MXPA00009958A - Nuevas secuencias de nucleotidos que codifican para el gen pck. - Google Patents

Abstract

Polinucleotido aislado a partir de bacterias corineformes que contiene una secuencia de polinucleotido seleccionada del grupo que comprende a) polinucleotido que es al menos 70 % identico a un polinucleotido que codifica para un polipeptido que contiene la secuencia de aminoacido de SEQ ID No. 2, b) polinucleotido que es al menos 70 % identico a un polinucleotido que codifica para el polipeptido que es expresado por medio del gen pck contenido sobre el vector pK19mobsacB?pck de la cepa E. coli depositada bajo DSM 13047, c) polinucleotido que codifica para un polipeptido que contiene una secuencia de aminoacido que es al menos 70% identica a la secuencia de aminoacido de SEQ ID No d) polinucleotido complementario a los polinucleotidos de a), b) o c), y e) polinucleotido que contiene al menos 15 bases sucesivas de la secuencia de polinucleotido de a), b), c) o d).

Description

NUEVAS SECUENCIAS DE NUCLEOTIDOS QUE CODIFICAN PARA EL GEN pck CAMPO DE LA INVENCION El objeto de la invención son las secuencias de nucleótidos que codifican para el gen pck de bacterias corineformes, y un método para la preparación mediante fermentación de L-aminoácidos, en particular L-lisina y L-treonina mediante debilitamiento del gen pck. Estado de la técnica Los aminoácidos, en particular la lisina y la treonina se emplean en la alimentación de animales, en la industria alimenticia, en la industria farmacéutica y en la medicina humana. Se sabe que estas sustancias se producen mediante la fermentación de cepas de bacterias corineformes, en particular Corynebacterium glutamicum. Debido a la gran significancia se trabaja continuamente en el mejoramiento de los procesos de producción. Las mejoras de los procesos se pueden relacionar con medidas referentes a las técnicas de la fermentación, como por ejemplo la agitación y el suministro de óxigeno, o a la composición de los medios de cultivo, como por ejemplo la concentración de azúcar durante la fermentación, o a la elaboración a. la forma de producto mediante, por ejemplo, cromatografía de Ref: 123449 intercambio de iones, o a las características intrínsecas de capacidad del microorganismo mismo. Para mejorar las características de capacidad de estos microorganismos se emplean métodos de la mutagenésis, S selección y elección de mutantes. De esta manera- se obtienen cepas que son resistentes contra antimetabolitos o auxotrópicas para productos del metabolismo de importancia regulatoria, y que producen el aminoácido deseado. Desde hace algunos años también ya se aplican 0 métodos de la técnica DNA recombinante para el mejoramiento de la cepa de las cepas de Corynebacterium que producen L- aminoácido. OBJETO DE LA INVENCION Los inventores se propusieron la tarea de 5 proporcionar al público nuevas medidas para la producción mejorada de aminoácidos por fermentación. DESCRIPCION DE LA INVENCION Los aminoácidos, en particular la L-lisina y la L-treonina se emplean en la alimentación de animales, en la 0 industria alimenticia, en la industria farmacéutica y en la medicina humana. Por consiguiente existe un interés general en que se proporcionen procesos mejorados para la producción de estos productos. El objeto de la invención es un polinucleótido aislado de bacterias corineformes que contiene una secuencia de polinucleótido seleccionada del grupo que comprende a) polinucleótido que es al menos 70 % idéntico a un polinucleótido que codifica para un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID No. 2, b) polinucleótido que es al menos 70 % idéntico a un polinucleótido que codifica para el polipéptido mencionado y esta contenido sobre el plásmido pEK-pckA (figura 1) o bien pEK-pckB (figura 2), c) polinucleótido que codifica para un polipéptido que contiene una secuencia de minoácido que es al menos 70% idéntica a la secuencia de aminoácido de SEQ ID No 2, d) polinucleótido complementario a los polinucleótidos de a) , b) o c) , y e) polinucleótido que contiene al menos 15 bases sucesivas de la secuencia de polinucleótido de a), b) , c) o d) . También es objeto de la invención un DNA de preferencia recombinante, replicable en microorganismos corineformes provenientes de Corynebacterium, que contiene al menos la secuencia de nucleótido que codifica para el gen pck representado en la SEQ ID No. 1. Es asimismo objeto un DNA replicable según la reivindicación 1 que contiene (i) la secuencia de nucleótido que se muestra en SEQ ID No. 1, o (ii) al menos una secuencia que corresponde a la secuencia (i) dentro de la región de la degeneración del código genético, o (iii) al menos una secuencia que hibridiza con la secuencia complementaria a la secuencia (i) o (ii), y/o eventualmente (iv) mutaciones de orientación funcionalmente neutral en ^ 10 (i). Otros objetos son un polinucleótido según la reivindicación 2, que contiene la secuencia de nucleótido como se representa en la SEQ ID No. 1, 15 un polinucleótido según la reivindicación 2, que codifica para un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácido como esta representada en la SEQ ID No. 2, f un vector que contiene el polinucleótido según la reivindicación 1, en particular pEK-pckA o pEK-pckB, 20 representado en las figuras 1 y 2, y bacterias corineformes que sirven como célula huésped en las que se incorporó la deleción Apck. Objeto de la invención son también los polinucleótidos constituidos sustancialmente por una 25 secuencia de polinucleótido, que se pueden obtener mediante rastreo por medio de la hibridización con una sonda que contiene la secuencia del polinucleótido según SEC ID No. 1 mencionado, o un fragmento de ella, de un banco de genes correspondiente que contiene el gen completo con la secuencia de polinucleótido correspondiente a SEQ ID No. 1, y aislamiento de la secuencia de DNA mencionada. Las secuencias de polinucleótidos de acuerdo a la invención son adecuadas como sondas de hibridización para RNA, cDNA y DNA, para aislar cDNA de longitud completa que codifican para fosfoenolpiruvatocarboxicinasa y aislar tales cDNA o genes que muestran una gran similitud de la secuencia con aquella del gen de la fosfoenolpiruvatocarboxicinasa . Las secuencias de polinucleótido de acuerdo a la invención son además adecuadas como cebadores para, mediante la reacción en cadena de polimerasa (RCP) , producir DNA de genes que codifican para la fosfoenolpiruvatocarboxicinasa . Tales oligonucleótidos que sirven como sondas o cebadores contienen al menos 30, preferiblemente al menos 20, en particular muy preferiblemente al menos 15 bases sucesivas. También son adecuados los oligonucleótidos con una longitud de al menos 40 ó 50 pares de bases. "Aislado" significa separado de su entorno natural .

"Polinucleótido" se refiere en general a poliribonucleótidos o polideoxiribonucleótidos, siendo que se puede tratar de RNA y DNA no modificados o RNA y DNA modificados . Por "polipéptidos" se entienden péptidos o proteínas que contienen dos o mas aminoácidos ligados a través de enlaces peptidicos. Los polipéptidos según la invención incluyen el polipéptido de acuerdo a SEQ ID No. 2, en particular aquellos con la actividad biológica de la PEP-carboxicinasa y también aquellos que son al menos idénticos en un 70 % con el polipéptido de acuerdo a SEQ ID No. 2, preferiblemente al menos en un 80 %, y particularmente aquellos que presentan al menos 90 % a 95 % de identidad al polipéptido de acuerdo a SEQ ID No. 2 y la actividad mencionada. La invención se relaciona además con un método para la producción mediante fermentación de L-aminoácidos, en particular L-lisina y L-treonina/ mediante el empleo de bacterias corineformes que en particular ya producen los L-aminoácidos y en las cuales se debilitan, en particular expresan a nivel reducido la(s) secuencia (s) de nucleótido (s) que codifica (n) para el gen pck. El concepto "debilitamiento" describe en este contexto la disminución o eliminación en un microorganismo. de la actividad intracelular de una o varias enzimas (proteínas) que se codifican mediante los DNAs correspondientes al emplear, por ejemplo, un promotor débil o un gen o alelo que codifica para una enzima 5 correspondiente con una baja actividad o bien que inactiva la enzima (proteina) cor-respondiente y que eventualmente combina estas medidas. Los microorganismos que son objeto de la presente invención pueden producir L-aminoácidos, en particular 10 lisina y treonina a partir de glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melaza, fécula, celulosa o de glicerina y etanol. Se puede tratar de representantes de bacterias corineformes, en particular de la especie Corynebacterium. En la especie Corynebacterium se debe mencionar is en particular el tipo Corynebacterium glutamicum, que es conocido en el ámbito especializado por su capacidad de producir L-aminoácidos. f N Las cepas adecuadas de la especie Corynebacterium, en particular del tipo Corynebacterium 20 glutamicum, son por ejemplo las conocidas cepas de tipo salvaje Corynebacterium glutamicum ATCC13032 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806 Corynebacterium acetoacidofilum ATCC13870 25 Corynebacterium termoaminogenes FEKM BP-1539 Corynebacterium melassecola ATCC17965 Brevibacterium flavum ATCC1 067 Brevibacterium lactofermentum ATTCC13869 y r " Brevibacterium divaricatum ATTCC14020 s y los mutantes y cepas productores de L-aminoácido producidos a partir de estas, como por ejemplo las cepas que producen lisina Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709 Brevibacterium flavum FERM-P 1708 r ^ 10 Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712 Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463 Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 y Corynebacterium glutamicum DSM5714 o como por ejemplo las cepas que producen treonina 15 Corynebacterium glutamicum ATCC21649 Brevibacterium flavum BB69 Brevibacterium flavum DSM5399 Brevibacterium lactofermentum FERM-BP 269 Brevibacterium lactofermentum TBB-10 20 Corynebacterium glutamicum MH20-22B-DR17. Los inventores tuvieron éxito en aislar el nuevo gen pck de C. glutamicum que codifica para la enzima fosfoenolpiruvato-carboxicinasa (PEP-carboxicinasa) (EC 4.1.1.49). 25 Para aislar el gen pck o también otros genes de C. glutamicum se instala primero en E. coli un banco de genes de este microorganismo. La instalación de bancos de ^ genes se describe en libros de enseñanza y manuales ^ " generalmente conocidos. Como ejemplos mencionaremos el S libro de enseñanza Winnacker: Gene und Klone, Eine Einführung in die Gentechnologie (editorial Chemie, Weinheim, Alemania, 1990) o el manual de Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989) . Un banco de genes muy conocido es ^ 10 de la cepa W3110 de E. coli K-12, el cual fue instalado por ^ Kohara et al. (Cell 50, 495 - 508 (1987)) en vectores ?. Bathe et al. (Molecular an General Genetics, 252:255-265, 1996) describen un banco de genes de C. glutamicum ATCC13032 que se instaló con el auxilio del vector cósmido 15 SuperCos I (Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84:2160-2164) en la cepa NM 554 de E.coli K-12 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16:1563-1575). Por otra parte, Bórmann et al. (Molecular Microbiology 6 (3), 317-326)) describen un banco de genes 20 de C. glutamicum ATTCC13032 mediante el empleo del cósmido pHC79 (Hohn y Collins, Gene 11, 291-298 (1980)). Para establecer un banco de genes de C. glutamicum en E. coli también se pueden usar plásmidos y vectores plasmidicos, como por ejemplo pBR322 (Bolívar, 25 Life Sciences, 25, 807-818 (1979)), pUC9 (Vieira et al., 1982, Gene, 19:259-268), pACYC177 (Chang y Cohén, Journal of Bacteriology 134, 1141-1156 (1978)) o pSClOl (Cohén y Chang, Journal of Bacteriology 132, 734-737 (1977)). Como huespedes son especialmente adecuadas aquellas cepas de E. coli con deficiencia de restricción y recombinación. A continuación el banco de genes se incorpora en una cepa marcadora mediante transformación (Hanhan, Jounal of Molecular Biology 166, 557-580, 1983) o electroporación (Tauch et.al., 1994, FEMS Microbiological Letters, 123:343-347) . La cepa marcadora se caracteriza porque tiene una mutación en el gen que interesa, la cual genera un fenotipo detectable. Dentro del marco de la presente invención tiene significancia el mutante HG4 de E.coli descrito por Goldie y Sanwal (Journal of Bacteriology 141: 1115-rll21 (1980)). Esta cepa lleva una mutación en el gen pck mediante la cual se inhibe fuertemente el crecimiento sobre succinato como única fuente de carbono. Mediante la transformación con un vector que contiene el gen pck se puede restablecer nuevamente el crecimiento sobre succinato. Los fragmentos largos de DNA clonados con ayuda de cósmidos u otros vectores se pueden subclonar a continuación en forma de fragmentos de DNA mas cortos en vectores plasmídicos conocidos. Mediante esto resulta posible la asociación del gen de conformidad con la invención a una sección de DNA especifica. Para este propósito se emplean vectores plasmídicos conocidos por el estado de la técnica, como por ejemplo pBR322 (Bolívar, Life Sciences, 25, 807-818 (1979)) o los vectores pSÜ 'v. descritos por Bartolomé et al. (Gene 102, 75-78 (1991)). Sin embargo, de preferencia se emplean vectores pendulares que replican tanto en Escheric ia coli como también en Corynebacterium glutamicum, como por ejemplo pZl (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549- 554) o pEKO (Eikmanns et al., Gene 102 (1991)), para llevar a cabo investigaciones en ambas especies. Los ejemplos de esto son los plásmidos pEK-pckA (figura 1) y pEK-pckB (figura 2), que se produjeron a partir del vector plasmídico pEKO y llevan el gen pck de acuerdo a la invención. Las secciones de DNA caracterizadas de esta manera se subclonan a continuación nuevamente en vectores convencionales adecuados para la secuenciación de DNA. Alternativamente es posible subclonar directamente en vectores secuenciadores las secciones de DNA largas clonadas en cósmidos. Los ejemplos de este tipo de vectores adecuados para la secuenciación de DNA son los plásmidos pGEM-5zf(-) o pGEM-5zf(+) de la razón social Promega Corporation (Promega Protocols and Application Guide, segunda edición, 1991, número de parte Y981, Promega Corporation, adison, I USA) .

Los métodos para la secuenciación de DNA se describen entre otros en Sanger et al. (Proceedings of the ^-N National (Academy) of Sciences of the United States of America USA, 74:5463-5467, 1977). s Las secuencias de DNA obtenidas se pueden entonces investigar con los algoritmos o bien programas de análisis de secuencias conocidos, como por ejemplo el de Staden {Nucleic Acids Research 14, 217-232(1986)), el programa GCG de Butler (Methods of Biochemical Analysis 39, f>> lo 74-97 (1998)), el algoritmo FASTA de Pearson y Lipman (Proceedings of the National Academy of Sciences USA 85, 2444-2448 (1988)) o el algoritmo BLAST de Altschul et l. (Nature Genetics 6, 119-129 (1994)), y compararse con los inscriptores de secuencias que existen en bancos de datos 15 públicamente accesibles. Los bancos . de datos públicamente accesibles para secuencias de neuclotidos son por ejemplo los de European Molecular Biologies Laboratories (EMBL, " Heidelberg, Alemania) o los del National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA) .. 20 De esta manera se obtuvo la nueva secuencia de DNA de C. glutamicum que codifica para el gen pck, la cual es parte integrante de la presente invención co o SEQ ID No. 1. Además, a partir de la presente secuencia de DNA se derivó con los métodos previamente descritos la secuencia 25 de aminoácido de la proteina correspondiente. En SEQ ID No. 2 se representa la secuencia de aminoácido resultante del producto del gen pck. Las secuencias de DNA que codifican que resultan de SEQ ID No. 1 mediante la degeneración del código S genético son igualmente parte integrante de la invención. Igualmente son parte integrante de la invención las secuencias de DNA que hibridizan con la SEQ ID No. 1 o partes de SEQ ID No. 1. Finalmente son parte integrante de la invención las secuencias de DNA que se producen mediante r ^ 10 la reacción en cadena de polimerasa (RCP) utilizando cebadores que resultan de la SEQ ID No. 1. Tales oligonucleótidos tienen típicamente una longitud de al menos 15 pares de bases. Las instrucciones para la identificación de las is secuencias de DNA mediante hibridización las encuentra el experto entre otros en el manual "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" de la razón social ^ " Boehringer annheim GmbH (Mannheim, Alemania, 1993) y en Liebl et al. (International Journal of Systematic 20 Bacteriology (1991) 41: 255-260). Las instrucciones para la amplificación de las secuencias de DNA con el auxilio de la reacción en cadena de polimerasa (RCP) las encuentra él experto entre otros en el manual de Gait: Oligonukleotide synthesis: a practical approach (IRL Press, Oxford, UK, 25 1984) y en Newton y Graham: RCP (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemania, 1994). Los inventores descubrieron que después del debilitamiento del gen pck, las bacterias corineformes producen L-aminoácidos de manera mejorada, en particular s lisina y treonina. Para lograr un debilitamiento se pueden reducir o eliminar o bién la expresión del gen pck o bién las propiedades catalíticas de la proteina de la enzima. Eventualmente es posible combinar ambas medidas. - 10 La reducción de la expresión del gen se puede llevar a cabo mediante una conducción adecuada del cultivo o mediante modificación genética (mutación) de las estructuras de señales de la expresión del gen. Las estructuras de señales de la expresión del gen son, por ís ejemplo, genes represores, genes activadores, operadores, promotores, atenuadores, sitios de enlace de ribosomas, el codón de iniciación y los terminadores. Las indicaciones a ^ este respecto las encuentra el experto, por ejemplo, en la solicitud de patente WO 96/15246, en Boyd y Murphy (Journal 20 of Bacteriology 170: 5949 (1988)), en Voskuil y Chambliss (Nucleic Acids Research 26: 3548 (1998), en Jensen y Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191 (1998)), en Patek et al. (Microbiology 142: 1297 (1996) y en libros de texto conocidos de la genética y de la biología molecular, como 25 por ejemplo el libro de texto de Knippers ("Molekulare Genetik", 6. edición, editorial Georg Thieme, Stuttgart, Alemania, 1995) o el de Winnacker PGene und Klone", VCH r" Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania, 1990) . Las mutaciones que conducen a una modificación o 5 a una reducción de las propiedades catalíticas de proteínas de enzimas se conocen a través del estado de la técnica; como ejemplos mencionaremos los trabajos de Qiu y Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Sugimoto et al. (Bioscience Biotechnology and Biochemistry ^ 10 61: 1760-1762 (1997)) y Mfickel ( Die Threonindehydratase aus Corynebacterium glutamicum: Auf ebung der allosterischen Regulation und Struktur des Enzyms", Berichte des Forschungszentrums Jülichs, Jül-2906, ISSN09442952, Jülic , Alemania, 1994). Las descripciones 15 sumarias se pueden sacar de libros de texto conocidos de la genética y la biología molecular, como por ejemplo el de Hagemann (vAllgemeine Genetik", editorial Gustav Fischer, ^ Stuttgart, 1986). Como mutaciones entran en consideración 20 transiciones, transversiones, inserciones y deleciones. En función del efecto del intercambio de aminoácido sobre la actividad de la enzima se habla de mutaciones de orientación contraria (missense mutations) y mutaciones sin orientación (nonsense mutations) . Las inserciones o 25 deleciones de al menos un par de bases en un gen conducen a mutaciones por cambio en el marco de lectura (frame shift mutations), las cuales conducen a que se inserten aminoácidos falsos o que la traslación se interrumpa. Las deleciones de varios codones típicamente conducen a una perdida total de la actividad enzimática. Las instrucciones para la creación de tales mutaciones pertenecen al estado de la técnica y se pueden sacar de libros de texto conocidos de la genética y de la biología molecular, como por ejemplo el libro de texto de Knippers ("Molekulare Genetik", 6. edición, editorial Georg Thieme, Stuttgart, Alemania, 1995), el de Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania, 1990) o el de Hagemann ("Allgemeine Genetik", editorial Gustav Fischer, Stuttgart, 1986) . Un ejemplo de un gen pck mutado es el alelo Apck contenido en el plásmido pK19mobsacBApck (figura 3) . El alelo Apck contiene únicamente los flancos 5' y 3' del gen pck; falta una sección de 1701 bp de longitud de la región de codificación (deleción) . Este alelo Apck se puede incorporar en baterías corineformes mediante mutagenésis de integración. Para este propósito se recurre al plásmido pK19mobsacBApck precedentemente indicado, el . cual no es replicable en C. glutamicum. Después de la transferencia mediante conjugación o transformación y recombinación homologa por medio de un primer evento "cross over" que produce la integración, y un segundo evento Mcross over" que produce la escisión en el gen pck se obtiene la inserción del alelo Apck y se logra una pérdida total de la función enzimática en la cepa respectiva. S Las instrucciones y explicaciones para la mutagenesis de integración se encuentran, por ejemplo, en Schwarzer y Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991) o en Peters-Wendisch et al. (Microbiology 144, 915-927 (1998)). Los ejemplos de cepas de bacterias corineformes f ^ 10 con gen pck debilitado que producen aminoácido, son la cepa MH20-22BApck que produce lisina y la cepa DM368-2Apck que produce treonina. Para la producción de L-aminoácidos puede ser que adicionalmente al debilitamientio del gen pck sea 15 conveniente además sobreexpresar una .o varias enzimas de la respectiva ruta de la biosintesis. Asi, por ejemplo, para la producción de la L- lisina es posible * sobreexpresar simultáneamente el gen dapA que codifica 20 para la síntesis de dihidrodipicolinato (EP-B 0 197 335)), o * amplificar simultáneamente un fragmento de DNA que transmite la resistencia a la S- (2-aminoetil) -cisteina (EP-A 0 088 166) . 25 Así, por ejemplo, para la producción de la L- treonina es posible * sobreexpresar simultáneamente el gen hom que codifica para la homoserino-dehidrogenasa (Peoples et al., 5 Molecular Microbiology 2, 63-72 (1988)} o los alelos norn"* o bién hoitirait que codifican para una homoserino dehidrogenasa "resistente a la retroalimentación" (Archer et al., Gene 107, 53-59 (1991); Reinscheid et al., Journal of Bacteriology 173, 3228-3230 (1991)). 10 Para la producción de L-aminoácidos, en particular lisina y treonina puede ser que adicionalmente al debilitamiento del gen pck, sea además conveniente eliminar reacciones secundarias indeseadas (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Micro-organisms", en: 15 Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982). Los microorganismos producidos de acuerdo a la " invención se pueden cultivar en forma continua o v discontinua en el cultivo en discontinuo o en el cultivo en 20 discontinuo con afluencia o en el cultivo en discontinuo con reciclaje para el fin de la producción de L- aminoácidos, en particular L-lisina y L-treonina. Un resumen sobre los métodos de cultivo conocidos se describe en el libro de texto de Chmiel (Bioprozesstechnik 1. 25 Éinführung in die Bioverfahrenstechnik (editorial Gustav Fischer, Stuttgart, 1991)) o en el libro de texto de Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (editorial Vieweg, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)). El medio de cultivo a ser empleado debe 5 satisfacer de manera adecuada a los requisitos de las cepas respectivas. Las descripciones de medios de cultivo para diversos microorganismos están conenidas en el manual "Manual of Methods for General Bacteriology" de la American Society for Bateriology (Washington D.C., USA, 1981). Como 0 fuente de carbono se pueden emplear azúcar y carbohidratos, como por ejemplo glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melaza, fécula y celulosa, aceites y grasas como, por ejemplo, aceite de soya, aceite de girasol, aceite de cacahuate y aceite de coco, ácidos grasos como, por 5 ejemplo, ácido palmítico, ácido . esteárico y ácido linoléico, alcoholes como, por ejmplo, glicerina y etanol, y ácidos orgánicos como, por ejemplo, ácido acético. Estas sustancias se pueden emplear individualmente o como mezzclas. Como fuente de nitrógeno se pueden emplear 0 compuestos orgánicos que contienen nitrógeno como peptonas, extracto de levadura, extracto de malta, agua de remojo de maíz, harina de frijol de soya y urea, o compuestos inorgánicos como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio. $ Las fuentes de nitrógeno se pueden emplear individualmente o como mezcla. Como fuente de fósforo se puede emplear ácido fosfórico, fosfato dihidrógeno de potasio o hidrogenofosfato dipotásico o las correspondientes sales que contienen sodio. El medio de cultivo debe contener además, sales de metales como, por ejemplo, sulfato de magnesio o sulfato de hierro, que son necesarias para el crecimiento. Finalmente es posible aplicar sustancias de crecimiento esenciales, como aminoácidos y vitaminas adicionalmente a las sustancias precedentemente mencionadas. Al medio de cultivo se le pueden adicionar además etapas previas adecuadas. Las sustancias aplicables mencionadas se pueden agregar al cultivo en forma de una preparación única o alimentarse de manera adecuada durante el cultivo. Para controlar el pH del cultivo se aplican de manera adecuada compuestos básicos como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoniaco o agua amoniacal, o compuestos ácidos como ácido fosfórico o ácido sulfúrico. Para controlar la espumación se pueden emplear agentes antiespumantes como, por ejemplo, poliglicolésteres de ácidos grasos. Para mantener la estabilidad de los plásmidos se le pueden adicionar al medio sustancias adecuadas de actividad selectiva, por ejemplo antibióticos. Con el fin de mantener las condiciones aeróbicas, al cultivo se le incorpora oxigeno o mezclas gaseosas que contienen oxigeno como, por ejemplo, aire. La temperatura del cultivo normalmente se encuentra a 20°C a 45°C, y ,·- preferiblemente a 25°C a 40°C. Se prosigue con el cultivo durante tanto tiempo hasta que se ha formado un máximo del 5 aminoácido deseado. Esta meta se alcanza normalmente dentro de 10 horas a 160 horas. El siguiente microorganismo se depositó en la Colección Alemana para Microorganismos y Culturas Celulares (Deutsche Sammlung für Mikrorganismen und Zellkulturen "^ ío DSMZ, Braunschweig, Alemania) conforme al Convenio de Budapest : * Cepa DH5a/pK19mobsacBApck de Escherichia coli como DSM 13047 El método de acuerdo a la invención sirve para la 15 producción por fermentación de L-aminoácidos, en particular ácido L-aspártico, L-asparagina, L-homoserina, L-treonina, L-isoleucina y L-metionina con bacterias corineforines, en ^ particular para la producción de L-lisina y L-treonina. Ejemplos 20 La presente invención se explica a continuación con más detalle en base a los ejemplos de realización. Para éste propósito se llevaron a cabo entre otras cosas, experimentos con la cepa MH20-22B de Corynebacterium glutamicum que produce Usina y con la cepa DM368-2 de Brevibacterium flavum que produce treonina. La cepa MH20-22B se encuentra depositada como DSM5715 (EP-B 0435 132), y la cepa DM368-2 como DSM5399 (EP-B- 0385 940) en la Colección Alemana para Microorganismos y Culturas Celulares (Deutsche Sammlung für Mikrorganismen und Zellkulturen DSMZ, Braunschweig, Alemania) conforme al Convenio de Budapest. Ejemplo 1 Aislamiento del gen pck Para aislar el gen de la PEP-carboxicinasa (pck) a partir de C. glutamicum se preparó un banco de genes cósmido sobre el cósmido pHC79 (Hohn y Collins, Gene 11 (1980) 291-298) según metodología conocida (Sambrook ' et al.. Molecular Cloning, A Laboratory Handbook, 1989, Cold Spring Harbour Laboratory Press) . Para este propósito se aisló DNS cromosómico de C. glutamicum ATCC13032 (Eikmanns et al., Microbiology 140 (1994) 1817-1828), y se digirió parcialmente con la enzima de restricción Sau3A. Después del empalme de los fragmentos obtenidos en el sitio de corte BamHI del cósmido pHC79, la preparación se empaquetó en la cápsula proteinica del bacteriófago Lambda, y con el se transfecto la cepa E. coli ED8654 (Murray el al., Molecular and General Genetics 150 (1997) 53-61) . El empaquetamiento de los cósmidos recombinantes en la cápsula proteinica del fago Lambda se llevó a cabo de acuerdo a un método de Sternberg et al. (Gene 1 (1979) 255-280), la transfección de E. coli ED8654 según un método de Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Handbook, 1989, (Cold Spring Harbour Laboratory Press) . De un total de 30 de los clones recombinantes de E. coli obtenidos se 5 aislaron los cósmidos correspondientes (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Handbook, 1989 (Cold Spring Harbour Laboratory Press) y se sometieron a un análisis de restricción con la enzima HindIII. Resultó que 24 de los cósmidos examinados poseían elementos de inserción, y que r ' 10 los tamaños de los elementos de inserción tenian tamaños de aproximadamente 35 kb. Se reunieron en total 2200 clones de E. coli portadores de cósmidos, .y a partir de ésta mezcla se preparó el DNA cósmido (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Handbook, 1989 (Cold Spring Harbour 15 Laboratory Press) . Para aislar el gen pck de C. glutamicum se transformó el banco de genes cósmido en el mutante HG24 ^ ^ (Goldie y Sanwal, Journal of Bacteriology 141 (1980) 115- 1121) de E. coli deficiente de PEP-carboxicinasa según 20 métodos conocidos (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Handbook, 1989 (Cold Spring Harbour Laboratory Press) . En virtud de su deficiencia de PEP-carboxicinasa, el mutante HG24 ya no esta en condiciones de crecer sobre succinato como única fuente de carbono. Después de la 25 transformación del banco de genes cósmido en este mutante, se obtuvieron un total de 1200 clones. De éstos, un total de dos clones mostraron crecimiento sobre medio minimal M9 - -. (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Handbook, 1989 (Cold Spring Harbour Laboratory Press) con succinato 5 (0,4 %) como única fuente de carbono. Después del aislamiento de los cósmidos correspondientes (Sambroolc et al.. Molecular Cloning, A Laboratory Handbook, 1989 (Cold Spring Harbour Laboratory Press) de estos clones y repetida transformación al mutante HG24 de E. coli, los clones lo resultantes estuvieron nuevamente en condición de crecer sobre medio M9 con succinato como única fuente de carbono. Para poder restringir el gen pck de C. glutamicum sobre un fragmento más pequeño, los dos cósmidos complementarios se digirieron con las enzimas de 15 restricción Xhol, Seal y PvuII y se. separaron en el campo eléctrico sobre un gel de agarosa al 0.8% de acuerdo a un método conocido (Sambrook et al., Molecular Cloning, A G'^ Laboratory Handbook, 1989 (Cold Spring Harbour Laboratory Press) . Los fragmentos en la gama de tamaño de más de 3.0 20 kb se aislaron del gel mediante electroelución (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Handbook, 1989 (Cold Spring Harbour Laboratory Press) y se ligaron al sitio de corte Salí (digestión Xhol) o bién EcoRI con tratamiento Klenow (digestión Seal y PvuII) del vector pE 30 (Eikmanns 25 et al.. Gene 102 (1991) 93-98). Con las preparaciones ligadas se transformó E. coli HG4, y los transformandos obtenidos se volvieron a examinar con respecto a su /- capacidad de crecimiento sobre succinato como fuente única de carbono. En la preparación de transformación con la 5 preparación de ligamiento PvuII se manifestaron siete clones cuyos plásmidos del mutante HG4 permitieron el crecimiento sobre succinato. A partir de las cepas recombinantes se aislaron los plásmidos correspondientes, y se sometieron a una elaboración de mapas de restricción. Se ^ 10 descubrió que todos los siete plásmidos llevaban el mismo elemento de inserción PvuII de 4.3 kbf tres con una orientación, cuatro con la otra. En función de la orientación del elemento de inserción en el vector, los nuevos plásmidos construidos se designaron como pEK-pckA y 15 pEK-pckB. Los mapas de restricción .de ambos plásmidos se representan en las figuras 1 y 2. Ejemplo 2 f " Secuenciación del gen estructural pck y las regiones adyacentes 20 Para la secuenciación se aisló de pEK-pckA el fragmento EcoRI de aproximadamente 3.9 kb de tamaño (en esto un sitio de corte EcoRI proviene del vector pEKO) de acuerdo a un método conocido. Los extremos salientes del fragmento se llenaron con polimerasa Klenow para formar extremos lisos (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Handbook, 1989 (Cold Spring Harbour Laboratory Press) y se ligaron al sitio de corte EcoRV del vector ^ pGEM-5Zf(+) (Promega Corporation, Madison, WI, USA). La inserción del plásmido producido de esta manera se s secuenció mediante el método de secuenciación de ruptura de cadena (Sanger et al., Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 74 (1977) 5463-5467). Esta representada como SEQ ID No. 1. La secuencia de nucleótido de 3935 bp obtenida se analizó con el paquete de programa HUSAR io (versión 3.0) del Centro Alemán de Investigación del Cáncer (Deutsenes Krebsforschungszentrum DKFZ, Heidelberg, Alemania) . El análisis de la secuencia de los fragmentos arrojo como resultado un marco de lectura abierto de 1830 bp de longitud que codifica para una proteina constituida 15 por 610 aminoácidos. E emplo 3 Sobreexpresión del gen pek i" ~ Mediante electroporacón con subsecuente selección sobre placas de agar BHI que contenían canamicina (50 µg ml) (Liebl et al., FEMS Microbiology Letters 65 (1989) 299-304) se introdujeron los plásmidos pEK-pckA y pEK-pckB en la cepa ATCC13032 de C. glutamicum, y las cepas resultantes se designaron como ATCC13032/pEK-pckA y ATCC13032/pEK-pckB. Ambas cepas y la cepa de partida se cultivaron en el medio complejo de Luria-Bertani (Sambrook et al., Molecular Cloning, A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press) , y el ensayo de la PEP- carboxicinasa se llevó a cabo de acuerdo al método como fué descrito por Bentle y Lardy (Journal of Biological Chemistry 251 (1976) 2916-2921). El resultado del análisis se representa en la tabla 1, y demuestra que la actividad de PEP-carboxicinasa es 10 a 12 veces más elevada en ambas cepas con los plásmidos pEK-pckA y pEK-pckB que en la cepa de partida. Tabla 1 Actividad de PEP-carboxicinasa en diversas cepas Ejemplo 4 Producción de un plásmido de integración para la mutagenesis de deleción del gen pck Para la desactivación del gen de la PEP- carboxicinasa se aisló el fragmento EcoRI-SacI del gen pck a partir del vector pEK-pckB, y se ligó dentro del vector pGEM-7Zf(+) (Promega Corporation, Madison, WI, USA). Del plásmido resultante se eliminó por deleción fragmento HindlI-HindlII interno de pck de 1.07 kb, a continuación se aisló el gen pck con la deleción de 1.07 kb como fragmento BfrI-SacI y, después de rellenar los extremos salientes se ligó dentro del vector pkl9mobsacB no replicable en C. glutamicum (Schafer et al., Gene 145, 69-73 (1994)). En el plásmido de integración pK19mobsacBApck construido de esta manera (figura 3), la región 5' del gen pck (350 bp) colinda directamente con la región 3' del gen pck (340 bp) ; en el genoma ambas regiones están separadas mediante 1071 bp. Hasta esta etapa todas las clonaciones se llevaron a cabo en E. coló DH5a como huésped. Ejemplo 5 Mutagénesis de deleción del gen pck en el productor de lisina MH20-22B Con el plásmido de integración pK19mobsacBApck se transformó a continuación E. coli S17-1 (Simón et al., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)). Esta cepa permite la transferencia de un plásmido hacia Corynebacterium glutamicum mediante conjugación (Schafer et al., Journal of bacteriology 172 (1990) 1663-1666) . Como recipiente de la conjugación se empleó a la cepa de producción de lisina C. glutamicum MH20-22B (Schrumpf et al., Applied Microbiology and Biotechnology 37 (1992) 566-571). De la conjugación entre E. coli S-171/pK19mobsacBApck y C. glutamicum MH20-22B y subsecuente selección sobre placas de agar Luria- Bertani con canamicina (25 µ?/p??) y ácido nalidixico (50 µ?/p??) se obtuvieron varios transconjugados. Para la ^- selección con miras al segundo evento de recombinación, que debe de conducir a la excisión del vector con todo y el gen 5 pck, estos transconjugados se cultivaron sobre medio complejo Luria-Bertani exento de antibiótico (Sambrook et al.: Molecular Cloning, ? laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press) con 1% de glucosa y a continuación se colocaron sobre placas en el mismo medio lo más 10% de sacarosa. El gen sacB que existe sobre el vector pkl9mobsacB codifica para la enzima levansucrasa y conduce a la síntesis de levan a partir de sacarosa. Puesto que levan es tóxico para C. glutamicum, solamente las células de C. glutamicum que perdieron el plásmido de integración pueden crecer sobre un medio que contiene sacarosa (Jager et al., Journal of Bacteriology 174 (1992) 5462-5466). Se examinaron 30 clones resistentes a la sacarosa con respecto ^ a su sensibilidad a la canamicina. Para 11 de los clones examinados se pudo confirmar la sensibilidad deseada a la canamicina además de la resistencia a la sacarosa. O sea que en estos 11 clones habla sufrido nuevamente la excisión el fondo del vector. Se verificó mediante análisis de reacción en cadena de polimerasa (RCP) si también habia tenido lugar la deleción deseada. Para este propósito se liberaron DNA cromosómieos de una colonia de la cepa de partida y de las colonias de los 11 clones sensitivos a la canamicina. Para hacer esto, con un palillo de dientes se - retiró de la placa de agar la colonia respectiva, se suspendión en 50 µ? de H20 y se incubó durante 5 minutos a S 95°C. Se aplicó en cada caso 1 µ? de las soluciones obtenidas como molde en la RCP. Como cebadores se emplearon oligonucleótidos que cubren las regiones de nucleótido 2136 a 2158 y de 3815 a 3793 en la SEQ ID No. 1. Las condiciones de la RCP fueron: desnaturalización previa: 150 segundos a '¦ ío 94°C; desnaturalización: 60 segundos a 94°C; hibridización: 30 segundos a 60°C amplificación: 120 segundos a 72°C; 30 ciclos, extensión final: 240 segundos a 72°C. En la preparación con el DNA de la cepa de partida se esperaba un producto de la RCP de 1.68 kb en virtud de los cebadores 15 elegidos. En la RCP con el imitante por deleción de pck se esperaba un producto de la RCP de 0.61. En un clon se obtuvo un producto de la RCP con tamaño de 0.61 Jcb. ^ Mediante ello se comprobó en este clon la deleción deseada del fragmento de pck interno con tamaño de 1071 bp. El clon 20 se designó como MH20-22BApck. En las preparaciones de los clones restantes se comprobó el producto de 1.68 kb de la RCP. En estos por consiguiente el vector habia sufrido la excisión de manera que quedaba restablecida la situción genómica de partida. 25 La cepa MH20-22BApck y la cepa de partida MH20- 22B se cultivaron en medio complejo Luria-Bertani más 1% de glucosa, y el ensayo PEP-carboxicinasa se llevó a cabo de acuerdo al método como se describe en Bentle y Lardy (Journal of Biological Chemistry 251 (1976) 2916-2921) . El resultado del análisis (tabla 2) demuestra que en contraste con la cepa MH20-22B de partida, en el mutante MH20-22BApck ya no se puede comprobar actividad de PEP-carboxicinasa. Tabla 2 Actividad de PEP-carboxicinasa en diversas cepas nmol min"1 mg proteina"1 es el limite de comprobación Ejemplo 6 Producción de L-lisina Para investigar la repercusión de la inactivación del gen de PEP-carboxicinasa sobre la producción de lisina, la cepa MH20-22B (Schrumpf et al., Applied Microbiology and Biotechnology 1992, 37: 566-571) así como el mutante MH20- 22BApck negativo de PEP-carboxicinasa (ejemplo 5) se cultivaron en medio complejo Luria-Bertani más 1% de glucosa, y se inoculó el medio de fermentación CGXII (Keilhauer et al./ Journal of Bacteriology 1993, 175: 5595- 5603) de ambos cultivos previos (inoculación 5%, densidad óptica aproximadamente 0.5 a 600 nm) . El medio contenía adicionalmente 3 mM de leucina, en virtud de que ambas cepas son auxótrofas respecto a la leucina. Las preparaciones comprendían en cada caso 60 mi de cultivo contenidos en matraces Erlenmayer de 500 mi con serpentines. Después de cultivar durante 24 horas a 28°C en un agitador rotativo del tipo Certomat S/50 (razón social Braun Biotech International, Melsungen, Alemania) a 120 RPM se determinó la concentración de la lisina segregada al medio . La determinación de la concentración de aminoácido se llevó a cabo mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (Jones y Gilligan, Journal of Chromatography 19B3, 266: 471-482) . El resultado de la fermentación se representa en la tabla 3. Tabla 3 Concentración de lisina en el sobrenadante de las cepas MH20-22B y MH20-22BApck Ejemplo 7 Mutagenesis de deleción del gen pck en el productor DM368-2 de treonina Al igual que en el caso del productor de Usina MH20-22B, con la cepa E. coli S17-l/pkl9mobsacBApck se llevó a cabo una conjugación con el productor DM368-2 de treonina, con subsecuente selección con miras a la primera y a la segunda recombinación (ver el ejemplo 5) . De 30 clones resistentes a la sacarosa 14 fueron sensitivos a la canamicina. De estos se pudo comprobar la deleción de 1071 bp del gen pck en dos clones, designados como DM368-2Apckl6 y DM36B-2Apckl8, con el auxilio del análisis de RCP descrito en el ejemplo 5. Un ensayo de enzima con la cepa DM368-2 de partida y ambas cepas de deleción de pck DM368-2Apckl6 y DM368-2Apckl8, efectuado como se describe en el ejemplo 5, demostró que en estos mutantes no se puede comprobar actividad de PEP-carboxicinasa (tabla 4) . Tabla 4 Actividad de PEP-carboxicinasa en diversas cepas nmol min-1 mg proteina"1 es el limite de comprobación Ejemplo 8 Producción de L-treonina En forma análoga a los experimentos con respecto a la producción de L-lisina también se investigó la acumulación de treonina en el sobrenadante de la cepa DM368-2Apckl6 deficiente de PEP-carboxicinasa, en comparación con la cepa DM368-2 de partida. Para este propósito se cultivaron ambas cepas en medio complejo Luria-Bertani más 1% de glucosa, y se inoculó el medio de fermentación CGXII de los cultivos previos. Después de cultivar durante 24 horas a 28°C en el agitador rotativo a 120 RPM se determinó la concentración de la treonina segregada al medio. La determinación de la concentración de aminoácido se llevó a cabo mediante cromatografía liquida de alto rendimiento (compárese lo precedente) . El resultado de la fermentación se representa en la tabla 5. Tabla 5 Concentración de la treonina en el sobrenadante de las cepas DM 368-2 y DM 368-2Apckl6 Cepa L-treonina (mM) DM 368-2 8 DM 368-2Apckl6 22 Dibujos: Se anexan las figuras siguientes: Figura 1: Mapa de restricción del plásmido pEK-pckA Figura 2: Mapa de restricción del plásmido pEK-pckB Figura 3: Mapa de restricción del plásmido pkl9mobsacBApck En el caso de la indicación de los números de pares de bases se trata de valores aproximados que se obtienen dentro del marco de la reproducibilidad. Las abreviaturas y designaciones empleadas tienen el significado siguiente: sacB: gen sacB ori V: Origen V de la replicación ori T: Origen de la replicación para el transfer Km-r: Resistencia a la canamicina Kpnl: Sitio de corte de la enzima, de restricción pnl HindIII: Sitio de corte de la enzima de restricción HindIII HindII Sitio de corte de la enzima de restricción HindII PstI: Sitio de corte de la enzima de restricción PstI Sphl: Sitio de corte de la enzima de restricción Sphl Xbal: Sitio de corte de la enzima de restricción Xbal Salí: Sitio de corte de la enzima de restricción Salí SacI Sitio de corte de la enzima de restricción SacI BfrI: Sitio de corte de la enzima de restricción BfrI Seal: Sitio de corte de la enzima de restricción Seal BamHI: Sitio de corte de la enzima de restricción BamHI EcoRI: Sitio de corte de la enzima de restricción EcoRI r pck' : fragmento terminal 3' del gen pck v. pck' ' : fragmento terminal 5' del gen pck 5 pck: gen pck PROTOCOLO DE SECUENCIA <110> Degussa-Hüls AG Forschungszentrum Jülich <120> Nuevas secuencias de nucleótido que codifican para el gen pck <130> 990110BT <140> <141> <160> 2 ^ 10 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 3935 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum 1S <220> <221> CDS <222> (2022) .. (3851) <400> 1 V. ctggcagttc tcctaattga tcgcgggaat tatcagaaat agacattatt tgttattttt 60 cctgttcaac tttaaaactt caatattcgt gagtttggat gaatccctag agcactacct 120 tttagacctc tcgctgcaat ttaggccagt tgagatttaa gctttccgac gattcttctc 180 attactgcaa tcgtaccggc gatggtggac acgatgacat gaaagagcat taaagcaatc 240 aagtacaggc tgaagtagtt aaaccactcc actccggtgc tctgtgataa aaaatgcgca 300 cccaaactca aagtgccaac tgggaaggta ctggcccacc atgtggggct gtatgtcgcc 360 cctttgaaaa cagctctgta gaacacaaag tgagcgatgg ctcccagagg aatcgtaaaa 420 attcccatga tgatgccgta aataatgccc attgtgattg ctgtcttgga tccaaaggac 480 gcaccgatga gctgagctgc tgcagtggat tggcccacca tacccaaagg aatccatgat 540 gttggtgttg ccatcagtgg gatgccctgc gccttggggc cgaaatagta gaaatacact €00 cgggtaaaaa ctgctggtgc agacgccaaa gttaaaagga agagcccgaa agaaacccac 660 agcatcgccg gaagttcaaa gtgctcatgg agttgtgctg ccgaggtgga agcaaccatc 720 ggcgtgacaa gaggaagacc ccacgcaaaa gttggtgtgc ccgccttaga tcgcaaaatg 780 gccgttatat ataaggaata ggcaacaagt cccacggctg tgccaataga ccagcacaca 840 aacataaatc cccacagatc atcacccaaa actacggggc ttgcagttcc caatgcgatc 900 aaacccatgg acagcattgc ccatgccggc atgadttcag ttttgaatga aggagagcgg 960 tagattagcc aaccgccaat aatgacaatt gccaccacaa cagctaacgc gaagaagaaa 1020 tctgcgacga ctggaaaacc atggattttc aacagtgatg acaacaatga gatgcccatg 1080 agggaaccag cccacgaggg gccaggtgga ggtaagaccg cagcgtagct tttggtcgaa 1140 gaaggagtgg gcatgcccat tactttaagc ctttggggca gtgaaaccgc taaatgggag 1200 cgttgtgcgc tcgatcactg gtctagacct ttgggctcca aaagttgcaa tttcgcgaat 1260 acttcaacac ttgtttgcaa tgtttgttaa taaatgggtt cgctagtgga ttctgtcgtt 1320 agtactggcc gtcgtggtgg ggtcatgtat ttaggtaggg caaagttaag atcagagcac 1380 tttttgatac gactaactgg atataacctt tggggtaacg tggggatgtg tgtgagtaat 1440 tttcaaagta tttaaaaggg ggatctaggg taaaaatttg gcttcaagta catatcttta 1500 gttcggtagt tgagggcggg tggtgacagt gcgggcatgc atgtgagtgt aaatgttgtt 1560 ttaaaaaggt gtgtactgac agtgggccgg tttgtgctgg tcggccacta gcggagtgct 1620 tggattgtga tggcagggta agggaaaggg attaccatta ccgctgttct tggcgttttg 1680 ttgcctattg tccgaatgtt aagtgttaat ggtgggaaaa ctgggaaagt tgtcccctgg 1740 aatgtgtgag aattgcccaa atctgaaccc aatggccatg gacggggaat gaactgtcgg 1800 agaacggttg aggttaattc ttgaaaccac ccccaaaata ggctatttaa acgggtgctc 1860 tcatattaaa gaaagtgtgt agatgcgtgt gggcaggggg taggtccact ggtaatgaca 1920 aatgtgtccg ttgtctcacc taaagtttta actagttctg tatctgaaag ctacgctagg 1980 gggcgagaac tctgtcgaat gacacaaaat ctggagaagt a atg act act gct gca 2036 Met Thr Thr Ala Ala 1 5 ate agg ggc ctt cag ggc gag gcg ceg acc aag aat aag gaa ctg ctg 2084 lie Arg Gly Leu Gln Gly Glu Ala Pro Thr Lys Asn Lys Glu Leu Leu 10 15 20 aac tgg ate gca gac gee gtc gag etc ttc cag ect gag gct gtt gtg 2132 Asn Trp lie Ala Asp Ala Val Glu Leu Phe Gln Pro Glu Ala Val Val 25 30 35 tt gtt gat gga tec cag gct gag tgg gat cgc atg gcg gag gat ctt 2180 Phe Val Asp Gly Ser Gln Ala Glu Trp Asp Arg Met Ala Glu Asp Leu 40 45 50 gtt gaa gee ggt acc etc ate aag etc aac gag gaa aag cgt ceg aac 2228 Val Glu Ala Gly Thr Leu lie Lys Leu Asn Glu Glu Lys Arg Pro Asn 55 60 65 age tac cta gct cgt tec aac cea tet gac gtt gcg cgc gtt gag tec 2276 Ser Tyr Leu Ala Arg Ser Asn Pro Ser Asp Val Ala Arg Val Glu Ser 70 75 80 85 cgc acc ttc ate tgc tec gag aag gaa gaa gat gct ggc cea acc aac 2324 Arg Thr Phe lie Cys Ser Glu Lys Glu Glu Asp Ala Gly Pro Thr Asn 90 95 100 aac tgg gct cea cea cag gca atg aag gaa gaa atg tec aag cat tac 2372 Asn Trp Ala Pro Pro Gln Ala Met Lys Asp Glu Met Ser Lys His Tyr 105 110 115 gct ggt tcc atg aag ggg cgc acc atg tac gtc gtg cct ttc tgc atg 2420 Ala Gly Ser Met Lys Gly Arg Thr Met Tyr Val Val Pro Phe Cys Met f 120 125 130 ggt cea ate age gat ceg gac cct aag ctt ggt gtg cag etc act gac 2468 5 Gly Pro lie Ser Asp Pro Asp Pro Lys Leu Gly Val Gln Leu Thr Asp 135 140 145 tcc gag tac gtt gtc atg tcc atg cgc ate atg acc cgc atg ggt att 2516 Ser Glu Tyr Val Val Met Ser Met Arg lie Met Thr Arg Met Gly lie 150 155 160 165 10 gaa gcg ctg gac aag ate gge gcg aac ggc age ttc gtc agg tgc etc 2564 Glu Ala Leu Asp Lys lie Gly Ala Asn Gly Ser Phe Val Arg Cys Leu 170 175 180 cae tcc gtt ggt gct cct ttg gag cea ggc cag gaa gac gtt gea tgg 2612 Hls Ser Val Gly Ala Pro Leu Glu Pro Gly Gln Glu Asp Val Ala Trp 15 185 190 195 cct tgc aac gac acc aag tac ate acc cag ttc cea gag acc aag gaa 2660 Pro Cys Asn Asp Thr Lys Tyr lie Thr Gln Phe Pro Glu Thr Lys Glu 200 205 210 att tgg tcc tac ggt tcc ggc tac ggc gga aac gea ate ctg gca aag 2708 20 lie Trp Ser Tyr Gly Ser Gly Tyr Gly Gly Asn Ala lie Leu Ala Lys 215 220 225 aag tgc tac gca ctg cgt ate gca tet gtc atg gct cgc gaa gaa gga 2756 Lys Cys Tyr Ala Leu Arg lie Ala Ser Val Met Ala Arg Glu Glu Gly 230 235 240 245 25 tgg atg gct gag cae atg ctc ate ctg aag ctg ate aac cca gag ggc 2804 Trp Met Ala Glu His Met Leu lie Leu Lys Leu lie Asn Pro Glu Gly 250 255 260 aag gcg tac cae ate gca gca gca ttc cca tet gct tgt ggc aag acc 2852 Lys Ala Tyr His lie Ala Ala Ala Phe Pro Ser Ala Cys Gly Lys Thr 265 270 275 aac ctc gee atg ate act cca acc ate cca ggc tgg acc gct cag gtt 2900 Asn Leu Ala Met lie Thr Pro Thr lie Pro Gly Trp Thr Ala Gln Val 280 285 290 gtt ggc gac gac ate gct tgg ctg aag ctg cgc gag gac ggc ctc tac 2948 Val Gly Asp Asp lie Ala Trp Leu Lys Leu Arg Glu Asp Gly Leu Tyr 295 300 305 gca gtt aac cca gaa aat ggt ttc ttc ggt gtt gct cca ggc acc aac 2996 Ala Val Asn Pro Glu Asn Gly Phe Phe Gly Val Ala Pro Gly Thr Asn 310 315 320 . 325 tac gca tec aac cca ate gcg atg aag acc atg gaa cca ggc aac acc 3044 Tyr Ala Ser Asn Pro lie Ala Met Lys Thr Met Glu Pro Gly Asn Thr 330 335 340 ctg ttc acc aac gtg gca ctc acc gac gac ggc gac ate tgg tgg gaa 3092 Leu Phe Thr Asn Val Ala Leu Thr Asp Asp Gly Asp lie Trp Trp Glu 345 350 355 ggc atg gac ggc gac gee cca gct cae ctc att gac tgg atg ggc aac 3140 Gly Met Asp Gly Asp Ala Pro Ala His Leu lie Asp Trp Met Gly Asn 360 365 370 gac tgg acc cea gag tcc gac gaa aac gct gct cac cct aac tcc cgt 3188 Asp Trp Thr Pro Glu Ser Asp Glu Asn Ala Ala His Pro Asn Ser Arg 375 380 385 tac tgc gta gca ate gac cag tcc cea gca gca gca cct gag ttc aac 3236 5 Tyr Cys Val Ala lie Asp Gln Ser Pro Ala Ala Ala Pro Glu Phe Asn 390 395 400 405 gac tgg gaa ggc gtc aag ate gac gca ate etc ttc ggt gga cgt cgc 3284 Asp Trp Glu Gly Val Lys lie Asp Ala lie Leu Phe Gly Gly Arg Arg 410 415 420 f 10 gca gac acc gtc cea ctg gtt acc cag acc tac gac tgg gag cac ggc 3332 Ala Asp Thr Val Pro Leu Val Thr Gln Thr Tyr Asp Trp Glu His Gly 425 430 435 acc atg gtt ggt gca ctg etc gca tcc ggt cag acc gca gct tcc gca 3380 Thr Met Val Gly Ala Leu Leu Ala Ser Gly Gln Thr Ala Ala Ser Ala 15 440 445 450 gaa gca aag gtc ggc acá etc cgc cac gac cea atg gca atg etc cea 3428 Glu Ala Lys Val Gly Thr Leu Arg His Asp Pro Met Ala Met Leu Pro 455 460 465 ttc att ggc tac aac gct ggt gaa tac ctg cag aac tgg att gac atg 3476 20 Phe lie Gly Tyr Asn Ala Gly Glu Tyr Leu Gln Asn Trp lie Asp Met 470 475 480 485 ggt aac aag ggt ggc gac aag atg cea tcc ate ttc ctg gtc aac tgg 3524 Gly Asn Lys Gly Gly Asp Lys Met Pro Ser lie Phe Leu Val Asn Trp 490 495 500 25 ttc cgc cgt ggc gaa gat gga cgc ttc ctg tgg cct ggc ttc ggc gac 3572 Phe Arg Arg Gly Glu Asp Gly Arg Phe Leu Trp Pro Gly Phe Gly Asp ^ ¦ 505 510 515 aac tct cgc gtt ctg aag tgg gtc atc gac cgc atc gaa ggc cac gtt 3620 Asn Ser Arg Val Leu Lys Trp Val lie Asp Arg lie Glu Gly His Val 520 525 530 ggc gca gac gag acc gtt gtt gga cac acc gct aag gcc gaa gac ctc 3668 Gly Ala Asp Glu Thr Val Val Gly His Thr Ala Lys Ala Glu Asp Leu 535 540 545 f"^ 10 gac ctc gac ggc ctc gac acc cea att gag gat gtc aag gaa gca ctg 3716 Asp Leu Asp Gly Leu Asp Thr Pro lie Glu Asp Val Lys Glu Ala Leu 550 555 560 565 acc gct cct gca gag cag tgg gca aac gac gtt gaa gac aac gcc gag 3764 Thr Ala Pro Ala Glu G n Trp Ala Asn Asp Val Glu Asp Asn Ala Glu 15 570 575 580 tac ctc act ttc ctc gga cea cgt gtt cct gca gag gtt cac age cag 3812 Tyr Leu Thr Phe Leu Gly Pro Arg Val Pro Ala Glu Val His Ser Gln 585 590 595 ttc gat gct ctg aag gcc cgc att tea gca gct cac gct taaagttcac . 3861 20 Phe Asp Ala Leu Lys Ala Arg lie Ser Ala Ala His Ala 600 605 610 gcttaagaac tgctaaataa caagaaaggc tcccaccgaa agtgggagcc tttcttgtcg 3921 ttaagcgatg aatt 3935 <210> 2 <211> 610 <212> PRT V. <213> Corynebacterium giutamicum 5 <400> 2 Met Thr Thr Ala Ala lie Arg Gly Leu Gln Gly Glu Ala Pro Thr Lys 1 5 10 15 Asn Lys Glu Leu Leu Asn Trp lie Ala Asp Ala Val Glu Leu Phe Gln 20 25 30 10 Pro Glu Ala Val Val Phe Val Asp Gly Ser Gln Ala Glu Trp Asp Arg 35 40 45 Het Ala Glu Asp Leu Val Glu Ala Gly Thr Leu lie Lys Leu Asn Glu 50 55 60 Glu Lys Arg Pro Asn Ser Tyr Leu Ala Arg Ser Asn Pro Ser Asp Val 15 65 70 75 . 80 Ala Arg Val Glu Ser Arg Thr Phe lie Cys Ser Glu Lys Glu Glu Asp 85 90 95 Ala Gly Pro Thr Asn Asn Trp Ala Pro Pro Gln Ala Met Lys Asp Glu 100 105 110 20 Met Ser Lys His Tyr Ala Gly Ser Met Lys Gly Arg Thr Met Tyr Val 115 120 125 Val Pro Phe Cys Met Gly Pro lie Ser Aap Pro Asp Pro Lys Leu Gly 130 135 140 Val Gln Leu Thr Asp Ser Glu Tyr Val Val Met Ser Met Arg lie Met 25 145 150 155 160 Thr Arg Het Gly lie Glu Ala Leu Asp Lys lie Gly Ala Asn Gly Ser 165 170 175 Phe Val Arg Cys Leu Hls Ser Val Gly Ala Pro Leu Glu Pro Gly Gln 180 185 190 Glu Asp Val Ala Trp Pro Cys Asn Asp Thr Lys Tyr lie Thr Gln Phe 195 200 205 Pro Glu Thr Lys Glu lie Trp Ser Tyr Gly Ser Gly Tyr Gly Gly Asn 210 215 220 Ala lie Leu Ala Lys Lys Cys Tyr Ala Leu Arg lie Ala Ser Val Met 225 230 235 240 Ala Arg Glu Glu Gly Trp Met Ala Glu His Met Leu lie Leu Lys Leu 245 250 255 lie Asn Pro Glu Gly Lys Ala Tyr His lie Ala Ala Ala Phe Pro Ser 260 265 270 Ala Cys Gly Lys Thr Asn Leu Ala Met lie Thr Pro Thr lie Pro Gly 275 280 285 Trp Thr Ala Gln Val Val Gly Asp Asp lie Ala Trp Leu Lys Leu Arg 290 295 300 Glu Asp Gly Leu Tyr Ala Val Asn Pro Glu Asn Gly Phe Phe Gly Val 305 310 315 320 Ala Pro Gly Thr Asn Tyr Ala Ser Asn Pro lie Ala Met Lys Thr Met 325 330 335 Glu Pro Gly Asn Thr Leu Phe Thr Asn Val Ala Leu Thr Asp Asp Gly 340 345 350 Asp lie Trp Trp Glu Gly Met Asp Gly Asp Ala Pro Ala Hls Leu lie 355 360 365 Asp Trp Met Gly Asn Asp Trp Thr Pro Glu Ser Asp Glu Asn Ala Ala 370 375 380 His Pro Asn Ser Arg Tyr Cys Val Ala lie Asp Gln Ser Pro Ala Ala 385 390 395 400 Ala Pro Glu Phe Asn Asp Trp Glu Gly Val Lys lie Asp Ala lie Leu 405 410 415 Phe Gly Gly Arg Arg Ala Asp Thr Val Pro Leu Val Thr Gln Thr Tyr 420 425 430 Asp Trp Glu His Gly Thr Met Val Gly Ala Leu Leu Ala Ser Gly Gln 435 440 445 Thr Ala Ala Ser Ala Glu Ala Lys Val Gly Thr Leu Arg His Asp Pro 450 455 460 Met Ala Met Leu Pro Phe lie Gly Tyr Asn Ala Gly Glu Tyr Leu Gln 465 470 475 480 Asn Trp lie Asp Met Gly Asn Lys Gly Gly Asp Lys Met Pro Ser lie 485 490 495 Phe Leu Val Asn Trp Phe Arg Arg Gly Glu Asp Gly Arg Phe Leu Trp 500 505 510 Pro Gly Phe Gly Asp Asn Ser Arg Val Leu Lys Trp Val lie Asp Arg 515 520 525 lie Glu Gly His Val Gly Ala Asp Glu Thr Val Val Gly His Thr Ala 530 535 540 Lys Ala Glu Asp Leu Asp Leu Asp Gly Leu Asp Thr Pro lie Glu Asp 545 550 555 560 Val Lys Glu Ala Leu Thr Ala Pro Ala Glu Gln Trp Ala Asn Asp Val 565 570 575 Glu Asp Asn Ala Glu Tyr Leu Thr Phe Leu Gly Pro Arg Val Pro Ala 580 585 590 Glu Val His Ser Gln Phe Asp Ala Leu Lys Ala Arg lie Ser Ala Ala 595 600 605 His Ala 610 DECLARACION QUE INCLUYE PROCESO Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes.

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES 1. Polinucleótido aislado a partir de bacterias corineformes que contiene una secuencia de polinucleótido caracterizado porqué se selecciona del grupo que comprende 5 a) polinucleótido que es al menos 70 % idéntico a un polinucleótido que codifica para un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID No. 2, b) polinucleótido que es al menos 70 % idéntico a un polinucleótido que codifica para el polipéptido 10 mencionado y esta contenido sobre el plásmido pEK-pckA o bien pEK-pckB, c) polinucleótido que codifica para un polipéptido que contiene una secuencia de minoácido que es al menos 70% idéntica a la secuencia de aminoácido de SEQ ID No 15 2, d) polinucleótido complementario a los polinucleótidos de a) , b) o c) , y ^ e) polinucleótido que contiene al menos 15 bases sucesivas de la secuencia de polinucleótido de a), b) , 20 c) o d) .
2. 2. Polinucleótido según la reivindicación 1, caracterizado porque el polinucleótido es un DNA replicable, de preferencia recombinante.
3. 3. Polinucleótido según la reivindicación 1, 25 caracterizado porque el polinucleótido es un RNA.
4. 4. Polinucleótido según la reivindicación 2, caracterizado porque contiene la secuencia de aminoácido según se representa en SEQ ID No. 1.
5. 5. DNA replicable según la reivindicación 2, 5 caracterizado porque contiene (i) la secuencia de nu.cleótido que se muestra en SEQ ID No . 1 o (ii) al menos una secuencia que corresponde a la secuencia (i) dentro de la zona de la degeneración ^ 10 del código genético, o ^ (iii) al menos una secuencia que hibridiza con la secuencia complementaria a la secuencia (i) o (ii), y/o eventualmente (iv) mutaciones de orientación funcionalmente neutral en 15 (i).
6. 6. Polinucleótido según la reivindicación 2, caracterizado porque codifica para un polipéptido que ^ representa la secuencia de aminoácido de la SEQ ID No. 2.
7. 7. Vector pEK-pckA, representado en la figura 1. 20
8. 8. Vector pEK-pckB, representado en la figura 2.
9. 9. Vector pkl9mobsacBApck, representado en la figura 3 y depositado en la cepa E. coli DH5a con el número DSM 13047.
10. 10. Bacterias corineformes que sirven como célula 25 huésped, caracerizadas porque contienen uno de los vectores so según las reivindicaciones 6 a 8# o en las cuales se incorporó la deleción Apck.
11. 11. Método para la producción por fermentación de L-aminoácidos, caracterizado porque se emplean bacterias en las que a) se debilita al polinucleótido según la reivindicación 1 o se reduce la actividad del polipéptido para el cual codifica el polinucleótido mencionado/ b) se concentra el producto deseado en el medio o en las células de las bacterias, y c) se aisla el producto.
12. 12. Método según la reivindicación 11, caracterizado porque se emplean bacterias de la especie Corynebacterium glutamicum.
13. 13. Método según la reivindicación 11, caracterizado porque el debilitamiento se obtiene mediante mutagenesis de integración con el auxilio del plásmido pK19mobsacBApck, representado en la figura 3 y depositado como DMS 13047.
14. 14. Método según la reivindicación 11, caracterizado porque para la producción de L-lisina se fermentan bacterias en las que eventualmente * se sobreexpresa simultáneamente el gen dapA que codifica para la síntesis de dihidrodipicolinato, y/o * se amplifica simultáneamente un fragmento de DNA que transmite la resistencia a la S- (2-aminoetil) - cisteina.
15. 15. Método según la reivindicación 11, caracterizado porque para la producción de L-treonina se fermentan bacterias en las que eventualmente se sobreexpresa simultáneamente el gen hom que codifica para la homoserino-dehidrogenasa y/o alelos homdr o bién homFBR que codifican para una homoserino dehidrogenasa "resistente a la retroalimentación" .