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Gebiet der Erfindung
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Die
Beschreibung stellt Nukleotidsequenzen aus coryneformen Bakterien
bereit, die für
das dep34-Gen kodieren und die Erfindung stellt ein Verfahren zur
fermentativen Herstellung von L-Lysin unter Verwendung von Bakterien
bereit, in denen das dep34-Gen eliminiert ist.
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Stand der Technik
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L-Aminosäuren, insbesondere
L-Lysin, werden in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen
Industrie, in der Nahrungsmittelindustrie und vor allem in der Tierernährung verwendet.
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Es
ist bekannt, dass Aminosäuren
durch Fermentation aus Stämmen
coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum,
hergestellt werden. Aufgrund ihrer großen Bedeutung wird beständig daran
gearbeitet, die Herstellungsverfahren zu verbessern. Verbesserungen
des Verfahrens können
sich auf die Fermentationsmaßnahmen
beziehen, wie zum Beispiel Rühren
und Sauerstoffzufuhr, oder auf die Zusammensetzung der Nährmedien,
wie zum Beispiel die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder
auf die Aufarbeitung zur Produktform, zum Beispiel durch Ionenaustauschchromatographie,
oder auf die inneren Output-Eigenschaften des Mikroorganismus selbst.
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Methoden
zur Mutagenese, Selektion und Mutantenselektion werden verwendet,
um die Outputeigenschaften dieser Mikroorganismen zu verbessern.
Stämme,
die gegen Antimetaboliten resistent sind oder für Metaboliten von regulatorischer
Bedeutung auxotroph sind, und Aminosäuren produzieren, werden auf diese Weise
erhalten.
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Methoden
der DNA-Rekombinantionstechnik wurden ebenfalls einige Jahre lang
benutzt, um den Stamm der Corynebacterium-Stämme zu verbessern, die L-Aminosäure produzieren,
indem einzelne Aminosäuren-Biosynthesegene
amplifiziert wurden und die Wirkung auf die Aminosäureproduktion
erforscht wurde.
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Aufgabe der Erfindung
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Die
Erfinder hatten zur Aufgabe, neue Maßnahmen für die verbesserte fermentative
Herstellung von L-Lysin bereitzustellen.
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Kurzdarstellung der Erfindung
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Wenn
im folgenden L-Lysin oder Lysin erwähnt wird, sind damit nicht
nur die Basen sondern auch die Salze, wie z. B. Lysinmonohydrochlorid
oder Lysinsulfat gemeint.
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Die
Beschreibung stellt ein isoliertes Polynukleotid aus coryneformen
Bakterien bereit, das eine Polynukleotidsequenz umfasst, die für das dep34-Gen
kodiert, ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus
- a) Polynukleotid,
das bis zu einem Umfang von mindestens 70 % mit einem Polynukleotid
identisch ist, das für
ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ-ID-Nr. 2
umfasst,
- b) Polynukleotid, das für
ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die bis
zu einem Umfang von mindestens 70 % mit der Aminosäuresequenz
von SEQ-ID-Nr. 2 identisch ist,
- c) Polynukleotid, das komplementär zu den Polynukleotiden aus
a) oder b) ist, und
- d) Polynukleotid, das mindestens 15 aufeinander folgende Nukleotide
der Polynukleotidsequenz aus a), b) oder c) umfasst,
wobei
das Polypeptid bevorzugt die Aktivität des Effluxproteins Dep34
aufweist.
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Die
Beschreibung stellt ebenfalls das oben genannte Polynukleotid bereit,
wobei dieses bevorzugt eine DNA ist, die zur Replikation fähig ist,
umfassend:
- (i) die Nukleotidsequenz, die in
SEQ-ID-Nr. 1 gezeigt wird, oder
- (ii) mindestens eine Sequenz, die der Sequenz (i) innerhalb
des Degenerationsbereichs des genetischen Codes entspricht, oder
- (iii) mindestens eine Sequenz, die mit den Sequenzen hybridisiert,
die zu den Sequenzen (i) oder (ii) komplementär sind, und optional
- (iv) Sinnmutationen neutraler Funktion in (i).
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Die
Beschreibung stellt ebenfalls bereit:
ein Polynukleotid, insbesondere
DNA, die zur Replikation fähig
ist, und die Nukleotidsequenz, wie in SEQ-ID-Nr. 1 gezeigt, umfasst;
ein
Polynukleotid, das für
ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz, wie in SEQ-ID-Nr.
2 gezeigt, umfasst;
Die Erfindung stellt bereit:
Einen
Vektor, dessen Restriktionskarte in 1 reproduziert
ist,
und coryneforme Bakterien, bei denen das dep34-Gen, insbesondere
durch eine Insertion oder Deletion, eliminiert ist.
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Die
Beschreibung stellt ebenfalls Polynukleotide bereit, die im Wesentlichen
eine Polynukleotidsequenz umfassen, die erhältlich sind durch Screenen
mittels Hybridisierung einer entsprechenden Genbank eines coryneformen
Bakteriums, die das vollständige
Gen oder Teile davon umfasst, mit einer Sonde, die die Sequenz des
Polynukleotids gemäß der Erfindung
gemäß SEQ-ID-Nr.
1 oder einem Fragment davon umfasst, und die Isolierung der erwähnten Polynukleotidsequenz.
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Ausführliche Beschreibung der Erfindung
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Polynukleotide,
die die Sequenzen gemäß der Beschreibung
umfassen, sind als Hybridisierungssonden für RNA, cDNA und DNA geeignet,
um in voller Länge
Nukleinsäuren
oder Polynukleotide oder Gene zu isolieren, die für das Effluxprotein
Dep34 kodieren oder jene Nukleinsäuren oder Polynukleotide oder
Gene zu isolieren, die eine starke Ähnlichkeit mit der Sequenz
des dep34-Gens aufweisen. Sie sind auch zur Inkorporation in so
genannte "Arrays", "Mikroarrays" oder "DNA-Chips" geeignet, um die
entsprechenden Polynukleotide nachzuweisen und zu bestimmen.
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Polynukleotide,
die die Sequenzen gemäß der Beschreibung
umfassen, sind ferner als Primer geeignet, mit deren Hilfe die DNA
von Genen, die für
das Effluxprotein Dep34 kodieren, durch die Polymerasekettenreaktion
(PCR) hergestellt werden können.
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Solche
Oligonukleotide, die als Sonden oder Primer dienen, umfassen mindestens
25, 26, 27, 28, 29 oder 30, bevorzugt mindestens 20, 21, 22, 23
oder 24, ganz besonders bevorzugt mindestens 15, 16, 17, 18 oder
19 aufeinander folgende Nukleotide.
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Oligonukleotide
mit einer Länge
von mindestens 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 oder 40, oder
mindestens 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 oder 50 Nukleotiden
sind auch geeignet.
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Oligonukleotide
mit einer Länge
von mindestens 100, 150, 200, 250 oder 300 Nukleotiden sind optional
auch geeignet.
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"Isoliert" bedeutet aus seiner
natürlichen
Umgebung separiert.
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"Polynukleotid" bezieht sich im
Allgemeinen auf Polyribonukleotide und Polydeoxyribonukleotide,
wobei es möglich
ist, dass diese nicht modifizierte RNA oder DNA oder modifizierte
RNA oder DNA sind.
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Die
Polynukleotide gemäß der Beschreibung
beinhalten ein Polynukleotid gemäß SEQ-ID-Nr.
1 oder ein Fragment, das daraus hergestellt wurde, und auch jene,
die mindestens 70 % bis 80 %, bevorzugt mindestens 81 % bis 85%,
besonders bevorzugt mindestens 86 % bis 90 %, und ganz besonders
bevorzugt mindestens 91 %, 93 %, 95 %, 97 % oder 99 % identisch
sind mit dem Polynukleotid gemäß SEQ-ID-Nr.
1 oder einem Fragment, das daraus hergestellt wurde.
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"Polypeptide" sind in der Bedeutung
von Peptiden oder Proteinen zu verstehen, die zwei oder mehr Aminosäuren umfassen,
die über
Peptidbindungen verbunden sind.
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Die
Polypeptide gemäß der Erfindung
beinhalten ein Polypeptid gemäß SEQ-ID-Nr.
2, insbesondere jene mit der biologischen Aktivität des Effluxproteins
Dep34 und auch jene, die mindestens 70% bis 80%, bevorzugt mindestens
81% bis 85%, besonders bevorzugt mindestens 86% bis 90% und ganz
besonders bevorzugt mindestens 91%, 93%, 95%, 97% oder 99% identisch
mit dem Polypeptid gemäß SEQ-ID-Nr.
2 sind und die erwähnte
Aktivität
aufweisen.
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Die
Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur fermentativen Herstellung
coryneformer Bakterien, die insbesondere bereits L-Lysin produzieren
und in denen Nukleotidsequenzen, die für das dep34-Gen kodieren, eliminiert
sind.
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Der
Begriff "Attenuation" beschreibt in diesem
Zusammenhang die Verringerung oder Elimination der intrazellulären Aktivität eines
oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die von
der entsprechenden DNA kodiert sind, zum Beispiel unter Verwendung
eines schwachen Promoters oder unter Verwendung eines Gens oder
Allels, das für
ein entsprechendes Enzym mit einer geringen Aktivität kodiert,
oder das entsprechende Gen oder Enzym (Protein) deaktiviert, und
optional die Kombination dieser Maßnahmen.
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Durch
Attenuationsmaßnahmen
wird die Aktivität
oder Konzentration des entsprechenden Proteins im Allgemeinen auf
0 bis 75%, 0 bis 50%, 0 bis 25%, 0 bis 10% oder 0 bis 5% der Aktivität oder Konzentration des
Wildtyp-Proteins oder der Aktivität oder Konzentration des Proteins
im Ausgangsmikroorganismus reduziert.
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Die
Mikroorganismen, die von der vorliegenden Erfindung bereitgestellt
werden, können
Aminosäuren aus
Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Zellulose
oder aus Glycerol und Ethanol herstellen. Sie können Repräsentanten coryneformer Bakterien,
insbesondere der Gattung Corynebacterium sein. Aus der Gattung Corynebacterium
kann insbesondere die Spezies Corynebacterium glutamicum erwähnt werden,
die unter Experten für
ihre Fähigkeit,
L-Lysin zu produzieren, bekannt ist.
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Geeignete
Stämme
der Gattung Corynebacterium, insbesondere der Spezies Corynebacterium
glutamicum (C. glutamicum), sind insbesondere die bekannten Wildtyp-Stämme
Corynebacterium
glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium
acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Corynebacterium
thermoaminogenes FERM BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium
lactofermentum ATCC13869 and
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
und
L-Lysin-produzierende Mutanten oder Stämme, die daraus hergestellt
werden.
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Das
neue dep34-Gen aus C. glutamicum, das für das Effluxprotein Dep34 kodiert,
wurde isoliert.
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Um
das dep34-gen oder auch andere Gene aus C. glutamicum zu isolieren,
wird zuerst eine Genbank dieses Mikroorganismus in Escherichia coli
(E. coli) aufgebaut. Der Aufbau von Genbanken wird in allgemein bekannten
Lehr- und Handbüchern
beschrieben. Das Lehrbuch von Winnacker: Gene und Klone, Eine Einführung in
die Gentechnologie [Genes and Clones, An Introduction to Genetic
Engineering] (Verlag Chemie, Weinheim, Germany, 1990), oder das
Handbuch von Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 1989) können als Beispiel erwähnt werden.
Eine gut bekannte Genbank ist die des E.-coli-K-l2-Stamms W3110,
der in λ-Vektoren
von Kohara et al. (Cell 50, 495–508
(1987)) aufgebaut wurde. Bathe et al. (Molecular and General Genetics,
252: 255–265,
1996) beschreiben eine Genbank von C. glutamicum ATCC13032, die
mit Hilfe des Cosmidvektors SuperCos1 (Wahl et al., 1987, Proceedings of
the National Academy of Sciences USA, 84: 2160–2164) im E.-coli-K-12-Stamm NM554
(Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16: 1563–1575) aufgebaut
wurde.
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Börmann et
al. (Molecular Microbiology 6 (3), 317–326)) (1992)) beschreiben
ihrerseits eine Genbank von C. glutamicum ATCC13032 unter Verwendung
des Cosmids pHC79 (Hohn and Collins, 1980, Gene 11, 291–298).
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Um
eine Genbank von C. glutamicum in E. coli herzustellen, ist es auch
möglich,
Plasmide zu verwenden, wie etwa pBR322 (Bolivar, 1979, Life Sciences,
25, 807–818)
oder pUC9 (Vieira et al., 1982, Gene, 19: 259–268). Geeignete Wirte sind
insbesondere jene E.-coli-Stämme,
die restriktions- und rekombinationsdefektiv sind, wie zum Beispiel
der Stamm DH5αmcr,
der von Grant et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences
USA, 87 (1990) 4645–4649)
beschrieben wurde. Die langen DNA-Fragmente, die mit Hilfe von Cosmiden
oder anderen λ-Vektoren
kloniert werden, können
ihrerseits subkloniert und anschließend in den üblichen
Vektoren sequenziert werden, die zur DNA-Sequenzierung geeignet
sind, z. B. von Sanger et al. (Proceedings of the National Academy
of Sciences of the United States of America, 74: 5463–5467, 1977)
beschrieben.
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Die
resultierenden DNA-Sequenzen können
dann mit bekannten Algorithmen oder Sequenzanalyseprogrammen erforscht
werden, wie z. B. das von Staden (Nucleic Acids Research 14, 217–232 (1986)),
das von Marck (Nucleic Acids Research 16, 1829–1836 (1988)) oder das GCG-Programm
von Butler (Methods of Biochemical Analysis 39, 74–97 (1998)).
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Die
DNA-Sequenz von C. glutamicum, die für das dep34-Gen kodiert, und die als SEQ-ID-Nr.
1 Bestandteil der vorliegenden Beschreibung ist, wurde gezeigt.
Ferner wurde die Aminosäuresequenz
des entsprechenden Proteins aus der vorliegenden DNA-Sequenz durch
die oben beschriebenen Methoden abgeleitet. Die resultierende Aminosäuresequenz
des dep34-Genprodukts wird in SEQ-ID-Nr. 2 gezeigt.
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Kodierende
DNA-Sequenzen, die aus SEQ-ID-Nr. 1 durch Degeneration des genetischen
Codes resultieren, sind ebenfalls Bestandteil der Beschreibung.
Auf die gleiche Weise sind DNA-Sequenzen, die mit SEQ-ID-Nr. 1 oder
Teilen von SEQ-ID-Nr. 1 hybridisieren, ein Bestandteil der Beschreibung.
Herkömmliche Aminosäureaustausche, wie
z. B. der Austausch von Glycin für
Alanin oder von Asparaginsäure
für Glutaminsäure in Proteinen,
sind ferner unter Fachleuten als "Sinnmutationen" bekannt, die nicht zu einer grundlegenden
Veränderung
der Aktivität
des Proteins führen,
d. h. dass sie von neutraler Funktion sind. Es ist ferner bekannt,
dass Veränderungen
am N- und/oder C-Terminus eines Proteins dessen Funktion nicht wesentlich
beeinträchtigen
können
oder sie sogar stabilisieren können.
Informationen in diesem Kontext kann der Fachmann unter anderem
in Ben-Bassat et
al. (Journal of Bacteriology 169: 751–757 (1987)), in O'Regan et al. (Gene
77: 237–251
(1989)), in Sahin-Toth et al. (Protein Sciences 3: 240–247 (1994)),
in Hochuli et al. (Bio/Technology 6: 1321–1325 (1988)) und in bekannten
Lehrbüchern
zu Genetik und Molekularbiologie finden. Aminosäuresequenzen, die auf entsprechende
Weise aus SEQ-ID-Nr. 2 resultieren, sind ebenfalls Bestandteil der
Beschreibung.
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Auf
die gleiche Weise sind DNA-Sequenzen, die mit SEQ-ID-Nr. 1 oder Teilen
von SEQ-ID-Nr. 1 hybridisieren, ein Bestandteil der Beschreibung.
Schließlich
sind DNA-Sequenzen,
die durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung von
Primer hergestellt werden, die aus SEQ-ID-Nr. 1 resultieren, ein
Bestandteil der Beschreibung. Solche Oligonukleotide haben typischerweise
eine Länge
von mindestens 15 Nukleotiden.
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Anleitungen
zur Identifikation von DNA-Sequenzen mittels Hybridisierung kann
der Fachmann unter anderem in dem Handbuch "The DIG System Users Guide for Filter
Hybridization" von
Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) und in Liebl
et al. (International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255–260 (1991))
finden. Die Hybridisierung findet unter stringenten Bedingungen
statt, das heißt
also, dass nur Hybride gebildet werden, in denen die Sonden- und
Targetsequenz, d. h. die Polynukleotide, die mit der Sonde behandelt
wurden, mindestens 70% identisch sind. Es ist bekannt, dass die
Stringenz der Hybridisierung, einschließlich der Waschschritte, durch
die Variation der Pufferzusammensetzung, der Temperatur und der
Salzkonzentration beeinflusst oder bestimmt wird.
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Die
Hybridisierungsreaktion wird bevorzugt unter einer, verglichen mit
den Waschschritten, relativ niedrigen Stringenz durchgeführt (Hybaid
Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996).
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Ein
5 × SSC-Puffer
bei einer Temperatur von ungefähr
50 °C bis
68 °C kann
zum Beispiel für
die Hybridisierungsreaktion benutzt werden. Sonden können hier
ebenfalls mit Polynukleotiden hybridisieren, die weniger als 70%
mit der Sequenz der Sonde identisch sind. Solche Hybride sind weniger
stabil und werden unter stringenten Bedingungen durch Waschen entfernt.
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Dies
kann zum Beispiel durch Absenken der Salzkonzentration auf 2 × SSC und
optional anschließend auf
0,5 × SSC
(The DIG System User's
Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland,
1995) erreicht werden, wobei eine Temperatur von ungefähr 50 °C bis 68 °C etabliert
wird. Es ist optional möglich,
die Salzkonzentration auf 0,1 × SSC
zu senken. Polynukleotidfragmente, die Zum Beispiel mindestens 70%
oder mindestens 80% oder mindestens 90% bis 95% identisch mit der
Sequenz der benutzten Sonde sind, können isoliert werden, indem
die Hybridisierungstemperatur schrittweise von 50 °C auf 68 °C, in Schritten
von ungefähr
1 bis 2 °C,
erhöht
wird. Weitere Anleitungen zur Hybridisierung sind in Form so genannter
Kits auf dem Markt erhältlich
(z. B. DIG Easy Hyb von Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland,
Katalog-Nr. 1603558).
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Anleitungen
zur Amplifikation von DNA-Sequenzen mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion
(PCR) kann der Fachmann unter anderem in dem Handbuch von Gait:
Oligonukleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford,
UK, 1984) and in Newton and Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag,
Heidelberg, Deutschland, 1994) finden.
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Es
wurde herausgefunden, dass coryneforme Bakterien L-Lysin nach der Elimination
des dep34-Gens auf verbesserte Weise produzieren.
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Um
eine Elimination zu erreichen können
entweder die Expression des dep34-Gens oder die katalytischen Eigenschaften
des Enzymproteins eliminiert werden. Die beiden Maßnahmen
können
optional kombiniert werden.
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Die
Reduktion der Genexpression kann durch geeignete Kultivierung oder
durch genetische Modifikation (Mutation) der Signalstrukturen der
Genexpression stattfinden. Signalstrukturen der Genexpression sind zum
Beispiel Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promoter, Attenuatoren,
Ribosomen-Bindungsstellen, der Startcodon und Terminatoren.
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Der
Fachmann kann Informationen dazu z. B. in der Patentanmeldung
WO 96/15246 , in Boyd and Murphy
(Journal of Bacteriology 170: 5949 (1988)), in Voskuil and Chambliss
(Nucleic Acids Research 26: 3548 (1998), in Jensen and Hammer (Biotechnology
and Bioengineering 58: 191 (1998)), in Patek et al. (Microbiology
142: 1297 (1996)), Vasicova et al. (Journal of Bacteriology 181:
6188 (1999)) und in bekannten Lehrbüchern zur Genetik und Molekularbiologie,
wie z. B. das Lehrbuch von Knippers ("Molekulare Genetik [Molecular Genetics]", 6. Auflage, Georg
Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995) oder das von Winnacker ("Gene und Klone [Genes
and Clones]", VCH
Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) finden.
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Mutationen,
die zu einer Veränderung
oder Reduktion der katalytischen Eigenschaften von Enzymproteinen
führen,
sind auf dem Stand der Technik bekannt; Beispiele, die erwähnt werden
können,
sind die Arbeiten von Qiu and Goodman (Journal of Biological Chemistry
272: 8611–8617
(1997)), Sugimoto et al. (Bioscience Biotechnology and Biochemistry
61: 1760–1762
(1997)) und Möckel
("Die Threonindehydratase
aus Corynebacterium glutamicum: Aufhebung der allosterischen Regulation
und Struktur des Enzyms [Threonine dehydratase from Corynebacterium
glutamicum: Canceling the allosteric regulation and structure of
the enzyme]", Reports
from the Jülich
Research Center, Jul-2906, ISSN09442952, Jülich, Deutschland, 1994). Zusammenfassende
Beschreibungen können
in bekannten Lehrbüchern
zur Genetik und Molekularbiologie gefunden werden, wie z. B. das
von Hagemann ("Allgemeine
Genetik [General Genetics]",
Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986).
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Mögliche Mutationen
sind Transitionen, Transversionen, Insertionen und Deletionen. Abhängig von der
Wirkung des Aminosäureaustauschs
auf die Enzymaktivität
beziehen sich "Fehlsinnmutationen" oder "Nichtsinnmutationen" darauf.
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Insertionen
oder Deletionen mindestens eines Basenpaars (bp) in einem Gen führen zu
Rasterverschiebungsmutationen, in deren Folge unrichtige Aminosäuren inkorporiert
werden, oder die Translation vorzeitig unterbrochen wird. Deletionen
mehrerer Codone führen
typischerweise zu einem vollständigen
Verlust der Enzymaktivität.
Anleitungen zur Erzeugung solcher Mutationen sind Stand der Technik
sind in bekannten Lehrbüchern
zur Genetik und Molekularbiologie zu finden, wie z. B. dem Lehrbuch
von Knippers ("Molekulare Genetik
[Molecular Genetics]",
6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995),
dem von Winnacker ("Gene
und Klone [Genes and Clones]",
VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) oder dem von
Hagemann ("Allgemeine
Genetik [General Genetics]",
Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986).
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Eine übliche Methode
zum Mutieren von Genen von C. glutamicum ist eine Methode der "Genunterbrechung" und des "Genersatzes", die von Schwarzer
and Pühler
(Bio/Technology 9, 84–87
(1991)) beschrieben wird.
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Bei
der Methode der Genunterbrechung wird ein zentraler Teil der kodierenden
Region des interessierenden Gens in einen Plasmidvektor geklont,
der sich in einem Wirt (typischerweise E. coli), aber nicht in C. glutamicum,
replizieren kann. Mögliche
Vektoren sind zum Beispiel pSUP301 (Simon et al., Bio/Technology
1, 784–791
(1983)), pK18mob oder pK19mob (Schäfer et al., Gene 145, 69–73 (1994)),
pK18mobsacB oder pK19mobsacB (Jäger
et al., Journal of Bacteriology 174: 5462–65 (1992)), pGEM-T (Promega
corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994). Journal of Biological
Chemistry 269: 32678–84;
US-Patentschrift 5,487,993 ),
pCR
®Blunt
(Invitrogen, Groningen, Holland; Bernard et al., Journal of Molecular
Biology, 234: 534–541
(1993)) oder pEM1 (Schrumpf et al, 1991, Journal of Bacteriology
173: 4510–4516).
Der Plasmidvektor, der den zentralen Teil der kodierenden Region
des Gens enthält,
wird dann in den gewünschten Stamm
von C. glutamicum durch Konjugation oder Transformation transferiert.
Das Verfahren der Konjugation wird zum Beispiel von Schäfer et al.
(Applied and Environmental Microbiology 60, 756–759 (1994)) beschrieben. Methoden
zur Transformation werden zum Beispiel von Thierbach et al. (Applied
Microbiology and Biotechnology 29, 356–362 (1988)), Dunican and Shivnan
(Bio/Technology 7, 1067–1070
(1989)) und Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343–347 (1994))
beschrieben. Nach homologer Rekombination mittels eines "Crossing-over-Ereignisses", wird die kodierende
Region des fraglichen Gens durch die Vektorsequenz unterbrochen,
und es werden zwei unvollständige
Allele erhalten, wobei einem das 3'-Ende und dem anderen das 5'-Ende fehlt. Diese
Methode wurde zum Beispiel von Fitzpatrick et al. (Applied Microbiology
and Biotechnology 42, 575–580
(1994)) verwendet, um das recA-Gen von C. glutamicum zu eliminieren.
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Bei
der Methode des "Genersatzes" wird eine Mutation,
wie z. B. eine Deletion, Insertion oder ein Hasenaustausch in vitro
in dem interessierenden Gen etabliert. Das hergestellte Allel wird
seinerseits in einen Vektor kloniert, der für C. glutamicum nicht replikativ
ist, und dieser wird dann in den gewünschten Wirt von C. glutamicum
durch Transformation oder Konjugation tranferiert.
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Nach
homologer Rekombination mittels eines ersten "Crossing-over-Ereignisses", das die Integration bewirkt
und eines geeigneten zweiten "Crossing-over-Ereignisses", das die Exzision
in dem Targetgen oder in der Targetsequenz bewirkt, wird die Inkorporation
der Mutation oder des Allels erreicht. Diese Methode wurde zum Beispiel
von Peters-Wendisch et al. (Microbiology 144, 915–927 (1998))
verwendet, um das pyc-Gen von C. glutamicum durch eine Deletion
zu eliminieren.
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Eine
Deletion, Insertion oder ein Basenaustausch kann auf diese Weise
in das dep34-Gen inkorporiert werden.
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Außerdem kann
es für
die Produktion con L-Lysin vorteilhaft sein, zusätzlich zur Elimination des dep34-Gens, ein oder mehrere
Enzyme des speziellen Biosynthesewegs, der Glycolyse, der Anaplerose,
des Citronensäurezyklus,
des Pentosephosphatzyklus, des Aminosäureexports und optional von
Regulationsproteinen zu verstärken,
insbesondere zu überexprimieren.
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Der
Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem
Zusammenhang den Anstieg der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme
(Proteine) in einem Mikroorganismus, die von der entsprechenden
DNA kodiert sind, zum Beispiel durch Erhöhen der Anzahl der Kopien des
Gens oder der Gene unter Verwendung eines potenten Promoters oder
unter Verwendung eines Gens oder Allels, das für ein entsprechendes Enzym (Protein)
kodiert, das eine hohe Aktivität
aufweist, und optional die Kombination dieser Maßnahmen.
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Durch Überexpression
wird die Aktivität
oder Konzentration des entsprechenden Proteins im Allgemeinen um
mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder
500%, bis zu einem Maximalwert von 1.000% oder 2.000% erhöht, basierend
auf der des Wildtyp-Proteins oder der Aktivität oder Konzentration des Proteins
in dem Ausgangsmikroorganismus.
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Somit
können
zur Herstellung von L-Aminosäuren
zusätzlich
zur Elimination des dep34-Gens gleichzeitig ein oder mehrere Gene,
ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus
- • dem dapA-Gen,
das für
Dihydrodipicolinatsynthase kodiert ( EP-B 0 197 335 ),
- • dem
gap-Gen, das für
Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase
kodiert (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076–6086),
- • dem
tpi-Gen, das für
Triosephosphat-Isomerase kodiert (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology
174: 6076–6086),
- • dem
pgk-Gen, das für
3-Phosphoglyceratkinase kodiert (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology
174: 6076–6086),
- • dem
zwf-Gen, das für
Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase
kodiert ( JP-A-09224661 ),
- • dem
pyc-Gen, das für
Pyruvate-Carboxylase kodiert ( DE-A 198 31 609 ),
- • dem
mqo-Gen, das für
Malatchinon-Oxidoreductase kodiert (Molenaar et al., European Journal
of Biochemistry 254, 395–403
(1998)),
- • dem
lysC-Gen, das für
eine Feedback-resistente Aspartatkinase kodiert (Zulassungsnr. P26512; EP-B-0387527 ; EP A-0699759 ; WO 00/63388 ),
- • dem
lysE-Gen, das für
Lysinexport kodiert ( DE-A-195 48222 ),
- • dem
hom-Gen, das für
Homoserin-Dehydrogenase kodiert ( EP-A 0131171 ),
- • dem
ilvA-Gen, das für
Threonin-Dehydratase kodiert (Möckel
et al., Journal of Bacteriology (1992) 8065 8072)) oder dem ilvA(Fbr)-Allel,
das für
eine "Feedback-restistente" Threonindehydratase
kodiert (Möckel et
al., (1994) Molecular Microbiology 13: 833–842),
- • dem
ilvBN-Gen, das für
Acetohydroxysäure-Synthase
kodiert ( EP-B 0356739 ),
- • dem
ilvD-Gen, das für
Dihydroxysäure-Dehydratase
kodiert (Sahm and Eggeling (1999) Applied and Environmental Microbiology
65: 1973–1979),
- • dem
zwa1-Gen, das für
das Zwa1-Protein kodiert ( DE:
19959328.0 , DSM 13115), überexprimiert werden.
-
Es
kann ferner zur Produktion von L-Aminosäuren zusätzlich zur Elimination des
dep34-Gens vorteilhaft sein, wenn gleichzeitig ein oder mehrere
Gene, ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus
- • dem pck-Gen,
das für
Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase
kodiert ( DE 199 50 409.1 ,
DSM 13047),
- • dem
pgi-Gen, das für
Glucose-6-phosphat-Isomerase kodiert ( US 09/396,478 , DSM 12969),
- • dem
poxB-Gen, das für
Pyruvatoxidase kodiert ( DE:
1995 1975.7 , DSM 13114),
- • dem
zwa2-Gen, das für
das Zwa2-Protein kodiert ( DE:
19959327.2 , DSM 13113),
eliminiert sind.
-
Zusätzlich zur
Elimination des dep34-Gens kann es ferner vorteilhaft für die Produktion
von Aminosäuren
sein, unerwünschte
Nebenreaktionen zu eliminieren (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction
of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic
Press, London, UK, 1982).
-
Die
Erfindung stellt auch die Mikroorganismen bereit, die gemäß der Erfindung
hergestellt wurden, und diese können
kontinuierlich oder diskontinuierlich im Batch-Verfahren (Batch-Kultur) oder in Fed-Batch
(Zulaufverfahren) oder im wiederholten Fed-Batch-Verfahren (repetitives Zulaufverfahren)
zum Zweck der Produktion von L-Lysin kultiviert werden. Eine Zusammenfassung
der bekannten Kulturmethoden ist in dem Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik
1. Einführung
in die Bioverfahrenstechnik [Bioprocess Technology 1. Introduction to
Bioprocess Technology (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))
oder in dem Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen
[Bioreactors and Peripheral Equipment] (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden,
1994)) beschrieben.
-
Das
zu verwendende Kulturmedium muss den Anforderungen der speziellen
Stämme
auf geeignete Weise entsprechen. Beschreibungen von Kulturmedien
für verschiedene
Mikroorganismen sind in dem Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society
for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten.
-
Zucker
und Kohlenhydrate, wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose,
Maltose, Melasse, Stärke
und Cellulose, Ole und Fette, wie zum Beispiel Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett,
Fettsäuren,
wie zum Beispiel Palmitinsäure,
Stearinsäure
und Linolsäure,
Alkohole, wie zum Beispiel Glycerol und Ethanol, und organische
Säuren,
wie zum Beispiel Essigsäure
können
als Kohlenstoffquelle verwendet werden. Diese Substanzen können einzeln
oder als Gemisch verwendet werden.
-
Organische
stickstoffhaltige Verbindungen, wie etwa Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt,
Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff, oder
anorganische Verbindungen, wie etwa Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid,
Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat, können als Stickstoffquelle
verwendet werden. Diese Stickstoffquellen können einzeln oder als Gemisch
verwendet werden.
-
Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat
oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden natriumhaltigen
Salze können
als Phosphorquelle verwendet werden.
-
Das
Kulturmedium muss ferner Metallsalze umfassen, wie zum Beispiel
Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind.
Schließlich
können
wesentliche Wachstumssubstanzen, wie etwa Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu
den oben erwähnten
Substanzen benutzt werden.
-
Geeignete
Vorläufer
können
dem Kulturmedium überdies
zugefügt
werden. Die erwähnten
Ausgangssubstanzen können
der Kultur in Form einer Einzelcharge zugefügt werden, oder sie können auf
geeignete Weise während
der Kultur zugeführt
werden.
-
Basische
Verbindungen, wie etwa Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak
oder Ammoniak in wässriger
Lösung,
oder saure Verbindungen, wie etwa Phosphorsäure oder Schwefelsäure können auf
geeignete Weise benutzt werden, um den pH-Wert der Kultur einzustellen.
Antischaummittel, wie zum Beispiel Fettsäurepolyglycolester, können benutzt
werden, um die Schaumentwicklung zu steuern. Geeignete Substanzen, die
eine selektive Wirkung aufweisen, wie zum Beispiel Antibiotika,
können
dem Medium zugefügt
werden, um die Stabilität
der Plasmide aufrecht zu erhalten. Um die aeroben Bedingungen aufrecht
zu erhalten, werden Sauerstoff oder sauerstoffhaltige Gasgemische,
wie zum Beispiel Luft, in die Kultur eingeführt. Die Temperatur der Kultur
liegt üblicherweise
zwischen 20 °C
und 45 °C,
und bevorzugt zwischen 25 °C
und 40 °C.
Die Kultivierung wird fortgesetzt, bis sich eine maximale Menge
des gewünschten
Produkts gebildet hat. Dieses Ziel wird üblicherweise innerhalb von
10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
-
Methoden
zur Bestimmung von L-Aminosäuren
sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Analyse kann somit zum
Beispiel durchgeführt
werden, wie von Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190)
beschrieben, durch Anionenaustauschchromatographie mit nachfolgender
Ninhydrinableitung, oder sie kann durch Umkehrphasen-HPLC durchgeführt werden,
wie zum Beispiel von Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979)
51: 1167–1174)
beschrieben.
-
Das
Verfahren gemäß der Erfindung
wird zur fermentativen Herstellung von L-Lysin verwendet.
-
Die
folgenden Mikroorganismen wurden am 05.03.2001 als Reinkultur bei
der Deutschen Sammlung für
Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ = German Collection of Microorganisms
and Cell Cultures, Braunschweig, Germany) in Übereinstimmung mit dem Budapester
Vertrag hinterlegt:
- • Escherichia coli top10/pCR2.1dep34int
als DSM 14144.
-
Die
vorliegende Erfindung wird im Folgenden mit Hilfe der Ausführungsbeispiele
ausführlicher
erläutert.
-
Die
Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli und alle Techniken
der Restriktion, Klenow- und alkalischen Phosphatasebehandlung wurden
mit der Methode von Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory
Manual, 1989, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, NY, USA) durchgeführt.
-
Methoden
zur Transformation von Escherichia coli werden ebenfalls in diesem
Handbuch beschrieben.
-
Die
Zusammensetzung der üblichen
Nährmedien,
wie etwa LB- oder TV-Medium ist ebenfalls in dem Handbuch von Sambrook
et al. zu finden.
-
Beispiel 1
-
Herstellung einer genomischen Cosmid-Genbank
aus C. glutamicum ATCC 13032
-
Chromosomale
DNA aus C. glutamicum ATCC 13032 wurde isoliert wie von Tauch et
al. (1995, Plasmid 33: 168–179)
beschrieben und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia,
Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Code-Nr. 27-0913-02)
teilweise gespalten. Die DNA-Fragmente wurden mit alkalischer Shrimp-Phosphatase
(Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung
SAP, Code-Nr. 1758250) dephosphoryliert. Die DNA des Cosmidvektors
SuperCos1 (Wahl et al. (1987), Proceedings of the National Academy
of Sciences, USA 84:2160–2164),
erhalten von Stratagene (La Jolla, USA, Produktbeschreibung SuperCosl
Cosmid Vector Kit, Code-Nr. 251301) wurde mit dem Restriktionsenzyme
XbaI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung
XbaI, Code-Nr. 270948-02)
gespalten und ebenso mit alkalischer Shrimp-Phosphatase dephosphoryliert.
Die Cosmid-DNA wurde dann mit dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham
Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Code-Nr.
27-0868-04) gespalten. Die auf diese Weise behandelte Cosmid-DNA
wurde mit der behandelten ATCC13032-DNA gemischt und die Charge
wurde mit T4-DNA-Ligase
(Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung
T4-DNA Ligase, Code-Nr. 27-0870-04) behandelt. Das Ligationsgemisch
wurde dann mit Hilfe von Gigapack II XL Packing Extract (Stratagene,
La Jolla, USA, Produktbeschreibung Gigapack IIXL Packing Extract,
Code-Nr. 200217) in Phagen gepackt.
-
Zur
Infektion des E.-coli-Stramms NM554 (Raleigh et al. 1988, Nucleic
Acid Res. 16: 1563–1575)
wurden die Zellen in 10 mM MgSO4 aufgenommen
und mit einem Aliquot der Phagensuspension gemischt. Die Infektion
und Titrierung der Cosmidbank wurde durchgeführt, wie von Sambrook et al.
(1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor)
beschrieben, wobei die Zellen auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology,
1: 190) + 100 μg/ml
Ampicillin plattiert wurden. Nach Inkubation über Nacht bei 37 °C wurden
einzelne rekombinante Klone selektiert.
-
Beispiel 2
-
Isolierung und Sequenzierung des dep34-Gens
-
Die
Cosmid-DNA einer einzelnen Kolonie wurde mit dem Qiaprep Spin Miniprep
Kit (Produkt-Nr. 27106, Qiagen, Hilden, Deutschland) in Übereinstimmung
mit den Anleitungen des Herstellers isoliert und mit dem Restriktionsenzym
Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung
Sau3AI, Produkt-Nr. 27-0913-02) teilweise gespalten. Die DNA-Fragmente
wurden mit alkalischer Shrimp-Phosphatase (Roche Molecular Biochemicals,
Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Produkt-Nr. 1758250)
dephosphoryliert.
-
Nach
Separation durch Gelelektrophorese wurden die Cosmidfragmente in
der Größenordnung
von 1.500 bis 2.000 bp mit dem QiaExII Gel Extraction Kit (Produkt-Nr. 20021, Qiagen,
Hilden, Deutschland) isoliert.
-
Die
DNA des Sequenzierungsvektors pZero-1, erhalten von Invitrogen (Groningen,
Niederlande, Produktbeschreibung Zero Background Cloning Kit, Produkt-Nr.
K2500-01) wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia,
Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Produkt-Nr. 27-0868-04) gespalten.
Die Ligation der Cosmidfragmente in dem Sequenzierungsvektor pZero-1
wurde durchgeführt
wie von Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor) beschrieben, wobei das DNA-Gemisch über Nacht
mit T4-Ligase (Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) inkubiert
wurde. Dieses Ligationsgemisch wurde dann einer Elektroporation
(Tauch et al. 1994, FEMS Microbiol. Letters, 123: 343–7) in den
E.-coli-Stamm DH5αmcr (Grant,
1990, Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S. A.,
87: 4645–4649).
Letters, 123: 343–7)
unterzogen und auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) mit
50 μg/ml
Zeocin ausplattiert.
-
Die
Plasmidherstellung der rekombinanten Klone wurde mit dem Biorobot
9600 (Produkt-Nr. 900200, Qiagen, Hilden, Deutschland) durchgeführt. Die
Sequenzierung wurde durchgeführt
mit der Dideoxy-Kettenabbruchmethode von Sanger et al. (1977, Proceedings
of the National Academies of Sciences, U.S.A., 74: 5463–5467) mit
Modifikationen gemäß Zimmermann
et al. (1990, Nucleic Acids Research, 18: 1067). Das "RRdRhodamin Terminator
Cycle Sequenzing Kit" von
PE Applied Biosystems (Produkt-Nr. 403044, Weiterstadt, Deutschland)
wurde verwendet. Die Separation durch Gelelektrophorese und Analyse
der Sequenzierungsreaktion wurden durchgeführt in einem "Rotiphoresis NF Acrylamide/Bisacrylamide"-Gel (29: 1) (Produkt-Nr. A124.1,
Roth, Karlsruhe, Deutschland) mit dem "ABI Prism 377" Sequenzierer von PE Applied Biosystems (Weiterstadt,
Deutschland).
-
Die
erhaltenen Sequenz-Rohdaten wurden dann unter Verwendung des Staden-Programmpakets
verarbeitet (1986, Nucleic Acids Research, 14: 217–231) Version
97-0. Die einzelnen Sequenzen der pZeroI-Derivate wurden zu einer
kontinuierlichen Contig zusammengefügt. Die computergestützten Analysen
der kodierenden Region wurden mit dem XNIP-Programm (Staden, 1986,
Nucleic Acids Research, 14: 217–231)
hergestellt. Weitere Analysen wurde mit dem "BLAST Search Program" (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids
Research, 25: 3389–3402)
gegen die nicht redundante Datenbank des "National Center for Biotechnology Information" (NCBI, Bethesda,
MD, USA) durchgeführt.
-
Die
resultierende Nukleotidsequenz wird in SEQ-ID-Nr. 1 gezeigt. Die
Analyse der Nucleotidsequenz zeigte einen offenen Leserahmen von
1.650 bp, der dep34-Gen genannt wurde. Das dep34-Gen kodiert für ein Polypeptid
von 549 Aminosäuren.
-
Beispiel 3
-
Herstellung eines Integrationsvektors
zur Integrationsmutagenese des dep34-Gens
-
Aus
dem Stamm ATCC 13032 wurde chromosomale DNA mit der Methode von
Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817–1828 (1994)) isoliert. Auf
der Basis der Sequenz des dep34-Gens, die für C. glutamicum aus Beispiel
2 bekannt ist, wurden die folgenden Oligonukleotide für die Polymerasekettenreaktion
ausgewählt (vgl.
SEQ-ID- Nr. 3 und
SEQ-ID-Nr. 4):
dep34-int1:
5' CTG TGC TGC TGA AAC TTC C 3'
dep34-int2:
5' AGIT CCA ATG AGA
GCC AAG C 3'
-
Die
gezeigten Primer wurden von MWG Biotech (Ebersberg, Deutschland)
synthetisiert und die PCR-Reaktion wurde mit der Standard-PCR-Methode
von Innis et al. (PCR protocols. A guide to methods and applications,
1990, Academic Press) mit der Taq-Polymerase von Boehringer Mannheim
(Deutschland, Produktbeschreibung Taq DNA polymerase, Produkt-Nr.
1 146 165) durchgeführt.
Mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion ermöglichen die Primer die Amplifikation
eines inneren Fragments des dep34-Gens mit einer Größe von 541
bp. Das auf diese Weise amplifizierte Produkt wurde elektrophoretisch
in einem 0,8%-igen Agarosegel getestet.
-
Das
amplifizierte DNA-Fragment wurde mit dem TOPO TA Cloning Kit von
Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA; Katalognummer K4500-01)
in den Vektor pCR2.1-TOPO (Mead at al. (1991) Bio/Technology 9:
657–663)
ligiert.
-
Der
E.-coli-Stamm TOP10 wurde dann mit der Ligationscharge einer Elektroporation
unterzogen (Hanahan, In: DNA cloning. A practical approach. Vol.
I. IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA, 1985). Die Selektion der
Plasmid tragenden Zellen wurde durchgeführt, indem die Transformationscharge
auf LB-Agar (Sambrook
et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989), das mit
50 mg/l Kanamycin angereichert worden war, ausplattiert wurde. Die
Plasmid-DNA wurde aus einer Transformante mit Hilfe des QIAprep
Spin Miniprep Kit von Qiagen isoliert und durch Restriktion mit
dem Restriktionsenzym EcoRI und anschließender Agarosegelelektrophorese
(0,8%) überprüft. Das
Plasmid wurde pCR2.1dep34int genannt und wird in 1 gezeigt.
-
Beispiel 4
-
Integrationsmutagenese des dep34-Gens
in den Stamm DSM 5715
-
Der
in Beispiel 3 erwähnte
Vektor pCR2.1dep34int wurde einer Elektrophorese unterzogen mit
einer Elekroporationsmethode von Tauch et al. (FEMS Microbiological
Letters, 123: 343–347
(1994)) in Corynebacterium glutamicum DSM 5715. Der Stamm DSM 5715
ist ein AEC-resistenter Lysinproduzent. Der Vektor pCR2.1dep34int
kann sich nicht unabhängig
in DSM5715 replizieren und wird in der Zelle nur dann zurückgehalten,
wenn er sich in das Chromosom von DSM 5715 integriert hat. Die Selektion
von Klonen, die pCR2.1dep34int in das Chromosom integriert hatten,
wurde durchgeführt,
indem die Elektroporationscharge auf LB-Agar (Sambrook et al., Molecular
cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, N. Y., 1989), das mit 15 mg/l Kanamycin angereichert
worden war, ausplattiert wurde.
-
Zum
Nachweis der Integration wurde das dep34int-Fragment mit dem Dig hybridization kit
von Boehringer durch die Methode "The DIG System Users Guide for Filter
Hybridization" von
Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) markiert.
Chromosomale DNA eines potentiellen Integranten wurde mit der Methode
von Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817–1828 (1994)) isoliert, und
in jedem Fall mit den Restriktionsenzymen KpnI, EcoRI und PstI gespalten.
Die gebildeten Fragmente wurden mittels Agarosegelelektrophorese
separiert und bei 68 °C
mit dem Dig Hybridization Kit von Boehringer hybridisiert. Das in
Beispiel 3 erwähnte
Plasmid pCR2.1dep34int wurde in das Chromosom von DSM5715 innerhalb
des chromosomalen dep34-Gens inseriert. Der Stamm wurde DSM5715::pCR2.1dep34int
genannt.
-
Beispiel 5
-
Herstellung von Lysin
-
Der
C.-glutamicum-Stamm DSM5715::pCR2.1dep34int, der in Beispiel 4 erhalten
wurde, wurde in einem Nährmedium
kultiviert, das zur Produktion von Lysin geeignet ist, und der Lysingehalt
in dem Kulturüberstand
wurde bestimmt.
-
Hierfür wurde
der Stamm zuerst auf einer Agarplatte mit dem entsprechenden Antibiotikum (Hirn-Herz-Agar
mit Kanamycin (25 mg/l)) 24 Stunden lang bei 33 °C inkubiert. Ausgehend von dieser
Agarplattenkultur wurde eine Vorkultur angeimpft (10 ml Medium in
einem 100-ml-Erlenmeyer-Kolben).
Das vollständige
CgIII-Medium wurde als Medium für
die Vorkultur verwendet. CgIII-Medium
| NaCl | 2,5
g/l |
| Baktopepton | 10
g/l |
| Bakto-Hefeextrakt | 10
g/l |
| Glucose
(separat autoklaviert) 2 % (w/v) | |
| Der
pH-Wert wurde auf pH 7,4 gebracht. | |
-
Kanamycin
(25 mg/l) wurde hier zugefügt.
Die Vorkultur wurde 16 Stunden lang bei 33 °C bei 240 U/Min. auf einer Rüttelmaschine
inkubiert. Eine Hauptkultur wurde aus dieser Vorkultur angeimpft,
so dass die anfängliche
OD (660 nm) der Hauptkultur 0,1 OD betrug. Für die Hauptkultur wurde MM-Medium
verwendet. MM-Medium
| CSL
(Maisquellwasser) | 5
g/l |
| MOPS
(Morpholinopropansulfonsäure) | 20
g/l |
| Glucose
(separat autoklaviert) | 50
g/l |
| Salze: | |
| (NH4)2SO4 | 25
g/l |
| KH2PO4 | 0,1 g/l |
| MgSO4·7
H2O | 1,0
g/l |
| CaCl2·2
H2O | 10
mg/l |
| FeSO4·7
H2O | 10
mg/l |
| MnSO4·H2O | 5,0
mg/l |
| Biotin
(sterilgefiltert) | 0,3
mg/l |
| Thiamin·HCl (sterilgefiltert) | 0,2
mg/l |
| Leucin
(sterilgefiltert) | 0,1
g/l |
| CaCO3 | 25 g/l |
-
CSL,
MOPS und die Salzlösung
wurde mit Ammoniak in wässriger
Lösung
auf einen pH-Wert von 7 gebracht und autoklaviert. Die sterilen
Substrat- und Vitaminlösungen
wurden dann zugefügt,
und das in trockenem Zustand autoklavierte CaCO3 wird
zugefügt.
-
Die
Kultivierung wird in einem 10 ml Volumen in einem 100-ml-Erlenmeyer-Kolben
mit Dampfsperre durchgeführt.
Kanamycin (25 mg/l) wurde zugefügt.
Die Kultivierung wurde bei 33 °C
und 80% Luftfeuchtigkeit durchgeführt.
-
Nach
72 Stunden wurde die OD mit einer Messwellenlänge von 660 nm mit einem Biomek
1000 (Reckmann Instruments GmbH, München) bestimmt. Die Menge
an Lysin, die sich gebildet hatte, wurde mit einem Aminosäurenanalysator
von Eppendorf BioTronik (Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatographie
und Nachsäulenderivatisierung
mit Ninhydrinnachweis bestimmt.
-
Das
Ergebnis des Versuchs wird in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1
| Stamm | OD
(660
nm) | Lysin
HCl
g/l |
| DSM5715 | 8,7 | 12,64 |
| DSM5715::pCR2.1d
ep34int | 9,1 | 14,14 |
-
Kurze Beschreibung der Figur:
-
1:
Karte des Plasmids pCR2.1dep34int.
-
Die
verwendeten Abkürzungen
und Bezeichnungen haben die folgende Bedeutung.
- KmR:
- Kanamycinresistenzgen
- KpnI:
- Spaltstelle des Restriktionsenzyms
KpnI
- EcoRI:
- Spaltstelle des Restriktionsenzyms
EcoRI
- PstI:
- Spaltstelle des Restriktionsenzyms
PstI
- dep34int:
- Internes Fragment
des dep34-Gens
- ColE1:
- Replikationsstartpunkt
des Plasmids ColE1
-
-
-
-
-
-
