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Gegenstand
der Erfindung ist ein coryneformes Bakterium, bei dem die Expression
eines Polynukleotids aus coryneformen Bakterien mit der Sequenz
des citA-Gens ausgeschaltet
ist, und ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Lysin
oder L-Valin durch Abschwächung
des citA-Gens. Das citA-Gen codiert für die Sensor Kinase Cit A eines
Zwei-Komponentensystems.
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Stand der Technik
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L-Aminosäuren, insbesondere
L-Lysin, finden in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen
Industrie, in der Lebensmittelindustrie und ganz besonders in der
Tierernährung
Anwendung.
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Es
ist bekannt, dass Aminosäuren
durch Fermentation von Stämmen
coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum,
hergestellt werden. Wegen der grossen Bedeutung wird ständig an
der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen
können
fermentationstechnische Massnahmen wie zum Beispiel Rührung und
Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien,
wie zum Beispiel die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder
die Aufarbeitung zur Produktform durch zum Beispiel Ionenaustauschchromatographie
oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus
selbst betreffen.
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Zur
Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden
Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet.
Auf diese Weise erhält
man Stämme,
die resistent gegen Antimetabolite oder auxotroph für regulatorisch
bedeutsame Metabolite sind und die Aminosäuren produzieren.
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Seit
einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik
zur Stammverbesserung von L-Aminosäure-produzierenden
Stämmen
von Corynebacterium eingesetzt.
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Aufgabe der Erfindung
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Die
Erfinder haben sich zur Aufgabe gestellt, neue Massnahmen zur verbesserten
fermentativen Herstellung von Aminosäuren, insbesondere L-Lysin,
bereitzustellen.
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Beschreibung der Erfindung
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Werden
im folgenden L-Lysin oder Lysin erwähnt, sind damit auch die Salze
wie z. B. Lysin-Monohydrochlorid oder Lysin-Sulfat gemeint.
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Gegenstand
der Beschreibung ist ein isoliertes Polynukleotid aus coryneformen
Bakterien, enthaltend eine für
das citA-Gen codierende Polynukleotidsequenz, ausgewählt aus
der Gruppe
- a) Polynukleotid, das mindestens
zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid
codiert, das die Aminosäuresequenz
von SEQ ID No. 2 enthält,
- b) Polynukleotid, das für
ein Polypeptid codiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die
zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2,
- c) Polynukleotid, das komplementär ist zu den Polynukleotiden
von a) oder b), und
- d) Polynukleotid, enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende
Nukleotide der Polynukleotidsequenz von a), b) oder c),
wobei
das Polypeptid die Aktivität
Sensor Kinase CitA aufweist.
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Gegenstand
der Beschreibung ist ebenfalls das oben genannte Polynukleotid,
wobei es sich bevorzugt um eine replizierbare DNA handelt, enthaltend:
- (i) die Nukleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID
No. 1 oder
- (ii) mindestens eine Sequenz, die der Sequenz (i) innerhalb
des Bereichs der Degeneration des genetischen Kodes entspricht,
oder
- (iii) mindestens eine Sequenz, die mit den zu den Sequenzen
(i) oder (ii) komplementären
Sequenzen hybridisiert, und gegebenenfalls
- (iv) funktionsneutralen Sinnmutationen in (i).
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Weitere
Gegenstände
der Beschreibung sind:
ein replizierbares Polynukleotid, insbesondere
DNA, enthaltend die Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID No. 1 dargestellt;
ein
Polynukleotid, das für
ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID No.
2 dargestellt, enthält.
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Die
Erfindung betrifft:
Ein rekombinantes coryneformes Bakterium,
bei dem die Expression eines für
ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz,
die wenigstens zu 90% mit der in SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenz
identisch ist, codierenden Polynukleotids ausgeschaltet ist.
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Die
Ausschaltung wird durch Deletion, Insertion oder Basenaustausch
erreicht.
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Das
Bakterium ist auch Teil der Erfindung, wobei das Polynukleotid aus
der folgenden Gruppe gewählt ist:
- a) Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID NO: 1 dargestellt;
oder
- b) Nukleotidsequenzen, die der Sequenz SEQ ID NO: 1 im Rahmen
der Degeneriertheit des genetischen Codes entsprechen; oder
- c) Nukleotidsequenz mit neutralen Sinnmutationen in SEQ ID NO:
1; oder
- d) Nukleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen an das
Komplement von SEQ ID NO: 1 hybridisiert, wobei die stringenten
Bedingungen das Waschen in 2 × SSC
bei Temperaturen von 50–68°C umfassen.
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Das
codierte Polynukleotid Polypeptid weist vorzugsweise die in SEQ
ID NO: 2 dargestellte Aminosäuresequenz
auf.
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Die
Erfindung betrifft auch:
Einen in Corynebacterium glutamicum
nicht-replikativen Vektor zur Mutagenese, umfassend ein Fragment
aus wenigstens 15 aufeinanderfolgenden Nukleotiden des wie in SEQ
ID NO: 1 dargestellten Polynukleotids und einen nicht-replikativen
Vektor, umfassend das in SEQ ID NO: 3 dargestellte interne Fragment
von SEG ID NO: 1.
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Coryneforme
Bakterien, transformiert mit einem Integrationsvektor, der ein Fragment
aus wenigstens 15 aufeinanderfolgenden Nukleotiden des in SEQ ID
NO: 1 dargestellten Polynukleotids trägt, sind ebenfalls Teil der
Erfindung.
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Gegenstand
der Beschreibung sind ebenso Polynukleotide, die im wesentlichen
aus einer Polynukleotidsequenz bestehen, die erhältlich sind durch Screening
mittels Hybridisierung einer entsprechenden Genbank eines coryneformen
Bakteriums, die das vollständige
Gen oder Teile davon enthält,
mit einer Sonde, die die Sequenz des erfindungsgemässen Polynukleotids
oder ein Fragment davon enthält
und Isolierung der genannten Polynukleotidsequenz.
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Polynukleotide
enthaltend die Sequenzen gemäss
der Beschreibung sind als Hybridisierungssonden für RNA, cDNA
und DNA geeignet, um Nukleinsäuren
beziehungsweise Polynukleotide oder Gene in voller Länge zu isolieren,
die für
das CitA-Protein codieren oder um solche Nukleinsäuren beziehungsweise
Polynukleotide oder Gene zu isolieren, die eine hohe Ähnlichkeit
mit der Sequenz des citA-Gens aufweisen.
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Polynukleotide
enthaltend die Sequenzen gemäss
der Beschreibung sind weiterhin als Primer geeignet, mit deren Hilfe
mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) DNA von Genen hergestellt
werden kann, die für das
CitA-Protein codieren.
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Solche
als Sonden oder Primer dienende Oligonukleotide enthalten mindestens
30, bevorzugt mindestens 20, ganz besonders bevorzugt mindestens
15 aufeinanderfolgende Nukleotide. Geeignet sind ebenfalls Oligonukleotide
mit einer Länge
von mindestens 40 oder 50 Nukleotiden.
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"Isoliert" bedeutet aus seinem
natürlichen
Umfeld herausgetrennt.
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"Polynukleotid" bezieht sich im
allgemeinen auf Polyribonukleotide und Polydeoxyribonukleotide,
wobei es sich um nicht modifizierte RNA oder DNA oder modifizierte
RNA oder DNA handeln kann.
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Die
Polynukleotide gemäss
Beschreibung schliessen ein Polynukleotid gemäss SEQ ID No. 1 oder ein daraus
hergestelltes Fragment und auch solche ein, die zu wenigstens 70%,
bevorzugt zu wenigstens 80% und besonders zu wenigstens 90% bis
95% identisch sind mit dem Polynukleotid gemäss SEQ ID No. 1 oder einem
daraus hergestellten Fragment.
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Unter "Polypeptiden" versteht man Peptide
oder Proteine, die zwei oder mehr über Peptidbindungen verbundene
Aminosäuren
enthalten.
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Die
Polypeptide gemäss
Beschreibung schliessen ein Polypeptid gemäss SEQ ID No. 2 mit der biologischen
Aktivität
des CitA-Proteins und auch solche ein, die zu wenigstens 80% und
besonders zu wenigstens 90% bis 95% identisch sind mit dem Polypeptid
gemäss
SEQ ID No. 2 und die genannte Aktivität aufweisen.
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Die
Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur fermentativen Herstellung
von L-Lysin oder L-Valin unter Verwendung von coryneformen Bakterien,
die insbesondere bereits Aminosäuren
produzieren und in denen die Polynukleotide mit den Sequenzen des
citA-Gens ausgeschaltet
sind.
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Der
Begriff "Abschwächung" beschreibt in diesem
Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines
oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die
entsprechende DNA codiert werden, indem man beispielsweise einen
schwachen Promotor verwendet oder ein Gen bzw. Allel verwendet,
das für
ein entsprechendes Enzym mit einer niedrigen Aktivität codiert
bzw. das entsprechende Gen oder Enzym (Protein) inaktiviert und
gegebenenfalls diese Massnahmen kombiniert.
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Die
Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind,
können
Aminosäuren,
insbesondere L-Lysin
aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose
oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es kann sich um Vertreter
coryneformer Bakterien insbesondere der Gattung Corynebacterium
handeln. Bei der Gattung Corynebacterium ist insbesondere die Art
Corynebacterium glutamicum zu nennen, die in der Fachwelt für ihre Fähigkeit
bekannt ist, L-Aminosäuren
zu produzieren.
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Geeignete
Stämme
der Gattung Corynebacterium, insbesondere der Art Corynebacterium
glutamicum (C. glutamicum), sind besonders die bekannten Wildtypstämme
Corynebacterium
glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium
acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Corynebacterium
thermoaminogenes FERM BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium
lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
oder
daraus hergestellte L-Aminosäuren
produzierende Mutanten beziehungsweise Stämme, wie beispielsweise die
L-Lysin produzierenden Stämme
Corynebacterium
glutamicum FERM-P 1709
Brevibacterium flavum FERM-P 1708
Brevibacterium
lactofermentum FERM-P 1712
Corynebacterium glutamicum FERM-P
6463
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464
Corynebacterium
glutamicum DM58-1
Corynebacterium glutamicum DG52-5
Corynebacterium
glutamicum DSM 5715 und
Corynebacterium glutamicum DSM 12866
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Den
Erfindern gelang es, das für
das CitA-Protein codierende citA-Gen von C. glutamicum, welches eine
Sensor Kinase eines Zwei-Komponenten-Systems ist, zu isolieren.
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Zur
Isolierung des citA-Gens oder auch anderer Gene von C. glutamicum
wird zunächst
eine Genbank dieses Mikroorganismus in Escherichia coli (E. coli)
angelegt. Das Anlegen von Genbanken ist in allgemein bekannten Lehrbüchern und
Handbüchern
niedergeschrieben. Als Beispiel seien das Lehrbuch von Winnacker:
Gene und Klone, Eine Einführung
in die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Deutschland, 1990), oder
das Handbuch von Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory
Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) genannt. Eine
sehr bekannte Genbank ist die des E. coli K-12 Stammes W3110, die
von Kohara et al. (Cell 50, 495–508
(1987)) in λ-Vektoren
angelegt wurde. Bathe et al. (Molecular and General Genetics, 252:
255–265,
1996) beschreiben eine Genbank von C. glutamicum ATCC13032, die
mit Hilfe des Cosmidvektors SuperCos I (Wahl et al., 1987, Proceedings
of the National Academy of Sciences USA, 84: 2160–2164) im
E. coli K-12 Stamm NM554 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research
16: 563–1575)
angelegt wurde. Börmann
et al. (Molecular Microbiology 6(3), 317–326 (1992)) wiederum beschreiben
eine Genbank von C. glutamicum ATCC13032 unter Verwendung des Cosmides
pHC79 (Hohn und Collins, 1980, Gene 11, 291–298).
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Zur
Herstellung einer Genbank von C. glutamicum in E. coli können auch
Plasmide wie pBR322 (Bolivar, 1979, Life Sciences, 25, 807–818) oder
pUC9 (Vieira et al., 1982, Gene, 19: 259–268) verwendet werden. Als
Wirte eignen sich besonders solche E. coli-Stämme, die restriktions- und
rekombinationsdefekt sind wie beispielsweise der Stamm DH5α (Jeffrey
H. Miller: "A Short
Course in Bacterial Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for
Escherichia coli and Related Bacteria", Cold Spring Harbor Laboratory Press,
1992).
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Die
mit Hilfe von Cosmiden oder anderen λ-Vektoren klonierten langen
DNA-Fragmente können
anschliessend wiederum in gängige
für die
DNA-Sequenzierung geeignete Vektoren subkloniert werden.
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Methoden
zur DNA-Sequenzierung sind unter anderem bei Sanger et al. (Proceedings
of the National Academy of Sciences of the United States of America
USA, 74: 5463–5467,
1977) beschrieben.
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Die
erhaltenen DNA-Sequenzen können
dann mit bekannten Algorithmen bzw. Sequenzanalyse-Programmen wie
z. B. dem von Staden (Nucleic Acids Research 14, 217–232 (1986)),
dem von Marck (Nucleic Acids Research 16, 1829–1836 (1988)) oder dem GCG-Programm
von Butler (Methods of Biochemical Analysis 39, 74–97 (1998))
untersucht werden.
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Auf
diese Weise wurde für
das citA-Gen codierende DNA von C. glutamicum erhalten, die als
SEQ ID No. 1 ist. Weiterhin wurde aus der vorliegenden DNA-Sequenz
mit den oben beschriebenen Methoden die Aminosäuresequenz des entsprechenden
Proteins abgeleitet. In SEQ ID No. 2 ist die sich ergebende Aminosäuresequenz
des citA-Genproduktes
dargestellt.
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Codierende
DNA-Sequenzen, die sich aus SEQ ID No. 1 durch die Degeneriertheit
des genetischen Kodes ergeben, sind ebenfalls Bestandteil der Beschreibung.
In gleicher Weise sind DNA-Sequenzen, die mit SEQ ID No. 1 oder
Teilen von SEQ ID No. 1 hybridisieren, Bestandteil der Beschreibung.
In der Fachwelt sind weiterhin konservative Aminosäureaustausche
wie z. B. Austausch von Glycin gegen Alanin oder von Asparaginsäure gegen
Glutaminsäure
in Proteinen als "Sinnmutationen" (sense mutations)
bekannt, die zu keiner grundsätzlichen
Veränderung
der Aktivität
des Proteins führen,
d. h. funktionsneutral sind. Weiterhin ist bekannt, dass Änderungen
am N- und/oder C-Terminus eines Proteins dessen Funktion nicht wesentlich
beeinträchtigen
oder sogar stabilisieren können.
Angaben hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Ben-Bassat
et al. (Journal of Bacteriology 169: 751–757 (1987)), bei O'Regan et al. (Gene
77: 237–251
(1989)), bei Sahin-Toth et al. (Protein Sciences 3: 240–247 (1994)),
bei Hochuli et al. (Bio/Technology 6: 1321–1325 (1988)) und in bekannten
Lehrbüchern
der Genetik und Molekularbiologie. Aminosäuresequenzen, die sich in entsprechender
Weise aus SEQ ID No. 2 ergeben, sind ebenfalls Bestandteil der Erfindung.
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Schliesslich
sind DNA-Sequenzen Bestandteil der Beschreibung, die durch die Polymerase-Kettenreaktion
(PCR) unter Verwendung von Primern hergestellt werden, die sich
aus SEQ ID No. 1 ergeben. Derartige Oligonukleotide haben typischerweise
eine Länge
von mindestens 15 Nukleotiden.
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Anleitungen
zur Identifizierung von DNA-Sequenzen mittels Hybridisierung findet
der Fachmann unter anderem im Handbuch "The DIG System Users Guide for Filter
Hybridization" der
Firma Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) und
bei Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology 41:
255–260
(1991)). Die Hybridisierung findet unter stringenten Bedingungen
statt, das heisst, es werden nur Hybride gebildet, bei denen Sonde
und Zielsequenz, d. h. die mit der Sonde behandelten Polynukleotide,
identisch sind. Es ist bekannt, dass die Stringenz der Hybridisierung
einschliesslich der Waschschritte durch Variieren der Pufferzusammensetzung,
der Temperatur und der Salzkonzentration beeinflusst bzw. bestimmt
wird. Die Hybridisierungsreaktion wird vorzugsweise bei relativ
niedriger Stringenz im Vergleich zu den Waschschritten durchgeführt (Hybaid
Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996). Für die Hybridisierungsreaktion
kann beispielsweise ein 5 × SSC-Puffer bei einer
Temperatur von ca. 50–68°C eingesetzt
werden. Dabei können
Sonden auch mit Polynukleotiden hybridisieren, die weniger als 70%
Identität
zur Sequenz der Sonde aufweisen. Solche Hybride sind weniger stabil
und werden durch Waschen unter stringenten Bedingungen entfernt.
Dies kann beispielsweise durch Senken der Salzkonzentration auf
2 × SSC
und gegebenenfalls nachfolgend 0,5 × SSC (The DIG System User's Guide for Filter
Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland, 1995)
erreicht werden, wobei eine Temperatur von ca. 50–68°C eingestellt
wird. Durch schrittweise Erhöhung
der Hybridisierungstemperatur in Schritten von ca. 1–2°C von 50
auf 68°C
können
Polynukleotidfragmente isoliert werden, die beispielsweise mindestens
70% oder mindestens 80% oder mindestens 90% bis 95% Identität zur Sequenz
der eingesetzten Sonde besitzen. Weitere Anleitungen zur Hybridisierung
sind in Form sogenannter Kits am Markt erhältlich (z. B. DIG Easy Hyb
von der Firma Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Catalog
No. 1603558).
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Anleitungen
zur Amplifikation von DNA-Sequenzen mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion
(PCR) findet der Fachmann unter anderem im Handbuch von Gait: Oligonucleotide
Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) und
bei Newton und Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland,
1994).
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Bei
der Arbeit an der vorliegenden Erfindung konnte festgestellt werden,
dass coryneforme Bakterien nach Abschwächung des citA-Gens in verbesserter
Weise Aminosäuren,
insbesondere L-Lysin, produzieren.
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Zur
Erzielung einer Abschwächung
können
entweder die Expression des citA-Gens oder die katalytischen Eigenschaften
des Enzymproteins herabgesetzt oder ausgeschaltet werden. Gegebenenfalls
können beide
Massnahmen kombiniert werden.
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Die
Verringerung der Genexpression kann durch geeignete Kulturführung oder
durch genetische Veränderung
(Mutation) der Signalstrukturen der Genexpression erfolgen. Signalstrukturen
der Genexpression sind beispielsweise Repressorgene, Aktivatorgene,
Operatoren, Promotoren, Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen,
das Startkodon und Terminatoren. Angaben hierzu findet der Fachmann
z. B. in der Patentanmeldung
WO
96/15246 , bei Boyd und Murphy (Journal of Bacteriology
170: 5949 (1988)), bei Voskuil und Chambliss (Nucleic Acids Research
26: 3548 (1998), bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering
58: 191 (1998)), bei Patek et al. (Microbiology 142: 1297 (1996)),
Vasicova et al. (Journal of Bacteriology 181: 6188 (1999)) und in
bekannten Lehrbüchern
der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers
("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg
Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995) oder dem von Winnacker
("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft,
Weinheim, Deutschland, 1990).
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Mutationen,
die zu einer Veränderung
bzw. Herabsetzung der katalytischen Eigenschaften von Enzymproteinen
führen,
sind aus dem Stand der Technik bekannt; als Beispiele seien die
Arbeiten von Qiu und Goodman (Journal of Biological Chemistry 272:
8611–8617
(1997)), Sugimoto et al. (Bioscience Biotechnology and Biochemistry
61: 1760–1762
(1997)) und Möckel
("Die Threonindehydratase
aus Corynebacterium glutamicum: Aufhebung der allosterischen Regulation
und Struktur des Enzyms",
Berichte des Forschungszentrums Jülich, Jül-2906, ISSN09442952, Jülich, Deutschland,
1994) genannt. Zusammenfassende Darstellungen können bekannten Lehrbüchern der
Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer
Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.
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Als
Mutationen kommen Transitionen, Transversionen, Insertionen und
Deletionen in Betracht. In Abhängigkeit
von der Wirkung des Aminosäureaustausches
auf die Enzymaktivität
wird von Fehlsinnmutationen (missense mutations) oder Nichtsinnmutationen
(nonsense mutations) gesprochen. Insertionen oder Deletionen von
mindestens einem Basenpaar (bp) in einem Gen führen zu Rasterverschiebungsmutationen
(frame shift mutations), in deren Folge falsche Aminosäuren eingebaut
werden oder die Translation vorzeitig abbricht. Deletionen von mehreren
Kodonen führen
typischerweise zu einem vollständigen
Ausfall der Enzymaktivität. Anleitungen
zur Erzeugung derartiger Mutationen gehören zum Stand der Technik und
können
bekannten Lehrbüchern
der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers
("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg
Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995), dem von Winnacker
("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft,
Weinheim, Deutschland, 1990) oder dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer
Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.
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Eine
gebräuchliche
Methode, Gene von C. glutamicum zu mutieren, ist die von Schwarzer
und Pühler (Bio/Technology
9, 84–87
(1991)) beschriebene Methode der Gen-Unterbrechung (gene disruption)
und des Gen-Austauschs
(gene replacement).
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Bei
der Methode der Gen-Unterbrechung wird ein zentraler Teil der Codierregion
des interessierenden Gens in einen Plasmidvektor kloniert, der in
einem Wirt (typischerweise E. coli), nicht aber in C. glutamicum replizieren
kann. Als Vektoren kommen beispielsweise pSUP301 (Simon et al.,
Bio/Technology 1, 784–791 (1983)),
pK18mob oder pK19mob (Schäfer
et al., Gene 145, 69–73
(1994)), pK18mobsacB oder pK19mobsacB (Jäger et al., Journal of Bacteriology
174: 5462–65
(1992)), pGEM-T (Promega corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994).
Journal of Biological Chemistry 269: 32678–84;
US-Patent 5,487,993 ), pCR
® Blunt
(Firma Invitrogen, Groningen, Niederlande; Bernard et al., Journal
of Molecular Biology, 234: 534–541
(1993)) oder pEM1 (Schrumpf et al, 1991, Journal of Bacteriology
173: 4510–4516)
in Frage. Der Plasmidvektor, der das zentrale Teil der Codierregion
des Gens enthält,
wird anschliessend durch Konjugation oder Transformation in den
gewünschten
Stamm von C. glutamicum überführt. Die
Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al.
(Applied and Environmental Microbiology 60, 756–759 (1994)) beschrieben. Methoden
zur Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et al. (Applied
Microbiology and Biotechnology 29, 356–362 (1988)), Dunican und Shivnan
(Bio/Technology 7, 1067–1070
(1989)) und Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343–347 (1994))
beschrieben. Nach homologer Rekombination mittels eines "cross-over"-Ereignisses wird
die Codierregion des betreffenden Gens durch die Vektorsequenz unterbrochen
und man erhält
zwei unvollständige
Allele, denen jeweils das 3'-
bzw. das 5'-Ende
fehlt. Diese Methode wurde beispielsweise von Fitzpatrick et al.
(Applied Microbiology and Biotechnology 42, 575–580 (1994)) zur Ausschaltung
des recA-Gens von C. glutamicum verwendet.
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Bei
der Methode des Genaustausches (gene replacement) wird eine Mutation
wie z. B. eine Deletion, Insertion oder Basenaustausch in dem interessierenden
Gen invitro hergestellt. Das hergestellte Allel wird wiederum in
einen für
C. glutamicum nicht replikativen Vektor kloniert und dieser anschliessend
durch Transformation oder Konjugation in den gewünschten Wirt von C. glutamicum überführt. Nach
homologer Rekombination mittels eines ersten, Integration bewirkenden "cross-over"-Ereignisses und
eines geeigneten zweiten, eine Exzision bewirkenden "cross-over"-Ereignisses im Zielgen
bzw. in der Zielsequenz erreicht man den Einbau der Mutation bzw.
des Allels. Diese Methode wurde beispielsweise von Peters-Wendisch
et al. (Microbiology 144, 915–927
(1998)) verwendet, um das pyc-Gen von C. glutamicum durch eine Deletion
auszuschalten.
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In
das citA-Gen kann auf diese Weise eine Deletion, Insertion oder
ein Basenaustausch eingebaut werden.
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Zusätzlich kann
es für
die Produktion von L-Aminosäuren, insbesondere
L-Lysin, vorteilhaft sein, zusätzlich
zur Abschwächung
des citA-Gens ein oder mehrere Enzyme des jeweiligen Biosyntheseweges,
der Glykolyse, der Anaplerotik, des Pentosephosphat-Zyklus oder
des Aminosäure-Exports
und gegebenenfalls regulatorische Proteine zu verstärken, insbesondere überzuexprimieren.
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Der
Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem
Zusammenhang die Erhöhung
der intrazellulären
Aktivität
eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus,
die durch die entsprechende DNA codiert werden, indem man beispielsweise
die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöht, einen starken Promotor
verwendet oder ein Gen oder Allel verwendet, das für ein entsprechendes
Enzym (Protein) mit einer hohen Aktivität codiert und gegebenenfalls
diese Massnahmen kombiniert.
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So
kann beispielsweise für
die Herstellung von L-Lysin gleichzeitig eines oder mehrere der
Gene, gewählt
aus der Gruppe
- – das für Dihydrodipicolinat-Synthase
codierende dapA-Gen ( EP-B
0 197 335 ),
- – das
für die
Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase codierende Gen gap (Eikmanns
(1992), Journal of Bacteriology 174: 6076–6086),
- – das
für Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase
codierende zwf-Gen ( JP-A-09224661 ),
- – das
für Pyruvat-Carboxylase
codierende pyc-Gen ( DE-A-198
31 609 ), das für
den Lysin-Export codierende lysE-Gen ( DE-A-195 48 222 )
- – das
für eine
feed back resistente Aspartatkinase codierende Gen lysC ( EP-B-0387527 ; EP-A-0699759 ; WO 00/63388 ), oder
- – das
für das
Zwa1-Protein codierende Gen zwa1 ( DE:
199 59 328.0 , DSM 13115)
verstärkt, insbesondere überexprimiert
werden.
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Ausserdem
kann es für
die Produktion von Aminosäuren,
insbesondere L-Lysin, vorteilhaft sein, neben der Abschwächung des
citA-Gens gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, gewählt aus
der Gruppe
- – das für Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase
codierende pck-Gen ( DE 199 50
409.1 , DSM 13047),
- – das
für Glucose-6-Phosphat-Isomerase
codierende pgi-Gen ( US 09/396,478 ,
DSM 12969),
- – das
für Pyruvat-Oxidase
codierende poxB-Gen (DE: 1995 1975.7, DSM 13114)
- – das
für das
Zwa2-Protein codierende zwa2-Gen ( DE:
199 59 327.2 , DSM 13113) abzuschwächen.
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Weiterhin
kann es für
die Produktion von Aminosäuren,
insbesondere L-Lysin vorteilhaft sein, neben der Abschwächung des
citA-Gens unerwünschte
Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction
of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic
Press, London, UK, 1982).
-
Die
erfindungsgemäss
hergestellten Mikroorganismen sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung
und können kontinuierlich
oder diskontinuierlich im batch-Verfahren
(Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated
fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der
Produktion von L-Aminosäuren,
insbesondere L-Lysin kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte
Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik
1. Einführung
in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))
oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg
Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
-
Das
zu verwendende Kulturmedium muss in geeigneter Weise den Ansprüchen der
jeweiligen Stämme
genügen.
Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind
im Handbuch "Manual of
Methods for General Bacteriology" der
American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten.
Als Kohlenstoffquelle können
Zucker und Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose,
Maltose, Melasse, Stärke
und Cellulose, Öle
und Fette, wie zum Beispiel Sojaöl,
Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett,
Fettsäuren,
wie zum Beispiel Palmitinsäure,
Stearinsäure
und Linolsäure,
Alkohole wie zum Beispiel Glycerin und Ethanol und organische Säuren, wie
zum Beispiel Essigsäure
verwendet werden. Diese Stoffe können
einzeln oder als Mischung verwendet werden.
-
Als
Stickstoffquelle können
organische stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt,
Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder
anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat,
Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen
können
einzeln oder als Mischung verwendet werden.
-
Als
Phosphorquelle können
Phosphorsäure,
Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die
entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium
muss weiterhin Salze von Metallen enthalten, wie zum Beispiel Magnesiumsulfat
oder Eisensulfat, die für
das Wachstum notwendig sind. Schliesslich können essentielle Wuchsstoffe
wie Aminosäuren
und Vitamine zusätzlich
zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium
können überdies
geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe
können
zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in
geeigneter Weise während
der Kultivierung zugefüttert
werden.
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Zur
pH-Kontrolle der Kultur können
basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak
beziehungsweise Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder
Schwefelsäure in
geeigneter Weise eingesetzt werden. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung
können
Antischaummittel, wie zum Beispiel Fettsäurepolyglykolester eingesetzt
werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem
Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe, wie zum Beispiel Antibiotika
hinzugefügt
werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff
oder Sauerstoff-haltige Gasmischungen, wie zum Beispiel Luft in
die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise
bei 20°C
bis 45°C
und vorzugsweise bei 25°C
bis 40°C.
Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum des gewünschten Produktes
gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden
bis 160 Stunden erreicht.
-
Methoden
zur Bestimmung von L-Aminosäuren
sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Analyse kann zum Beispiel
so wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190)
beschrieben durch Anionenaustausch-Chromatographie mit anschliessender
Ninhydrin-Derivatisierung erfolgen, oder sie kann durch reversed
Phase HPLC erfolgen, so wie bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry
(1979) 51: 1167–1174) beschrieben.
-
Die
Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur fermentativen Herstellung
einer Aminosäure,
ausgewählt
aus der Gruppe L-Asparagin, L-Threonin, L-Serin, L-Glutamat, L-Glycin,
L-Alanin, L-Cystein, L-Valin, L-Methionin,
L-Isoleucin, L-Leucin, L-Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan
und L-Arginin, insbesondere
L-Lysin, unter Verwendung von coryneformen Bakterien, die insbesondere
bereits eine oder mehrere der genannten Aminosäuren produzieren.
-
Folgender
Mikroorganismus wurde am 19. 01. 2001 als Reinkultur bei der Deutschen
Sammlung für Mikroorganismen
und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) gemäss Budapester
Vertrag hinterlegt:
- – Escherichia coli Stamm Top10/pCR2.1citAint
als DSM 13998.
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Die
vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen
näher erläutert.
-
Die
Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli sowie alle Techniken
zur Restriktion, Klenow- und alkalische Phosphatasebehandlung wurden
nach Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 1989,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA)
durchgeführt.
Methoden zur Transformation von Escherichia coli sind ebenfalls
in diesem Handbuch beschrieben.
-
Die
Zusammensetzung gängiger
Nährmedien
wie LB- oder TV-Medium kann ebenfalls dem Handbuch von Sambrook
et al. entnommen werden.
-
Beispiel 1
-
Herstellung einer genomischen Cosmid-Genbank
aus C. glutamicum ATCC 13032.
-
Chromosomale
DNA aus C. glutamicum ATCC 13032 wurde wie bei Tauch et al. (1995,
Plasmid 33: 168–179)
beschrieben isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham
Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Code
no. 27-0913-02) partiell gespalten. Die DNA-Fragmente wurden mit
shrimp alkalischer Phosphatase (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim,
Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Code no. 1758250) dephosphoryliert.
Die DNA des Cosmid-Vektors
SuperCos1 (Wahl et al. (1987), Proceedings of the National Academy
of Sciences, USA 84: 2160–2164),
bezogen von der Firma Stratagene (La Jolla, USA, Produktbeschreibung
SuperCos1 Cosmid Vektor Kit, Code no. 251301) wurde mit dem Restriktionsenzym
XbaI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung
XbaI, Code no. 27-0948-02) gespalten und ebenfalls mit shrimp alkalischer
Phosphatase dephosphoryliert.
-
Anschliessend
wurde die Cosmid-DNA mit dem Restriktions enzym BamHI (Amersham
Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Code
no. 27-0868-04) gespalten. Die auf diese Weise behandelte Cosmid-DNA
wurde mit der behandelten ATCC13032-DNA gemischt und der Ansatz
mit T4-DNA-Ligase (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung
T4-DNA-Ligase, Code no.
27-0870-04) behandelt. Das Ligationsgemisch wurde anschliessend
mit Hilfe des Gigapack II XL Packing Extracts (Stratagene, La Jolla,
USA, Produktbeschreibung Gigapack II XL Packing Extract, Code no.
200217) in Phagen verpackt.
-
Zur
Infektion des E. coli Stammes NM554 (Raleigh et al. 1988, Nucleic
Acid Res. 16: 1563–1575)
wurden die Zellen in 10 mM MgSO4 aufgenommen
und mit einem Aliquot der Phagensuspension vermischt. Infektion
und Titerung der Cosmidbank wurden wie bei Sambrook et al. (1989,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) beschrieben
durchgeführt,
wobei die Zellen auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) +
100 μg/ml
Ampicillin ausplattiert wurden. Nach Inkubation über Nacht bei 37°C wurden
rekombinante Einzelklone selektioniert.
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Beispiel 2
-
Isolierung und Sequenzierung des Gens
citA
-
Die
Cosmid-DNA einer Einzelkolonie wurde mit dem Qiaprep Spin Miniprep
Kit (Product No. 27106, Qiagen, Hilden, Germany) nach Herstellerangaben
isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia,
Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Product No. 27-0913-02)
partiell gespalten. Die DNA-Fragmente
wurden mit shrimp alkalischer Phosphatase (Roche Molecular Biochemicals,
Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Product No. 1758250)
dephosphoryliert. Nach gelelektrophoretischer Auftrennung erfolgte
die Isolierung der Cosmidfragmente im Grössenbereich von 1500 bis 2000
bp mit dem QiaExII Gel Extraction Kit (Product No. 20021, Qiagen,
Hilden, Germany).
-
Die
DNA des Sequenziervektors pZero-1 bezogen von der Firma Invitrogen
(Groningen, Niederlande, Produktbeschreibung Zero Background Cloning
Kit, Product No. K2500-01) wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI
(Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung
BamHI, Product No. 27-0868-04) gespalten. Die Ligation der Cosmidfragmente
in den Sequenziervektor pZero-1 wurde wie von Sambrook et al. (1989, Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei
das DNA-Gemisch mit T4-Ligase (Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) über Nacht
inkubiert wurde. Dieses Ligationsgemisch wurde anschliessend in
den E. coli Stamm DH5αMCR
(Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A.,
87: 4645–4649)
elektroporiert (Tauch et al. 1994, FEMS Microbiol Letters, 123:
343–7)
und auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) mit 50 μg/ml Zeocin
ausplattiert.
-
Die
Plasmidpräparation
der rekombinanten Klone erfolgte mit dem Biorobot 9600 (Product
No. 900200, Qiagen, Hilden, Deutschland). Die Sequenzierung erfolgte
nach der Dideoxy-Kettenabbruch-Methode von Sanger et al. (1977,
Proceedings of the National Academies of Sciences, U.S.A., 74: 5463–5467) mit
Modifikationen nach Zimmermann et al. (1990, Nucleic Acids Research,
18: 1067). Es wurde der "RR
dRhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit" von PE Applied Biosystems (Product
No. 403044, Weiterstadt, Deutschland) verwendet. Die gelelektrophoretische
Auftrennung und Analyse der Sequenzierreaktion erfolgten in einem "Rotiphorese NF Acrylamid/Bisacrylamid" Gel (29:1) (Product
No. A124.1, Roth, Karlsruhe, Germany) mit dem "ABI Prism 377" Sequenziergerät von PE Applied Biosystems
(Weiterstadt, Deutschland).
-
Die
erhaltenen Roh-Sequenzdaten wurden anschliessend unter Anwendung
des Staden-Programmpakets (1986, Nucleic Acids Research, 14: 217–231) Version
97-0 prozessiert. Die Einzelsequenzen der pZero1-Derivate wurden
zu einem zusammenhängenden
Contig assembliert. Die computergestützten Codierbereichsanalysen
wurden mit dem Programm XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Research,
14: 217–231)
angefertigt. Weitere Analysen wurden mit dem "BLAST search program" (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids
Research, 25: 3389–3402)
gegen die non-redundant Datenbank des "National Center for Biotechnology Information" (NCBI, Bethesda,
MD, USA) durchgeführt.
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Die
erhaltene Nukleotidsequenz ist in SEQ ID No. 1 dargestellt. Die
Analyse der Nukleotidsequenz ergab ein offenes Leseraster von 1653
bp, welches als citA-Gen bezeichnet wurde. Das citA-Gen codiert
für ein Polypeptid
von 551 Aminosäuren.
-
Beispiel 3
-
Herstellung eines Integrationsvektors
für die
Integrationsmutagenese des citA-Gens
-
Aus
dem Stamm ATCC 13032 wurde nach der Methode von Eikmanns et al.
(Microbiology 140: 1817–1828
(1994)) chromosomale DNA isoliert. Aufgrund der aus Beispiel 2 für C. glutamicum
bekannten Sequenz des citA-Gens wurden die folgenden Oligonukleotide
für die
Polymerase-Kettenreaktion ausgewählt (siehe
SEQ ID No. 4 und SEQ ID No. 5):
-
Die
dargestellten Primer wurden von der Firma MWG Biotech (Ebersberg,
Deutschland) synthetisiert und nach der Standard-PCR-Methode von
Innis et al. (PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990,
Academic Press) mit der Taq-Polymerase der Firma Boehringer Mannheim
(Deutschland, Produktbeschreibung Taq DNA Polymerase, Product No.
1 146 165) die PCR Reaktion durchgeführt. Mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion ermöglichen
die Primer die Amplifikation eines 480 bp grossen internen Fragmentes des
citA-Gens. Das so amplifizierte Produkt wurde in einem 0,8%igen
Agarosegel elektrophoretisch geprüft.
-
Das
amplifizierte DNA-Fragment (siehe SEQ ID No. 3) wurde mit dem TOPO
TA Cloning Kit der Firma Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA;
Katalog Nummer K4500-01)
in den Vektor pCR2.1-TOPO (Mead at al. (1991) Bio/Technology 9:
657–663)
ligiert.
-
Anschliessend
wurde der E. coli Stamm TOP10 mit dem Ligationsansatz (Hanahan,
In: DNA cloning. A practical approach. Vol. I. IRL-Press, Oxford,
Washington DC, USA, 1985) elektroporiert. Die Selektion von Plasmidtragenden
Zellen erfolgte durch Ausplattieren des Transformationsansatzes
auf LB-Agar (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual.
2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, N. Y., 1989), der mit 50 mg/l Kanamycin supplementiert
worden war. Plasmid-DNA wurde aus einer Transformante mit Hilfe
des QIAprep Spin Miniprep Kit der Firma Qiagen isoliert und durch
Restriktion mit dem Restriktionsenzym EcoRI und anschliessende Agarosegel-Elektrophorese (0,8%) überprüft. Das
Plasmid wurde pCR2.1citAint genannt und ist in 1 dargestellt.
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Folgender
Mikroorganismus wurde als Reinkultur am 19.01.2001 bei der Deutschen
Sammlung für
Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland)
gemäss
Budapester Vertrag hinterlegt:
- – Escherichia
coli Top10/pCR2.1citAint als DSM 13998
-
Beispiel 4
-
Integrationsmutagenese des citA-Gens in
den Stämmen
DSM 5715 und FERM-BP 1763
-
Der
in Beispiel 3 genannte Vektor pCR2.1citAint wurde nach der Elektroporationsmethode
von Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters, 123: 343–347 (1994))
in die Stämme
Corynebacterium glutamicum DSM 5715 und Brevibacterium lactofermentum
FERM-BP 1763 elektroporiert. Bei dem Stamm DSM 5715 handelt es sich
um einen AEC-resistenten Lysin-Produzenten (
EP-B-0435132 ), bei dem Stamm FERM-BP
1763 um einen Mycophenolsäure-resistenten
Valin-Produzenten (
US-A-5,188,948 ).
Der Vektor pCR2.1citAint kann in DSM5715 und FERM-BP 1763 nicht
selbständig
replizieren und bleibt nur dann in der Zelle erhalten, wenn er ins
Chromosom von DSM 5715 bzw. FERM-BP 1763 integriert hat. Die Selektion
von Klonen mit ins Chromosom integriertem pCR2.1citAint erfolgte
durch Ausplattieren des Elektroporationsansatzes auf LB-Agar (Sambrook
et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2
nd Ed.
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.),
der mit 15 mg/l Kanamycin supplementiert worden war.
-
Für den Nachweis
der Integration wurde das citAint-Fragment nach der Methode "The DIG System Users
Guide for Filter Hybridization" der
Firma Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) mit
dem Dig-Hybridisierungskit
der Firma Boehringer markiert. Chromosomale DNA je eines potentiellen
Integranten wurde nach der Methode von Eikmanns et al. (Microbiology
140: 1817–1828
(1994)) isoliert und jeweils mit den Restriktionsenzymen EcoRI,
BamHI und HindIII geschnitten. Die entstehenden Fragmente wurden
mittels der Agarosegel-Elektrophorese aufgetrennt und mit dem Dig-Hybrisierungskit
der Firma Boehringer bei 68°C
hybridisiert. Das in Beispiel 3 genannte Plasmid pCR2.1citAint war
innerhalb des chromosomalen citA-Gens ins Chromosom von DSM5715
und ins Chromosom von FERM-BP 1763 inseriert worden. Die Stämme wurden
als DSM5715::pCR2.1citAint und FERM-BP 1763::pCR2.1citAint bezeichnet.
-
Beispiel 5
-
Herstellung von Lysin
-
Der
in Beispiel 4 erhaltene C.glutamicum Stamm DSM5715::pCR2.1citAint
wurde in einem zur Produktion von Lysin geeigneten Nährmedium
kultiviert und der Lysingehalt im Kulturüberstand bestimmt.
-
Dazu
wurde der Stamm zunächst
auf Agarplatte mit dem entsprechenden Antibiotikum (Hirn-Herz Agar
mit Kanamycin (25 mg/l) für
24 Stunden bei 33°C
inkubiert. Ausgehend von dieser Agarplattenkultur wurde eine Vorkultur
angeimpft (10 ml Medium im 100 ml Erlenmeyerkolben). Als Medium
für die
Vorkultur wurde das Vollmedium CgIII verwendet. Medium
CgIII
NaCl | 2,5
g/l |
Bacto-Pepton | 10
g/l |
Bacto-Yeast-Extrakt | 10
g/l |
Glucose
(getrennt autoklaviert) | 2%
(w/v) |
-
Der
pH-Wert wird auf pH 7,4 eingestellt
-
Diesem
wurde Kanamycin (25 mg/l) zugesetzt. Die Vorkultur wurde 16 Stunden
bei 33°C
bei 240 rpm auf dem Schüttler
inkubiert. Von dieser Vorkultur wurde eine Hauptkultur angeimpft,
so dass die Anfangs-OD (660 nm) der Hauptkultur 0,1 OD beträgt. Für die Hauptkultur
wurde das Medium MM verwendet. Medium
MM
CSL
(Corn Steep Liquor) | 5
g/l |
MOPS
(Morpholinopropansulfonsäure) | 20
g/l |
Glucose
(getrennt autoklaviert) | 50
g/l |
Salze: | |
(NH4)2SO4 | 25
g/l |
KH2PO4 | 0,1
g/l |
MgSO4·7
H2O | 1,0
g/l |
CaCl2·2
H2O | 10
mg/l |
FeSO4·7
H2O | 10
mg/l |
MnSO4·H2O | 5,0
mg/l |
Biotin
(sterilfiltriert) | 0,3
mg/l |
Thiamin·HCl (sterilfiltriert) | 0,2
mg/l |
Leucin
(sterilfiltriert) | 0,1
g/l |
CaCO3 | 25 g/l |
-
CSL,
MOPS und die Salzlösung
wurden mit Ammoniakwasser auf pH 7 eingestellt und autoklaviert. Anschliessend
wurden die sterilen Substrat- und Vitaminlösungen zugesetzt, sowie das
trocken autoklavierte CaCO3 zugesetzt.
-
Die
Kultivierung erfolgte in 10 ml Volumen in einem 100 ml Erlenmeyerkolben
mit Schikanen. Es wurde Kanamycin (25 mg/l) zugesetzt. Die Kultivierung
erfolgte bei 33°C
und 80% Luftfeuchtigkeit.
-
Nach
72 Stunden wurde die OD bei einer Messwellenlänge von 660 nm mit dem Biomek
1000 (Reckmann Instruments GmbH, München) ermittelt. Die gebildete
Lysinmenge wurde mit einem Aminosäureanalysator der Firma Eppendorf-BioTronik
(Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatographie und Nachsäulenderivatisierung
mit Ninhydrindetektion bestimmt.
-
In
Tabelle 1 ist das Ergebnis des Versuchs dargestellt. Tabelle 1
Stamm | OD
(660 nm) | Lysin-HCl
g/l |
DSM5715 | 7,5 | 13,3 |
DSM5715DpCR2.1citAint | 7,4 | 14,4 |
-
Beispiel 6
-
Herstellung von Valin
-
Der
in Beispiel 4 erhaltene B. lactofermentum Stamm FERM-BP 1763::pCR2.1citAint
wurde in einem zur Produktion von Valin geeigneten Nährmedium
kultiviert und der Valingehalt im Kulturüberstand bestimmt.
-
Dazu
wurde der Stamm zunächst
auf Agarplatte mit dem entsprechenden Antibiotikum (Hirn-Herz Agar
mit Kanamycin (25 mg/l) für
24 Stunden bei 33°C
inkubiert. Ausgehend von dieser Agarplattenkultur wurde eine Vorkultur
angeimpft (10 ml Medium im 100 ml Erlenmeyerkolben). Als Medium
für die
Vorkultur wurde das Vollmedium CgIII verwendet. Diesem wurde Kanamycin
(25 mg/l) zugesetzt. Die Vorkultur wurde 16 Stunden bei 33°C bei 240
rpm auf dem Schüttler
inkubiert. Von dieser Vorkultur wurde eine Hauptkultur angeimpft, so
dass die Anfangs-OD (660 nm) der Hauptkultur 0,1 OD betrug. Für die Hauptkultur
wurde das Medium MM verwendet. Medium
MM
CSL
(Corn Steep Liquor) | 5
g/l |
MOPS
(Morpholinopropansulfonsäure) | 20
g/l |
Glucose
(getrennt autoklaviert) | 50
g/l |
Salze: | |
(NH4)2SO4 | 25
g/l |
KH2PO | 0,1
g/l |
MgSO4·7
H2O | 1,0
g/l |
CaCl2·2
H2O | 10
mg/l |
FeSO4·7
H2O | 10
mg/l |
MnSO4·H2O | 5,0
mg/l |
Isoleucin
(sterilfiltriert) | 0,1
g/l |
Methionin
(sterilfiltriert) | 0,1
g/l |
Thiamin·HCl (sterilfiltriert) | 0,2
mg/l |
Leucin
(sterilfiltriert) | 0,1
g/l |
CaCO3 | 25
g/l |
-
CSL
(Corn Steep Liquor), MOPS (Morpholinopropansulfonsäure) und
die Salzlösung
wurden mit Ammoniakwasser auf pH 7 eingestellt und autoklaviert.
Anschliessend wurden die sterilen Substrat- und Vitaminlösungen zugesetzt,
sowie das trocken autoklavierte CaCO3 zugesetzt.
-
Die
Kultivierung erfolgte in 10 ml Volumen in einem 100 ml Erlenmeyerkolben
mit Schikanen. Es wurde Kanamycin (25 mg/l) zugesetzt. Die Kultivierung
erfolgte bei 33°C
und 80% Luftfeuchte.
-
Nach
48 Stunden wurde die OD bei einer Messwellenlänge von 660 nm mit dem Biomek
1000 (Beckmann Instruments GmbH, München) ermittelt. Die gebildete
Valinmenge wurde mit einem Aminosäureanalysator der Firma Eppendorf-BioTronik
(Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatographie und Nachsäulenderivatisierung
mit Ninhydrindetektion bestimmt.
-
In
Tabelle 2 ist das Ergebnis des Versuchs dargestellt. Tabelle 2
Stamm | OD
(660 nm) | Valin-HCl
g/l |
FERM-BP
1763 | 12,1 | 7,5 |
FERM-BP
1763 ☐pCR2.1citAint | 13,5 | 10,8 |
-
Folgende
Figur ist beigefügt:
-
1:
Karte des Plasmids pCR2.1citAint.
-
Die
verwendeten Abkürzungen
und Bezeichnungen haben folgende Bedeutung.
- KmR:
- Kanamycin Resistenz-Gen
- EcoRI:
- Schnittstelle des
Restriktionsenzyms EcoRI
- HindIII:
- Schnittstelle des
Restriktionsenzyms HindIII
- BamHI:
- Schnittstelle des
Restriktionsenzyms BamHI
- citAint:
- internes Fragment
des citA-Gens
- ColE1:
- Replikationsursprung
des Plasmides ColE1
-
-
-
-
-
-