DE10042739A1 - Neue für das lipB-Gen kodierende Nukleotidsequenzen - Google Patents
Neue für das lipB-Gen kodierende NukleotidsequenzenInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft isolierte Polynukleotide, enthaltend eine Polynukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe DOLLAR A a) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2 enthält, DOLLAR A b) Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2, DOLLAR A c) Polynukleotid, das komplementär ist zu den Polynukleotiden von a) oder b), und DOLLAR A d) Polynukleotid, enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide der Polynukleotidsequenz von a), b) oder c), DOLLAR A und Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von coryneformen Bakterien, in denen zumindest das lipB-Gen abgeschwächt vorliegt, und die Verwendung der Polynukleotiden, die die erfindungsgemäßen Sequenzen enthalten, als Hybridisierungssonden.
Description
Gegenstand der Erfindung sind für das lipB-Gen kodierende
Nukleotidsequenzen aus coryneformen Bakterien und ein
Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren,
insbesondere L-Lysin, durch Abschwächung des lipB-Gens. Das
lipB-Gen kodiert für die Lipoprotein-Ligase B.
L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, finden in der
Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie, in der
Lebensmittelindustrie und ganz besonders in der
Tierernährung Anwendung.
Es ist bekannt, dass Aminosäuren durch Fermentation von
Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere
Corynebacterium glutamicum, hergestellt werden. Wegen der
grossen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der
Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen
können fermentationstechnische Massnahmen wie zum Beispiel
Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die
Zusammensetzung der Nährmedien, wie zum Beispiel die
Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die
Aufarbeitung zur Produktform durch zum Beispiel
Ionenaustauschchromatographie oder die intrinsischen
Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst
betreffen.
Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser
Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion
und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise Erhält man
Stämme, die resistent gegen Antimetabolite oder auxotroph
für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und die
Aminosäuren produzieren.
Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der
rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung von L-
Aminosäure-produzierenden Stämmen von Corynebacterium
eingesetzt.
Die Erfinder haben sich zur Aufgabe gestellt, neue
Massnahmen zur verbesserten fermentativen Herstellung von
Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, bereitzustellen.
Werden im folgenden L-Lysin oder Lysin erwähnt, sind damit
auch die Salze wie z. B. Lysin-Monohydrochlorid oder
Lysin-Sulfat gemeint.
Gegenstand der Erfindung ist ein isoliertes Polynukleotid
aus coryneformen Bakterien, enthaltend eine für das
lipB-Gen kodierende Polynukleotidsequenz, ausgewählt aus
der Gruppe
- a) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2 enthält,
- b) Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2,
- c) Polynukleotid, das komplementär ist zu den Polynukleotiden von a) oder b), und
- d) Polynukleotid, enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide der Polynukleotidsequenz von a), b) oder c),
wobei das Polypeptid bevorzugt die Aktivität der
Lipoprotein-Ligase B aufweist.
Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls das oben genannte
Polynukleotid, wobei es sich bevorzugt um eine
replizierbare DNA handelt, enthaltend:
- a) die Nukleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID No. 1 oder
- b) mindestens eine Sequenz, die der Sequenz (i) innerhalb des Bereichs der Degeneration des genetischen Kodes entspricht, oder
- c) mindestens eine Sequenz, die mit den zu den Sequenzen (i) oder (ii) komplementären Sequenzen hybridisiert, und gegebenenfalls
- d) funktionsneutralen Sinnmutationen in (i).
Weitere Gegenstände sind:
eine replizierbares Polynukleotid, insbesondere DNA, enthaltend die Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID No. 1 dargestellt;
ein Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID No. 2 dargestellt, enthält;
ein Vektor, enthaltend Teile des erfindungsgemässen Polynukleotids, mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide der beanspruchten Sequenz
und coryneforme Bakterien, in denen das lipB-Gen, insbesondere durch eine Insertion oder Deletion, abgeschwächt ist.
eine replizierbares Polynukleotid, insbesondere DNA, enthaltend die Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID No. 1 dargestellt;
ein Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID No. 2 dargestellt, enthält;
ein Vektor, enthaltend Teile des erfindungsgemässen Polynukleotids, mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide der beanspruchten Sequenz
und coryneforme Bakterien, in denen das lipB-Gen, insbesondere durch eine Insertion oder Deletion, abgeschwächt ist.
Gegenstand der Erfindung sind ebenso Polynukleotide, die im
wesentlichen aus einer Polynukleotidsequenz bestehen, die
erhältlich sind durch Screening mittels Hybridisierung
einer entsprechenden Genbank eines coryneformen Bakteriums,
die das vollständige Gen oder Teile davon enthält, mit
einer Sonde, die die Sequenz des erfindungsgemässen
Polynukleotids oder ein Fragment davon enthält und
Isolierung der genannten Polynukleotidsequenz.
Polynukleotide, enthaltend die Sequenzen gemäss der
Erfindung, sind als Hybridisierungssonden für RNA, cDNA und
DNA geeignet, um Nukleinsäuren, beziehungsweise
Polynukleotide oder Gene in voller Länge zu isolieren, die
für die Lipoprotein-Ligase B kodieren oder um solche
Nukleinsäuren beziehungsweise Polynukleotide oder Gene zu
isolieren, die eine hohe Ähnlichkeit mit der Sequenz des
lipB-Gens aufweisen.
Polynukleotidsequenzen gemäss der Erfindung sind weiterhin
als Primer geeignet, mit deren Hilfe mit der
Polymerase-Kettenreaktion (PCR) DNA von Genen hergestellt
werden kann, die für die Lipoprotein-Ligase B kodieren.
Solche als Sonden oder Primer dienende Oligonukleotide
enthalten mindestens 30, bevorzugt mindestens 20, ganz
besonders bevorzugt mindestens 15 aufeinanderfolgende
Nukleotide. Geeignet sind ebenfalls Oligonukleotide mit
einer Länge von mindestens 40 oder 50 Nukleotiden.
"Isoliert" bedeutet aus seinem natürlichen Umfeld
herausgetrennt.
"Polynukleotid" bezieht sich im allgemeinen auf
Polyribonukleotide und Polydeoxyribonukleotide, wobei es
sich um nicht modifizierte RNA oder DNA oder modifizierte
RNA oder DNA handeln kann.
Die Polynukleotide gemäss Erfindung schliessen ein
Polynukleotid gemäss SEQ ID No. 1 oder ein daraus
hergestelltes Fragment und auch solche ein, die zu
wenigstens 70%, bevorzugt zu wenigstens 80% und besonders
zu wenigstens 90% bis 95% identisch sind mit dem
Polynukleotid gemäss SEQ ID No. 1 oder eines daraus
hergestellten Fragments.
Unter "Polypeptiden" versteht man Peptide oder Proteine,
die zwei oder mehr über Peptidbindungen verbundene
Aminosäuren enthalten.
Die Polypeptide gemäss Erfindung schliessen ein Polypeptid
gemäss SEQ ID No. 2, insbesondere solche mit der
biologischen Aktivität der Lipoprotein-Ligase B und auch
solche ein, die zu wenigstens 70%, bevorzugt zu wenigstens
80% und besonders zu wenigstens 90% bis 95% identisch
sind mit dem Polypeptid gemäss SEQ ID No. 2 und die
genannte Aktivität aufweisen.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur
fermentativen Herstellung von Aminosäuren, insbesondere
L-Lysin, unter Verwendung von coryneformen Bakterien, die
insbesondere bereits Aminosäuren produzieren und in denen
die für das lipB-Gen kodierenden Nukleotidsequenzen
abgeschwächt, insbesondere ausgeschaltet oder auf niedrigem
Niveau exprimiert werden.
Der Begriff "Abschwächung" beschreibt in diesem
Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der
intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme
(Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die
entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise
einen schwachen Promotor verwendet oder ein Gen bzw. Allel
verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer
niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Gen oder
Enzym (Protein) inaktiviert und gegebenenfalls diese
Massnahmen kombiniert.
Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden
Erfindung sind, können Aminosäuren, insbesondere L-Lysin
aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose,
Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol
herstellen. Es kann sich um Vertreter coryneformer
Bakterien insbesondere der Gattung Corynebacterium handeln.
Bei der Gattung Corynebacterium ist insbesondere die Art
Corynebacterium glutamicum zu nennen, die in der Fachwelt
für ihre Fähigkeit bekannt ist, L-Aminosäuren zu
produzieren.
Geeignete Stämme der Gattung Corynebacterium, insbesondere
der Art Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum), sind
besonders die bekannten Wildtypstämme
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
oder daraus hergestellte L-Aminosäuren produzierende Mutanten beziehungsweise Stämme, wie beispielsweise die L-Lysin produzierenden Stämme
Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709
Brevibacterium flavum FERM-P 1708
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464
Corynebacterium glutamicum DM58-1
Corynebacterium glutamicum DG52-5
Corynebacterium glutamicum DSM 5715 und
Corynebacterium glutamicum DSM 12866
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
oder daraus hergestellte L-Aminosäuren produzierende Mutanten beziehungsweise Stämme, wie beispielsweise die L-Lysin produzierenden Stämme
Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709
Brevibacterium flavum FERM-P 1708
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464
Corynebacterium glutamicum DM58-1
Corynebacterium glutamicum DG52-5
Corynebacterium glutamicum DSM 5715 und
Corynebacterium glutamicum DSM 12866
Den Erfindern gelang es, das neue, für die Lipoprotein-
Ligase B kodierende lipB-Gen von C. glutamicum zu
isolieren.
Zur Isolierung des lipE-Gens oder auch anderer Gene von
C. glutamicum wird zunächst eine Genbank dieses
Mikroorganismus in Escherichia coli (E. coli) angelegt. Das
Anlegen von Genbanken ist in allgemein bekannten
Lehrbüchern und Handbüchern niedergeschrieben. Als Beispiel
seien das Lehrbuch von Winnacker: Gene und Klone, Eine
Einführung in die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim,
Deutschland, 1990), oder das Handbuch von Sambrook et al.:
Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1989) genannt. Eine sehr bekannte Genbank
ist die des E. coli K-12 Stammes W3110, die von Kohara et
al. (Cell 50, 495-508 (1987)) in λ-Vektoren angelegt wurde.
Bathe et al. (Molecular and General Genetics, 252: 255-265,
1996) beschreiben eine Genbank von C. glutamicum ATCC13032,
die mit Hilfe des Cosmidvektors SuperCos I (Wahl et al.,
1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA,
84: 2160-2164) im E. coli K-12 Stamm NM554 (Raleigh et al.,
1988, Nucleic Acids Research 16: 1563-1575) angelegt wurde.
Börmann et al. (Molecular Microbiology 6(3), 317-326
(1992)) wiederum beschreiben eine Genbank von C. glutamicum
ATCC13032 unter Verwendung des Cosmides pHC79 (Hohn und
Collins, 1980, Gene 11, 291-298).
Zur Herstellung einer Genbank von C. glutamicum in E. coli
können auch Plasmide wie pBR322 (Bolivar, 1979, Life
Sciences, 25, 807-818) oder pUC9 (Vieira et al., 1982,
Gene, 19: 259-268) verwendet werden. Als Wirte eignen sich
besonders solche E. coli-Stämme, die restriktions- und
rekombinationsdefekt sind wie beispielsweise der Stamm
DH5α (Jeffrey H. Miller: "A Short Course in Bacterial
Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia
coli and Related Bacteria", Cold Spring Harbour Laboratory
Press, 1992).
Die mit Hilfe von Cosmiden oder anderen λ-Vektoren
klonierten langen DNA-Fragmente können anschliessend
wiederum in gängige für die DNA-Sequenzierung geeignete
Vektoren subkloniert werden.
Methoden zur DNA-Sequenzierung sind unter anderem bei
Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America USA, 74: 5463-5467,
1977) beschrieben.
Die erhaltenen DNA-Sequenzen können dann mit be kannten
Algorithmen bzw. Sequenzanalyse-Programmen wie z. B. dem von
Staden (Nucleic Acids Research 14, 217-232(1986)), dem von
Marck (Nucleic Acids Research 16, 1829-1836 (1988)) oder
dem GCG-Programm von Butler (Methods of Biochemical
Analysis 39, 74-97 (1998)) untersucht werden.
Auf diese Weise wurde die neue für das lipB-Gen kodierende
DNA-Sequenz von C. glutamicum erhalten, die als SEQ ID No.
1 Bestandteil der vorliegenden Erfindung ist. Weiterhin
wurde aus der vorliegenden DNA-Sequenz mit den oben
beschriebenen Methoden die Aminosäuresequenz des
entsprechenden Proteins abgeleitet. In SEQ ID No. 2 ist die
sich ergebende Aminosäuresequenz des lipB-Genproduktes
dargestellt.
Kodierende DNA-Sequenzen, die sich aus SEQ ID No. 1 durch
die Degeneriertheit des genetischen Kodes ergeben, sind
ebenfalls Bestandteil der Erfindung. In gleicher Weise sind
DNA-Sequenzen, die mit SEQ ID No. 1 oder Teilen von
SEQ ID No. 1 hybridisieren, Bestandteil der Erfindung. In
der Fachwelt sind weiterhin konservative
Aminosäureaustausche wie z. B. Austausch von Glycin gegen
Alanin oder von Asparaginsäure gegen Glutaminsäure in
Proteinen als "Sinnmutationen" (sense mutations) bekannt,
die zu keiner grundsätzlichen Veränderung der Aktivität des
Proteins führen, d. h. funktionsneutral sind. Weiterhin ist
bekannt, dass Änderungen am N- und/oder C-Terminus eines
Proteins dessen Funktion nicht wesentlich beeinträchtigen
oder sogar stabilisieren können. Angaben hierzu findet der
Fachmann unter anderem bei Ben-Bassat et al. (Journal of
Bacteriology 169: 751-757 (1987)), bei O'Regan et al. (Gene
77: 237-251 (1989)), bei Sahin-Toth et al. (Protein Sciences
3: 240-247 (1994)), bei Hochuli et al. (Bio/Technology
6: 1321-1325 (1988)) und in bekannten Lehrbüchern der
Genetik und Molekularbiologie. Aminosäuresequenzen, die
sich in entsprechender Weise aus SEQ ID No. 2 ergeben, sind
ebenfalls Bestandteil der Erfindung.
Schliesslich sind DNA-Sequenzen Bestandteil der Erfindung,
die durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter
Verwendung von Primern hergestellt werden, die sich aus
SEQ ID No. 1 ergeben. Derartige Oligonukleotide haben
typischerweise eine Länge von mindestens 15 Nukleotiden.
Anleitungen zur Identifizierung von DNA-Sequenzen mittels
Hybridisierung findet der Fachmann unter anderem im
Handbuch "The DIG System Users Guide for Filter
Hybridization" der Firma Boehringer Mannheim GmbH
(Mannheim, Deutschland, 1993) und bei Liebl et al.
(International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-
260 (1991)). Die Hybridisierung findet unter stringenten
Bedingungen statt, das heisst, es werden nur Hybride
gebildet, bei denen Sonde und Zielsequenz, d. h. die mit
der Sonde behandelten Polynukleotide, mindestens 70%
identisch sind. Es ist bekannt, dass die Stringenz der
Hybridisierung einschliesslich der Waschschritte durch
Variieren der Pufferzusammensetzung, der Temperatur und der
Salzkonzentration beeinflusst bzw. bestimmt wird. Die
Hybridisierungsreaktion wird vorzugsweise bei relativ
niedriger Stringenz im Vergleich zu den Waschschritten
durchgeführt (Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited,
Teddington, UK, 1996). Für die Hybridisierungsreaktion kann
beispielsweise ein 5x SSC-Puffer bei einer Temperatur von
ca. 50-68°C eingesetzt werden. Dabei können Sonden auch
mit Polynukleotiden hybridisieren, die weniger als 70%
Identität zur Sequenz der Sonde aufweisen. Solche Hybride
sind weniger stabil und werden durch Waschen unter
stringenten Bedingungen entfernt. Dies kann beispielsweise
durch Senken der Salzkonzentration auf 2x SSC und
gegebenenfalls nachfolgend 0,5x SSC (The DIG System Users
Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim,
Mannheim, Deutschland, 1995) erreicht werden, wobei eine
Temperatur von ca. 50-68°C eingestellt wird. Durch
schrittweise Erhöhung der Hybridisierungstemperatur in
Schritten von ca. 1-2°C von 50 auf 68°C können
Polynukleotidfragmente isoliert werden, die beispielsweise
mindestens 70% oder mindestens 80% oder mindestens 90%
bis 95% Identität zur Sequenz der eingesetzten Sonde
besitzen. Weitere Anleitungen zur Hybridisierung sind in
Form sogenannter Kits am Markt erhältlich (z. B. DIG Easy
Hyb von der Firma Roche Diagnostics GmbH, Mannheim,
Deutschland, Catalog No. 1603558).
Anleitungen zur Amplifikation von DNA-Sequenzen mit Hilfe
der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) findet der Fachmann
unter anderem im Handbuch von Gait: OligonukleotideA: a
Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) und bei
Newton und Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag,
Heidelberg, Deutschland, 1994).
Bei der Arbeit an der vorliegenden Erfindung konnte
festgestellt werden, dass coryneforme Bakterien nach
Abschwächung des lipB-Gens in verbesserter Weise
Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, produzieren.
Zur Erzielung einer Abschwächung können entweder die
Expression des lipB-Gens oder die katalytischen
Eigenschaften des Enzymproteins herabgesetzt oder
ausgeschaltet werden. Gegebenenfalls können beide
Massnahmen kombiniert werden.
Die Verringerung der Genexpression kann durch geeignete
Kulturführung oder durch genetische Veränderung (Mutation)
der Signalstrukturen der Genexpression erfolgen.
Signalstrukturen der Genexpression sind beispielsweise
Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren,
Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen, das Startkodon und
Terminatoren. Angaben hierzu findet der Fachmann z. B. in
der Patentanmeldung WO 96/15246, bei Boyd und Murphy
(Journal of Bacteriology 170: 5949 (1988)), bei Voskuil und
Chambliss (Nucleic Acids Research 26: 3548 (1998), bei
Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191
(1998)), bei Pátek et al. (Microbiology 142: 1297 (1996)),
Vasicova et al. (Journal of Bacteriology 181: 6188 (1999))
und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und
Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers
("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag,
Stuttgart, Deutschland, 1995) oder dem von Winnacker ("Gene
und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland,
1990).
Mutationen, die zu einer Veränderung bzw. Herabsetzung der
katalytischen Eigenschaften von Enzymproteinen führen, sind
aus dem Stand der Technik bekannt; als Beispiele seien die
Arbeiten von Qiu und Goodman (Journal of Biological
Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Sugimoto et all
(Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61: 1760-1762
(1997)) und Möckel ("Die Threonindehydratase aus
Corynebacterium glutamicum: Aufhebung der allosterischen
Regulation und Struktur des Enzyms", Berichte des
Forschungszentrums Jülichs, Jül-2906, ISSN09442952, Jülich,
Deutschland, 1994) genannt. Zusammenfassende Darstellungen
können bekannten Lehrbüchern der Genetik und
Molekularbiologie wie z. B. dem von Hagemann ("Allgemeine
Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen
werden.
Als Mutationen kommen Transitionen, Transversionen,
Insertionen und Deletionen in Betracht. In Abhängigkeit von
der Wirkung des Aminosäureaustausches auf die
Enzymaktivität wird von Fehlsinnmutationen (missense
mutations) oder Nichtsinnmutationen (nonsense mutations)
gesprochen. Insertionen oder Deletionen von mindestens
einem Basenpaar (bp) in einem Gen führen zu
Rasterverschiebungsmutationen (frame shift mutations), in
deren Folge falsche Aminosäuren eingebaut werden oder die
Translation vorzeitig abbricht. Deletionen von mehreren
Kodonen führen typischerweise zu einem vollständigen
Ausfall der Enzymaktivität. Anleitungen zur Erzeugung
derartiger Mutationen gehören zum Stand der Technik und
können bekannten Lehrbüchern der Genetik und
Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers
("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag,
Stuttgart, Deutschland, 1995), dem von Winnacker ("Gene und
Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland,
1990) oder dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav
Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.
Eine gebräuchliche Methode, Gene von C. glutamicum zu
mutieren, ist die von Schwarzer und Pühler (Bio/Technology
9, 84-87 (1991)) beschriebene Methode der Gen-Unterbrechung
(gene disruption) und des Gen-Austauschs (gene
replacement).
Bei der Methode der Gen-Unterbrechung wird ein zentraler
Teil der Kodierregion des interessierenden Gens in einen
Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt (typischerweise
E. coli), nicht aber in C. glutamicum replizieren kann. Als
Vektoren kommen beispielsweise pSUP301 (Simon et al.,
Bio/Technology 1, 784-791 (1983)), pK18mob oder pK19mob
(Schäfer et al., Gene 145, 69-73 (1994)), pK18mobsacB oder
pK19mobsacB (Jäger et al., Journal of Bacteriology 174:
5462-65 (1992)), pGEM-T (Promega corporation, Madison, WI,
USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994). Journal of Biological
Chemistry 269: 32678-84; US-Patent 5,487,993), pCR®Blunt
(Firma Invitrogen, Groningen, Niederlande; Bernard et al.,
Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)) oder
pEM1 (Schrumpf et al. 1991, Journal of Bacteriology
173: 4510-4516) in Frage. Der Plasmidvektor, der das
zentrale Teil der Kodierregion des Gens enthält, wird
anschliessend durch Konjugation oder Transformation in den
gewünschten Stamm von C. glutamicum überführt. Die Methode
der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al.
(Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994))
beschrieben. Methoden zur Transformation sind
beispielsweise bei Thierbach et al. (Applied Microbiology
and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican und Shivnan
(Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) und Tauch et al. (FEMS
Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)) beschrieben.
Nach homologer Rekombination mittels eines "cross-over"-
Ereignisses wird die Kodierregion des betreffenden Gens
durch die Vektorsequenz unterbrochen und man erhält zwei
unvollständige Allele, denen jeweils das 3'- bzw. das 5'-
Ende fehlt. Diese Methode wurde beispielsweise von
Fitzpatrick et al. (Applied Microbiology and Biotechnology
42, 575-580 (1994)) zur Ausschaltung des recA-Gens von C.
glutamicum verwendet.
Bei der Methode des Genaustausches (gene replacement) wird
eine Mutation wie z. B. eine Deletion, Insertion oder
Basenaustausch in dem interessierenden Gen in-vitro
hergestellt. Das hergestellte Allel wird wiederum in einen
für C. glutamicum nicht replikativen Vektor kloniert und
dieser anschliessend durch Transformation oder Konjugation
in den gewünschten Wirt von C. glutamicum überführt. Nach
homologer Rekombination mittels eines ersten, Integration
bewirkenden "cross-over"-Ereignisses und eines geeigneten
zweiten, eine Exzision bewirkenden "cross-over"-Ereignisses
im Zielgen bzw. in der Zielsequenz erreicht man den Einbau
der Mutation bzw. des Allels. Diese Methode wurde
beispielsweise von Peters-Wendisch et al. (Microbiology 144,
915-927 (1998)) verwendet, um das pyc-Gen von C.
glutamicum durch eine Deletion auszuschalten.
In das lipB-Gen kann auf diese Weise eine Deletion,
Insertion oder ein Basenaustausch eingebaut werden.
Zusätzlich kann es für die Produktion von L-Aminosäuren,
insbesondere L-Lysin, vorteilhaft sein, zusätzlich zur
Abschwächung des lipE-Gens eines oder mehrere Enzyme des
jeweiligen Biosyntheseweges, der Glykolyse, der
Anaplerotik, des Zitronensäure-Zyklus, des Pentosephosphat-
Zyklus, des Aminosäure-Exports und gegebenenfalls
regulatorische Proteine zu verstärken, insbesondere
überzuexprimieren.
So kann beispielsweise für die Herstellung von L-Lysin
gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus
der Gruppe
- - das für die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende Gen dapA (EP-B 0 197 335),
- - das für die Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase kodierende Gen gap (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),
- - das für die Triosephosphat Isomerase kodierende Gen tpi (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),
- - das für die 3-Phosphoglycerat Kinase kodierende Gen pgk (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),
- - das für die Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase kodierende Gen zwf (JP-A-09224661),
- - das für die Pyruvat Carboxylase kodierende Gen pyc (DE-A-198 31 609),
- - das für eine feed back resistente Aspartatkinase kodierende Gen lysC (Kalinowski et al. (1990), Molecular and General Genetics 224, 317-324; Accession No. P26512), oder
- - das für die Malat-Chinon-Oxidoreduktase kodierende Gen mqo (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)), oder
- - das für den Lysin-Export kodierende Gen lysE (DE-A-195 48 222)
- - das für das Zwa1-Protein kodierende Gen zwa1 (DE: 199 59 328.0, DSM 13115)
verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.
Ausserdem kann es für die Produktion von Aminosäuren,
insbesondere L-Lysin, vorteilhaft sein, neben der
Abschwächung des lipB-Gens gleichzeitig eines oder mehrere
der Gene, ausgewählt aus der Gruppe
- - das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende Gen pck (DE 199 50 409.1, DSM 13047),
- - das für die Glucose-6-Phosphat Isomerase kodierende Gen pgi(US 09/396,478, DSM 12969),
- - das für die Pyruvat-Oxidase kodierende Gen poxB (DE: 199 51 975.7, DSM 13114)
- - das für das Zwa2-Protein kodierende Gen zwa2 (DE: 199 59 327.2, DSM 13113)
abzuschwächen.
Weiterhin kann es für die Produktion von Aminosäuren,
insbesondere L-Lysin vorteilhaft sein, neben der
Abschwächung des lipB-Gens unerwünschte Nebenreaktionen
auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing
Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products,
Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London,
UK, 1982).
Die erfindungsgemäss hergestellten Mikroorganismen sind
ebenfalls Gegenstand der Erfindung und können
kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren
(Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder
repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren)
zum Zwecke der Produktion von L-Aminosäuren, insbesondere
L-Lysin kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über
bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel
(Bioprozesstechnik 1. Einführung in die
Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart,
1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und
periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag,
Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
Das zu verwendende Kulturmedium muss in geeigneter Weise
den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen.
Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener
Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for
General Bacteriology" der American Society for Bacteriology
(Washington D. C., USA, 1981) enthalten. Als
Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z. B.
Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse,
Stärke und Cellulose, Öle und Fette, wie zum Beispiel
Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett,
Fettsäuren, wie zum Beispiel Palmitinsäure, Stearinsäure
und Linolsäure, Alkohole wie zum Beispiel Glycerin und
Ethanol und organische Säuren, wie zum Beispiel Essigsäure
verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als
Mischung verwendet werden.
Als Stickstoffquelle können organische Stickstoffhaltige
Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt,
Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff
oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat,
Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und
Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen
können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Als Phosphorquelle können Phosphorsäure,
Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder
die entsprechenden Natrium haltigen Salze verwendet werden.
Das Kulturmedium muss weiterhin Salze von Metallen
enthalten, wie zum Beispiel Magnesiumsulfat oder
Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind.
Schliesslich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren
und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen
eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies
geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten
Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen
Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der
Kultivierung zugefüttert werden.
Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen
wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak
beziehungsweise Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie
Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise
eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können
Antischaummittel, wie zum Beispiel Fettsäurepolyglykolester
eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von
Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende
Stoffe, wie zum Beispiel Antibiotika hinzugefügt werden. Um
aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff
oder Sauerstoff-haltige Gasmischungen, wie zum Beispiel
Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur
liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei
25°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis
sich ein Maximum des gewünschten Produktes gebildet hat.
Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis
160 Stunden erreicht.
Methoden zur Bestimmung von L-Aminosäuren sind aus dem
Stand der Technik bekannt. Die Analyse kann zum Beispiel so
wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958),
1190) beschrieben durch Anionenaustausch-Chromatographie
mit anschliessender Ninhydrin-Derivatisierung erfolgen,
oder sie kann durch reversed phase HPLC erfolgen, so wie
bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-
1174) beschrieben.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur
fermentativen Herstellung einer Aminosäure, ausgewählt aus
der Gruppe L-Asparagin, L-Threonin, L-Serin, L-Glutamat,
L-Glycin, L-Alanin, L-Cystein, L-Valin, L-Methicnin,
L-Isoleucin, L-Leucin, L-Tyrosin, L-Phenylalanin,
L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan und L-Arginin,
insbesondere L-Lysin, unter Verwendung von coryneformen
Bakterien, die insbesondere bereits eine oder mehrere der
genannten Aminosäuren produzieren.
Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von
Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Die Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli sowie
alle Techniken zur Restriktion, Klenow- und alkalische
Phosphatasebehandlung wurden nach Sambrook et al.
(Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring
Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA)
durchgeführt. Methoden zur Transformation von Escherichia
coli sind ebenfalls in diesem Handbuch beschrieben.
Die Zusammensetzung gängiger Nährmedien wie LB- oder
TY-Medium kann ebenfalls dem Handbuch von Sambrook et al.
entnommen werden.
Chromosomale DNA aus C. glutamicum ATCC 13032 wurde wie bei
Tauch et al., (1995, Plasmid 33: 168-179) beschrieben,
isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham
Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung
Sau3AI, Code no. 27-0913-02) partiell gespalten. Die
DNA-Fragmente wurden mit shrimp alkalischer Phosphatase
(Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland,
Produktbeschreibung SAP, Code no. 1758250)
dephosphoryliert. Die DNA des Cosmid-Vektors SuperCosl
(Wahl et al. (1987), Proceedings of the National Academy of
Sciences, USA 84: 2160-2164), bezogen von der Firma
Stratagene (La Jolla, USA, Produktbeschreibung SuperCos1
Cosmid Vektor Kit, Code no. 251301) wurde mit dem
Restriktionsenzym XbaI (Amersham Pharmacia, Freiburg,
Deutschland, Produktbeschreibung XbaI, Code no. 27-0948-02)
gespalten und ebenfalls mit shrimp alkalischer Phosphatase
dephosphoryliert.
Anschliessend wurde die Cosmid-DNA mit dem
Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg,
Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Code no.
27-0868-04) gespalten. Die auf diese Weise behandelte
Cosmid-DNA wurde mit der behandelten ATCC13032-DNA gemischt
und der Ansatz mit T4-DNA-Ligase (Amersham Pharmacia,
Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase,
Code no. 27-0870-04) behandelt. Das Ligationsgemisch wurde
anschliessend mit Hilfe des Gigapack II XL Packing Extracts
(Stratagene, La Jolla, USA, Produktbeschreibung Gigapack II
XL Packing Extract, Code no. 200217) in Phagen verpackt.
Zur Infektion des E. coli Stammes NM554 (Raleigh et al.
1988, Nucleic Acid Res. 16: 1563-1575) wurden die Zellen in
10 mM MgSO4 aufgenommen und mit einem Aliquot der
Phagensuspension vermischt. Infektion und Titerung der
Cosmidbank wurden wie bei Sambrook et al. (1989, Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor)
beschrieben durchgeführt, wobei die Zellen auf LB-Agar
(Lennox, 1955, Virology, 1: 190) + 100 µg/ml Ampicillin
ausplattiert wurden. Nach Inkubation über Nacht bei 37°C
wurden rekombinante Einzelklone selektioniert.
Die Cosmid-DNA einer Einzelkolonie wurde mit dem Qiaprep
Spin Miniprep Kit (Product No. 27106, Qiagen, Hilden,
Germany) nach Herstellerangaben isoliert und mit dem
Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg,
Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Product No.
27-0913-02) partiell gespalten. Die DNA-Fragmente wurden
mit shrimp alkalischer Phosphatase (Roche Molecular
Biochemicals, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung
SAP, Product No. 1758250) dephosphoryliert. Nach
gelelektrophoretischer Auftrennung erfolgte die Isolierung
der Cosmidfragmente im Grössenbereich von 1500 bis 2000 bp
mit dem QiaExII Gel Extraction Kit (Product No. 20021,
Qiagen, Hilden, Germany).
Die DNA des Sequenziervektors pZero-1 bezogen von der Firma
Invitrogen (Groningen, Niederlande, Produktbeschreibung
Zero Background Cloning Kit, Product No. K2500-01) wurde
mit dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia,
Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Product
No. 27-0868-04) gespalten. Die Ligation der Cosmidfragmente
in den Sequenziervektor pZero-1 wurde wie von Sambrook et
al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei das
DNA-Gemisch mit T4-Ligase (Pharmacia Biotech, Freiburg,
Deutschland) über Nacht inkubiert wurde. Dieses
Ligationsgemisch wurde anschliessend in den E. coli Stamm
DH5αMCR (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy
of Sciences, U. S. A., 87: 4645-4649) elektroporiert (Tauch et
al. 1994, FEMS Microbiol Letters, 123: 343-7) und auf
LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) mit 50 µg/ml Zeocin
ausplattiert.
Die Plasmidpräparation der rekombinanten Klone erfolgte mit
dem Biorobot 9600 (Product No. 900200, Qiagen, Hilden,
Deutschland). Die Sequenzierung erfolgte nach der
Dideoxy-Kettenabbruch-Methode von Sanger et al. (1977,
Proceedings of the National Academies of Sciences, U. S. A.,
74: 5463-5467) mit Modifikationen nach Zimmermann et al.
(1990, Nucleic Acids Research, 18: 1067). Es wurde der "RR
dRhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit" von PE Applied
Biosystems(Product No. 403044, Weiterstadt, Deutschland)
verwendet. Die gelelektrophoretische Auftrennung und
Analyse der Sequenzierreaktion erfolgte in einem
"Rotiphorese NF Acrylamid/Bisacrylamid" Gel (29 : 1) (Product
No. A124.1, Roth, Karlsruhe, Germany) mit dem "ABI Prism
377" Sequenziergerät von PE Applied Biosystems
(Weiterstadt, Deutschland).
Die erhaltenen Roh-Sequenzdaten wurden anschliessend unter
Anwendung des Staden-Programpakets (1986, Nucleic: Acids
Research, 14: 217-231) Version 97-0 prozessiert. Die
Einzelsequenzen der pZero1-Derivate wurden zu einem
zusammenhängenden Contig assembliert. Die computergestützte
Kodierbereichsanalyse wurden mit dem Programm XNIP (Staden,
1986, Nucleic Acids Research, 14: 217-231) angefertigt.
Weitere Analysen wurden mit den "BLAST search pro grams"
(Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research,
25: 33893402) gegen die non-redundant Datenbank des
"National Center for Biotechnology Information" (NCBI,
Bethesda, MD, USA) durchgeführt.
Die erhaltene Nukleotidsequenz ist in SEQ ID No. 1
dargestellt. Die Analyse der Nukleotidsequenz ergab ein
offenes Leseraster von 804 bp, welches als lipB-Gen
bezeichnet wurde. Das lipB-Gen kodiert für ein Polypeptid
von 269 Aminosäuren.
Claims (17)
1. Isoliertes Polynukleotid aus coryneformen Bakterien,
enthaltend eine für das lipB-Gen kodierende
Polynukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe
- a) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2 enthält,
- b) Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens zu 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2,
- c) Polynukleotid, das komplementär ist zu den Polynukleotiden von a) oder b), und
- d) Polynukleotid, enthaltend mindestens 15
aufeinanderfolgende Nukleotide der
Polynukleotidsequenz von a), b), oder c),
wobei das Polypeptid bevorzugt die Aktivität der Lipoprotein-Ligase B aufweist.
2. Polynukleotide gemäss Anspruch 1, wobei das
Polynukleotid eine in coryneformen Bakterien
replizierbare, bevorzugt rekombinante DNA ist.
3. Polynukleotide gemäss Anspruch 1, wobei das
Polynukleotid eine RNA ist.
4. Polynukleotid gemäss Anspruch 2, enthaltend die
Nukleinsäuresequenz wie in SEQ ID No. 1 dargestellt.
5. Replizierbare DNA gemäss Anspruch 2 enthaltend
- a) die Nukleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID No. 1, oder
- b) mindestens eine Sequenz, die der Sequenz (i) innerhalb des Bereichs der Degeneration des genetischen Kodes entspricht, oder
- c) mindestens eine Sequenz, die mit den zu den Sequenzen (i) oder (ii) komplementären Sequenzen hybridisiert, und gegebenenfalls
- d) funktionsneutrale Sinnmutationen in (i).
6. Verfahren gemäss Anspruch 5,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Hybridisierung unter einer Stringenz
entsprechend höchstens 2x SSC durchgeführt wird.
7. Polynukleotidsequenz gemäss Anspruch 2, die für ein
Polypeptid kodiert, das die in SEQ ID No. 2
dargestellte Aminosäuresequenz enthält.
8. Coryneforme Bakterien, in denen das lipE-Gen
abgeschwächt, bevorzugt ausgeschaltet wird.
9. Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren,
insbesondere L-Lysin,
dadurch gekennzeichnet, dass man
folgende Schritte durchführt,
- a) Fermentation der die gewünschte L-Aminosäure produzierenden coryneformen Bakterien, in denen man zumindest das lipB-Gen abschwächt,
- b) Anreicherung des gewünschten Produkts im Medium oder in den Zellen der Bakterien, und
- c) Isolieren der L-Aminosäure.
10. Verfahren gemäss Anspruch 9,
dadurch gekennzeichnet,
dass man Bakterien einsetzt, in denen man zusätzlich
weitere Gene des Biosyntheseweges der gewünschten
L-Aminosäure verstärkt.
11. Verfahren gemäss Anspruch 9,
dadurch gekennzeichnet,
dass man Bakterien einsetzt, in denen die
Stoffwechselwege zumindest teilweise ausgeschaltet
sind, die die Bildung der gewünschten L-Aminosäure
verringern.
12. Verfahren gemäss Anspruch 9,
dadurch gekennzeichnet,
dass man die Expression des (der) Polynukleotids(e),
das (die) für das lipB-Gen kodiert (kodieren)
verringert, insbesondere ausschaltet.
13. Verfahren gemäss Anspruch 9,
dadurch gekennzeichnet,
dass man die regulatorischen Eigenschaften des
Polypeptids herabsetzt, für das das Polynukieotid lipB
kodiert.
14. Verfahren gemäss Anspruch 9,
dadurch gekennzeichnet,
dass man für die Herstellung von L-Aminosäuren,
insbesondere L-Lysin, Bakterien fermentiert, in denen
man gleichzeitig eines oder mehrere der Gene,
ausgewählt aus der Gruppe
- 1. 14.1 das für die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende Gen dapA,
- 2. 14.2 das für die Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase kodierende Gen gap,
- 3. 14.3 das für die Triosephosphat Isomerase kodierende Gen tpi,
- 4. 14.4 das für die 3-Phosphoglycerat Kinase kodierende Gen pgk,
- 5. 14.5 das für die Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase kodierende Gen zwf,
- 6. 14.6 das für die Pyruvat-Carboxylase kodierende Gen pyc,
- 7. 14.7 das für eine feed back resistente Aspartatkinase kodierende Gen lysC,
- 8. 14.8 das für die Malat-Chinon-Oxidoreduktase kodierende Gen mqo,
- 9. 14.9 das für den Lysin-Export kodierende Gen lysE
- 10. 14.10 das für das Zwa1-Protein kodierende Gen zwa1
15. Verfahren gemäss Anspruch 9,
dadurch gekennzeichnet,
dass man gleichzeitig eines oder mehrere der Gene,
ausgewählt aus der Gruppe:
- 1. 15.1 das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende Gen pck,
- 2. 15.2 das für die Glucose-6-Phosphat Isomerase kodierende Gen pgi,
- 3. 15.3 das für die Pyruvat-Oxidase kodierende Gen poxB
- 4. 15.4 das für das Zwa2-Protein kodierende Gen zwa2 abschwächt.
16. Verfahren gemäss einem oder mehreren der
vorhergehenden
Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
dass man Mikroorganismen der Gattung Corynebacterium
einsetzt.
17. Verfahren zum Auffinden von RNA, cDNA und DNA, um
Nukleinsäuren, beziehungsweise Polynukleotide oder
Gene zu isolieren, die für die Lipoprotein-Ligase B
kodieren oder eine hohe Ähnlichkeit mit der Sequenz
des lipE-Gens aufweisen,
dadurch gekennzeichnet,
dass man die Polynukleotide, enthaltend die Sequenzen
gemäss den Ansprüchen 1 bis 4 als
Hybridisierungssonden einsetzt.
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DE10042739A DE10042739A1 (de) | 2000-08-31 | 2000-08-31 | Neue für das lipB-Gen kodierende Nukleotidsequenzen |
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