DE10032350A1

DE10032350A1 - Neue für das mdhA-Gen kodierende Nukleotidsequenzen

Info

Publication number: DE10032350A1
Application number: DE10032350A
Authority: DE
Inventors: Andre Drysch; Douwe Molenaar; Michel Eduard Van Der Rest
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2000-07-04
Filing date: 2000-07-04
Publication date: 2002-01-24
Also published as: US7067288B2; WO2002002778A8; ATE312929T1; WO2002002778A1; US20020037568A1; DE60115900T2; AU2001279674A1; EP1297148A1; ES2254459T3; US6995002B2; CN1440458A; KR20030013521A; EP1297148B1; DE60115900D1; US20040142454A1; KR100904744B1

Abstract

Die Erfindung betrifft für das mdhA-Gen kodierende Polynukleotide aus coryneformen Bakterien, die Polynukleotidsequenzen enthalten, ausgewählt aus der Gruppe DOLLAR A a) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 3 enthält, DOLLAR A b) Polynukleotid, das für ein Polypeptid codiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 3, DOLLAR A c) Polynukleotid, das komplementär ist zu den Polynukleotiden von a), b) oder c), und DOLLAR A d) Polynukleotid, enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide der Polynukleotidsequenzen von a), b) oder c); DOLLAR A und ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von coryneformen Bakterien, in denen zumindest das mdhA-Gen abgeschwächt vorliegt, und die Verwendung der Polynukleotidsequenzen als Hybridisierungssonden.

Description

Gegenstand der Erfindung sind für das mdhA-Gen kodierende Nukleotidsequenzen aus coryneformen Bakterien und ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, durch Abschwächung des mdhA-Gens.

Stand der Technik

L-Aminosäuren, insbesondere Lysin, finden in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie, in der Lebensmittelindustrie und ganz besonders in der Tierernährung Anwendung.

Es ist bekannt, daß Aminosäuren durch Fermentation von Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum, hergestellt werden. Wegen der großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen, wie zum Beispiel Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien, wie zum Beispiel die Zuckerkonzentration während der Fermentation oder die Aufarbeitung zur Produktform durch zum Beispiel Ionenaustauschchromatographie oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.

Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man Stämme, die resistent gegen Antimetabolite oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und die Aminosäuren produzieren.

Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung von L- Aminosäure produzierenden Stämmen von Corynebacterium eingesetzt.

Aufgabe der Erfindung

Die Erfinder haben sich zur Aufgabe gestellt, neue Maßnahmen zur verbesserten, fermentativen Herstellung von Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, bereitzustellen.

Beschreibung der Erfindung

L-Aminosäuren, insbesondere Lysin, finden in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie, in der Lebensmittelindustrie und ganz besonders in der Tierernährung Anwendung. Es besteht daher ein allgemeines Interesse daran, neue, verbesserte Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, bereitzustellen.

Gegenstand der Erfindung ist ein isoliertes Polynukleotid aus coryneformen Bakterien, enthaltend eine für das mdhA- Gen kodierende Polynukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe:

a) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 3 enthält,
b) Polynukleotid, das für ein Polypeptid codiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 3,
c) Polynukleotid, das komplementär ist zu den Polynukleotiden von a) oder b), und
d) Polynukleotid, enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide der Polynukleotidsequenz von a), b) oder c),

wobei das Polypeptid bevorzugt die Aktivität der Malat- Dehydrogenase aufweist.

Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls ein isoliertes Polypeptid mit Malat-Dehydrogenase-Aktivität, das die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 1 enthält.

Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls das Polynukleotid gemäß Anspruch 1, wobei es sich bevorzugt um eine replizierbare DNA handelt, enthaltend:

a) die Nukleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID No. 2, oder
b) mindestens eine Sequenz, die der Sequenz (i) innerhalb des Bereichs der Degeneration des genetischen Codes entspricht, oder
c) mindestens eine Sequenz, die mit der zur Sequenz (i) oder (ii) komplementären Sequenz hybridisiert, und gegebenenfalls
d) funktionsneutrale Sinnmutationen in (i).

Weitere Gegenstände sind:
eine replizierbare DNA, enthaltend die Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID No. 2 dargestellt,
ein Vektor, enthaltend das Polynukleotid gemäß Anspruch 1, Punkt d, insbesondere pEMmdhAint, hinterlegt in E. coli DSM 13494 am 18.05.2000 bei der DSMZ, Braunschweig (Deutschland),
und coryneforme Bakterien, die in dem mdhA-Gen eine Deletion oder Insertion, insbesondere unter Verwendung des Vektors pEMmdhAint, enthalten.

Gegenstand der Erfindung sind ebenso Polynukleotide, die im wesentlichen aus einer Polynukleotidsequenz bestehen, die erhältlich sind durch Screening mittels Hybridisierung einer entsprechenden Genbank, die das vollständige mdhA-Gen mit der Polynukleotidsequenz, entsprechend SEQ ID No. 2, enthält, mit einer Sonde, die die Sequenz des genannten Polynukleotids gemäß SEQ ID No. 2 oder ein Fragment davon enthält und Isolierung der genannten DNA-Sequenz.

Polynukleotidsequenzen gemäß der Erfindung sind als Hybridisierungs-Sonden für RNA, cDNA und DNA geeignet, um Nukleinsäuren, beziehungsweise Polynukleotide oder Gene in voller Länge zu isolieren, die für Malat-Dehydrogenase kodieren oder um solche Nukleinsäuren bzw. Polynukleotide oder Gene zu isolieren, die eine hohe Ähnlichkeit der Sequenz mit der des Malat-Dehydrogenase-Gens aufweisen.

Polynukleotidsequenzen gemäß der Erfindung sind weiterhin als Primer geeignet, mit deren Hilfe mit der Polymerase Kettenreaktion (PCR) DNA von Genen hergestellt werden kann, die für Malat-Dehydrogenase kodieren.

Solche als Sonden oder Primer dienende Oligonukleotide enthalten mindestens 30, bevorzugt mindestens 20, ganz besonders bevorzugt mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide. Geeignet sind ebenfalls Oligonukleotide mit einer Länge von mindestens 40 oder 50 Nukleotiden.

"Isoliert" bedeutet aus seinem natürlichen Umfeld herausgetrennt.

"Polynukleotid" bezieht sich im allgemeinen auf Polyribonukleotide und Polydesoxyribonukleotide, wobei es sich um nicht modifizierte RNA oder DNA oder modifizierte RNA oder DNA handeln kann.

Unter "Polypeptiden" versteht man Peptide oder Proteine, die zwei oder mehr über Peptidbindungen verbundene Aminosäuren enthalten.

Die Polypeptide gemäß Erfindung schließen die Polypeptide gemäß SEQ ID No. 3, insbesondere solche mit der biologischen Aktivität der Malat-Dehydrogenase und auch solche ein, die zu wenigstens 70%, bevorzugt zu wenigstens 80% und besonders zu wenigstens 90% bis 95% identisch sind mit dem Polypeptid gemäß SEQ ID No. 3 und die genannte Aktivität aufweisen.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren, insbesondere Lysin, unter Verwendung von coryneformen Bakterien, die insbesondere bereits die Aminosäuren produzieren und in denen die für das mdhA-Gen kodierenden Nukleotidsequenzen abgeschwächt, insbesondere ausgeschaltet oder auf niedrigem Niveau exprimiert werden.

Der Begriff "Abschwächung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor verwendet oder ein Gen, beziehungsweise Allel, verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer niedrigen Aktivität kodiert, beziehungsweise das entsprechende Gen oder Enzym (Protein) inaktiviert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.

Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können Aminosäuren, insbesondere Lysin, aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es kann sich um Vertreter coryneformer Bakterien, insbesondere der Gattung Corynebacterium handeln. Bei der Gattung Corynebacterium ist insbesondere die Art Corynebacterium glutamicum zu nennen, die in der Fachwelt für ihre Fähigkeit bekannt ist, L-Aminosäuren zu produzieren.

Geeignete Stämme der Gattung Corynebacterium, insbesondere der Art Corynebacterium glutamicum, sind besonders die bekannten Wildtypstämme:

Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020

und daraus hergestellte L-Aminosäuren produzierende Mutanten, beziehungsweise Stämme, wie beispielsweise die L- Lysin produzierenden Stämme:

Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709
Brevibacterium flavum FERM-P 1708
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464
Corynebacterium glutamicum DM58-1
Corynebacterium glutamicum DG52-5
Corynebacterium glutamicum DSM5714 und
Corynebacterium glutamicum DSM12866.

Den Erfindern gelang es, das neue, für das Enzym Malat- Dehydrogenase (E.C. 1.1.1.37) kodierende mdhA-Gen von C. glutamicum zu isolieren.

Hierzu wird zunächst das Malat-Dehydrogenase-Enzymprotein durch chromatographische Methoden bis zur Homogenität gereinigt. Methoden und Anleitungen zur Proteinreinigung und Darstellung sind z. B. im Lehrbuch von Schleifer und Wensink: "Practical Methods in Molecular Biology" (Springer- Verlag, Berlin, Deutschland, 1981); im Handbuch von Harris und Angal: "Protein Purification Methods: A Practical Approach" (IRL Press, Oxford, UK, 1989); im Lehrbuch von Scopes: "Protein Purification: Principles and Practice", 3^rd ed. (Springer-Verlag, New York, USA, 1993), und in allgemein bekannten Lehrbüchern und Handbüchern niedergeschrieben. Das reine Enzymprotein kann anschließend durch Behandlung mit geeigneten Enzymen, wie zum Beispiel Trypsin oder Chymotrypsin, in Peptide zerlegt werden. Die Aminosäure-Sequenz dieser Peptide kann durch die von Edman (Archives of Biochemistry 22, 475 (1949)) beschriebene Methode der N-terminalen Sequenzierung bestimmt werden. Es ist gleichfalls möglich, die N-terminalen Aminosäuren des gereinigten Enzymproteins direkt zu bestimmen. Methoden und Anleitungen zur Proteinsequenzierung sind zum Beispiel bei Smith: "Protein Sequencing Protocolls: Methods in Molecular Biology", Vol. 64 und Vol. 112 (Humana Press, Totowa, NJ, USA, 1996) und bei Kamp et al.: "Protein Structure Analysis: Preparation, Characterization, and Microsequencing" (Springer-Verlag. New York, NY, USA, 1997) angegeben. Auf diese Weise kann die Aminosäuresequenz des Malat- Dehydrogenase-Enzymproteins je nach Aufwand teilweise oder vollständig bestimmt werden. In SEQ ID No. 1 sind die 20 N- terminalen Aminosäuren des isolierten Malat-Dehydrogenase- Enzymproteins dargestellt.

Unter Ausnutzung des bekannten Kodon-Gebrauchs für coryneforme Bakterien (Malumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993)) können synthetische Oligonukleotide synthetisiert und als Primer zur Amplifikation der entsprechenden chromosomalen DNA-Segmente mittels der Polymeraseketten- Reaktion (PCR) eingesetzt werden. Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem beispielsweise im Handbuch von Gait: "Oligonukleotide synthesis: a practical approach" (IRL Press, Oxford, UK, 1984) und bei Newton und Graham: "PCR" (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994). Das auf diese Weise erhaltene DNA-Fragment des sod- Gens wird anschließend mit bekannten Methoden, wie z. B. bei Sambrook et al.: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2^nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, 1989) beschrieben kloniert und kann als Sonde zur Suche des vollständigen Gens einschließlich seiner 5'- und 3'-Flanken in Genbanken eingesetzt werden.

Es ist gleichfalls möglich, das vollständige Gen einschließlich seiner 5'- und 3'-Flanke durch die Methode des "plasmid rescue" zu isolieren. Bei dieser Methode wird ein Fragment des interessierenden Gens, das beispielsweise auf die oben beschriebene Weise erhalten wurde, in einen für coryneforme Bakterien nicht replikativen Plasmidvektor kloniert. Der das Genfragment enthaltende Plasmidvektor wird durch Transformation und sich anschließender, homologer Rekombination in das Zielgen des Wirtes eingebaut bzw. integriert. Das Zielgen ist dadurch markiert. Die chromosomale DNA des dergestalt markierten Stammes wird anschließend isoliert und mit einem geeigneten Restriktionsenzym verdaut. Geeignete Restriktionsenzyme sind insbesondere solche, die nicht innerhalb der eingesetzten Vektor-DNA schneiden. Die erhaltenen DNA- Fragmente werden durch Behandlung mit Ligase zirkularisiert und ein zur Replikation des Plasmidvekors geeigneter Wirt, typischerweise Escherichia coli, mit dem Ligationsgemisch transformiert. Plasmid-DNA wird aus den Transformanten isoliert und die klonierten DNA-Abschnitte sequenziert. Die Methode des "plasmid rescue" ist beispielsweise bei Niaudet et al. (Gene 19, 277-284 (1982)) beschrieben. Methoden zur DNA-Sequenzierung sind unter anderem bei Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74: 5463-5467, 1977) oder in dem Protokoll von Zimmerman et al. (BioTechniques 17: 302 (1994)) beschrieben.

Die erhaltenen DNA-Sequenzen können dann mit bekannten Algorithmen bzw. Sequenzanalyse-Programmen, wie z. B. dem von Staden (Nucleic Acids Research 14, 217-232(1986)), dem von Marck (Nucleic Acids Research 16, 1829-1836 (1988)) oder dem GCG-Programm von Butler (Methods of Biochemical Analysis 39, 74-97 (1998)) untersucht werden.

Auf diese Weise wurde die neue, für das Gen mdhA kodierende DNA-Sequenz von C. glutamicum erhalten, die als SEQ ID No. 2 Bestandteil der vorliegenden Erfindung ist. Außerdem wurde aus der vorliegenden DNA-Sequenz mit den oben beschriebenen Methoden die Aminosäuresequenz des entsprechenden Translationsproduktes bzw. Genproduktes abgeleitet. In SEQ ID No. 3 ist die sich ergebende Aminosäuresequenz des mdhA-Genproduktes dargestellt. Es ist bekannt (O'Regan et al., Gene 77, 237-251 (1989)), daß die durch das Startkodon ATG kodierte Aminosäure Methionin bzw. Formyl-Methionin bei verschiedenen Proteinen durch Enzyme des Wirtes entfernt wird.

Kodierende DNA-Sequenzen, die sich aus SEQ ID No. 2 durch die Degeneriertheit des genetischen Codes ergeben, sind ebenfalls Bestandteil der Erfindung. In gleicher Weise sind DNA-Sequenzen, die mit SEQ ID No. 2 oder Teilen von SEQ ID No. 2 hybridisieren, Bestandteil der Erfindung. Schließlich sind DNA-Sequenzen Bestandteil der Erfindung, die durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung von Primern hergestellt werden, die sich aus SEQ ID No. 2 ergeben.

Anleitungen zur Identifizierung von DNA-Sequenzen mittels Hybridisierung findet der Fachmann unter anderem im Handbuch "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" der Firma Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) und bei Liebl et al. ("International Journal of Systematic Bacteriology" (1991) 41: 255-260). Anleitungen zur Amplifikation von DNA- Sequenzen mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) findet der Fachmann unter anderem im Handbuch von Gait: "Oligonukleotide synthesis: a practical approach" (IRL Press, Oxford, UK, 1984) und bei Newton und Graham: "PCR" (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994).

Bei der Arbeit an der vorliegenden Erfindung konnte festgestellt werden, daß coryneforme Bakterien nach Abschwächung des mdhA-Gens in verbesserter Weise Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, produzieren.

Zur Erzielung einer Abschwächung können entweder die Expression des mdhA-Gens oder die katalytischen Eigenschaften der Enzymproteins herabgesetzt oder ausgeschaltet werden. Gegebenenfalls können beide Maßnahmen kombiniert werden.

Die Verringerung der Genexpression kann durch geeignete Kulturführung oder durch genetische Veränderung (Mutation) der Signalstrukturen der Genexpression erfolgen. Signalstrukturen der Genexpression sind beispielsweise Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren, Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen, das Startkodon und Terminatoren. Angaben hierzu findet der Fachmann z. B. in der Patentanmeldung WO 96/15246, bei Boyd und Murphy (Journal of Bacteriology 170: 5949 (1988)), bei Voskuil und Chambliss (Nucleic Acids Research 26: 3548 (1998), bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191 (1998)), bei Patek et al. (Microbiology 142: 1297 (1996)), Vasicova et al. (Journal of Bacteriology 181: 6188 (1999)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers ("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme-Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995) oder dem von Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990).

Mutationen, die zu einer Veränderung bzw. Herabsetzung der katalytischen Eigenschaften von Enzymproteinen führen, sind aus dem Stand der Technik bekannt; als Beispiele seien die Arbeiten von Qiu und Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Sugimoto et al. (Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61: 1760-1762 (1997)) und Möckel ("Die Threonindehydratase aus Corynebacterium glutamicum: Aufhebung der allosterischen Regulation und Struktur des Enzyms", Berichte des Forschungszentrums Jülichs, Jül-2906, ISSN09442952, Jülich, Deutschland, 1994) genannt. Zusammenfassende Darstellungen können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie, wie z. B. dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer-Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.

Als Mutationen kommen Transitionen, Transversionen, Insertionen und Deletionen in Betracht. In Abhängigkeit von der Wirkung des Aminosäureaustausches auf die Enzymaktivität wird von Fehlsinnmutationen (missense mutations) oder Nichtsinnmutationen (nonsense mutations) gesprochen. Insertionen oder Deletionen von mindestens einem Basenpaar in einem Gen führen zu Rasterverschiebungsmutationen (frame shift mutations), in deren Folge falsche Aminosäuren eingebaut werden oder die Translation vorzeitig abbricht. Deletionen von mehreren Kodonen führen typischerweise zu einem vollständigen Ausfall der Enzymaktivität. Anleitungen zur Erzeugung derartiger Mutationen gehören zum Stand der Technik und können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers ("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme-Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995), dem von Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) oder dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer-Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.

Eine gebräuchliche Methode, Gene von C. glutamicum zu mutieren, ist die von Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)) beschriebene Methode der Gen-Unterbrechung (gene disruption) und des Gen-Austauschs (gene replacement).

Bei der Methode der Gen-Unterbrechung wird ein zentraler Teil der Kodierregion des interessierenden Gens in einen Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt (typischerweise E. coli), nicht aber in C. glutamicum replizieren kann. Als Vektoren kommen beispielsweise pSUP301 (Simon et al., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)), pK18mob oder pK19mob (Schäfer et al., Gene 145, 69-73 (1994)), pK18mobsacB oder pK19mobsacB (Jäger et al., Journal of Bacteriology 174: 5462-65 (1992)), pGEM-T (Promega corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994). Journal of Biological Chemistry 269: 32678-84; US-Patent 5,487,993), pCR®Blunt (Firma Invitrogen, Groningen, Niederlande; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)) oder pEM1 (Schrumpf et al. 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510-4516) in Frage. Der Plasmidvektor, der das zentrale Teil der Kodierregion des Gens enthält, wird anschließend durch Konjugation oder Transformation in den gewünschten Stamm von C. glutamicum überführt. Die Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)) beschrieben. Methoden zur Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican und Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) und Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)) beschrieben. Nach homologer Rekombination mittels eines "cross-over"- Ereignisses wird die Kodierregion des betreffenden Gens durch die Vektorsequenz unterbrochen, und man erhält zwei unvollständige Allele, denen jeweils das 3'- bzw. das 5'- Ende fehlt. Diese Methode wurde beispielsweise von Fitzpatrick et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 42, 575-580 (1994)) zur Ausschaltung des recA-Gens von C. glutamicum verwendet.

In Fig. 1 ist beispielhaft der Plasmidvektor pEMmdhAint gezeigt, mit Hilfe dessen das mdhA-Gen unterbrochen bzw. ausgeschaltet werden kann.

Bei der Methode des Genaustausches (gene replacement) wird eine Mutation, wie z. B. eine Deletion, Insertion oder Basenaustausch in dem interessierenden Gen in vitro hergestellt. Das hergestellte Allel wird wiederum in einen für C. glutamicum nicht replikativen Vektor kloniert und dieser anschließend durch Transformation oder Konjugation in den gewünschten Wirt von C. glutamicum überführt. Nach homologer Rekombination mittels eines ersten, Integration bewirkenden "cross-over"-Ereignisses und eines geeigneten zweiten, eine Excision bewirkenden "cross-over"-Ereignisses im Zielgen bzw. in der Zielsequenz erreicht man den Einbau der Mutation bzw. des Allels. Diese Methode wurde beispielsweise von Peters-Wendisch (Microbiology 144, 915-927 (1998)) verwendet, um das pyc-Gen von C. glutamicum durch eine Deletion auszuschalten.

In das mdhA-Gen kann auf diese Weise eine Deletion, Insertion oder ein Basenaustausch eingebaut werden.

Zusätzlich kann es für die Produktion von L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, vorteilhaft sein, zusätzlich zur Abschwächung des mdhA-Gens eines oder mehrere Enzyme des jeweiligen Biosyntheseweges, der Glykolyse, der Anaplerotik, des Pentosephosphat-Zyklus oder des Aminosäure-Exports zu verstärken, insbesondere zu überexprimieren.

So kann beispielsweise für die Herstellung von L-Lysin gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe:

- das für die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende dapA- Gen (EP-B 0 197 335),
- das für die Enolase kodierende eno-Gen (DE: 199 47 791.4),
- das für das zwf-Genprodukt kodierende zwf-Gen (JP-A- 09224661),
- das für die Pyruvat-Carboxylase codierende pyc-Gen (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),
- das für den Lysin-Export kodierende lysE-Gen (DE-A-195 48 222)

verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.

Außerdem kann es für die Produktion von Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, vorteilhaft sein, neben der Abschwächung des mdhA-Gens gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe:

- das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende pck-Gen (DE 199 50 409.1, DSM 13047),
- das für die Glucose-6-Phosphat-Isomerase kodierende pgi- Gen (US 09/396,478, DSM 12969),
- das für die Pyruvat-Oxidase kodierende poxB-Gen (DE:199 51 975.7, DSM 13114)

abzuschwächen.

Weiterhin kann es für die Produktion von Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, vorteilhaft sein, neben der Abschwächung des mdhA-Gens unerwünschte Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Micro-organisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982).

Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung und können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed-batch(Zulaufverfahren)- oder repeated fed-batch-Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion von L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden sind im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer-Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas ("Bioreaktoren und periphere Einrichtungen" (Vieweg-Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.

Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten. Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate, wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose; Öle und Fette, wie zum Beispiel Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnußöl und Kokosfett; Fettsäuren, wie zum Beispiel Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure; Alkohole, wie zum Beispiel Glycerin und Ethanol, und organische Säuren, wie zum Beispiel Essigsäure, verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Als Stickstoffquelle können organische, stickstoffhaltige Verbindungen, wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff, oder anorganische Verbindungen, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat, verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden natriumhaltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muß weiterhin Salze von Metallen enthalten, wie zum Beispiel Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind.

Schließlich können essentielle Wuchsstoffe, wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.

Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen, wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak beziehungsweise Ammoniakwasser, oder saure Verbindungen, wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure, in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel, wie zum Beispiel Fettsäurepolyglykolester, eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete, selektiv wirkende Stoffe, wie zum Beispiel Antibiotika, hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff- haltige Gasmischungen, wie zum Beispiel Luft, in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum des gewünschten Produktes gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.

Methoden zur Bestimmung von L-Aminosäuren sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Analyse kann zum Beispiel so wie bei Spackman et al. ("Analytical Chemistry", 30, (1958), 1190) beschrieben durch Anionenaustauschchromatographie mit anschließender Ninhydrin-Derivatisierung erfolgen, oder sie kann durch reversed phase HPLC erfolgen, so wie bei Lindroth et al. ("Analytical Chemistry" (1979) 51: 1167-1174) beschrieben.

Folgender Mikroorganismus wurde bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) gemäß Budapester Vertrag am 18.05.2000 hinterlegt:

- Escherichia coli DHSαmcr/pEMmdhAint als DSM13494.

Das erfindungsgemäße Verfahren dient zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren, insbesondere L-Lysin.

Beispiele

Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.

Die Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli sowie alle Techniken zur Restriktion, Klenow- und alkalische Phosphatasebehandlung wurden nach Sambrook et al. (Molecular cloning. A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA) durchgeführt. Methoden zur Transformation von Escherichia coli sind ebenfalls in diesem Handbuch beschrieben.

Die Zusammensetzung gängiger Nährmedien, wie LB- oder TY- Medium kann ebenfalls dem Handbuch von Sambrook et al. entnommen werden.

Die Malat-Dehydrogenase-Aktivität wurde, wie von Sanwal (Journal of Biological Chemistry 244 (7): 1831-1837 (1969)) und Smith (Methods of Enzymatical Analysis, 1985, Ed. 3, Band 3 (Bergmeyer et al. (Eds.)), VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland) beschrieben, bestimmt.

Proteinkonzentrationen wurden nach Smith et al. (Analytical Biochemistry 150: 76-85 (1985)) gemessen.

Beispiel 1 Isolierung und Reinigung der Malat-Dehydrogenase aus Corynebacterium glutamicum ATCC 13032

Es wurden viermal 100 ml 2 × TY mit jeweils einer Kolonie des Stammes Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 beimpft und in jeweils 250-ml-Erlenmeyerkolben für 16 Stunden bei 30°C und 200 Umdrehungen pro Minute kultiviert. Die Zellen wurden zweimal in Puffer A (50 mM K-Phosphat, pH 7,5, 1 mM Dithiothreitol, 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure) bei 4°C gewaschen, und in 20 ml desselben Puffers resuspendiert. Die Zellen wurden dreimal in einer vorgekühlten French- Pressure-Zelle der Firma Spectronic Unicam (Rochester, NY, USA) bei 165 MPa aufgeschlossen. Anschließend wurden die Zelltrümmer in einer Zentrifuge bei 4°C für 10 Minuten bei 75600 × g sedimentiert. Die Reinigung des Malat- Dehydrogenase-Proteins erfolgte in drei Schritten.

Schritt 1 Streptomycinsulfatfällung

Der Überstand wurde abgenommen und mit einer Streptomycinsulfatfällung weiter behandelt. Dazu wurde eine 10-prozentige (Gewicht/Volumen) Streptomycinsulfatlösung langsam, unter Rühren bei 0°C, zugegeben, bis eine Endkonzentration von 0,75% erreicht war. Der Ansatz wurde 15 Minuten auf Eis inkubiert und anschließend für 10 Minuten bei 4°C und 15000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde dann in einem, entsprechend nach Herstellerangaben vorbehandelten Dialyseschlauch (Firma Medicell, London, UK) gefüllt und zweimal in jeweils 1 l Puffer B (10 mM K- Phosphat, pH 7,5, 1 mM Dithiothreitol, 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure) für 1,5 Stunden bei 4°C dialysiert. Das Dialysat wurde dann für 15 Minuten bei 4°C und 75600 × g zentrifugiert.

Schritt 2 Anionenaustauscherchromatographie

Der Überstand aus Schritt 1 wurde abgenommen und auf eine mit 4 Säulenvolumen von Puffer B equilibrierte Anionenaustauschersäule vom Typ "Resource Q" (1 ml Säulenvolumen, Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland) aufgetragen. Die Säule wurde mit 4 Säulenvolumen Puffer B gespült und anschließend mit einem linearen Gradienten von Puffer B nach Puffer C (10 mM K-Phosphat, pH 7,5, 1 mM Dithiothreitol, 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure, 1 M NaCl) in 15 Säulenvolumen eluiert. Die Anionentauscherchromatographie erfolgte bei 20°C und die Sammlung der Fraktionen bei 4°C. Die Malat-Dehydrogenase eluierte bei ca. 0,5 M NaCl. Die Fraktionen, welche Malat- Dehydrogenase-Aktivität enthielten, wurden vereinigt und danach mittels Gelfiltration über PD-10-Säulen (Fa. Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland) mit eiskaltem Puffer D (10 mM K-phosphat, pH 7,5) nach den Angaben des Herstellers entsalzt.

Schritt 3 Farbstoff-Affinitätschromatographie

Auf eine Säule, befüllt mit 2,5 ml des Säulenmaterials "Reactive Brown 10" (Firma Sigma, Deisenhofen, Deutschland) und equilibriert mit 12,5 ml Puffer D wurde weniger als 10 mg Gesamtprotein aus Schritt 2 gegeben. Die Säule wurde mit 15 ml eiskaltem Puffer D gespült und die Malat- Dehydrogenase mit 2,5 ml Puffer E (10 mM K-Phosphat, ph 7,5, 1 mM NADH) eluiert. Das Eluat wurde mittels Gelfiltration über PD-10-Säulen, wie oben beschrieben, entsalzt.

Schritt 4 Farbstoff-Affinitätschromatographie

Der Schritt 3 wurde wiederholt.

Das so gereinigte Protein wurde bei -20°C gelagert. Zur Stabilisierung der Aktivität wurde die Probe mit 1 mg/ml Rinderserum Albumin supplementiert. Bei Proben, die für die Bestimmung der N-terminalen Sequenz des Malat-Dehydrogenase- Proteins eingesetzt wurden, unterblieb die Supplementierung mit Rinderserum Albumin. Zur Aktivitätsemessung des gereinigten Enzyms wurde ein Lambda-10-Spektrophotometer der Firma Perkin Elmer (Foster City, CA, USA) verwendet. Die gereinigte Malat-Dehydrogenase hatte eine maximale, spezifische, Oxalacetat-reduzierende Aktivität von 1200 bis 1300 µmol/min und mg Protein bei einer Konzentration von 0,1 mM Oxalacetat und 0,3 mM NADH.

Die Reinheit der isolierten Malat-Dehydrogenase wurde mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese bestimmt. Die Untersuchung zeigte, daß die gereinigte Malat-Dehydrogenase als homogenes Protein mit einer apparenten Molekülmasse von 33 kDa vorlag.

Beispiel 2 Bestimmung der N-ständigen Aminosäuresequenz

Die N-ständige Aminosäuresequenz des gereinigten Malat- Dehydrogenase-Proteins wurde durch Edman-Abbau (Edman, Molecular Biology Biochemistry Biophysics 8: 211-55 (1970)) mittels des automatischen Sequenzers Model 476A der Firma PE Biosystems (Foster City, CA, USA) bestimmt. Die erhaltene Aminosäuresequenz (siehe auch SEQ ID No. 1) war:

Asn-Ser-Pro-Gln-Asn-Val-Ser-Thr-Lys-Lys-Val-Thr-Val-Thr- Gly-Ala-Ala-Gly-Gln-Ile.

Beispiel 3 Herstellung eines Vektors mit einer Kopie eines internen Fragmentes des mdhA-Gens

Ein Segment des mdhA-Gens wurde mittels Polymerase- Kettenreaktion (PCR), ausgehend von chromosomaler DNA des Stammes ATCC13032 amplifiziert und anschließend kloniert.

Anhand der in Beispiel 2 bestimmten, N-ständigen Aminosäuresequenz wurde der degenerierte Primer P1 entworfen. Dieser Primer hatte die Sequenz:

5'-AARGTYACYGTYACYGGY-3'.

Als zweiter, degenerierter Primer wurde der Primer P2 eingesetzt, der die folgende Sequenz hatte:

5'-CGRTTRTGRTCVARRCG-3'.

Die Abkürzung R steht für die Nukleobasen A oder G; die Abkürzung Y für C oder T, und die Abkürzung V für A, G oder C.

Die dargestellten Primer wurden von der Firma MWG Biotech (Ebersberg, Deutschland) synthetisiert. Die PCR-Reaktion wurde nach der Standard-PCR-Methode von Innis et al., (PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press, New York, USA) durchgeführt. Als Matrize wurde genomische DNA von Corynebacterium glutamicum ATCC13032 verwendet, die nach der von Pospiech und Neumann (Trends in Genetics 11: 217-218 (1995)) beschriebenen Methode isoliert wurde.

Bei der Polymerasekettenreaktion wurde ein Zyklus, bestehend aus Denaturierung (30 Sekunden, 94°C), Annealing (60 Sekunden, 63°C) und Synthese (90 Sekunden, 72°C) 30mal durchlaufen. Anschließend wurde eine letzte Synthese von 10 Minuten bei 72°C durchgeführt. Es wurde die Taq- Polymerase der Firma Promega (Madison, WI, USA) und ein Thermocycler der Firma Techne (Cambridge, UK) verwendet.

Das auf diese Weise hergestellte, ca. 470 bp lange DNA- Fragment des mdhA-Gens wurde mit Hilfe des QIAQuick PCR Purification Kit der Firma Qiagen (Hilden, Deutschland) gereinigt und in die EcoRV-Schnittstelle des Vektors pBlueskript II SK(+) (Firma Stratagene, La Jolla, CA, USA) kloniert. Anschließend wurde das Fragment unter Zuhilfenahme der Restriktionsenzyme BamHI und HindIII isoliert und in den mit den Restriktiomsenzymen BamHI und HindIII behandelten Vektor pEM1 (Schrumpf et al. Journal of Bacteriology 173, 4510-4516 (1991)) in E. coli DHα kloniert, wobei die Selektion auf LB-Medium, supplementiert mit 50 µg/ml Kanamycin, erfolgte. Das so entstandene Plasmid wurde als pEMmdhAint bezeichnet.

Beispiel 4 Ermittlung der Sequenz des mdhA-Gens

In dem Stamm Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 wurde das mdhA-Gen mit Hilfe des Plasmides pEMmdhAint inaktiviert.

Der Stamm Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 wurde, wie bei Van der Rest et al (Applied Microbiology and Biotechnology 52, 541-545 (1999)) beschrieben, mit dem Plasmid pEMmdhAint transformiert. Die Selektion der Transformanten erfolgte auf LBHIS-Agar, der mit 25 mg/l Kanamycin supplementiert worden war. LBHIS-Agar besteht aus LB-Medium, das mit 18,5 g/l Hirn-Herz-Bouillon (Firma Becton Dickinson, Sparks MD, USA), 91 g/l Sorbitol und 15 g/l Agar-Agar supplementiert wurde. Auf diese Weise entstand der Stamm ATCC13032mdhA::pEMmdhAint, bei dem das Plasmid pEMmdhAint im mdhA-Gen integriert ist.

Chromosomale DNA wurde aus dem Stamm ATCC13032mdhA::pEMmdhAint, wie bei Pospiech und Neumann (Trends in Genetics 11: 217-218 (1995)) beschrieben, isoliert und in zwei verschiedenen Ansätzen, einmal mit dem Restriktionsenzym StuI und einmal mit dem Restriktionsenzym XbaI, vollständig verdaut. Die chromosomalen Restriktionsfragmente wurden, wie bei Niaudet et al. (Gene 19, 277-284 (1982)) beschrieben, ligiert und Escherichia coli DH5α-MCR (Grant et al Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 87,4645-4649 (1990)) mit dem Ligationsansatz transformiert. Transformanten wurden auf LB- Agar mit 50 mg/l Kanamycin selektioniert. Plasmid-DNA wurde aus den Transformanten isoliert und einer Restriktionsanalyse unterzogen. Auf diese Weise wurden die Plasmide pEMmdhAint-StuI und pEMmdhAint-XbaI identifiziert, welche zusätzlich zu dem bereits im Plasmid pEMmdhAint klonierten, 470 bp langen, internen Fragment des mdhA-Gens Bereiche des 5'- und des 3'-Endes des Gens trugen. Das Plasmid pEMmdhAint-StuI, erhalten aus dem StuI Verdau, besaß zusätzlich 0,56 kb am 5'- und 0,40 kb am 3'-Ende des 470-bp-Bereiches. Das Plasmid pEMmdhAint-XbaI, erhalten aus dem XbaI Verdau, besaß zusätzlich 1,2 kb am 3'-Ende des 470-bp- Bereichs.

Die erhaltenen Plasmide wurden von der Firma Seqlab (Göttingen, Deutschland) unter Anwendung des Cycle- Sequencing-Protokolls von Zimmerman et al. (BioTechniques 17: 302 (1994)) sequenziert. Die Auswertung der Sequenzen erfolgte mit der PC/Gene-Version 6.60 der Firma Intelligenetics Inc. (Genf, Schweiz). Die Sequenz des mdhA- Genclusters ist in Seq ID No. 2 dargestellt.

Beispiel 5 Herstellung von L-Lysin-Produzenten mit inaktiviertem mdhA- Gen

Um die Auswirkung der Auschaltung des mdhA-Gens auf die Produktion von Lysin zu untersuchen, wurden Versuche mit verschiedenen, bekannten Lysinproduzenten von C. glutamicum durchgeführt.

1. Herstellung der Stämme

Der Stamm MH20-22B ist in der EP-B-0435132 beschrieben und als DSM5715 gemäß Budapester Vertrag hinterlegt. Der Stamm DM58-1 ist in der EP-B-0358940 beschrieben. Die dort beschriebene Transformante DM58-1/pDM6 ist als DSM4697 gemäß Budapester Vertrag hinterlegt. Durch Kurierungsmethoden, wie beispielsweise durch die von Schäfer et al. (Journal of Bacteriology, 176, 7309-7319 (1994)) beschriebenen Methode des "plasmid curing", kann der Stamm DM58-1 aus DSM4697 hergestellt werden. Der Stamm DG 52-5 ist in DE-C-38 23 451 beschrieben. Die dort beschriebene Transformante DG 52-5/pZ1-asd ist als DSM4421 gemäß Budapester Vertrag hinterlegt. Der Stamm DG52-5 kann ebenfalls durch die Methode des "Plasmid-Curings" aus DSM4421 hergestellt werden.

Der Stamm Corynebacterium glutamicum MH20-22B wurde, wie bei Van der Rest et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 52, 541-545 (1999)) beschrieben, mit dem Plasmid pEMmdhAint transformiert. Die Selektion der Transformanten erfolgte auf LBHIS-Agar, der mit 25 mg/l Kanamycin supplementiert worden war. Auf diese Weise entstand der Stamm MH20- 22BmdhA::pEMmdhAint. Auf die gleiche Weise entstanden, ausgehend von den Stämmen DG52-5 und DM58-1, jeweils die Stämme DG52-5mdhA::pEMmdhAint und DM58-1mdhA::pEMmdhAint.

2. Bestimmung der Malat-Dehydrogenase-Aktivität

Zur Bestätigung des Erfolgs der Insertionsmutagenese wurde in den Stämmen MH20-22B, DM58-1 und DG52-5 und in den Insertionsmutanten MH20-22BmdhA::pEMmdhAint, DG52- 5mdhA::pEMmdhAint und DM58-1mdhA::pEMmdhAint die Malatdehydrogenase-Aktivität gemessen. Dazu wurde von den Stämmen jeweils eine Kolonie auf 50 ml 2 × TY Medium angeimpft und 16 Stunden in einem 250-ml-Erlenmeyer-Kolben bei 30°C und 200 Umdrehungen pro Minute inkubiert. Dabei enthielten die Medien für die Stämme MH20- 22BmdhA::pEMmdhAint, DG52-5mdhA::pEMmdhAint und DM58- 1mdhA::pEMmdhAint zusätzlich 25 µg/ml Kanamycin. Die Kulturen wurden 10 Minuten bei 10000 × g abzentrifugiert, zweimal mit 50 mM Kaliumphosphat pH 7,5 gewaschen und anschließend in 5 ml desselben Puffers suspendiert. Die Zellsuspensionen wurden mit zwei Passagen durch eine eiskalte French-Press-Zelle bei 165 MPa aufgeschlossen. Anschließend wurden die Proben 10 Minuten bei 75000 × g und 4°C zentrifugiert. Der klare Überstand wurde als Rohextrakt für die Malatdehydrogenase-Aktivitätsmessungen verwendet. Die Malatdehydrogenase wurde bestimmt, wobei als Puffer 100 mM 3-Amino-1-propanol (pH 9,2) mit zusätzlich 4,5 mM MgCl₂ und 2,9 mM NAD⁺ verwendet wurde. Der Testansatz enthielt 1 ml dieses Puffers und 50 µl des Rohextraktes. Der Ansatz wurde zuerst 30 Minuten bei 30°C inkubiert. Danach wurde die Malatdehydrogenasereaktion durch Zugabe von 25 mM neutralisiertem L-Malat gestartet. Die Absorption wurde bei einer Wellenlänge von 340 nm in einem Lambda-10- Spektrophotometer der Firma PE Biosystems (Foster City, CA, USA) gemessen. Als Kontrolle der spezifischen NAD⁺- Reduktionsgeschwindigkeit diente die Messung mit komplettem Reaktionsansatz ohne L-Malat.

Die Ausgangsstämme MH20-22B, DM58-1 und DG52-5 besaßen jeweils eine spezifische Malat-Dehydrogenase-Aktivität von 301, 380 und 354 nmol/min × mg Protein, wohingegen die mdhA- Insertionsmutanten keine nachweisbare Malat-Dehydrogenase- Aktivität aufwiesen. Dabei war die untere Nachweisgrenze der Aktivität 2 nmol/min × mg Protein.

Beispiel 6 Herstellung von L-Lysin

Die in Beispiel 5 beschriebenen Stämme wurden in 2 × TY- Medium, das im Falle der Insertionsmutanten mit Kanamycin (25 µg/ml) supplementiert worden war, für 24 Stunden bei 30°C inkubiert. Für die Kultivierung in Flüssigmedium wurde das Medium CgIII (Keilhauer et al. 1993, Journal of Bacteriology 175: 5595-5603) verwendet, das für die Insertionsmutanten zusätzlich mit Kanamycin (25 mg/l) supplementiert worden war. Hierzu wurden 10 ml Medium, die in 100-ml-Erlenmeyerkolben enthalten waren, mit einer Kolonie des Stammes angeimpft und die Kultur anschließend als Vorkultur weiterverwendet.

Als Produktions- bzw. Testmedium wurde das CGXII-Glukose- Minimalmedium (Keilhauer et al. Journal of Bacteriology 175, 5595-5603 (1993)) verwendet. Das Medium enthielt kein Kanamycin. Die Kultivierung erfolgte in 500-ml- Erlenmeyerkolben, welche mit einer auf dem Boden am Rand entlang liegenden Metallspirale mit einem Durchmesser von 2 cm bestückt waren. Diese Kolben wurden mit 60 ml CGXII- Glukose-Minimalmedium befüllt. Die Kulturen wurden so mit der Vorkultur angeimpft, daß die optische Dichte beim Start einen Wert zwischen 0,5 und 0,6 hatten. Die Kultivierung erfolgte für 72 Stunden bei 30°C. Die Kolben wurden mit einer Frequenz von 140 Umdrehungen pro Minute geschüttelt.

Nach 72 Stunden Inkubation wurden die optische Dichte der Kultur und die Lysinkonzentration im Produktionsmedium bestimmt.

Die optische Dichte (OD) wurde mit einem Lambda-B- Spektrophotometer der Firma Perkin-Elmer bei einer Wellenlänge von 600 nm bestimmt.

L-Lysin wurde mittels "High Performance Liquid Chromatography" bestimmt, wobei eine "Hypersil ODS 5µ"- Säule (Dimensionen: 125 × 4 mm) von der Firma Chromatographie-Service, Langerwehe, Deutschland, benutzt wurde. Die Trennung erfolgte mittels eines linearen Gradienten der Laufmittel A: 0.1 mM Natriumacetat, pH 7,5 und B: Methanol (Verhältnis A : B von 85 : 15 bis 0 : 100). Die Aminosäuren wurden 5 Minuten vor der Auftragung mit ortho- Phthaldialdehyd (OPA Reagent, Firma Pierce, Rockford IL, USA) derivatisiert. Die Detektion erfolgte durch Messung der Fluoreszenz mit einer Anregungs-Wellenlänge von 243 nm und einer Emissions-Wellenlänge von 436 nm. In Tabelle 1 ist das Ergebnis des Versuches dargestellt.

TABELLE 1

SEQUENZPROTOKOLL

Folgende Figur ist beigefügt:

Fig. 1 Karte des Plasmids pEMmdhAint.

Die verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen haben folgende Bedeutung. Bei der Angabe der Basenpaarzahlen handelt es sich um Näherungswerte, die im Rahmen der Reproduzierbarkeit von Messungen erhalten werden.

mdhAint: internes Fragment des mdhA-Gens, Basen 566 bis 1035 der Seq. ID. NO. 1
Km-Gen: Km-Resistenz-Gen (Tn5)
oriV: E.-coli-Replikationsursprung
oriT: Origin für Transfer (Mobilisation) aus Plasmid RP4
BamHI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms BamHI
HindIII: Schnittstelle des Restriktionsenzyms HindIII.

Claims

1. Isoliertes Polynukleotid aus coryneformen Bakterien, enthaltend eine für das mdhA-Gen kodierende Polynukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe:

a) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid codiert, die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 3 enthält,
b) Polynukleotid, das für ein Polypeptid codiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens zu 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 3 enthält,
c) Polynukleotid, das komplementär ist zu den Polynukleotiden von a) oder b), und
d) Polynukleotid, enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide der Polynukleotidsequenz von a), b) oder c),

wobei das Polypeptid bevorzugt die Aktivität der Malat-Dehydrogenase aufweist.

2. Polynukleotide gemäß Anspruch 1, wobei das Polynukleotid eine in coryneformen Bakterien replizierbare, bevorzugt rekombinante DNA ist.

3. Polynukleotide gemäß Anspruch 1, wobei das Polynukleotid eine RNA ist.

4. Isoliertes Polypeptid mit Malat-Dehydrogenase- Aktivität, das die N-terminale Aminosäuresequenz:
enthält, dargestellt in der SEQ ID No. 1.

5. Replizierbare DNA gemäß Anspruch 2, enthaltend:

a) die Nukleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID No. 2, oder
b) mindestens eine Sequenz, die der Sequenz (i) innerhalb des Bereichs der Degeneration des genetischen Codes entspricht, oder
c) mindestens eine Sequenz, die mit den zu den Sequenzen (i) oder (ii) komplementären Sequenzen hybridisiert, und gegebenenfalls
d) funktionsneutrale Sinnmutationen in (i).

6. Coryneforme Bakterien, in denen das mdhA-Gen abgeschwächt, bevorzugt ausgeschaltet wird.

7. Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, dadurch gekennzeichnet, dass man folgende Schritte durchführt:

a) Fermentation der die gewünschte L-Aminosäure produzierenden Bakterien, in denen man zumindest das mdhA-Gen abschwächt,
b) Anreicherung des gewünschten Produkts im Medium oder in den Zellen der Bakterien und
c) Isolieren der L-Aminosäure.

8. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man Bakterien einsetzt, in denen man zusätzlich weitere Gene des Biosyntheseweges der gewünschten L-Aminosäure verstärkt.

9. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man Bakterien einsetzt, in denen die Stoffwechselwege zumindest teilweise ausgeschaltet sind, die die Bildung der gewünschten L-Aminosäure verringern.

10. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man die Expression des (der) Polynukleotids(e), das (die) für das mdhA-Gen kodiert (kodieren) verringert, insbesondere ausschaltet.

11. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man die katalytischen Eigenschaften des Polypeptids (Enzymproteins) herabsetzt, für das das Polynukleotid mdhA kodiert.

12. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man für die Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, Bakterien fermentiert, in denen man gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe:

1. 12.1 das für die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende dapA-Gen,
2. 12.2 das für die Pyruvat-Carboxylase kodierende pyc-Gen,
3. 12.3 das für die Enolase kodierende eno-Gen,
4. 12.4 das für das zwf-Genprodukt kodierende zwf-Gen,
5. 12.5 das für den Lysin-Export kodierende lysE-Gen,

verstärkt, bevorzugt überexprimiert.

13. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe:

1. 13.1 das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende pck-Gen,
2. 13.2 das für die Glucose-6-Phosphat-Isomerase kodierende pgi-Gen,
3. 13.3 das für die Pyruvat-Oxidase kodierende poxB-Gen abschwächt.

14. Verfahren gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man Mikroorganismen der Gattung Corynebacterium glutamicum einsetzt.

15. Verfahren zum Auffinden von RNA, cDNA und DNA, um Nukleinsäuren, beziehungsweise Polynukleotide oder Gene, zu isolieren, die für Malat-Dehydrogenase kodieren oder eine hohe Ähnlichkeit mit der Sequenz des Malat-Dehydrogenase-Gens aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass man die Polynukleotidsequenzen gemäß den Ansprüchen 1 bis 4 als Hybridisierungssonden einsetzt.