DE19950409A1 - Neue für das pck-Gen codierende Nukleotidsequenzen - Google Patents
Neue für das pck-Gen codierende NukleotidsequenzenInfo
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Abstract
Isoliertes Polynukleotid aus coryneformen Bakterien, enthaltend eine Polynukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe DOLLAR A a) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2 enthält, DOLLAR A b) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für das Polypeptid codiert, das durch das in dem hiterlegten E.coli-Stamm DSM 13047 auf Vektor pK19mobsacBDELTAck enthaltene pck-Gen exprimiert wird, DOLLAR A c) Polynukleotid, das für ein Polypeptid codiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2, DOLLAR A d) Polynukleotid, das komplementär ist zu den Polynukleotiden von a), b) oder c), und DOLLAR A e) Polynukleotid, enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Basen der Polynukleotidsequenz von a), b), c) oder d).
Description
Gegenstand der Erfindung sind für das pck-Gen kodierende
Nukleotidsequenzen aus coryneformen Bakterien und ein
Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren,
insbesondere L-Lysin und L-Threonin, durch Abschwächung des
pck-Gens.
Aminosäuren, insbesondere Lysin und Threonin finden in der
Tierernährung, in der Lebensmittelindustrie, in der
pharmazeutischen Industrie und in der Humanmedizin
Anwendung.
Es ist bekannt, daß diese Stoffe durch Fermentation von
Stämmen coryneformer Bakterien insbesondere Corynebacterium
glutamicum hergestellt werden. Wegen der großen Bedeutung
wird ständig an der Verbesserung der Herstellverfahren
gearbeitet. Verfahrensbesserungen können
fermentationstechnische Maßnahmen wie z. B. Rührung und
Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der
Nährmedien wie z. B. die Zuckerkonzentration während der
Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform durch
z. B. Ionenaustauschchromatographie oder die intrinsischen
Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst
betreffen.
Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser
Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion
und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man
Stämme, die resistent gegen Antimetabolite oder auxotroph
für regulatorisch bedeutsame Stoffwechselprodukte sind und
die gewünschte Aminosäure produzieren.
Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der
rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung von L-
Aminosäure produzierenden Stämmen von Corynebacterium
eingesetzt.
Die Erfinder haben sich zur Aufgabe gestellt, neue
Maßnahmen zur verbesserten fermentativen Herstellung von
Aminosäuren der Öffentlichkeit zur Verfügung zu stellen.
Aminosäuren, insbesondere L-Lysin und L-Threonin, finden in
der Tierernährung, in der Lebensmittelindustrie, in der
pharmazeutischen Industrie und in der Humanmedizin
Anwendung. Es besteht daher ein allgemeines Interesse
daran, neue verbesserte Verfahren zur Herstellung dieser
Produkte bereitzustellen.
Gegenstand der Erfindung ist ein isoliertes Polynukleotid
aus coryneformen Bakterien, enthaltend eine
Polynukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe
- a) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2 enthält,
- b) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für das genannte Polypeptid codiert und auf dem Plasmid pEK-pckA (Abb. 1) bzw. pEK-pckB (Abb. 2) enthalten ist,
- c) Polynukleotid, das für ein Polypeptid codiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2,
- d) Polynukleotid, das komplementär ist zu den Polynukleotiden von a), b) oder c), und
- e) Polynukleotid, enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Basen der Polynukleotidsequenz von a), b), c) oder d).
Gegenstand der Erfindung ist ebenso eine in coryneformen
Mikroorganismen replizierbare, bevorzugt rekombinante DNA
mit der Herkunft Corynebacterium, die zumindest die
Nukleotidsequenz enthält, die für das pck-Gen, dargestellt
in der SEQ ID No. 1, codiert.
Gegenstand ist ebenfalls eine replizierbare DNA gemäß
Anspruch 1 enthaltend:
- a) die Nukleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID No. 1, oder
- b) mindestens eine Sequenz, die der Sequenz (i) innerhalb des Bereichs der Degeneration des genetischen Codes entspricht, oder
- c) mindestens eine Sequenz, die mit der zur Sequenz (i) oder (ii) komplementären Sequenz hybridi siert, und/oder gegebenenfalls
- d) funktionsneutralen Sinnmutationen in (i).
Weitere Gegenstände sind
ein Polynukleotid gemäß Anspruch 2, enthaltend die Nukleotidsequenz wie in SEQ ID No. 1 dargestellt,
ein Polynukleotid gemäß Anspruch 2, das für ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID No. 2 dargestellt, enthält
ein Vektor, enthaltend das Polynukleotid gemäß Anspruch 1, insbesondere pEK-pckA oder pEK-pckB, dargestellt in den Fig. 1 und 2
und als Wirtszelle dienende coryneforme Bakterien, in die die Δpck-Deletion eingebaut wurde.
ein Polynukleotid gemäß Anspruch 2, enthaltend die Nukleotidsequenz wie in SEQ ID No. 1 dargestellt,
ein Polynukleotid gemäß Anspruch 2, das für ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID No. 2 dargestellt, enthält
ein Vektor, enthaltend das Polynukleotid gemäß Anspruch 1, insbesondere pEK-pckA oder pEK-pckB, dargestellt in den Fig. 1 und 2
und als Wirtszelle dienende coryneforme Bakterien, in die die Δpck-Deletion eingebaut wurde.
Gegenstand der Erfindung sind ebenso Polynukleotide, die im
wesentlichen aus einer Polynukleotidsequenz bestehen, die
erhältlich sind durch Screening mittels Hybridisierung
einer entsprechenden Genbank, die das vollständige Gen mit
der Polynukleotidsequenz entsprechend SEQ ID No. 1
enthalten mit einer Sonde, die die Sequenz des genannten
Polynukleotids gemäß SEQ ID No. 1 oder ein Fragment davon
enthält und Isolierung der genannten DNA-Sequenz.
Polynukleotidsequenzen gemäß der Erfindung sind geeignet
als Hybridisierungs-Sonden für RNA, cDNA und DNA, um cDNA
in voller Länge zu isolieren, die für Phosphoenolpyruvat-
Carboxykinase codieren und solche cDNA oder Gene zu
isolieren, die eine hohe Ähnlichkeit der Sequenz mit der
des Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase Gens aufweisen.
Polynukleotidsequenzen gemäß der Erfindung sind weiterhin
als Primer zur Herstellung von DNA von Genen geeignet, die
für Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase codieren, durch die
Polymerase-Kettenreaktion (PCR).
Solche als Sonden oder Primer dienende Oligonukleotide
enthalten mindestens 30, bevorzugt mindestens 20, ganz
besonders bevorzugt mindestens 15 aufeinanderfolgende
Basen. Geeignet sind ebenfalls Oligonukleotide mit einer
Länge von mindestens 40 oder 50 Basenpaaren.
"Isoliert" bedeutet aus seinem natürlichen Umfeld
herausgetrennt.
"Polynukleotid" bezieht sich im allgemeinen auf
Polyribonukleotide und Polydeoxyribonukleotide, wobei es
sich um nicht modifizierte RNA und DNA oder modifizierte
RNA und DNA handeln kann.
Unter "Polypeptiden" versteht man Peptide oder Proteine,
die zwei oder mehr über Peptidbindungen verbundene
Aminosäuren erhalten.
Die Polypeptide gemäß Erfindung schließen das Polypeptid
gemäß SEQ ID No. 2, insbesondere solche mit der
biologischen Aktivität der PEP-Carboxykinase und auch
solche ein, die zu wenigstens 70% identisch sind mit dem
Polypeptid gemäß SEQ ID No. 2, bevorzugt zu wenigstens 80%
und besonders solche, die zu wenigstens 90% bis 95%
Identität zu dem Polypeptid gemäß SEQ ID No. 2 und die
genannte Aktivität aufweisen.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur
fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere
L-Lysin und L-Threonin unter Verwendung von coryneformen
Bakterien, die insbesondere bereits die L-Aminosäuren
produzieren und in denen die für das pck-Gen codierend(en)
Nukleotidsequenz(en) abgeschwächt, insbesondere auf
niedrigem Niveau exprimiert werden.
Der Begriff "Abschwächung" beschreibt in diesem
Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der
intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme
(Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die
entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise
einen schwachen Promotor verwendet oder ein Gen bzw. Allel
verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer
niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Enzym
(Protein) inaktiviert und gegebenenfalls diese Maßnahmen
kombiniert.
Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden
Erfindung sind, können L-Aminosäuren insbesondere Lysin und
Threonin aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose,
Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und
Ethanol herstellen. Es kann sich um Vertreter coryneformer
Bakterien insbesondere der Gattung Corynebacterium handeln.
Bei der Gattung Corynebacterium ist insbesondere die Art
Corynebacterium glutamicum zu nennen, die in der Fachwelt
für ihre Fähigkeit bekannt ist, L-Aminosäuren zu
produzieren.
Geeignete Stämme der Gattung Corynebacterium, insbesondere
der Art Corynebacterium glutamicum, sind beispielsweise die
bekannten Wildtypstämme
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
und daraus hergestellte L-Aminosäure produzierende Mutanten bzw. Stämme,
wie beispielsweise die Lysin produzierenden Stämme
Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709
Brevibacterium flavum FERM-P 1708
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 und
Corynebacterium glutamicum DSM5714 oder
wie beispielsweise die L-Threonin produzierenden Stämme
Corynebacterium glutamicum ATCC21649
Brevibacterium flavum BB69
Brevibacterium flavum DSM5399
Brevibacterium lactofermentum FERM-BP 269
Brevibacterium lactofermentum TBB-10
Corynebacterium glutamicum MH20-22B-DR17.
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
und daraus hergestellte L-Aminosäure produzierende Mutanten bzw. Stämme,
wie beispielsweise die Lysin produzierenden Stämme
Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709
Brevibacterium flavum FERM-P 1708
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 und
Corynebacterium glutamicum DSM5714 oder
wie beispielsweise die L-Threonin produzierenden Stämme
Corynebacterium glutamicum ATCC21649
Brevibacterium flavum BB69
Brevibacterium flavum DSM5399
Brevibacterium lactofermentum FERM-BP 269
Brevibacterium lactofermentum TBB-10
Corynebacterium glutamicum MH20-22B-DR17.
Den Erfindern gelang es, das neue, für das Enzym
Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase (PEP-Carboxykinase)
(EC 4.1.1.49) kodierende pck-Gen von C. glutamicum zu
isolieren.
Zur Isolierung des pck-Gens oder auch anderer Gene von C.
glutamicum wird zunächst eine Genbank dieses Mikrorganismus
in E. coli angelegt. Das Anlegen von Genbanken ist in
allgemein bekannten Lehrbüchern und Handbüchern
niedergeschrieben. Als Beispiel seien das Lehrbuch von
Winnacker: Gene und Klone. Eine Einführung in die
Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Deutschland, 1990)
oder das Handbuch von Sambrook et al.: Molecular Cloning, A
Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press,
1989) genannt. Eine sehr bekannte Genbank ist die des E.
coli K-12 Stammes W3110, die von Kohara et al. (Cell 50,
495-508 (1987)) in λ-Vektoren angelegt wurde. Bathe et
al. (Molecular and General Genetics, 252: 255-265, 1996)
beschreiben eine Genbank von C. glutamicum ATCC13032, die
mit Hilfe des Cosmidvektors SuperCos I (Wahl et al., 1987,
Proceedings of the National Academy of Sciences USA,
84: 2160-2164) im E. coli K-12 Stamm NM554 (Raleigh et al.,
1988, Nucleic Acids Research 16: 1563-1575) angelegt wurde.
Börmann et al. (Molecular Microbiology 6(3), 317-325)
wiederum beschreiben eine Genbank von C. glutamicum
ATCC13032 unter Verwendung des Cosmids pHC79 (Hohn und
Collins, Gene 11, 291-298 (1980)).
Zur Herstellung einer Genbank von C. glutamicum in E. coli
können auch Plasmide bzw. Plasmidvektoren wie
beispielsweise pBR322 (Bolivar, Life Sciences, 25, 807-818
(1979)), pUC9 (Vieira et al., 1982, Gene, 19 : 259-268),
pACYC177 (Chang und Cohen, Journal of Bacteriology 134,
1141-1156 (1978)) oder pSC101 (Cohen und Chang, Journal of
Bacteriology 132, 734-737 (1977)) verwendet werden. Als
Wirte eignen sich besonders solche E. coli-Stämme, die
restriktions- und rekombinationsdefekt sind.
Die Genbank wird anschließend in einen Indikatorstamm durch
Transformation (Hanahan, Journal of Molecular Biology 166,
557-580, 1983) oder Elektroporation (Tauch et. al., 1994,
FEMS Microbiological Letters, 123: 343-347) eingebaut. Ber
Indikatorstamm zeichnet sich dadurch aus, daß er eine
Mutation in dem interessierenden Gen besitzt, die einen
detektierbaren Phänotyp hervorruft. Im Rahmen der
vorliegenden Erfindung ist die von Goldie und Sanwal
(Journal of Bacteriology 141: 1115-1121 (1980))
beschriebene E. coli Mutante HG4 von Bedeutung. Dieser
Stamm trägt eine Mutation im pck-Gen, wodurch das Wachstum
auf Succinat als alleiniger Kohlenstoffquelle stark
beeinträchtigt wird. Durch Transformation mit einem das
pck-Gen enthaltenden Vektor kann das Wachstum auf Succinat
wiederhergestellt werden.
Die mit Hilfe von Cosmiden oder anderen Vektoren klonierten
langen DNA-Fragmente können anschließend in Form kürzerer
DNA-Fragmente in bekannte Plasmidvektoren subkloniert
werden. Dadurch wird die Zuordnung des erfindungsgemäßen
Gens zu einem spezifischen DNA-Abschnitt ermöglicht. Hierzu
verwendet man aus dem Stand der Technik bekannte
Plasmidvektoren wie z. B. pBR322 (Bolivar, Life Sciences,
25, 807-818 (1979)) oder die von Bartolomé et al. (Gene
102, 75-78 (1991)) beschriebenen pSU-Vektoren. Vorzugsweise
verwendet man jedoch Pendelvektoren, die sowohl in
Escherichia coli als auch in Corynebacterium glutamicum
replizieren, wie z. B. pZ1 (Menkel et al., Applied and
Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554) oder pEKO
(Eikmanns et al., Gene 102 (1991)), um Untersuchungen in
beiden Spezies durchführen zu können. Beispiele hierfür
sind die Plasmide pEK-pckA (Fig. 1) und pEK-pckB (Fig.
2), die ausgehend von dem Plasmidvektor pEKO hergestellt
wurden und das erfindungsgemäße pck-Gen tragen.
Die auf diese Weise charakterisierten DNA-Abschnitte werden
anschließend wiederum in gängige für die DNA-Sequenzierung
geeignete Vektoren subkloniert. Alternativ können die
langen in Cosmiden klonierten DNA-Abschnitte direkt in
Sequenziervektoren subkloniert werden. Beispiele für
derartige für die DNA-Sequenzierung geeignete Vektoren sind
die Plasmide pGEM-5zf(-) oder pGEM-5zf(+) der Firma Promega
Corporation (Promega Protocols and Application Guide,
Second Edition, 1991, part number Y981, Promega
Corporation, Madison, WI, USA).
Methoden zur DNA-Sequenzierung sind unter anderem bei
Sanger et al. (Proceedings of the National of Sciences of
the United States of America USA, 74: 5463-5467, 1977)
beschrieben.
Die erhaltenen DNA-Sequenzen können dann mit bekannten
Algorithmen bzw. Sequenzanalyse-Programmen wie z. B. dem
von Staden (Nucleic Acids Research 14, 217-232(1986)), dem
GCG-Programm von Butler (Methods of Biochemical Analysis
39, 74-97 (1998)) dem FASTA-Algorithmus von Pearson und
Lipman (Proceedings of the National Academy of Sciences USA
85, 2444-2448 (1988)) oder dem BLAST-Algorithmus von
Altschul et al. (Nature Genetics 6, 119-129 (1994))
untersucht und mit den in öffentlich zugänglichen
Datenbanken vorhandenen Sequenzeinträgen verglichen werden.
Öffentlich zugängliche Datenbanken für Nukleotidsequenzen
sind beispielsweise die der European Molecular Biologies
Laboratories (EMBL, Heidelberg, Deutschland) oder die des
National Center for Biotechnology Information (NCBI,
Bethesda, MD, USA).
Auf diese Weise wurde die neue für das pck-Gen kodierende
DNA-Sequenz von C. glutamicum erhalten, die als SEQ ID No.
1 Bestandteil der vorliegenden Erfindung ist. Weiterhin
wurde aus der vorliegenden DNA-Sequenz mit den oben
beschriebenen Methoden die Aminosäuresequenz des
entsprechenden Proteins abgeleitet. In SEQ ID No. 2 ist die
sich ergebende Aminosäuresequenz des pck-Genproduktes
dargestellt.
Kodierende DNA-Sequenzen, die sich aus SEQ ID No. 1 durch
die Degeneriertheit des genetischen Codes ergeben, sind
ebenfalls Bestandteil der Erfindung. In gleicher Weise sind
DNA-Sequenzen, die mit SEQ ID No. 1 oder Teilen von SEQ ID
No. 1 hybridisieren Bestandteil der Erfindung. Schließlich
sind DNA-Sequenzen Bestandteil der Erfindung, die durch die
Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung von
Primern hergestellt werden, die sich aus SEQ ID No. 1
ergeben. Derartige Oligonukleotide haben typischerweise
eine Länge von mindestens 15 Basenpaaren.
Anleitungen zur Identifizierung von DNA-Sequenzen mittels
Hybridisierung findet der Fachmann unter anderem im
Handbuch "The DIG System Users Guide for Filter
Hybridization" der Firma Boehringer Mannheim GmbH
(Mannheim, Deutschland, 1993) und bei Liebl et al.
(International Journal of Systematic Bacteriology (1991)
41: 255-260). Anleitungen zur Amplifikation von DNA-
Sequenzen mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
findet der Fachmann unter anderem im Handbuch von Gait:
Oligonukleotide synthesis: a practical approach (IRL Press,
Oxford, UK, 1984) und bei Newton und Graham: PCR (Spektrum
Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994).
Die Erfinder fanden heraus, daß coryneforme Bakterien nach
Abschwächung des pck-Gens in verbesserter Weise L-
Aminosäuren insbesondere Lysin und Threonin produzieren.
Zur Erzielung einer Abschwächung kann entweder die
Expression des pck-Gens oder die katalytischen
Eigenschaften des Enzymproteins herabgesetzt bzw.
ausgeschaltet werden. Gegebenenfalls können beide Maßnahmen
kombiniert werden.
Die Erniedrigung der Genexpression kann durch geeignete
Kulturführung oder durch genetische Veränderung (Mutation)
der Signalstrukturen der Genexpression erfolgen.
Signalstrukturen der Genexpression sind beispielsweise
Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren,
Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen, das Startkodon und
Terminatoren. Angaben hierzu findet der Fachmann z. B. in
der Patentanmeldung WO 96/15246, bei Boyd und Murphy
(Journal of Bacteriology 170: 5949 (1988)), bei Voskuil und
Chambliss (Nucleic Acids Research 26: 3548 (1998), bei
Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191
(1998)), bei Patek et al. (Microbiology 142: 1297 (1996)
und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und
Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers
("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag,
Stuttgart, Deutschland, 1995) oder dem von Winnacker ("Gene
und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland,
1990).
Mutationen, die zu einer Veränderung bzw. Herabsetzung der
katalytischen Eigenschaften von Enzymproteinen führen, sind
aus dem Stand der Technik bekannt; als Beispiele seien die
Arbeiten von Qiu und Goodman (Journal of Biological
Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Sugimoto et al.
(Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61: 1760-1762
(1997)) und Möckel ("Die Threonindehydratase aus
Corynebacterium glutamicum: Aufhebung der allosterischen
Regulation und Struktur des Enzyms", Berichte des
Forschungszentrums Jülichs, Jül-2906, ISSN09442952, Jülich,
Deutschland, 1994) genannt. Zusammenfassende Darstellungen
können bekannten Lehrbüchern der Genetik und
Molekularbiologle wie z. B. dem von Hagemann ("Allgemeine
Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen
werden.
Als Mutationen kommen Transitionen, Transversionen,
Insertionen und Deletionen in Betracht. In Abhängigkeit von
der Wirkung des Aminosäureaustausches auf die
Enzymaktivität wird von Fehlsinnmutationen (missense
mutations) oder Nichtsinnmutationen (nonsense mutations)
gesprochen. Insertionen oder Deletionen von mindestens
einem Basenpaar in einem Gen führen zu
Rasterverschiebungsmutationen (frame shift mutations), die
dazu führen, daß falsche Aminosäuren eingebaut werden oder
die Translation vorzeitig abbricht. Deletionen von mehreren
Kodonen führen typischerweise zu einem vollständigen
Ausfall der Enzymaktivität. Anleitungen zur Erzeugung
derartiger Mutationen gehören zum Stand der Technik und
können bekannten Lehrbüchern der Genetik und
Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers
("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag,
Stuttgart, Deutschland, 1995), dem von Winnacker ("Gene und
Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland,
1990) oder dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav
Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.
Ein Beispiel für ein mutiertes pck-Gen ist das in Plasmid
pK19mobsacBΔpck (Fig. 3) enthaltene Δpck-Allel. Das Δpck-
Allel enthält lediglich die 5'- und die 3'-Flanke des pck-
Gens; ein 1071 bp langer Abschnitt der Kodierregion fehlt
(Deletion). Dieses Δpck-Allel kann durch
Integrationsmutagenese in coryneforme Bakterien eingebaut
werden. Hierzu bedient man sich des oben angegebenen
Plasmides pK19mobsacBΔpck, das in C. glutamicum nicht
replizierbar ist. Nach Übertragung durch Konjugation oder
Transformation und homologer Rekombination mittels eines
ersten, Integration bewirkenden "cross over"-Ereignisses
und eines zweiten, eine Excision bewirkenden "cross over"-
Ereignisses im pck-Gen erreicht man den Einbau des Δpck-
Allels und erzielt einen Totalverlust der Enzymfunktion in
dem jeweiligen Stamm.
Anleitungen und Erläuterungen zur Integrationsmutagenese
findet man beispielsweise bei Schwarzer und Pühler
(Bio/Technology 9, 84-87 (1991)) oder Peters-Wendisch et al.
(Microbiology 144, 915-927 (1998)).
Beispiele für Aminosäure produzierenden Stämme coryneformer
Bakterien mit abgeschwächtem pck-Gen sind der Lysin
produzierende Stamm MH20-22BΔpck und der
Threonin-produzierende Stamm DM368-2Δpck.
Zusätzlich kann es für die Produktion von L-Aminosäuren
vorteilhaft sein, zusätzlich zur Abschwächung des pck-Gens
eines oder mehrere Enzyme des jeweiligen Biosyntheseweges
zu überexprimieren.
So kann beispielsweise für die Herstellung von L-Lysin
- - gleichzeitig das für die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende dapA-Gen überexprimiert werden (EP-B 0 197 335), oder
- - gleichzeitig ein S-(2-Aminoethyl)-Cystein-Resistenz vermittelndes DNA-Fragment amplifiziert werden (EP-A 0 088 166).
So können beispielsweise für die Herstellung von L-Threonin
- - gleichzeitig das für die Homoserin-Dehydrogenase kodierende hom-Gen (Peoples et al., Molecular Microbiology 2, 63-72 (1988)) oder die für eine "feed back resistente" Homoserin-Dehydrogenase kodierenden homdr- bzw. homFBR Allele (Archer et al., Gene 107, 53-59 (1991); Remscheid et al., Journal of Bacteriology 173, 3228-3230 (1991)) überexprimiert werden.
Weiterhin kann es für die Produktion von L-Aminosäuren
insbesondere Lysin und Threonin vorteilhaft sein, neben der
Abschwächung des pck-Gens unerwünschte Nebenreaktionen
auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing
Micro-organisms", in: Overproduction of Microbial Products,
Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London,
UK, 1982).
Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können
kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren
(Satzkultivierung) oder im feed batch (Zulaufverfahren) oder
repeated feed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren)
zum Zwecke der Produktion von L-Aminosäuren insbesondere L-
Lysin und L-Threonin kultiviert werden. Eine
Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden sind im
Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die
Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart,
1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und
periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag,
Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den
Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen
von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im
Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der
American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA,
1981) enthalten. Als Kohlenstoffquelle können Zucker und
Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose,
Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und
Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und
Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure
und Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol und
organische Säuren wie z. B. Essigsäure verwendet werden.
Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet
werden. Als Stickstoffquelle können organische Stickstoff-
haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt,
Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser,
Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen
wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat,
Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die
Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung
verwendet werden. Als Phosphorquelle können Phosphorsäure,
Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder
die entsprechenden Natrium haltigen Salze verwendet werden.
Das Kulturmedium muß weiterhin Salze von Metallen enthalten
wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das
Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle
Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den
oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium
können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die
genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines
einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise
während der Kultivierung zugefüttert werden.
Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen
wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw.
Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure
oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur
Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie
z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur
Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem
Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe z. B. Antibiotika
hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen
aufrechtzuerhalten werden Sauerstoff oder Sauerstoff
haltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur
eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise
bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C. Die
Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum der
gewünschten L-Aminosäure gebildet hat. Dieses Ziel wird
normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden
erreicht.
Folgender Mikroorganismus wurde bei der Deutschen Sammlung
für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig,
Deutschland) gemäß Budapester Vertrag hinterlegt:
- - Escherichia coli Stamm DH5α/pK19mobsacBΔpck als DSM 13047.
Das erfindungsgemäße Verfahren dient zur fermentativen
Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-
Asparaginsäure, L-Asparagin, L-Homoserin, L-Threonin, L-
Isoleucin und L-Methionin mit coryneformen Bakterien,
insbesondere der Herstellung von L-Lysin und L-Threonin.
Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von
Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Zu diesem Zweck wurden unter anderem Versuche mit dem
Lysin-Produzenten Corynebacterium glutamicum Stamm MH20-22B
und dem Threonin-Produzenten Brevibacterium flavum Stamm
DM368-2 durchgeführt. Stamm MH20-22B ist als DSM5715
(EP-B-0 435 132) und Stamm DM368-2 als DSM5399 (EP-B-0 385 940)
bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und
Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) gemäß
Budapester Vertrag hinterlegt.
Zur Isolierung des PEP-Carboxykinase-Gens (pck) aus C.
glutamicum wurde basierend auf dem Cosmid pHC79 (Hohn und
Collins, Gene 11 (1980) 291-298) eine Cosmid-Genbank nach
bekannter Methodik (Sambrook et al., Molecular Cloning, A
Laboratory Handbook, 1989, Cold Spring Harbour Laboratory
Press) angelegt. Dazu wurde aus C. glutamicum ATCC13032
chromosomale DNS isoliert (Eikmanns et al., Microbiology
140 (1994) 1817-1828) und mit dem Restriktionsenzym Sau3A
partiell verdaut. Nach Ligation der erhaltenen Fragmente in
die BamHI-Schnittstelle des Cosmids pHC79 wurde der Ansatz
in die Proteinhülle des Bakteriophagen Lambda verpackt und
der E. coli-Stamm ED8654 (Murray et al. Molecular and
General Genetics 150 (1997) 53-61) damit transfiziert. Die
Verpackung der rekombinanten Cosmide in die Proteinhülle
des Phagen Lambda erfolgte nach einer Methode von Sternberg
et al. (Gene 1 (1979) 255-280), die Transfektion von E.
coli ED8654 nach einer Methode von Sambrook et al.
(Molecular Cloning, A Laboratory Handbook, 1989, Cold
Spring Harbour Laboratory Press). Aus insgesamt 30 der
erhaltenen rekombinanten E. coli-Klone wurden die
entsprechenden Cosmide isoliert (Sambrock et al., Molecular
Cloning, A Laboratory Handbook, 1989, Cold Spring Harbour
Laboratory Press) und einer Restriktionsanalyse mit dem
Enzym HindIII unterzogen. Es zeigte sich, daß 24 der
untersuchten Cosmide Inserts besaßen, und daß die Inserts
Größen von ungefähr 35 kb aufwiesen. Insgesamt 2200 Cosmid-
tragende E. coli-Klone wurden vereinigt und aus diesem
Gemisch nach bekanntem Verfahren (Sambrock et al.,
Molecular Cloning, A Laboratory Handbook, 1989, Cold Spring
Harbour Laboratory Press) die Cosmid-DNA präpariert.
Zur Isolierung des pck-Gens aus C. glutamicum wurde die
Cosmid-Genbank in die PEP-Carboxykinase-defekte E. coli-
Mutante HG4 (Goldie and Sanwal, Journal of Bacteriology 141
(1980) 115-1121) nach bekanntem Verfahren (Sambrock et al.,
Molecular Cloning, A Laboratory Handbook, 1989, Cold Spring
Harbour Laboratory Press) transformiert. Die Mutante HG4
ist aufgrund ihres PEP-Carboxykinase-Defektes nicht mehr in
der Lage, auf Succinat als einziger Kohlenstoffquelle zu
wachsen. Nach Transformation der Cosmid-Genbank in diese
Mutante wurden insgesamt 1200 Klone erhalten. Von diesen
zeigten insgesamt zwei Klone Wachstum auf M9-Minimalmedium
(Sambrock et al., Molecular Cloning, A Laboratory Handbook,
1989, Cold Spring Harbour Laboratory Press) mit Succinat
(0.4%) als einziger Kohlenstoffquelle. Nach Isolierung der
entsprechenden Cosmide (Sambrock et al., Molecular Cloning,
A Laboratory Handbook, 1989, Cold Spring Harbour Laboratory
Press) aus diesen Klonen und erneuter Transformation in die
E. coli-Mutante HG4 waren die resultierenden Klone erneut
in der Lage, auf M9-Medium mit Succinat als einziger
Kohlenstoffquelle zu wachsen.
Um das pck-Gen aus C. glutamicum auf einem kleineren
Fragment einzugrenzen, wurden die zwei komplementierenden
Cosmide mit den Restriktionsenzymen XhoI, ScaI und PvuII
verdaut und nach bekannter Methode (Sambrock et al.,
Molecular Cloning, A Laboratory Handbook, 1989, Cold Spring
Harbour Laboratory Press) auf einem 0,8%igen Agarosegel im
elektrischen Feld aufgetrennt. Fragmente im Größenbereich
über 3,0 kb wurden durch Elektroelution (Sambrock et al.,
Molecular Cloning, A Laboratory Handbook, 1989, Cold Spring
Harbour Laboratory Press) aus dem Gel isoliert und in die
SalI (XhoI-Verdau), bzw. in die Klenow-behandelte EcoRI-
Schnittstelle (ScaI- und PvuII-Verdau) des Vektors pEKO
(Eikmanns et al., Gene 102 (1991) 93-98) ligiert. Mit den
Ligationsansätzen wurde E. coli HG4 transformiert und die
erhaltenen Transformanten erneut auf ihre Fähigkeit
untersucht, auf Succinat als alleiniger Kohlenstoffquelle
zu wachsen. In dem Transformationsansatz mit dem PvuII-
Ligationsansatz zeigten sich sieben Klone, deren Plasmide
der Mutante HG4 Wachstum auf Succinat erlaubten. Aus den
rekombinanten Stämmen wurden die entsprechenden Plasmide
isoliert und einer Restriktionskartierung unterzogen. Es
zeigte sich, daß alle sieben Plasmide das gleiche 4.3-kb
PvuII-Insert trugen, drei in der einen Orientierung, vier
in der anderen. In Abhängigkeit von der Orientierung des
Inserts im Vektor wurden die neu konstruierten Plasmide als
pEK-pckA und pEK-pckB bezeichnet. Die Restriktionskarten
beider Plasmide sind in Fig. 1 und 2 dargestellt.
Für die Sequenzierung wurde das circa 3.9 kb große EcoRI-
Fragment aus pEK-pckA (dabei stammt eine EcoRI-
Schnittstelle aus dem Vektor pEKO) nach bekannter Methode
isoliert. Die überhängenden Enden des Fragmentes wurden mit
Klenow-Polymerase zu glatten Enden aufgefüllt (Sambrock et
al., Molecular Cloning, A Laboratory Handbook, 1989, Cold
Spring Harbour Laboratory Press) und in die EcoRV-
Schnittstelle des Vektors pGEM-5Zf(+)(Promega Corporation,
Madison, WI, USA) ligiert. Die Insertion des so erzeugten
Plasmides wurde durch die Kettenabbruch-Sequenziermethode
(Sanger et al., Proceedings of the National Academy of
Sciences USA, 74 (1977) 5463-5467) sequenziert. Sie ist als
SEQ ID No. 1 dargestellt. Die erhaltene Nukleotidsequenz
von 3935 bp wurde mit dem Programmpaket HUSAR (Release 3.0)
des Deutschen Krebsforschungszentrums (DKFZ, Heidelberg,
Deutschland) analysiert. Die Sequenzanalyse der Fragmente
ergab ein offenes Leseraster von 1830 bp Länge, das für
eine Protein bestehend aus 610 Aminosäuren kodiert.
Durch Elektroporation mit nachfolgender Selektion auf
Kanamycin (50 µg/ml) enthaltenden BHI-Agarplatten (Liebl et
al., FEMS Microbiology Letters 65 (1989) 299-304) wurden
die Plasmide pEK-pckA und pEK-pckB in den C. glutamicum
Stamm ATCC13032 eingeführt und die resultierenden Stämme
als ATCC13032/pEK-pckA und ATCC13032/pEK-pckB bezeichnet.
Diese beiden Stämme und der Ausgangsstamm wurden in Luria-
Bertani-Komplexmedium [Sambrook et al., Molecular Cloning,
A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory
Press] gezüchtet und der PEP-Carboxykinase-Test
entsprechend der Methode wie sie von Bentle and Lardy
[Journal of Biological Chemistry 251 (1976) 2916-2921]
beschrieben wurde, durchgeführt. Das Ergebnis der Analyse
ist in Tabelle 1 dargestellt und zeigt, daß die PEP-
Carboxykinase-Aktivität in den beiden Stämmen mit den
Plasmiden pEK-pckA bzw. pEK-pckB 10- bis 12fach höher ist
als im Ausgangsstamm.
Für die Inaktivierung des PEP-Carboxykinase-Gens wurde aus
dem Vektor pEK-pckB (Fig. 2) das EcoRI-SacI Fragment des
pck-Gens isoliert und in den Vector pGEM-7Zf(+)(Promega
Corporation, Madison, WI, USA) einligiert. Aus dem
resultierenden Plasmid wurde ein pck-internes 1,07 kb
HindII-HindIII-Fragment deletiert, anschließend das pck-Gen
mit der 1,07-kb-Deletion als BfrI-SacI-Fragment isoliert
und nach Auffüllen der überhängenden Enden in den in C.
glutamicum nicht-replikativen Vektor pk19mobsacB (Schäfer
et al., Gene 145, 69-73 (1994)) ligiert. In dem so
konstruierten Integrationsplasmid pK19mobsacBΔpck (Fig. 3)
grenzt der 5'-Bereich des pck-Gens (350 bp) direkt an den
3'-Bereich des pck-Gens (340 bp); im Genom sind die beiden
Bereiche durch 1071 bp voneinander getrennt. Bis zu diesem
Schritt wurden alle Klonierungen in EL coli DH5α als Wirt
durchgeführt.
Mit dem Integrationsplasmid pK19mobsacBΔpck wurde dann E.
coli S17-1 transformiert (Simon et al., Bio/Technology
1,784-791 (1983)). Dieser Stamm ermöglicht den Transfer
eines Plasmides nach Corynebacterium glutamicum durch
Konjugation (Schäfer et al., Journal of Bacteriology 172
(1990) 1663-1666). Als Rezipient der Konjugation wurde der
Lysinproduktionsstamm C. glutamicum MH20-22B verwendet
(Schrumpf et al., Applied Microbiology and Biotechnology 37
(1992) 566-571)). Aus der Konjugation zwischen E. coli
S17-1/pk19mobsacBΔpck und C. glutamicum MH20-22B und
nachfolgenden Selektion auf Luria-Bertani-Agar-Platten mit
Kanamycin (25 µg/ml) und Nalidixinsäure (50 µg/ml) wurden
mehrere Transkonjuganten erhalten. Zur Selektion auf das
zweite Rekombinationsereignis, das zur Excision des Vektors
samt pck-Gen führen soll, wurden diese Transkonjuganten auf
Antibiotika-freiem Luria-Bertani-Komplexmedium [Sambrook et
al. Molecular Cloning, A laboratory manual (1989) Cold
Spring Harbour Laboratory Press] mit 1% Glucose kultiviert
und dann auf dem gleichen Medium plus 10% Saccharose
plattiert. Das auf dem Vektor pk19mobsacB vorhandene sacB-
Gen kodiert für das Enzym Levansucrase und führt zur
Synthese von Levan aus Saccharose. Da Levan für C.
glutamicum toxisch ist, können nur C. glutamicum Zellen,
die das Integrationsplasmid verloren haben, auf Saccharose-
haltigem Medium wachsen (Jäger et al., Journal of
Bacteriology 174 (1992) 5462-5466). 30 Saccharose-
resistente Klone wurden auf ihre Kanamycin-Sensitivität hin
überprüft. Für 11 der getesteten Klone konnte neben der
Saccharose-Resistenz auch die gewünschte Kanamycin-
Sensitivität bestätigt werden. In diesen 11 Klonen war also
der Vektorhintergrund wieder excisiert. Ob auch die
gewünschte Deletion erfolgt war, wurde durch Analyse
mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) geprüft. Dafür
wurde chromosomale DNA von einer Kolonie des Ausgangsstamms
und von Kolonien der 11 Kanamycin-sensitiven Klone
freigesetzt. Hierzu wurde die jeweilige Kolonie mit einem
Zahnstocher von der Agarplatte abgenommen, in 50 µl H2O
suspendiert und 5 Minuten bei 95°C inkubiert. Jeweils 1 µl
der erhaltenden Lösung wurden als Template in die PCR
eingesetzt. Als Primer wurden Oligonukleotide verwendet,
die die Bereiche von Nukleotid 2136 bis 2158 und von 3815
bis 3793 in der SEQ ID No. 1 abdecken. Die PCR-Bedingungen
waren: Vorabdenaturierung: 150 Sekunden bei 94°C;
Denaturierung 60 Sekunden bei 94°C; Hybridisierung 30
Sekunden bei 60°C; Amplifizierung 120 Sekunden bei 72°C; 30
Zyklen, End-Extension 240 Sekunden bei 72°C. Im Ansatz mit
der DNA des Ausgangsstammes wurde aufgrund der gewählten
Primer ein PCR-Produkt von 1,68 kb erwartet. In der PCR mit
der pck-Deletionsmutante wurde ein PCR-Produkt von 0,61 kb
erwartet. Bei einem Klon wurde ein 0,61 kb großes PCR-
Produkt erhalten. Dadurch wurde die gewünschte Deletion des
internen 1071 bp großen pck-Fragmentes bei diesem Klon
nachgewiesen. Der Klon wurde als MH20-22BΔpck bezeichnet.
In den Ansätzen der übrigen Klonen wurde das 1,68 kb PCR-
Produkt nachgewiesen. In diesen war der Vektor also so
excisiert, daß die genomische Ausgangssituation wieder
hergestellt war.
Der Stamm MH20-22BΔpck und der Ausgangsstamm MH20-22B
wurden in Luria-Bertani-Komplexmedium plus 1% Glucose
angezogen und der PEP-Carboxykinase-Test wurde entsprechend
der Methode, wie sie bei Bentle and Lardy (Journal of
Biological Chemistry 251 (1976) 2916-2921) beschrieben ist,
durchgeführt. Das Ergebnis der Analyse (Tabelle 2) zeigt,
daß in der Mutante MH20-22BΔpck im Gegensatz zum
Ausgangsstamm MH20-22B keine PEP-Carboxykinase-Aktivität
mehr nachweisbar ist.
Zur Untersuchung der Auswirkung der Inaktivierung des PEP-
Carboxykinase-Gens auf die Lysinproduktion wurde der Stamm
MH20-22B (Schrumpf et al., Applied Microbiology and
Biotechnology 1992, 37: 566-571) sowie die PEP-
Carboxykinase-negative Mutante MH20-22BΔpck (Beispiel 5) in
Luria-Bertani-Komplexmedium plus 1% Glucose kultiviert und
das Fermentationsmedium CGXII (Keilhauer et al., Journal of
Bacteriology 1993, 175: 5595-5603) aus den beiden
Vorkulturen beimpft (5% Inokulum, Optische Dichte bei
600 nm circa 0,5). Das Medium enthielt zusätzlich 3 mM Leucin,
da die beiden Stämme Leucin-auxotroph sind. Die Ansätze
bestanden aus jeweils 60 ml Kultur, die in 500 ml-
Erlenmeyer-Kolben mit Schikanen enthalten waren. Nach
Kultivierung für 24 Stunden bei 28°C auf einem
Rotationsschüttler vom Typ Certomat S/50 (Firma B. Braun
Biotech International, Melsungen, Deutschland) bei 120 Upm
wurde die Konzentration des in das Medium ausgeschiedenen
Lysins bestimmt.
Die Bestimmung der Aminosäurekonzentration erfolgte mittels
Hochdruckflüssigkeitschromatographie (Jones und Gilligan,
Journal of Chromatography 1983, 266: 471-482). Das Ergebnis
der Fermentation ist in Tabelle 3 dargestellt.
Mit dem E. coli-Stamm S17-1/pk19mobsacBΔpck wurde wie im
Fall des Lysinproduzenten MH20-22B eine Konjugation mit dem
Threoninproduzenten DM368-2 mit anschließender Selektion
auf die erste und zweite Rekombination durchgeführt (siehe
Beispiel 5). Von 30 Saccharose-resistenten Klonen waren 14
Kanamycin-sensitiv. Von diesen konnte in zweien, als
DM368-2Δpck16 und DM368-2Δpck18 bezeichneten Klonen mit Hilfe
der in Beispiel 5 beschriebenen PCR-Analyse die 1071 bp-
Deletion im pck-Gen nachgewiesen werden.
Ein Enzymtest mit dem Ausgangsstamm DM368-2 und den beiden
pck-Deletionsstämmen DM368-2Δpck16 und DM368-2Δpck18,
durchgeführt wie in Beispiel 5 beschrieben, zeigte, daß in
diesen Mutanten keine PEP-Carboxykinase-Aktivität
nachweisbar ist (Tabelle 4).
Analog zu den Experimenten zur L-Lysinproduktion wurde auch
die Akkumulation von Threonin im Kulturüberstand des PEP-
Carboxykinase-defekten Stammes DM368-2BΔpck16 im Vergleich
mit dem Ausgangsstamm DM368-2 untersucht. Dazu wurden die
beiden Stämme in Luria-Bertani-Komplexmedium plus 1%
Glucose gezüchtet und das Fermentationsmedium CGXII aus den
Vorkulturen beimpft. Nach Kultivierung für 24 Stunden bei
28°C auf dem Rotationsschüttler bei 120 Upm wurde die
Konzentration des in das Medium ausgeschiedenen Threonins
bestimmt.
Die Bestimmung der Aminosäurekonzentration erfolgte mittels
Hochdruckflüssigkeitschromatographie (siehe oben). Das
Ergebnis der Fermentation ist in Tabelle 5 dargestellt.
Folgende Figuren sind beigefügt:
Fig. 1 Restriktionskarte des Plasmides pEK-pckA,
Fig. 2 Restriktionskarte des Plasmides pEK-pckB,
Fig. 3 Restriktionskarte des Plasmides pk19mobsacBΔpck.
Bei der Angabe der Basenpaarzahlen handelt es sich um ca.-
Werte, die im Rahmen der Reproduzierbarkeit erhalten
werden.
Die verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen haben
folgende Bedeutung:
sacB: sacB-Gen
ori V: Replikationsursprung V
ori T: Replikationsursprung für den Transfer
Km-r: Kanamycin Resistenz
KpnI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms KpnI
HindIII: Schnittstelle des Restriktionsenzyms HindIII
HindII: Schnittstelle des Restriktionsenzyms HindII
PstI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms PstI
SphI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms SphI
XbaI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms XbaI
SalI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms SalI
SacI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms SacI
BfrI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms BfrI
ScaI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms ScaI
BamHI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms BamHI
EcoRI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms EcoRI
pck': 3'-terminales Fragment des pck-Gens
pck': 5'-terminales Fragment des pck-Gens
pck: pck-Gen.
sacB: sacB-Gen
ori V: Replikationsursprung V
ori T: Replikationsursprung für den Transfer
Km-r: Kanamycin Resistenz
KpnI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms KpnI
HindIII: Schnittstelle des Restriktionsenzyms HindIII
HindII: Schnittstelle des Restriktionsenzyms HindII
PstI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms PstI
SphI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms SphI
XbaI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms XbaI
SalI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms SalI
SacI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms SacI
BfrI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms BfrI
ScaI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms ScaI
BamHI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms BamHI
EcoRI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms EcoRI
pck': 3'-terminales Fragment des pck-Gens
pck': 5'-terminales Fragment des pck-Gens
pck: pck-Gen.
Claims (15)
1. Isoliertes Polynukleotid aus coryneformen Bakterien
enthaltend eine Polynukleotidsequenz, ausgewählt aus der
Gruppe
- a) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2 enthält,
- b) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für das genannte Polypeptid codiert und auf dem Plasmid pEK-pckA (Abb. 1) bzw. pEK-pckB (Abb. 2) enthalten ist,
- c) Polynukleotid, das für ein Polypeptid codiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2,
- d) Polynukleotid, das komplementär ist zu den Polynukleotiden von a), b) oder c), und
- e) Polynukleotid, enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Basen der Polynukleotidsequenz von a), b), c) oder d).
2. Polynukleotid gemäß Anspruch 1,
wobei das Polynukleotid eine replizierbare, bevorzugt
rekombinante DNA ist.
3. Polynukleotid gemäß Anspruch 1, wobei
das Polynukleotid eine RNA ist.
4. Polynukleotid gemäß Anspruch 2,
enthaltend die Nukleinsäuresequenz wie in SEQ ID No. 1
dargestellt.
5. Replizierbare DNA gemäß Anspruch 2, enthaltend
- a) die Nukleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID No. 1, oder
- b) mindestens eine Sequenz, die der Sequenz (i) innerhalb des Bereichs der Degeneration des genetischen Codes entspricht, oder
- c) mindestens eine Sequenz, die mit der zur Sequenz (1) oder (ii) komplementären Sequenz hybridisiert, und/oder gegebenenfalls
- d) funktionsneutralen Sinnmutationen in (i).
6. Polynukleotidsequenz gemäß Anspruch 2, das
für ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz
in SEQ ID No. 2 darstellt, enthält.
7. Vektor pEK-pckA, dargestellt in Fig. 1.
8. Vektor pEK-pckB, dargestellt in Fig. 2.
9. Vektor pk19mobsacBΔpck, dargestellt in Fig. 3 und
hinterlegt in dem Stamm E. coli DH5α unter der Nummer
DSM 13047
10. Als Wirtszelle dienende coryneforme Bakterien, die
einen der Vektoren gemäß den Ansprüchen 6 bis 8
enthalten oder in die die Δpck-Deletion eingebaut
wurde.
11. Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-
Aminosäuren,
dadurch gekennzeichnet,
daß man Bakterien einsetzt, in denen man
- a) das Polynukleotid gemäß Anspruch 1 abschwächt oder die Aktivität des Polypeptids herabsetzt, für das das genannte Polynukleotid codiert.
- b) das gewünschte Produkt im Medium oder in den Zellen der Bakterien anreichert und
- c) das Produkt isoliert
12. Verfahren gemäß Anspruch 12,
dadurch gekennzeichnet,
daß man Bakterien der Gattung Corynebacterium
glutamicum einsetzt.
13. Verfahren gemäß Anspruch 12,
dadurch gekennzeichnet,
daß man die Abschwächung durch Integrationsmutagenese
mit Hilfe des Plasmides pK19mobsacBΔpck, dargestellt
in Fig. 3 und hinterlegt als DSM 13047, erzielt.
14. Verfahren gemäß 12,
dadurch gekennzeichnet,
daß man für die Herstellung von L-Lysin Bakterien
fermentiert, in denen man gegebenenfalls
- - gleichzeitig das für das Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende dapA-Gen überexprimiert, und/oder
- - gleichzeitig ein S-(2-Aminoethyl)-Cystein-Resistenz vermittelndes DNA-Fragment amplifiziert.
15. Verfahren gemäß Anspruch 12,
dadurch gekennzeichnet,
daß man für die Herstellung von L-Threonin Bakterien
fermentiert, in denen man gegebenenfalls gleichzeitig
das für die Homoserin-Dehydrogenase kodierende hom-Gen
und/oder für eine "feed back resistente" Homoserin-
Dehydrogenase kodierende homdr- bzw. homFBR-Allele
überexprimiert.
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