KCCM10770P-NCgl0275	51.5	52.0	51.9	51.8

상기 결과와 같이, L-라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10770P를 기반으로 NCgl0275 유전자를 결손시키는 경우, L-라이신 생산능이 평균 14.6% 증가함을 확인하였다.

따라서, 실시예 7의 결과와 마찬가지로, L-라이신 생산능을 갖는 다양한 코리네박테리움 속 미생물에서 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 단백질을 불활성화함으로써 이의 모균주에 비해 L-라이신 생산능을 향상시킬 수 있음을 확인하였다.

실시예 9: 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ3P에서 NCgl0275 유전자가 결손된 균주의 제작 및 L-라이신 생산능 평가

L-라이신을 생산하는 다른 코리네박테리움 글루타미쿰에 속하는 균주들에서도 상기와 동일한 효과가 있는지를 확인하기 위하여, 상기 실시예 6과 같은 방법으로 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ3P(Binder et al. Genome Biology 2012, 13:R40)를 대상으로 NCgl0275 유전자가 결손된 균주를 제작하고 CJ3P-NCgl0275로 명명하였다.

이후, 상기 실시예 6과 동일한 방법으로 배양하고, 배양 종료 후 HPLC를 이용하여 L-라이신의 생산량을 측정하였고, 분석한 L-라이신의 농도를 하기 표 6에 나타내었다.

CJ3P 및 CJ3P-Ncgl0275의 L-라이신 생산능 분석

	균주	L-라이신 (g/L)
		배치 1	배치 2	배치 3	평균
대조군	CJ3P	7.6	7.4	7.9	7.6
실험군	CJ3P-NCgl0275	8.7	8.9	8.7	8.8

상기 결과와 같이, L-라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ3P를 대상으로 NCgl0275 유전자를 결손시키는 경우, L-라이신 생산능이 평균 15.8% 증가함을 확인하였다.

따라서, 실시예 6 내지 실시예 8의 결과와 마찬가지로, L-라이신 생산능을 갖는 다양한 코리네박테리움 속 미생물에서 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 단백질을 불활성화함으로써 L-라이신 생산능을 향상시킬 수 있음을 확인하였다.

실시예 10: 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P에서 NCgl0275 유전자가 결손된 균주의 제작 및 L-발린 생산능 평가

상기의 L-라이신 외에, L-발린 생산능을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰에서도 NCgl0275 유전자 결손을 통해 발린 생산능이 향상되는지에 대해 평가하고자 하였다.

상기 실시예 5에서 제작한 재조합 플라스미드 pDZ-△NCgl0275를 염색체 상에서의 상동 재조합에 의해 L-발린 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P(대한민국 등록특허 제10-1117022호)에 형질전환시켰다(van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). 그 후, 4%의 수크로오스를 포함하는 고체평판배지에서 2차 재조합을 수행하였다. 2차 재조합이 완료된 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 형질 전환주를 대상으로 프라이머 3과 프라이머 6을 이용한 PCR을 통하여 염색체상에서 NCgl0275 유전자가 결손된 균주를 제조하였다. 상기 재조합 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P-NCgl0275라 명명하였다.

상기에서 제작된 균주의 L-발린 생산능을 비교하고자 아래와 같은 방법으로 배양하여 배양액 성분을 분석하였다. 생산 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 접종하고, 30℃에서 72시간 동안, 200rpm에서 진탕 배양하였다. 이후, HPLC를 이용하여 L-발린의 농도를 분석하였고, 분석한 L-발린의 농도를 하기 표 7에 나타내었다.

<생산배지 (pH 7.0)>

포도당 100 g, 황산암모늄 40 g, 대두단백질 2.5 g, 옥수수침지고형분(Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, 제2인산칼륨 1 g, 황산마그네슘7수염 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민-HCl 1 ㎎, 판토텐산칼슘 2 ㎎, 니코틴아마이드 3 ㎎, 탄산칼슘 30 g (증류수 1리터 기준)

KCCM11201P 및 KCCM11201P-NCgl0275의 L-발린 생산능

	균주	L-발린 (g/L)
		배치 1	배치 2	배치 3	평균
대조군	KCCM11201P	2.8	2.7	2.9	2.8
실험군	KCCM11201P-NCgl0275	3.3	3.8	3.4	3.5

상기 결과와 같이, KCCM11201P-NCgl0275 균주의 L-발린 생산능은 대조군 대비 25.0% 증가함을 확인하였다. 즉, 코리네박테리움 속 미생물에서 서열 NCgl0275 유전자를 결손시킴으로써 L-발린의 생산능을 향상시킬 수 있음을 확인하였다.

또한, 코리네박테리움 속 미생물에서 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 단백질을 불활성화함으로써 다양한 L-아미노산 생산능을 향상시킬 수 있음을 확인하였다.

실시예 11: 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ7V를 이용한 NCgl0275 유전자가 결손된 균주의 제작 및 L-발린 생산능 평가

L-발린을 생산하는 다른 코리네박테리움 글루타미쿰에 속하는 균주들에서도 상기와 동일한 효과가 있는지를 확인하기 위하여, 야생주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067에 1종의 변이[ilvN(A42V); Biotechnology and Bioprocess Engineering, June 2014, Volume 19, Issue 3, pp 456-467]를 도입하여 L-발린 생산능이 향상된 균주를 제작하였다.

구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 야생형인 ATCC14067 균주의 게노믹 DNA를 G-spin Total DNA 추출 미니 키트(Intron사, Cat. No 17045)를 이용하여 키트에 제공된 프로토콜에 따라 추출하였다. 상기 게노믹 DNA를 주형으로 PCR을 실시하였다. ilvN 유전자에 A42V 변이를 도입하는 벡터를 제작하기 위해서, 프라이머 7(서열번호 9)과 프라이머 8(서열번호 10)의 프라이머 쌍 및 프라이머 9(서열번호 11)과 프라이머 10(서열번호 12)의 프라이머 쌍을 이용하여 유전자 단편(A, B)을 각각 얻었다. PCR의 조건은 94℃에서 5분간 변성한 후; 94℃에서 30초 변성, 55℃에서 30초 어닐링, 및 72℃ 60초 중합을 25회 반복한 후; 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다.

그 결과, 단편 A, B 모두 537bp의 폴리뉴클레오티드를 획득할 수 있었다. 상기 두 단편을 주형으로 프라이머 7(서열번호 9)과 프라이머 10(서열번호 12)을 이용하여 Overlapping PCR을 실시하여 1044bp의 PCR 결과물 (이하, "변이 도입 단편"이라 명명함)을 얻었다.

상기 얻어진 변이 도입 단편을 제한효소 XbaI(New England Biolabs, Beverly, MA)로 처리한 후, 동일한 제한효소로 처리된 pDZ벡터와 T4 리가아제(New England Biolabs, Beverly, MA)를 이용하여 라이게이션하였다. 상기 제작한 유전자를 대장균 DH5α에 형질전환시킨 후, 이를 카나마이신 함유 LB배지에서 선별하고, DNA-spin 플라스미드 DNA 정제 키트(iNtRON 사)로 DNA를 획득하였다. 상기 ilvN 유전자의 A42V 변이 도입을 목적으로 하는 벡터를 pDZ-ilvN(A42V)라 명명하였다.

ilvN 유전자의 A42V 변이 도입 목적의 단편을 제작하기 위한 프라이머 7 내지 10

프라이머	염기 서열
프라이머 7 (서열번호 9)	aatttctagaggcagaccctattctatgaagg
프라이머 8 (서열번호 10)	agtgtttcggtctttacagacacgagggac
프라이머 9 (서열번호 11)	gtccctcgtgtctgtaaagaccgaaacact
프라이머 10(서열번호 12)	aatttctagacgtgggagtgtcactcgcttgg

이후, 상기에서 제작된 재조합 플라스미드 pDZ-ilvN(A42V)를 염색체 상에서의 상동 재조합에 의해 야생형인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067에 형질전환시켰다(van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). 그 후, 4%의 수크로오스를 포함하는 고체평판배지에서 2차 재조합을 수행하였다. 2차 재조합이 완료된 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 형질 전환주를 대상으로 프라이머 7과 프라이머 10을 이용한 PCR을 통하여 유전자 단편을 증폭한 뒤, 유전자 서열 분석을 통하여 변이 도입 균주를 확인하였다. 상기 재조합 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ7V라 명명하였다.

마지막으로, L-발린 생산능을 갖게된 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ7V를 대상으로 상기 실시예 9와 같은 방법으로 NCgl0275 유전자가 결손된 균주를 제작하고 CJ7V-NCgl0275로 명명하였다. 제작된 균주의 L-발린 생산능을 비교하고자 상기 실시예 9과 동일한 방법으로 배양하여 L-발린의 농도를 분석하였고, 분석한 L-발린의 농도를 하기 표 9에 나타내었다.

CJ7V 및 CJ7V-NCgl0275의 L-발린 생산능

	균주	L-발린 (g/L)
		배치 1	배치 2	배치 3	평균
대조군	CJ7V	3.2	3.7	3.3	3.4
실험군	CJ7V-NCgl0275	3.9	4.2	3.9	4.0

상기 결과와 같이, CJ7V-NCgl0275 균주의 L-발린 생성능은 대조군 대비 17.6% 증가함을 확인하였다. 즉, L-발린 생산능을 갖는 다양한 코리네박테리움 속 미생물에서 NCgl0275 유전자를 결손시킴으로써 L-발린의 생산능을 향상시킬 수 있음을 확인하였다.

따라서, 실시예 6 내지 10과 마찬가지로, 코리네박테리움 속 미생물에서 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 단백질을 불활성화함으로써 다양한 L-아미노산 생산능을 향상시킬 수 있음을 확인하였다.

실시예 12: 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ8V를 이용한 NCgl0275 유전자가 결손된 균주의 제작 및 L-발린 생산능 평가

L-발린을 생산하는 다른 코리네박테리움 글루타미쿰에 속하는 균주들에서도 상기와 동일한 효과가 있는지를 확인하기 위하여, 상기 실시예 10와 같은 방법으로 야생주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869에 1종의 변이[ilvN(A42V)]를 도입하여 L-발린 생산능을 갖게된 변이주를 제작하고, 상기 재조합 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ8V라 명명하였다.

L-발린 생산능을 갖게된 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ8V를 대상으로 상기 실시예 9와 같은 방법으로 NCgl0275 유전자가 결손된 균주를 제작하였고, 이를 CJ7V-NCgl0275로 명명하였다.

제작한 상기 균주의 L-발린 생산능을 비교하고자 상기 실시예 9과 동일한 방법으로 배양하여 L-발린의 농도를 분석하였고, 분석한 L-발린의 농도를 하기 표 10에 나타내었다.

CJ8V 유래 CJ8V-NCgl0275의 L-발린 생산능

	균주	L-발린 (g/L)
		배치 1	배치 2	배치 3	평균
대조군	CJ8V	2.5	2.8	2.8	2.7
실험군	CJ8V-NCgl0275	3.2	3.6	3.4	3.4

상기 결과와 같이, CJ8V-NCgl0275 균주의 L-발린 생성능은 대조군 대비 25.9% 증가함을 확인하였다. 즉, 상기 실시예 10 내지 11의 결과와 마찬가지로, L-발린 생산능을 갖는 다양한 코리네박테리움 속 미생물에서 NCgl0275 유전자를 결손시킴으로써 L-발린의 생산능을 향상시킬 수 있음을 확인하였다.

따라서, 실시예 6 내지 11과 마찬가지로, 코리네박테리움 속 미생물에서 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 단백질을 불활성화함으로써 다양한 L-아미노산 생산능을 향상시킬 수 있음을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본원이 속하는 기술분야의 당업자는 본원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

한국미생물보존센터(국외) KCCM12153P 20171107

<110> CJ CheilJedang Corporation <120> A microorganism of corynebacterium genus having L-amino acid productivity and method for producing L-amino acid using the same <130> KPA171172-KR <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 116 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 1 Met Thr Ser Val Ile Pro Glu Gln Arg Asn Asn Pro Phe Tyr Arg Asp 1 5 10 15 Ser Ala Thr Ile Ala Ser Ser Asp His Thr Glu Arg Gly Glu Trp Val 20 25 30 Thr Gln Ala Lys Cys Arg Asn Gly Asp Pro Asp Ala Leu Phe Val Arg 35 40 45 Gly Ala Ala Gln Arg Arg Ala Ala Ala Ile Cys Arg His Cys Pro Val 50 55 60 Ala Met Gln Cys Cys Ala Asp Ala Leu Asp Asn Lys Val Glu Phe Gly 65 70 75 80 Val Trp Gly Gly Leu Thr Glu Arg Gln Arg Arg Ala Leu Leu Arg Lys 85 90 95 Lys Pro His Ile Thr Asn Trp Ala Glu Tyr Leu Ala Gln Gly Gly Glu 100 105 110 Ile Ala Gly Val 115 <210> 2 <211> 351 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 2 atgacgtctg tgattccaga gcagcgcaac aacccctttt atagggacag cgccacaatt 60 gcttcctcgg accacacaga gcgtggtgag tgggtcactc aggcaaagtg tcgaaatggc 120 gacccagatg cattgtttgt tcgtggtgca gcgcaacgcc gagcagcagc aatttgccgc 180 cactgccctg tagccatgca gtgctgcgcc gatgccttag ataacaaggt ggaattcgga 240 gtctggggag gcctgaccga gcgccagcgc cgtgcattgc ttcgaaagaa gccgcacatt 300 actaactggg ctgaatattt ggctcagggg ggcgagatcg ccggggttta a 351 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 1 <400> 3 acctacaaca aagctctcat caacc 25 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 2 <400> 4 ctaccctgtg gaacacctac atct 24 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 3 <400> 5 gaattcgcgc cccactggcc cttc 24 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 4 <400> 6 accccggcgg cgctgctctg gaatcac 27 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 5 <400> 7 gagcagcgcc gccggggttt aattaat 27 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 6 <400> 8 gcaggtcgac ctggttaccg gtctgaatc 29 <210> 9 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 7 <400> 9 aatttctaga ggcagaccct attctatgaa gg 32 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 8 <400> 10 agtgtttcgg tctttacaga cacgagggac 30 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 9 <400> 11 gtccctcgtg tctgtaaaga ccgaaacact 30 <210> 12 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 10 <400> 12 aatttctaga cgtgggagtg tcactcgctt gg 32

Claims (5)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 단백질이 불활성화된, L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움속 미생물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 L-아미노산은 L-라이신(L-lysine) 또는 L-발린(L-valine)인, 코리네박테리움속 미생물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 코리네박테리움속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인, 코리네박테리움속 미생물.
   
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및
   상기 미생물 또는 배지로부터 L-아미노산을 회수하는 단계를 포함하는, L-아미노산의 생산방법.
   
5. 제4항에 있어서, 상기 L-아미노산은 L-라이신(L-lysine) 또는 L-발린(L-valine)인, L-아미노산의 생산방법.