CN108642073A - 一种梨PbrRALF2蛋白质的体外表达及其多克隆抗体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种梨PbrRALF2蛋白质的体外表达及其多克隆抗体的制备方法,通过设计引物克隆梨花粉PbrRALF2基因；构建大肠杆菌重组表达载体PbrALF2‑pCold‑TF；将构建的重组表达载体PbrRALF2‑pCold‑TF转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，构建表达梨PbrRALF2蛋白质的重组菌株；对重组菌株进行表达，并用镍柱亲和层析法纯化重组梨PbrRALF2蛋白质；以纯化的重组梨PbrRALF2蛋白质为抗原，采用多克隆抗体制备方法制备梨PbrRALF2多克隆抗体。通过本发明的方法，实现了梨PbrRALF2蛋白的体外表达，并制备出了效价高、特异性好的梨PbrRALF2多克隆抗体，完全可以满足相关实验及产业化的需求。

Description

一种梨PbrRALF2蛋白质的体外表达及其多克隆抗体的制备 方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种梨PbrRALF2蛋白质的体外表达及其多克 隆抗体的制备方法。

背景技术

花粉萌发及花粉管在花柱内正常生长是开花植物成功完成双受精的重要保障。如果花粉 管生长过快，会造成花粉管未到达子房提前破裂，受精失败；如果花粉管生长过慢，花粉管 在最佳受精时间内到达不了子房从而造成受精失败。梨是典型的异花授粉植物，梨花粉管生 长速率自我调控机制的研究具有理论与实践的双重价值。近30年来，国内外对于RALF调 控植物生长的机制进行了很多研究，而对RALF的生物学功能研究面临的首要问题就是 RALF蛋白质的制备，而由于RALF蛋白质只有5kDa左右，植物体内提取过程相当困难，给研究带来了很大的阻力。所以利用基因工程技术制备重组植物RALF蛋白质是解决上述问题的一个有效途径。

利用基因工程技术制备重组蛋白是一种具有广阔前景的技术手段。到目前为止，已有多 种蛋白质表达系统，如原核表达系统、真核表达系统、无细胞表达系统等。大肠杆菌表达系 统是最常用的一种原核表达系统，相比传统从活体材料中提取蛋白的方法，该系统具有遗传 背景和生化特性清楚、生长快，成本低、表达量高、表达产物分离纯化相对简单和便于大规 模生产等优点。长期以来，已有无数成功表达重组蛋白的案例。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种低成本、高产率、易纯化的梨PbrRALF2蛋白质的 体外表达方法。

本发明的另一目的在于提供采用上述方法制备的重组梨PbrRALF2蛋白质体在制备多克 隆抗体中的应用。

本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：

一种梨RALF蛋白质体外表达的方法，包括以下步骤：

a.提取梨花粉总RNA，反转录成cDNA，设计引物PCR扩增梨PbrRALF2基因；

b.构建表达梨PbrRALF2蛋白质的原核重组表达载体；

c.将步骤b构建的原核重组表达载体转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)中，构建PbrRALF2重组表达菌株；

d.培养步骤c所构建的PbrRALF2重组表达菌株至OD₆₀₀达到0.4-0.6，并低温处理后， 加入诱导剂IPTG，诱导表达梨PbrRALF2蛋白质；

e.纯化诱导表达的梨PbrRALF2蛋白质。

步骤a中，用于PCR扩增梨PbrRALF2基因的正向引物为5’-CGGGATCCATGGAGTTTGACATGGACTCG-3’，反向引物为5’-GCTCTAGATTAACTCCTGCACCTTGTGATG-3’。PCR扩增梨PbrRALF2基因的PCR反应 体系为：ddH₂O30μl，上下游引物各2μl,cDNA 2μl,5×Phusion HF Buffer 10μl,10mM dNTP 1μl,25mMMgSO₄ 2μl,Phusion DNA Polymerase 1μl；PCR反应条件为：98℃预变 性2min，然后进行98℃15s，62℃30s，68℃1min，共35个循环，最后68℃延伸 10min。所述梨PbrRALF2蛋白质N端带有6个组氨酸标签(His-Tag)。

步骤b中，构建表达梨PbrRALF2蛋白质的原核重组表达载体时，所使用的原核表达载 体为大肠杆菌表达载体pCold-TF，克隆梨PbrRALF2基因的插入位点为BamH I和Xba I酶切位点之间。优选的，PCR产物经2％的琼脂糖凝胶电泳分析并切胶回收，回收产物用 BamHI和Xba I限制性内切酶双酶切后连接到经同样双酶切的大肠杆菌表达载体pCold-TF 的BamH I和Xba I位点上。

步骤d中，所述的低温处理为置于冰上5～10min，然后15～17℃静置40～60分钟，所述 诱导剂IPTG的终浓度为0.5～1.0mmol/L，所述诱导表达的条件为15～17℃诱导20～24小 时。

步骤d中诱导表达梨PbrRALF2蛋白质的详细过程为：将构建的PbrRALF2重组表达菌 株按照1:50的体积比接种到100ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，220～250rpm震荡培养过夜，然后按1:50的体积比转接到300ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、200～240rpm震荡培养至菌液OD₆₀₀达到0.4-0.6，迅速置于冰上 5～10分钟，然后16℃静置50分钟；然后加入终浓度为0.5mmol/L的诱导剂IPTG， 16℃、220～240rpm震荡培养,诱导表达24小时；

步骤e中纯化诱导表达的梨PbrRALF2蛋白质的详细过程为：诱导表达完成后，于4℃ 下12000rpm离心10分钟后弃上清液，收集沉淀，向沉淀中加入裂解液重悬沉淀；重悬后菌液使用超声破碎，超声破碎完成后，12000rpm离心15分钟，收集上清液，上清液经0.45 μm滤膜过滤后，使用镍柱亲和层析法对梨PbrRALF2蛋白质进行纯化，使用镍柱亲和层析 介质纯化蛋白质前，需用10倍柱体积的平衡缓冲液来平衡层析介质；收集纯化蛋白质，使 用截流量为30kDa的超滤管在4℃下6000rpm转速下进行浓缩、脱盐,最后放入-80℃保存 备用；

所述裂解液的配方为：140mM氯化钠，2.7mM氯化钾，10mM磷酸氢二钠，1.8mM 磷酸二氢钾，50×EDTA-free protease inhibitor cocktail III，pH值为7.3；

所述平衡缓冲液的配方为：500mM氯化钠，20mM三(羟甲基)氨基甲烷，5mM咪 唑，pH值为7.3。

使用镍柱亲和层析法纯化梨PbrRALF2蛋白质的洗脱过程为：10倍柱体积的平衡缓冲液 (500mM氯化钠，20mM三(羟甲基)氨基甲烷，5mM咪唑，pH值为7.3)平衡柱子， 控制流速为1ml/min；经滤膜过滤后的20ml蛋白质上清样经过纯化柱，控制流速为1 ml/min；20倍柱体积含50mM咪唑的清洗液(500mM氯化钠，20mM三(羟甲基)氨基 甲烷，50mM咪唑，pH值为7.3)冲洗柱子，控制流速为1ml/min；10倍柱体积含300mM 咪唑的洗脱冲液(500mM氯化钠，20mM三(羟甲基)氨基甲烷，300mM咪唑，pH值 为7.3)洗脱纯化柱，控制流速为1ml/min，收集洗脱液得纯化蛋白，使用超滤管(截流量 为30kDa)于4℃下6000rpm进行浓缩、脱盐，最后﹣80℃保存。

一种梨PbrRALF2多克隆抗体的制备方法，用上述的方法制备的重组梨PbrRALF2蛋白 质作为免疫原，得到多克隆抗体。所述多克隆抗体的制备过程可以为：将采用上述方法制得 的重组梨PbrRALF2蛋白质作为抗原免疫日本大耳白兔，第一次免疫采用重组梨PbrRALF2 蛋白质与等体积的弗氏完全佐剂乳化后注射实验兔，3周后用重组梨PbrRALF2蛋白质与等 体积的弗氏不完全佐剂乳化后第二次免疫实验兔，之后每两周进行1次加强免疫，总共4次 免疫，最后一次免疫7天后采血，收集抗血清。优选的，第一次免疫采用500μg重组梨 PbrRALF2蛋白质与等体积的弗氏完全佐剂乳化后注射实验兔；3周后用300μg重组梨PbrRALF2蛋白质与等体积的弗氏不完全佐剂乳化后第二次免疫实验兔。

以上述方法制备的重组梨PbrRALF2蛋白质作为免疫原得到的多克隆抗体。

上述的多克隆抗体在制备用于检测梨PbrRALF2蛋白质的试剂盒中的应用。

一种用于检测梨PbrRALF2蛋白质的试剂盒，包含上述的多克隆抗体。

本发明的有益效果：

(1)本发明采用分子生物学的方法，首次体外表达和纯化了梨PbrRALF2蛋白质，也为进一步制备抗体奠定基础。

(2)采用本发明中的体外表达及纯化蛋白的方法，适用于所有梨RALF基因，可根据自己的研究目的与需要灵活变通。

(3)本发明表达的梨PbrRALF2蛋白质能够直接在体外处理条件下造成‘砀山酥梨’花粉生长受抑制，对梨花粉管生长自我调控机制的研究具有理论指导意义和应用参考价值。

(4)本发明中梨PbrRALF2蛋白质抗体可与梨花粉蛋白和纯化的梨PbrRALF2蛋白质特异性结合，特异性好，广泛适用于各种检测梨PbrRALF2蛋白质的免疫检测工具。

附图说明

图1是梨PbrRALF2基因序列信号肽预测示图。

图2是PCR扩增梨PbrRALF2基因的琼脂糖凝胶电泳示图；

其中，Marker为DNA标准分子质量。

图3是重组梨PbrRALF2蛋白质的诱导表达纯化后SDS-PAGE示图；

其中，Marker为蛋白质标准分子量。

图4是anti-His(C-term)单克隆抗体为一抗鉴定纯化后重组梨PbrRALF2蛋白质的Western blotting示图；

其中，Marker为蛋白质标准分子量。

图5是ELISA法评定抗体效价示图；

其中，横坐标为不同稀释比例；纵坐标为OD490吸收值。

图6是制备的多克隆抗体与重组梨PbrRALF2蛋白质的Western blot示图；

其中，Marker为蛋白质标准分子量。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解 释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

实施例1：PbrRALF2-pCold-TF重组质粒的构建与鉴定

(1)梨PbrRALF2基因的序列分析及克隆

(1.1)梨PbrRALF2基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1，氨基酸序列为SEQ ID NO:2。利用序列分析网站SignalP 4.1Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析并 去除信号肽和前体肽序列(图1)。

(1.2)取新鲜砀山酥梨花粉，按照植物总RNA提取试剂盒说明书提取‘砀山酥梨’花粉RNA，用反转录试剂盒反转录成cDNA。

(1.3)引物设计及PCR反应：设计上游引物(PbrRALF2-pCold-BamHI-Forward)为5’-CGGGATCCATGGAGTTTGACATGGACTCG-3’(下划线为BamH I酶切位点，加粗部分 为起始密码子)，下游引物(PbrRALF2-pCold-Xba I-Reverse)为

5’-GCTCTAGATTAACTCCTGCACCTTGTGATG-3’(下划线为Xba I酶切位点)；

以cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系(总反应体系50μl)为：ddH₂O 30μl，上下游引物各2μl,cDNA 2μl,5×Phusion HF Buffer 10μl,10mM dNTP 1μl,25mM MgSO₄ 2μl, Phusion DNA Polymerase 1μl；PCR反应条件为：98℃预变性2min，然后进行98℃15s，62℃30s，68℃1min，共35个循环，最后68℃延伸10min。

(1.4)PCR产物经2％的琼脂糖凝胶电泳分析鉴定并切胶回收，如图2可见，在100～250bp有一清晰的亮带，与预期大小符合。

PCR产物参考康为世纪公司Gel extraction kit快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书 进行回收。回收后的PCR产物经BamH I和Xba I限制性内切酶双酶切后通过T4-DNA连接 酶插入到经同样双酶切的大肠杆菌表达载体pCold-TF的BamH I和Xba I位点上(参见TAKARA公司载体图谱)，4℃连接18小时，构建PbrRALF2-pCold-TF重组质粒，将重组 质粒PbrRALF2-pCold-TF转化到大肠杆菌菌株DH5α，在LB固体平板(含100μg/ml氨苄青 霉素)上于37℃培养，挑选单菌落经酶切鉴定正确后，再通过苏州金唯智生物科技有限公司 DNA测序验证其序列正确性。测序结果表明，所获得的梨PbrRALF2基因编码区序列与预 计相符。说明重组质粒构建成功并将其命名为PbrRALF2-pCold-TF。

实施例2：梨PbrRALF2蛋白质在大肠杆菌中的表达

1.获得表达梨PbrRALF2的重组表达菌株

挑测序成功的菌接种到4ml含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB液体培养基中，37℃、250rpm振荡培养过夜，按照康为世纪公司的QuickPure Plasmid Mini kit快速质粒小提取试 剂盒将PbrRALF2-pCold-TF重组表达载体提取出来，取1ng重组表达载体PbrRALF2-pCold-TF经化学法转化大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布于含100μg/mL的氨苄青霉素LB平板 上筛选重组子，培养温度为37℃，培养时间为过夜培养，获得重组子为表达梨PbrRALF2 的基因工程菌，随机选取1个单菌落进行划线培养，取少量长出的划线培养菌接种于1ml LB(含100μg/ml氨苄青霉素)液体培养基中，37℃、250rpm振荡培养过夜，吸取1μl菌液 做模板经PCR验证正确后，然后按700μl菌液加入300μl灭菌20％(v/v)甘油，混匀后用 液氮速冻贮存于﹣80℃冰箱，得到表达梨PbrRALF2重组表达菌株。

2.重组梨PbrRALF2蛋白质的诱导表达纯化及鉴定

(2.1)梨PbrRALF2蛋白质的诱导表达

将梨PbrRALF2重组表达菌株按1:50的体积比接种到100ml LB(含100μg/ml氨苄青霉 素)液体培养基中，37℃、240rpm振荡培养过夜，活化重组表达菌株。将活化的重组表达菌株再按1:50的体积比转接至300ml LB液体培养基(含氨苄青霉素100μg/mL)中培养，培养条件为37℃，220～240rpm，振荡培养至菌液OD600为0.4～0.6后，迅速置于冰上5～10 分钟，然后放入16℃摇床中静置50分钟，最后加入终浓度为0.5～1.0mmol/L的IPTG， 16℃、240rpm震荡培养诱导表达20～24小时。收取不同条件下诱导表达后的4ml菌液， 离心后弃上清液，各加入200μl 10％SDS，混匀后100℃加热5分钟使蛋白质变性，置于冰 中冷却2分钟，于4℃下12000rpm离心10分钟，取上清液50μl，再各加入50μl 2×SDS- PAGE上样缓冲液，各取10μl进行SDS-PAGE电泳，经考马斯亮蓝染色后检测梨 PbrRALF2蛋白的表达。

(2.2)梨PbrRALF2蛋白质的纯化

将梨PbrRALF2重组表达菌株按1:50的体积比接种到100ml LB(含100μg/ml氨苄青霉 素)液体培养基中，37℃、240rpm振荡培养过夜，活化重组表达菌株。将活化的重组表达菌株再按1:50的体积比转接至300ml LB液体培养基(含氨苄青霉素100μg/mL)中培养，培养条件为37℃，240rpm，振荡培养至菌液OD600为0.4～0.6后，迅速置于冰上10分钟， 然后放入16℃摇床中静置50分钟，最后加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，16℃、240 rpm震荡培养诱导表达24小时。表达完成后4℃、12000rpm离心10分钟后弃上清，收集 菌体沉淀，用20ml裂解液(140mM氯化钠，2.7mM氯化钾，10mM磷酸氢二钠，1.8 mM磷酸二氢钾，50×EDTA-freeprotease inhibitor cocktail III，pH值为7.3)重悬菌体后超声 波破碎，功率240W，条件为：开启3s，停7s，反复10次，破碎至溶液澄清。超声破碎 完成后，于4℃下12000rpm离心15分钟，收集上清液，上清液经0.45μm滤膜过滤去除 杂质。利用德国默克密理博公司的Ni-NTA琼脂糖亲和层析填料纯化梨PbrRALF2重组蛋白 质，具体操作为：10倍柱体积的平衡缓冲液(500mM氯化钠，20mM三(羟甲基)氨基甲 烷，5mM咪唑，pH值为7.3)平衡柱子，控制流速为1ml/min；经滤膜过滤后的20ml蛋 白质上清样经过纯化柱，控制流速为1ml/min；20倍柱体积含50mM咪唑的清洗液(500 mM氯化钠，20mM三(羟甲基)氨基甲烷，50mM咪唑，pH值为7.3)冲洗柱子，控制 流速为1ml/min；10倍柱体积含300mM咪唑的洗脱冲液(500mM氯化钠，20mM三(羟 甲基)氨基甲烷，300mM咪唑，pH值为7.3)洗脱纯化柱，控制流速为1ml/min，收集洗 脱液得纯化蛋白，使用超滤管(截流量为30kDa)于4℃下6000rpm进行浓缩、脱盐，最 后﹣80℃保存。取少量蛋白质进行SDS-PAGE电泳纯度分析和Western Blotting鉴定，结果 如图3所示。利用anti-His(C-term)单克隆抗体的Western Blotting鉴定结果如图4所示， 确定其为梨PbrRALF2重组蛋白质。

实施例3：梨PbrRALF2蛋白质的多克隆抗体的制备及抗体效价和特异性评定

按照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书对纯化后重组梨PbrRALF2蛋白质的蛋白浓度进 行测定。将纯化后的重组梨PbrRALF2蛋白质作为抗原免疫日本大耳白兔。实验免疫前耳部 静脉采血0.5ml，收集血清作为后续ELISA检测的阴性对照。首次免疫用500μg溶于0.5ml PBS纯化的重组梨PbrRALF2蛋白质与等体积的弗氏完全佐剂乳化后免疫实验兔，3周后用300μg溶于0.3ml PBS纯化的重组梨PbrRALF2蛋白质与等体积的弗氏不完全佐剂乳化 后第二次免疫实验兔，之后每两周用300μg纯化的重组梨PbrRALF2蛋白质进行1次加强 免疫，总共4次免疫，最后一次加强免疫一周后采血，收集抗血清；阴性血清作为阴性对 照，ELISA法测定抗体效价(阴性血清作为阴性对照)，Western blotting测定抗体特异性。 稀释后的抗血清在490nm吸光度大于免疫前(阴性对照)血清2.1倍时的最高稀释倍数定义为 抗体的效价，ELISA结果如图5所示，表明经制备的梨PbrRALF2多克隆抗体抗血清效价约 为1:1024000；制备的梨PbrRALF2多克隆抗体的抗体特异性经Western blotting分析得出其 特异性良好，图6所示。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种梨PbrRALF2蛋白质的体外表达及其多克隆抗体的制备方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggctagtc tgcacagctt ctcactcctc ctcctgatct gcgcctcaat cttggtggtg 60

ggttcgtcaa atggggacca gcaccacctc acctggatac ccaccgccga cgccaagtca 120

gccccctgca agggctccat agccgagtgc gccttggctg ccggggatga tggggagttt 180

gacatggact cggagatcag ccgtcgcatc ttagccacca ccaagtacat cagctacggt 240

gcgctgcaga ggaacaccgt gccttgctcc aggcgcggcg cctcctacta caattgcaag 300

cccggggccc aggccaaccc ctacagccgc ggctgcagcg ccatcacaag gtgcaggagt 360

taa 363

<210> 2

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Ser Leu His Ser Phe Ser Leu Leu Leu Leu Ile Cys Ala Ser

1 5 10 15

Ile Leu Val Val Gly Ser Ser Asn Gly Asp Gln His His Leu Thr Trp

20 25 30

Ile Pro Thr Ala Asp Ala Lys Ser Ala Pro Cys Lys Gly Ser Ile Ala

35 40 45

Glu Cys Ala Leu Ala Ala Gly Asp Asp Gly Glu Phe Asp Met Asp Ser

50 55 60

Glu Ile Ser Arg Arg Ile Leu Ala Thr Thr Lys Tyr Ile Ser Tyr Gly

65 70 75 80

Ala Leu Gln Arg Asn Thr Val Pro Cys Ser Arg Arg Gly Ala Ser Tyr

85 90 95

Tyr Asn Cys Lys Pro Gly Ala Gln Ala Asn Pro Tyr Ser Arg Gly Cys

100 105 110

Ser Ala Ile Thr Arg Cys Arg Ser

115 120

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgggatccat ggagtttgac atggactcg 29

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gctctagatt aactcctgca ccttgtgatg 30

Claims (10)

1.一种梨RALF蛋白质体外表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a.提取梨花粉总RNA，反转录成cDNA，设计引物PCR扩增梨PbrRALF2基因；

b.构建表达梨PbrRALF2蛋白质的原核重组表达载体；

c.将步骤b构建的原核重组表达载体转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)中，构建PbrRALF2重组表达菌株；

d.培养步骤c所构建的PbrRALF2重组表达菌株至OD₆₀₀达到0.4-0.6，并低温处理后，加入诱导剂IPTG，诱导表达梨PbrRALF2蛋白质；

e.纯化诱导表达的梨PbrRALF2蛋白质。

2.根据权利要求1所述的梨PbrRALF2蛋白质体外表达的方法，其特征在于，步骤a中，用于PCR扩增梨PbrRALF2基因的正向引物为5’-

CGGGATCCATGGAGTTTGACATGGACTCG-3’，反向引物为5’-

GCTCTAGATTAACTCCTGCACCTTGTGATG-3’。

3.根据权利要求1或2所述的梨PbrRALF2蛋白质体外表达的方法，其特征在于，步骤a中，PCR扩增梨PbrRALF2基因的PCR反应体系为：ddH₂O 30μl，上下游引物各2μl,cDNA 2μl,5×Phusion HF Buffer 10μl,10mM dNTP 1μl,25mM MgSO₄ 2μl,Phusion DNA Polymerase1μl；PCR反应条件为：98℃预变性2min，然后进行98℃15s，62℃30s，68℃1min，共35个循环，最后68℃延伸10min。

4.根据权利要求1所述的梨PbrRALF2蛋白质体外表达的方法，其特征在于，步骤b中，构建表达梨PbrRALF2蛋白质的原核重组表达载体时，所使用的原核表达载体为大肠杆菌表达载体pCold-TF，克隆梨PbrRALF2基因的插入位点为BamH I和Xba I酶切位点之间。

5.根据权利要求1所述的梨PbrRALF2蛋白质体外表达的方法，其特征在于，步骤d中，所述的低温处理为置于冰上5～10min，然后15～17℃静置40～60分钟，所述诱导剂IPTG的终浓度为0.5～1.0mmol/L，所述诱导表达的条件为15～17℃诱导20～24小时。

6.根据权利要求1或5所述的梨PbrRALF2蛋白质体外表达的方法，其特征在于，步骤d中诱导表达梨PbrRALF2蛋白质的详细过程为：将构建的PbrRALF2重组表达菌株按照1:50的体积比接种到100ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，220～250rpm震荡培养过夜，然后按1:50的体积比转接到300ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、200～240rpm震荡培养至菌液OD₆₀₀达到0.4-0.6，迅速置于冰上5～10分钟，然后16℃静置50分钟；然后加入终浓度为0.5mmol/L的诱导剂IPTG，16℃、220～240rpm震荡培养,诱导表达24小时；

步骤e中纯化诱导表达的梨PbrRALF2蛋白质的详细过程为：诱导表达完成后，于4℃下12000rpm离心10分钟后弃上清液，收集沉淀，向沉淀中加入裂解液重悬沉淀；重悬后菌液使用超声破碎，超声破碎完成后，12000rpm离心15分钟，收集上清液，上清液经0.45μm滤膜过滤后，使用镍柱亲和层析法对梨PbrRALF2蛋白质进行纯化，使用镍柱亲和层析介质纯化蛋白质前，需用10倍柱体积的平衡缓冲液来平衡层析介质；收集纯化蛋白质，使用截流量为30kDa的超滤管在4℃下6000rpm转速下进行浓缩、脱盐,最后放入-80℃保存备用；

所述裂解液的配方为：140mM氯化钠，2.7mM氯化钾，10mM磷酸氢二钠，1.8mM磷酸二氢钾，50×EDTA-free protease inhibitor cocktail III，pH值为7.3；

所述平衡缓冲液的配方为：500mM氯化钠，20mM三(羟甲基)氨基甲烷，5mM咪唑，pH值为7.3。

7.一种梨PbrRALF2多克隆抗体的制备方法，其特征在于：用权利要求1-6任一所述的方法制备的重组梨PbrRALF2蛋白质作为免疫原，得到多克隆抗体。

8.以权利要求1-6任一所述方法制备的重组梨PbrRALF2蛋白质作为免疫原得到的多克隆抗体。

9.权利要求8所述的多克隆抗体在制备用于检测梨PbrRALF2蛋白质的试剂盒中的应用。

10.一种用于检测梨PbrRALF2蛋白质的试剂盒，其特征在于，包含权利要求8所述的多克隆抗体。