CN115181736B - 一种可以结合脂多糖的蛋白酶pck及其制备和应用 - Google Patents

一种可以结合脂多糖的蛋白酶pck及其制备和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115181736B
CN115181736B CN202210016038.2A CN202210016038A CN115181736B CN 115181736 B CN115181736 B CN 115181736B CN 202210016038 A CN202210016038 A CN 202210016038A CN 115181736 B CN115181736 B CN 115181736B
Authority
CN
China
Prior art keywords
pck
lipopolysaccharide
protease
gly
leu
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210016038.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115181736A (zh
Inventor
邱丽梅
尹肖婷
刘青
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Oceanology of CAS
Original Assignee
Institute of Oceanology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Oceanology of CAS filed Critical Institute of Oceanology of CAS
Priority to CN202210016038.2A priority Critical patent/CN115181736B/zh
Publication of CN115181736A publication Critical patent/CN115181736A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115181736B publication Critical patent/CN115181736B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/101—Plasmid DNA for bacteria
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及分子生物学，具体地说是一种可以结合脂多糖的蛋白酶PCK及其制备和应用。蛋白酶其氨基酸序列中磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶激活位点、GTP结合位点、草酰乙酸作为底物的结合位点和金属结合位点。将含有PCK对应核苷酸的质粒转化到大肠杆菌中，随后进行诱导表达，采用Ni‑NTA亲和层析柱对PCK蛋白分离纯化；获得的PCK蛋白不仅具有催化草酰乙酸转变为磷酸烯醇式丙酮酸和二氧化碳的催化活性，亦可应用于脂多糖的清除或者中和。本发明利用原核表达和亲和层析的方法大量制备PCK蛋白酶，采用ELISA方法对脂多糖的结合活性进行鉴定，旨在降低药物清除LPS的毒副作用和成本，同时为蛋白酶在LPS清除剂上的应用提供新思路，为结合脂多糖的酶制剂的工业化推广奠定基础。

Description

一种可以结合脂多糖的蛋白酶PCK及其制备和应用
技术领域
本发明涉及分子生物学，具体地说是一种可以结合脂多糖的蛋白酶PCK及其制备和应用。
背景技术
脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)又叫内毒素，是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，由脂质A、核心多糖和O抗原组成，脂质A是脂多糖的毒性核心，O抗原是LPS引发免疫应答的易变部分，核心多糖主要起连接作用，有时也有抗原性。脂多糖可伴随革兰氏阴性菌的裂解而大量释放，也可以由活菌细胞壁发泡而释放。脂多糖可以通过呼吸道和消化道进入人体并在人体内不断累积，当脂多糖的含量蓄积到一定的阈值时，会导致发热、炎症、水肿、心血管疾病和肝肾功能障碍等疾病。
在一些特殊的环境中，如养殖业中特殊的饲养环境，微生物大量生长于动物排泄物，与饲料粉尘等容易形成含有脂多糖的微生物气溶胶。暴露在上述特殊环境中的人和动物易引发各种呼吸道疾病，甚至可能导致脓毒血症等全身性症状，造成巨大的生命和财产损失，因此人们希望可以找到高效清除或者是中和脂多糖的制剂或药物。
目前LPS结合剂或清除剂的应用范例较少，经常使用的LPS清除方式是体外循环用LPS去除柱，其体外循环使用了革兰氏阴性菌的强力抗生素——多粘菌素(PMB)具有肾毒性和神经毒性，因此不得不对制备步骤严加管控，成本升高。
发明内容
本发明目的在于提供一种可以结合脂多糖的蛋白酶PCK及其制备和应用。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种可以结合脂多糖的蛋白酶PCK，蛋白酶其氨基酸序列中磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶激活位点、GTP结合位点、草酰乙酸作为底物的结合位点和金属结合位点。
所述金属结合位点中金属离子为Mg2+和/或Mn2+。
所述蛋白酶氨基酸中磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶活性位点的特征氨基酸为R,Y,G,K,H,S,N,D,F,V,N,W,；GTP结合位点的特征氨基酸为A,G,R,W,F,N；催化草酰乙酸作为底物的结合位点的特征氨基酸为R,Y,G,K,K,F；金属结合位点的特征氨基酸为K,H,T,D,F。
所述蛋白酶氨基酸为SEQ ID NO.1中氨基酸序列所示。
一种可以结合脂多糖的蛋白酶PCK的制备方法，设计正反一对引物，以RNA反转录的cDNA为模板，利用PCR方法扩增PCK蛋白酶对应的基因，而后与pET-30a(+)质粒相连，转化入BL21(DE3)表达菌株中；随后进行诱导表达，采用Ni-NTA亲和层析柱对PCK蛋白分离纯化，即获得含有权利要求1所述功能位点的蛋白酶PCK；其中，正向引物MF的序列为5’GGTACCATGGGGTCGTTAGATATAAAT3’；反向引物MR的序列为5’CTCGAGTTACATGGAGTTGACGCGAGC3’。
所述将转化菌株涂布于含卡那霉素抗性的LB平板，挑取阳性克隆菌株，37℃，200-220rpm震荡过夜培养；将上述菌液按1:100的体积比接种至LB培养基中，摇床培养至OD600至0.4-0.6，加入IPTG后，20℃，100rpm震荡表达20h；4000rpm，30min离心收集表达菌体，加入裂解液TBS(0.15MTris，0.05M NaCl，PH7.6)，反复冻融3次后进行超声破碎；10000rpm，离心30min收集上清液；将上清用0.4μM滤膜过滤后缓慢流过Ni-NTA亲和层析柱，用含10mM咪唑的漂洗液漂洗至少3h；之后用含300mM咪唑的洗脱液洗脱，收集吸光值最高处的液体，即得含有权利要求1所述功能位点的蛋白酶PCK。
一种可以结合脂多糖的蛋白酶PCK的应用，所述蛋白酶PCK在作为脂多糖的中和剂或清除剂。
本发明所具有的优点：
⑴本发明利用分子生物学手段，PCK蛋白容易实现体外大量重组表达，成本低廉，具有工业化生产的潜力；
⑵本发明生产及应用过程不会产生有毒有害物质，不会对生态环境和人体产生危害；
⑶本发明蛋白酶PCK具有强的LPS结合活性以及抑菌活性，证明其可用于LPS清除剂或中和剂的开发应用。
附图说明
图1为本发明实施例提的基于ELISA的rPCK与LPS的互作效果图。
图2为本发明实施例提的基于MIC rPCK抑制大肠杆菌生长的效果图。
具体实施方式
下面的实验例中将对本发明作进一步阐述，但本发明不限于此。
本发明以长牡蛎为例，用PCR技术扩增PCK蛋白的编码区基因片段，将其克隆到pET-30a(+)表达载体中，获得重组载体pET-30a(+)-PCK，随后转入宿主细胞BL21(DE3)中实现原核体外重组表达。经镍琼脂糖凝胶纯化获得PCK重组蛋白，透析，获得的PCK蛋白不仅具有催化草酰乙酸转变为磷酸烯醇式丙酮酸和二氧化碳的催化活性，亦可应用于脂多糖的清除或者中和；具体①基于ELISA检测PCK对LPS的结合活性，结果显示PCK对LPS具有强结合活性，进行非线性回归分析拟合得到的曲线如图1所示；②基于MIC法检测PCK对大肠杆菌的抑制活性，结果显示重组表达的蛋白对大肠杆菌的生长具有抑制作用，蛋白浓度为3.125ug/ml时，具有明显的抑制活性,并且其抑制率随着蛋白浓度的增加而明显升高，蛋白浓度与大肠杆菌生长的吸光值的关系见图2。
实验例1 PCK蛋白的获得以及序列特征分析
在NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获取序列号为XM_011425883的mRNA序列，该序列被注释为“预测为磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的mRNA序列”。根据该mRNA序列翻译得到的蛋白质序列搜索比对不同物种的PCK蛋白，而后采用Blast网站对来自不同物种的PCK蛋白序列进行分析，其保守序列如下表所示：
Figure BDA0003460838220000031
SEQ ID NO.1
MGSLDINNKRISVEGRLKDVDGPNFASRIVEESLGGFTRPYQSIASQVLYGKWNDLPKKVQHYVQDNVKLCKPDTIHICDGSDRENEMLLYILQRDGMIKPLPKMDNCWLARTDPKDVARVESRTFISTENMRDTIPVVKNGITGTLGNWMSPDDLDTELNMRFPGCMKGRTMFVIPFSMGPVGSALSKIGIELTDSAYVAASMRIMTRVGKKVLKTLGNGDFVKCLHSVGAPYPLKEPMVSNWPCNPKETIIAHLPERNEICSYGSGYGGNSLLGKKCFALRLGSILGRREGWLAEHMLILGIENSKGEKKYFAAAFPSACGKTNLAMMKSALPDYKITCVGDDIAWMRFDKDGKLRAINPEAGFFGVAPGTSMKTNPMAMETISRNTIFTNVAETSDGGVFWEGLEGEVSRTTKIKSWLGVEDWHAEQGKPAAHPNSRFCTPAAQCPIMDERWQDPEGVPIEAIIFGGRRPEGVPLVYEAFNWQHGVYIGASMRSEATAAAEHKSKVIMHDPFAMRPFFGYNFGHYLEHWLSFQQKQGLDLPKIYHVNWFRKDKNGRFMWPGFGENSRVLDWIFRRVNGEDCAVQSAIGNLPRKGSLNLEGLQEDVDMDALFSIPKEYWQKEVKDIGKYFDEQVHEDLPPEIMKELRSLEARVNSM*
实验例2PCK蛋白的体外重组表达与纯化
1.PCK的质粒构建和转化
以长牡蛎肝胰腺组织反转录的cDNA为模板，正反引物对(MF/MR)进行PCR合成可以编码本发明PCK蛋白的基因。将目的基因与PET-30a(+)表达载体相连。随后将重组质粒导入到大肠杆菌DH5α菌株中，具体步骤如下所述，重组质粒和大肠杆菌DH5α感受态细胞分别预冷30min后，将5μL质粒加入到感受态细胞中，在42℃中准确热激90s，迅速置于冰上2min。随后加入200μL LB液体培养基，37℃，200rpm，培养45min。取80μL涂布于含有50μg/ml卡那霉素的平板上，37℃培养约12h。随机挑取数个单克隆菌落于含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm，培养约4-6h。将上述挑取的单克隆培养物利用载体引物T7(5'TAATACGACTCACTATAGGG3')以及T7t(5'GCTAGTTATTGCTCAGCGG3)进行菌落PCR，筛选阳性菌落，测序验证PCK蛋白对应的基因序列是否正确。
2.PCK蛋白的大量制备
将测序正确菌落大量培养，提取正确的重组质粒，导入到大肠杆菌表达感受态细胞BL21(DE3)中，步骤同1。将导入成功的阳性菌落，37℃，200-220rpm震荡过夜培养；将上述菌液按1:100的体积比接种至大量培养基中，摇床培养至OD600至0.4-0.6，加入终浓度为1mM IPTG后，20℃，100rpm震荡表达20h；4000rpm，30min离心收集表达菌体，加入裂解液，反复冻融3次后进行超声破碎；10000rpm，离心30min收集上清液；将上清用0.4μM滤膜过滤后缓慢上Ni柱，用含10mM咪唑的漂洗液漂洗至少3h；之后用含100mM咪唑的洗脱液洗脱，收集吸光值最高处的液体，透析复性后即得含所述功能位点的蛋白酶PCK，即含序列表SEQ IDNO.1中所示氨基酸。
实施例3 PCK蛋白LPS结合活性验证
1.基于ELISA实验验证重组PCK与脂多糖的结合活性
采用ELISA的方法验证了PCK与脂多糖的结合活性，具体操作如下：将溶于50mM碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液的LPS加入96孔酶标板孔中(20μg/孔)，在4℃孵育过夜以使LPS包被在酶标板孔底部；用PBST缓冲液(含137mM氯化钠、2.7mM氯化钾、10mM磷酸氢二钠、2mM磷酸二氢钾和0.05％吐温-20，pH 7.4)重复洗涤酶标板孔三次，并加入3％(g/mL)牛血清白蛋白(BSA)溶液进行封闭，37℃孵育30min；弃封闭液，将使用TBS稀释至不同浓度梯度的PCK溶液(28μM，14μM，7μM，3.5μM，1.75μM，0)加入酶标板孔与LPS进行结合，室温孵育2h；用PBST缓冲液重复洗涤酶标板孔三次，加入商品化的抗his标签单克隆抗体作为一抗(v/v＝1：1000)，37℃孵育1h；再用PBST缓冲液重复洗涤酶标板孔三次，并加入商品化的HRP标记的抗体作为二抗(v/v＝1：1000)，37℃孵育1h；再用PBST缓冲液重复洗涤酶标板孔三次，然后使用TMB试剂盒测定重组PCK与脂多糖的结合活性，其中rTrx作为阴性对照。每个样品浓度3个重复，采用Prism 9.3.3软件对反应的吸光值进行处理，可以看出重组PCK具有脂多糖的结合活性(图1)。
2.基于MIC实验验证重组PCK的抑菌活性
检测重组PCK的抑菌活性，具体操作步骤如下：1)用TBS将革兰氏阴性菌(本发明使用的是大肠杆菌)调整浓度为104个/mL，随即加入不同浓度的重组PCK蛋白(倍比梯度稀释至12.5μg/ml，6.25μg/ml，3.125μg/ml)，孵育2h。2)将以上混合液均等加入96孔酶标板中(100μL/孔，每个样品3个重复)，再补加150μL无抗性的液体培养基。3)在全自动定量绘图酶标仪(Biotek)中37℃培养，每30分钟实时检测一次细菌生长的OD600值，取3次平均值绘制细菌生长曲线。rTrx标签蛋白作为阴性对照，TBS作为空白对照。可以看出重组PCK有明显的抑菌活性(图2)。
序列表
<110> 中国科学院海洋研究所
<120> 一种可以结合脂多糖的蛋白酶PCK及其制备和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 658
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Gly Ser Leu Asp Ile Asn Asn Lys Arg Ile Ser Val Glu Gly Arg
1 5 10 15
Leu Lys Asp Val Asp Gly Pro Asn Phe Ala Ser Arg Ile Val Glu Glu
20 25 30
Ser Leu Gly Gly Phe Thr Arg Pro Tyr Gln Ser Ile Ala Ser Gln Val
35 40 45
Leu Tyr Gly Lys Trp Asn Asp Leu Pro Lys Lys Val Gln His Tyr Val
50 55 60
Gln Asp Asn Val Lys Leu Cys Lys Pro Asp Thr Ile His Ile Cys Asp
65 70 75 80
Gly Ser Asp Arg Glu Asn Glu Met Leu Leu Tyr Ile Leu Gln Arg Asp
85 90 95
Gly Met Ile Lys Pro Leu Pro Lys Met Asp Asn Cys Trp Leu Ala Arg
100 105 110
Thr Asp Pro Lys Asp Val Ala Arg Val Glu Ser Arg Thr Phe Ile Ser
115 120 125
Thr Glu Asn Met Arg Asp Thr Ile Pro Val Val Lys Asn Gly Ile Thr
130 135 140
Gly Thr Leu Gly Asn Trp Met Ser Pro Asp Asp Leu Asp Thr Glu Leu
145 150 155 160
Asn Met Arg Phe Pro Gly Cys Met Lys Gly Arg Thr Met Phe Val Ile
165 170 175
Pro Phe Ser Met Gly Pro Val Gly Ser Ala Leu Ser Lys Ile Gly Ile
180 185 190
Glu Leu Thr Asp Ser Ala Tyr Val Ala Ala Ser Met Arg Ile Met Thr
195 200 205
Arg Val Gly Lys Lys Val Leu Lys Thr Leu Gly Asn Gly Asp Phe Val
210 215 220
Lys Cys Leu His Ser Val Gly Ala Pro Tyr Pro Leu Lys Glu Pro Met
225 230 235 240
Val Ser Asn Trp Pro Cys Asn Pro Lys Glu Thr Ile Ile Ala His Leu
245 250 255
Pro Glu Arg Asn Glu Ile Cys Ser Tyr Gly Ser Gly Tyr Gly Gly Asn
260 265 270
Ser Leu Leu Gly Lys Lys Cys Phe Ala Leu Arg Leu Gly Ser Ile Leu
275 280 285
Gly Arg Arg Glu Gly Trp Leu Ala Glu His Met Leu Ile Leu Gly Ile
290 295 300
Glu Asn Ser Lys Gly Glu Lys Lys Tyr Phe Ala Ala Ala Phe Pro Ser
305 310 315 320
Ala Cys Gly Lys Thr Asn Leu Ala Met Met Lys Ser Ala Leu Pro Asp
325 330 335
Tyr Lys Ile Thr Cys Val Gly Asp Asp Ile Ala Trp Met Arg Phe Asp
340 345 350
Lys Asp Gly Lys Leu Arg Ala Ile Asn Pro Glu Ala Gly Phe Phe Gly
355 360 365
Val Ala Pro Gly Thr Ser Met Lys Thr Asn Pro Met Ala Met Glu Thr
370 375 380
Ile Ser Arg Asn Thr Ile Phe Thr Asn Val Ala Glu Thr Ser Asp Gly
385 390 395 400
Gly Val Phe Trp Glu Gly Leu Glu Gly Glu Val Ser Arg Thr Thr Lys
405 410 415
Ile Lys Ser Trp Leu Gly Val Glu Asp Trp His Ala Glu Gln Gly Lys
420 425 430
Pro Ala Ala His Pro Asn Ser Arg Phe Cys Thr Pro Ala Ala Gln Cys
435 440 445
Pro Ile Met Asp Glu Arg Trp Gln Asp Pro Glu Gly Val Pro Ile Glu
450 455 460
Ala Ile Ile Phe Gly Gly Arg Arg Pro Glu Gly Val Pro Leu Val Tyr
465 470 475 480
Glu Ala Phe Asn Trp Gln His Gly Val Tyr Ile Gly Ala Ser Met Arg
485 490 495
Ser Glu Ala Thr Ala Ala Ala Glu His Lys Ser Lys Val Ile Met His
500 505 510
Asp Pro Phe Ala Met Arg Pro Phe Phe Gly Tyr Asn Phe Gly His Tyr
515 520 525
Leu Glu His Trp Leu Ser Phe Gln Gln Lys Gln Gly Leu Asp Leu Pro
530 535 540
Lys Ile Tyr His Val Asn Trp Phe Arg Lys Asp Lys Asn Gly Arg Phe
545 550 555 560
Met Trp Pro Gly Phe Gly Glu Asn Ser Arg Val Leu Asp Trp Ile Phe
565 570 575
Arg Arg Val Asn Gly Glu Asp Cys Ala Val Gln Ser Ala Ile Gly Asn
580 585 590
Leu Pro Arg Lys Gly Ser Leu Asn Leu Glu Gly Leu Gln Glu Asp Val
595 600 605
Asp Met Asp Ala Leu Phe Ser Ile Pro Lys Glu Tyr Trp Gln Lys Glu
610 615 620
Val Lys Asp Ile Gly Lys Tyr Phe Asp Glu Gln Val His Glu Asp Leu
625 630 635 640
Pro Pro Glu Ile Met Lys Glu Leu Arg Ser Leu Glu Ala Arg Val Asn
645 650 655
Ser Met

Claims (1)

1.一种蛋白酶PCK在作为脂多糖的中和剂或清除剂中的应用，其特征在于：所述蛋白酶PCK的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
CN202210016038.2A 2022-01-07 2022-01-07 一种可以结合脂多糖的蛋白酶pck及其制备和应用 Active CN115181736B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210016038.2A CN115181736B (zh) 2022-01-07 2022-01-07 一种可以结合脂多糖的蛋白酶pck及其制备和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210016038.2A CN115181736B (zh) 2022-01-07 2022-01-07 一种可以结合脂多糖的蛋白酶pck及其制备和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115181736A CN115181736A (zh) 2022-10-14
CN115181736B true CN115181736B (zh) 2023-05-30

Family

ID=83511927

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210016038.2A Active CN115181736B (zh) 2022-01-07 2022-01-07 一种可以结合脂多糖的蛋白酶pck及其制备和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115181736B (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112210518A (zh) * 2020-11-09 2021-01-12 内蒙古普泽生物制品有限责任公司 一种罗伊氏乳杆菌及其在降低脂多糖浓度和改善胰岛素抵抗中的应用

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2159822C (en) * 1993-04-07 2007-05-15 Patrick Baeuerle Process for inhibiting the transcription of genes
DE19950409A1 (de) * 1999-10-20 2001-04-26 Degussa Neue für das pck-Gen codierende Nukleotidsequenzen
GB0921730D0 (en) * 2009-12-11 2010-01-27 Respivert Ltd Method of treatment
CN101979550B (zh) * 2010-10-09 2012-06-27 山东大学 玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因启动子克隆和应用
RU2015104762A (ru) * 2012-07-13 2018-08-31 Уэйв Лайф Сайенсес Лтд. Хиральный контроль
AU2015222944A1 (en) * 2014-02-27 2016-09-08 Massachusetts Institute Of Technology T cell balance gene expression, compositions of matters and methods of use thereof
CN113604459B (zh) * 2021-08-31 2023-10-10 江南大学 一种磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶及其应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112210518A (zh) * 2020-11-09 2021-01-12 内蒙古普泽生物制品有限责任公司 一种罗伊氏乳杆菌及其在降低脂多糖浓度和改善胰岛素抵抗中的应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
脂多糖和甲基磺酰苯丙氨酰氯甲酮对巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇流出和ATP结合盒转运体A1表达的影响;曹冬黎;郝新瑞;胡炎伟;李晓旭;唐雅玲;唐朝克;;中国动脉硬化杂志(第07期);全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN115181736A (zh) 2022-10-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111748571B (zh) 一种将枯草芽孢杆菌工程化为生产纳米抗体的多功能稳定平台的方法
JP5787298B2 (ja) 膜に提示したタンパク質を特異的に認識するポリペプチドの調製方法
CN111690054A (zh) 一种马氏珠母贝Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因、编码的蛋白质和应用
CN108642073A (zh) 一种梨PbrRALF2蛋白质的体外表达及其多克隆抗体的制备方法
CN113512110B (zh) Bvdv纳米抗体及其制备方法及应用
CN115181736B (zh) 一种可以结合脂多糖的蛋白酶pck及其制备和应用
CN114645033B (zh) 一种三磷酸核苷水解酶及其纯化方法和应用
EP1981978B1 (en) Affinity polypeptide for purification of recombinant proteins
CN111690636B (zh) 一种胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因、编码的蛋白质和应用
RU2580031C2 (ru) ПЛАЗМИДНЫЙ ВЕКТОР pET-His8-TrxL-Acip1, ШТАММ БАКТЕРИИ Escherichia coli BL21(DE3)/pET-His8-TrxL-Acip1 ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ АНТИМИКРОБНОГО ПЕПТИДА АЦИПЕНСИНА-1 И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ УКАЗАННОГО ПЕПТИДА
CN113912691A (zh) 重组长牡蛎高迁移率族蛋白r-CgHMGB1、制备方法及其应用
CN108864273B (zh) 一种模拟人源性抗菌肽及其制备方法
CN108048475B (zh) 缢蛏i型溶菌酶-2基因、编码蛋白及重组缢蛏i型溶菌酶-2基因工程菌的构建方法
CN107893059B (zh) 一种罗非鱼抗病免疫基因重组蛋白的制备与应用
CN107840884B (zh) 一种抗禽类传染性支气管炎病毒的纳米抗体及其制备方法
CN112094853A (zh) 白斑综合征病毒vp28基因、重组蛋白、多克隆抗体及制备方法和应用
CN112111496A (zh) 稀有鮈鲫载脂蛋白ApoE基因、重组蛋白、多克隆抗体及制备方法和应用
CN108676793B (zh) 基于gp5.5蛋白质的大肠杆菌总tRNA纯化方法
CN108218970B (zh) 一种重组蛋白及其制备方法和应用
RU2618850C2 (ru) Плазмидный вектор pET-mChBac75Na, штамм бактерии Eschrichia coli BL21(DE3/ pET-mChBac75Na для экспрессии антимикробного пептида минибактенецина ChBac7.5 Nα и способ получения указанного пептида
CN112979770A (zh) 一种蛋白a突变体、融合蛋白和应用
CN111073894B (zh) 菲律宾蛤仔ape基因片段、编码蛋白、制备方法及用途
CN116640743B (zh) 一种核酸内切酶及其应用
CN114380897B (zh) 一种结核分枝杆菌包涵体蛋白复性的方法及其专用复性缓冲液
CN114990098B (zh) 一种裂解酶、编码基因、组合物、抑菌剂制备方法及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant