CN108822195A

CN108822195A - 砀山酥梨具有促进花粉管生长功能的蛋白、编码基因PbrTTS1及其应用

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Publication number: CN108822195A
Application number: CN201810642892.3A
Authority: CN
Inventors: 张绍铃; 焦慧君; 吴巨友; 许林林; 黄小三; 谢智华; 刘倩; 常耀军; 王鹏
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2018-06-14
Filing date: 2018-06-21
Publication date: 2018-11-16
Anticipated expiration: 2038-06-21
Also published as: US11325953B2; CN108822195B; US20200048314A1

Abstract

本发明提供了砀山酥梨具有促进花粉管生长功能的蛋白PbrTTS1、编码基因及其应用，属于植物基因工程技术领域。本发明用重组蛋白培养花粉处理花粉管，结果证明所述蛋白能促进花粉管的生长，从而扩展了梨中非S因子参与SI过程的调控机制。同时采用重组蛋白研究非S因子参与的SI过程的机制，可以很大程度上降低劳动力成本，提高授粉效率，对农业生产也具有非常重要的理论和实践意义。

Description

砀山酥梨具有促进花粉管生长功能的蛋白、编码基因PbrTTS1 及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及砀山酥梨具有促进花粉管生长功能的蛋白、编码基因PbrTTS1及其应用。

背景技术

自交不亲和(SI)现象是植物界中普遍存在的一种控制近亲繁殖的一种方式(Iwano and Takayama 2012)。SI主要包括孢子体自交不亲和，罂粟科自交不亲和以及基于S-RNase配子体自交不亲和三种类型。其中基于S-RNase配子体自交不亲和主要包括蔷薇科，茄科，车前草科物种(Clarke andNewbigin 1993；Huang et al.2009)。

梨属于蔷薇科物种，其主要表现为基于S-RNase的SI现象。在梨的SI反应中，雌配子和雄配子的S-locus基因型起着决定性的作用。当雄配子体携带的基因型和雌配子体携带的基因型不相同时，花粉则可以萌发生长；反之亦然(Hua et al.2008)。在梨SI的机制中，除主要的S-locus基因型起决定性作用之外，其他的非S因子也可以对SI的过程产生影响。在烟草中，花柱基质中的分泌蛋白如120K，NaTTS和NaPELPIII都会影响烟草的SI的过程。

120K，NaTTS,NaPELPIII是目前已报道的在雌蕊中可能与S-RNase形成复合体参与到SI过程中的一类高度糖基化的蛋白(Cruz‐Garcia et al.2005)。其中120K与S-RNase蛋白一起被吸收进花粉管，从而参与SI的过程(Nathan Hancock et al.2005；McClure2006)。NaTTS在花柱基质中形成自上而下的浓度梯度，从而引导花粉管向下生长，又或者是为花粉管的生长提供营养物质(Wu et al.1995；Wu et al.2000)。NaPELPIII在活体中可以结合到花粉管的细胞壁，从而影响花粉管的生长(De Graafet al.2004；Eberle etal.2013)。

120K，NaTTS,NaPELPIII均属于AGPs家族，该家族基因是一类高度糖基化的蛋白并且富含proline，在其C端含有一个富含半胱氨酸的保守结构域(CTD)，在其N端具有一个糖基片段(Schultz et al.2002)。但是关于基因结构中是C端的保守结构域还是N端的糖基化片段参与到SI的过程至今尚不清楚。

在梨的授粉受精的过程中，花粉能否在柱头上萌发生长和能否在花柱基质中生长到达胚囊直接影响授粉是否成功。而现有技术中没有关于梨中控制花粉管生长的基因的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种参与到SI的过程的新的AGPs家族基因，提供了砀山酥梨具有促进花粉管生长功能的蛋白PbrTTS1、编码基因及其应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种砀山酥梨促进砀山酥梨花粉管生长的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示。

本发明提供了所述的砀山酥梨促进砀山酥梨花粉管生长的蛋白的编码基因PbrTTS1，所述编码基因PbrTTS1的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。

本发明提供了一种用于扩增所述的编码基因PbrTTS1的引物，包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示；所述反向引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.4所示。

本发明提供了所述的编码基因PbrTTS1的扩增方法，包括以下步骤：

(1)以砀山酥梨的叶，茎或花柱为材料提取总RNA，逆转录，得到cDNA；

(2)以所述cDNA为模板，用所述引物进行PCR反应，得到PCR反应产物为编码基因PbrTTS1。

优选的，所述PCR反应的体系为20μl，具体包括以下含量组分：2μL 50ng/μL cDNA，6μL 2×PCRMasterMix，1μL 1.0μmol/L正向引物、1μL 1μmol/L反向引物和余量的ddH₂O。

优选的，所述PCR反应的程序如下：94℃，预变性3分钟，94℃变性30s|，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个热循环，72℃延伸10min，4℃保存。

本发明提供了一种花粉管生长促进剂，所述促进剂包括所述蛋白。

优选的，所述促进剂中所述蛋白的浓度不低于0.005μmol/L。

本发明提供了所述蛋白、所述编码基因PbrTTS1、所述引物或所述花粉管生长促进剂在授粉或花粉管生长中的应用。

优选的，所述授粉的方法包括如下步骤：

a.在大蕾期的前一天将砀山酥梨去除雄蕊，得到去雄蕊的砀山酥梨花；

b.将所述蛋白喷洒在砀山酥梨花的柱头上，蘸取非砀山酥梨品种的花粉点到砀山酥梨的柱头上；

C.用硫酸纸袋套到授粉的花柱上，固定硫酸纸袋。

本发明提供的砀山酥梨促进砀山酥梨花粉管生长的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示。本发明用重组蛋白培养花粉处理花粉管，结果证明所述蛋白能促进花粉管的生长，从而扩展了梨中非S因子参与SI过程的调控机制。同时采用重组蛋白研究非S因子参与的SI过程的机制，可以很大程度上降低劳动力成本，提高授粉效率，对农业生产也具有非常重要的理论和实践意义。

附图说明

图1为本发明的技术流程图；

图2为PbrTTS1基因在梨各个组织中表达情况图；

图3为PbrTTS1基因在不同梨品系中序列比对图；其中‘DS’，‘XSJ’，‘HH’，‘FS’，‘XS’，‘CG’分别表示‘砀山酥梨’，‘新世纪’，‘黄花’，‘丰水’，‘喜水’，‘翠冠’；

图4为PbrTTS1和PbrS-RNase互作关系验证图；其中AD，BD，AD-T，BD-53,BD-Lam分别表示pGADT7，pGBKT7，pGADT7-T，pGBKT7-57，pGBKT7-Lam，横线和竖线部分表示PbrTTS1-BD，BD分别与6种PbrS-RNase组合，其余三列为不同组实验中同一种组合；

图5为本发明中SEQ ID No.2信号肽预测图；

图6为本发明实施例4的载体构建流程示意图；

图7为PbrTTS1重组蛋白表达纯化SDS-PAGE检测；图7-a为PbrTTS1和pCold-TF重组蛋白表达SDS-PAGE检测图，M表示Marke,1和2分别表示pCold-TF重组蛋白未加IPTG和加IPTG诱导，3和4分别表示PbrTTS 1重组蛋白未加IPTG和加IPTG诱导；图7-b为PbrTTS1重组蛋白纯化SDS-PAGE检测图，M表示Marke,1表示咪唑洗脱浓缩后的PbrTTS1重组蛋白；

图8为重组PbrTTS1蛋白对砀山酥梨花粉管生长的影响和长度统计，图8-a为对照，图8-b和图8-c分别为用不同浓度的重组PbrTTS1蛋白处理砀山酥梨花粉，图8-d为花粉管长度统计。

具体实施方式

在本发明中，所述砀山酥梨促进砀山酥梨花粉管生长的蛋白的制备方法优选包括重组原核生物重组表达系统的构建方法和重组蛋白的表达和纯化方法。

所述重组原核生物表达系统的构建方法，优选包括以下步骤：

A.去除所述蛋白的编码基因PbrTTS1的信号肽序列的同时添加ATG和酶切位点，得到去除信号肽且添加有双酶切位点的PbrTTS1基因片段；

B.将所述去除信号肽的PbrTTS1基因片段和质粒载体分别进行双酶切，将得到的两个酶切产物进行连接，得到重组质粒载体PbrTTS1-cutSignalP-pCold-TF；

C.将所述重组质粒载体PbrTTS1-cutSignalP-pCold-TF转化入原核生物中培养，得到候选重组原核生物表达载体；

D.将所述候选重组原核生物表达载体接种到筛选培养基中培养，得到的菌液；

E.将所述菌液进行测序验证，测序含有目标基因片段的菌液为重组原核生物表达系统。

在本发明中，所述去除梨PbrTTS1基因的信号肽序列的同时添加酶切位点的方法是采用PbrTTS1-cutSignalP-F和PbrTTS1-cutSignalP-R引物对所述PbrTTS1进行扩增，所得到的扩增产物为去除信号肽且添加有双酶切位点的PbrTTS1基因片段。所述PbrTTS1-cutSignalP-F的核苷酸序列具有如序列表中SEQ ID No.5所示(5’-ggatccATGCACCCACCAGCCC-3’)。所述PbrTTS1-cutSignalP-R的核苷酸序列具有如序列表中SEQ ID No.6所示(5’-tctagaACGAGGACATGTGGGCTCA-3’)。所述扩增的程序如下：98℃，预变性3s，98℃变性10s，66℃退火30s，72℃延伸20s，35个热循环，72℃延伸2min，4℃保存。所述扩增的体系优选为50μLPCR的反应体系，包括2μL模板，10μL 5×Q5反应缓冲液，1μL10mmol/L dNTPs，0.5μL Q5High-Fidelity DNAPolymerase，10μmol/L的引物各2.5μL，加水补齐到50μL。

在本发明中，所述质粒载体为pCold-TF载体。所述双酶切用酶优选为BamHI和XbaI。本发明所述双酶切的反应体系和程序没有特殊限制，采用本领域所熟知的BamHI和XbaI的酶切反应参数即可。本发明对所述连接的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的连接方案即可。

在本发明中，所述原核生物优选为大肠杆菌Rosetta(DE3)。所述筛选培养基优选为含100μg/mL的氨苄青霉素的LB培养基平板。所述培养的温度优选为37℃。所述培养的时间优选为12～16h，更优选为13～15h。

在本发明中，所述重组蛋白的表达和纯化方法，优选包括以下步骤：

Ⅰ.将上述方案制备的重组原核生物表达体系接种在液体筛选培养基上进行活化培养，再转接到新的液体筛选培养基中扩大培养，得到扩大培养菌液；

Ⅱ.将所述扩大培养菌液中添加诱导剂进行诱导表达，离心，收集菌体沉淀；

Ⅲ.将所述菌体沉淀进行超声破碎，二次离心，过滤，收集上清液；

Ⅳ.将所述上清液采用Ni-NTA琼脂糖亲和层析填料纯化梨PbrTTS1重组蛋白。

在本发明中，所述活化培养和扩大培养的接种量优选为1:50。所述液体筛选培养基优选为含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基。所述活化培养的方式优选为在37℃、220rpm振荡培养过夜。所述扩大培养的方式优选为在37℃、200rpm振荡培养。所述扩大培养的时间截止为OD₆₀₀达到0.4～0.6范围。

在本发明中，所述诱导剂优选为终浓度为0.5mmol/L的IPTG。所述诱导表达的时间优选为24h。所述离心的转速优选为12000rpm。所述离心的温度优选为4℃。所述离心的时间优选为10～30min。所述超声的参数如下：开启3s，停7s，破碎至溶液澄清。

在本发明中，所述二次离心的转速优选为12000rpm。所述二次离心的时间优选为20min。所述过滤用滤膜的孔径优选为0.22μm。本发明对所述采用Ni-NTA琼脂糖亲和层析填料纯化方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的亲和层析填料纯化方法即可。

本发明提供了一种用于扩增所述的编码基因PbrTTS1的引物，包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示(5’-ATGGGTTCTCCTGCCGTG-3)；所述反向引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.4所示(5’-TTAAACGAGGACATGTGGGCTCA-3’)。

本发明对所述提取总RNA的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的提取方法即可。在本发明实施例中，所述提取总RNA的方法采用植物总RNA提取试剂盒。所述植物总RNA提取试剂盒购自FOREGENE，按照该试剂盒提供的操作说明书操作。

在本发明中，所述逆转录优选采用试剂盒方法进行。所述试剂盒法优选采用TransScript反转录试剂盒。所述TransScript反转录试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，按照该试剂盒提供的说明书操作。

在本发明中，所述PCR反应的体系优选为20μl，具体包括以下含量组分：2μL 50ng/μl cDNA，6μL 2×PCR MasterMix，1μL 1.0μmol/L正向引物、1μL 1μmol/L反向引物和余量的ddH₂O。

在本发明中，所述PCR反应的程序优选如下：94℃，预变性3min，94℃变性30s|，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个热循环，72℃延伸10min，4℃保存。

在本发明中，所述促进剂中所述蛋白的浓度优选不低于0.005μmol/L，更优选为0.0075～0.1μmol/L，最优选为0.01μmol/L。所述蛋白的来源优选采用上述方案制备得到的重组蛋白。所述辅料包括500mmol/L氯化钠，20mmol/L三(羟甲基)氨基甲烷和300mmol/L咪唑的水溶液，所述辅料的pH值为7.9。

在本发明中，所述促进剂的制备方法，优选包括以下步骤：

将含有质量浓度为10％蔗糖，质量浓度0.01％的硼酸，质量浓度0.03％的硝酸钙，0.03mmol/L的2-吗啉乙磺酸(MES)的溶液溶解上述蛋白，用Tris来调节pH。

在本发明中，所述授粉的方法优选包括如下步骤：

C.用硫酸纸袋套到授粉的花柱上，固定硫酸纸袋。

在本发明中，所述花粉管生长的处理方法是用4ml的梨花粉培养基预培养砀山酥梨花粉40min，花粉的培养条件在25℃，60rpm的摇床上。之后将预培养的花粉按计算的相应体积分别分装到2ml的EP管子中，加入蛋白的体积和预花粉的体积总共200μl，每个浓度梯度做三次生物学重复实验。之后继续在25℃，60rpm的摇床上培养花粉2h。

下面结合实施例对本发明提供的砀山酥梨具有促进花粉管生长功能的蛋白PbrTTS1、编码基因及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

PbrTTS1基因的组织定位

从‘砀山酥梨’茎，叶，果肉，花粉，花柱中抽提RNA，经反转录得到的第一链cDNA用于检测PbrTTS1的表达部位。

RNA抽提使用植物总RNA提取试剂盒(购自FOREGENE，按照该试剂盒提供的操作说明书操作)。第一链cDNA的合成用TransScript反转录试剂盒(购自北京全式金生物技术有限公司，按照该试剂盒提供的说明书操作)。扩增基因引物对为：PbrTTS1-F1：5’-TGTCTTCGTTCACCCACCAG-3’(SEQ ID No.7)；PbrTTS1-R1：5’-CGCTACAAAGCTCCTTGGGA-3’(SEQ ID No.8)，另外PbrTubulin作为内参基因，引物对为PbrTubulin-F:5’-TCAGTCGCCGCCGGCCTTTTG-3’(SEQ ID No.9)；PbrTubulin-R:5’-TGGGCTTTGCTCCTCTTAC-3’(SEQ ID No.10)。20μL PCR的反应体系包括100ng cDNA，2×Hieff^TM PCR Master Mix(购自上海翊圣生物科技有限公司)。1.0μmol/L上述引物和灭菌水。PCR反应在Veriti扩增仪上按以下程序完成:94℃，预变性3min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个热循环，72℃延伸10min，4℃保存。

PCR产物经1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测后，产生一条单一PCR条带产物。组织定位实验结果表明PbrTTS1基因在叶，茎，花柱中均有表达，在花粉和果肉中不表达(图2)。

实施例2

PbrTTS1基因的多态性的鉴定

从‘砀山酥梨’、‘丰水’、‘新世纪’、‘翠冠’、‘黄花’、‘喜水’花柱中抽提RNA，经反转录得到的第一链cDNA用于PbrTTS1基因的克隆。

RNA抽提和反转录按照实施例1进行。扩增基因引物对为SEQ ID No.3和SEQ IDNo.4。克隆基因的高保真酶采用Q5 High-Fidelity DNA Polymerase(购自NEB公司)，50μLPCR的反应体系包括2μL cDNA,10μL 5×Q5Reaction Buffer，1μL 10mmol/L dNTPs，0.5μLQ5High-Fidelity DNA Polymerase，10μmol/L的引物各2.5μL，加水补齐到50μL。PCR反应在Veriti扩增仪上按以下程序完成:98℃，预变性3s，98℃变性10s，66℃退火30s，72℃延伸20s，35个热循环，72℃延伸2min，4℃保存。产生一条单一PCR条带产物。

PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测后，用快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(购自康为世纪)回收DNA片段，步骤参照使用说明。回收纯化的DNA溶液与pEASY-BluntZero载体(购自北京全式金生物技术有限公司)进行连接反应，按说明书步骤操作。连接反应体系总体积是5μL，其中包括4.5μL纯化的PCR产物，0.5μL pEASY-BluntZero载体。25℃连接10分钟。取5μL连接产物，采用热击法(参照《分子克隆实验手册》第三版，科学出版社，2002)转化大肠杆菌DH5α，在含有100mg/L卡纳霉素的LB固体平板中筛选阳性克隆，挑取3个阳性克隆测序(由苏州金唯智生物科技有限公司完成)。测序结果表明，PbrTTS1在不同梨品种中有少量的氨基酸的差异，克隆的PbrTTS1基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，BLAST的结果分析证明从梨中新得到的基因为一个AGPs基因家族成员，将这个基因命名为PbrTTS1(图3)。

实施例3

PbrTTS1基因与PbrS-RNase之间的特异性识别的鉴定

根据酵母双杂pGADT7和pGBKT7载体的多克隆位点和载体序列分析，分析并去除PbrTTS1，PbrS1-RNase(AB002139.1)，PbrS2-RNase(AB014073.1)，PbrS3-RNase(AB002140.1)，PbrS5-RNase(AB002141.1)，PbrS7-RNase(AB002143.1)，PbrS34-RNase(DQ414813.1)的信号肽和终止密码子。选择EcoRI和BamHI以及其同尾酶MfeI和BgLII作为内切酶，按照引物设计的原则设计引物(下划线部分是酶切位点)，其引物对序列如下所示：

PbrTTS1-pGBKT7-F:5’-gaattcATGCACCCACCAGCCC-3’(SEQ ID No.11)

PbrTTS1-pGBKT7-R:5’-ggatccACGAGGACATGTGGGCTCA-3’(SEQ ID No.12)

PbrS1-RNase-pGADT-F:5’-ggatccATGTACGATTATTTTCAATTTACGC-3’(SEQ IDNo.13)

PbrS1-RNase-pGADT7-R:5’-gaattgATACTGAACACTGGAGGG-3’(SEQ ID No.14)

PbrS2-RNase-pGADT7-F:5’-gaattcATGGCGAGATACGATTATTTT-3’(SEQ ID No.15)

PbrS2-RNase-pGADT7-R:5’-agatctATACTGAATATCATCAATGGGG-3’(SEQ ID No.16)

PbrS3-RNase-pGADT7-F:5’-gaattcATGTACGATTATTTTCAATTTACGC-3’(SEQ IDNo.17)

PbrS3-RNase-pGADT7-R:5’-agatctATACTTGATATTGTTGGTGGG-3’(SEQ ID No.18)

PbrS5-RNase-pGADT7-F:5’-gaattcATGTACGATTATTTTCAATTTACGC-3’(SEQ IDNo.19)

PbrS5-RNase-pGADT7-R:5’-agatctATACTTGATATTGTTGGTGGG-3’(SEQ ID No.20)

PbrS7-RNase-pGADT7-F:5’-gaattgATGTACGATTATTTTCAATTTACGC-3’(SEQ IDNo.21)

PbrS7-RNase-pGADT7-R:5’-agatctATACTTAACATCGGCCG-3’(SEQ ID No.22)

PbrS34-RNase-pGADT7-F:5’-gaattgATGTACGATTATTTTCAATTTACGC-3’(SEQ IDNo.23)

PbrS34-RNase-pGADT7-R:5’-agatctATACTGAATACTATTGTTTGGG-3’(SEQ IDNo.24)

以测序正确的保存菌液提取质粒为PbrTTS1的模版，以‘翠冠’、‘黄花’、‘砀山酥梨’的花柱为PbrS-RNase的模板进行含限制性酶切位点基因的克隆。PCR扩增的退火温度为59℃，PCR反应体系及扩增程序同实施例2。回收目的条带，再连接pGBKT7和pGADT7的载体上，从而构建相应的重组载体。双酶切体系总体积为40μL，其中含有相应PCR的纯化产物15μL，10×FastDigest Green Buffer(购自ThermoFisher公司)4μL，相应的酶各2μL及水17μL。pGADT7和pGBKT7载体的双酶切体系总体积为40μL，其中含有经过质粒提取获得的相应的载体DNA 10μL，10×FastDigest Green Buffer 4μL，EcoRI 2μL，BamHI 2μL(购自ThermoFisher公司)及水22μL。于37℃酶切3-4小时后回收(方法同实施例1)。经过限制性内切酶消化过的表达载体pGBKT7与PbrTTS1基因使用T4DNA连接酶(购自NEB公司)于4℃连接16小时，反应总体积10μL，其中含有10×T4DNA Ligase Buffer 1μL，T4DNALigase 1μL，PbrTTS1基因的双酶切回收产物6μL，pGADT7载体的双酶切回收产物2μL。PbrS-RNase与pGADT7也采用相同的方法连接。取连接产物10μL转化大肠杆菌感受态DH5α，分别在含有100μg/ml卡纳霉素和100μg/ml氨苄霉素的LB固体平板中筛选出阳性克隆，抽提质粒进行酶切及PCR鉴定，测序结果确定没有读码框突变，获得含有插入目的片段的重组载体。

质粒的抽提按照康维世纪质粒提取说明书的步骤操作。将抽提的质粒PbrTTS1-BD分别和PbrS1-RNase-AD,PbrS2-RNase-AD,PbrS3-RNase-AD,PbrS5-RNase-AD,PbrS7-RNase-AD,PbrS34-RNase-AD组合，PbrTTS1-BD+AD，BD分别和PbrS1-RNase-AD,PbrS2-RNase-AD,PbrS3-RNase-AD,PbrS5-RNase-AD,PbrS7-RNase-AD,PbrS34-RNase-AD组合，pGADT7-T+pGBKT7-53，pGADT7-T+pGBKT7-Lam分别共转入酵母菌株AH109感受态体内(唯地生物科技有限公司)。按照说明书进行酵母转化。涂SD/-Trp/-Leu的平板，28℃培养2～3天。将每个组合的单克隆菌落分别划到SD/-Trp/-Leu和SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His的平板上，28℃继续培养2-3天，观察其在两种平板上的生长状态，从而确定互作关系。之后将单克隆菌落用4ml SD/-Trp/-Leu的液体培养基在28℃，220rpm的摇床上培养直到OD值到0.8左右。吸取5μl相应的菌液在SD/-Trp/-Leu和SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His两种平板上点点，28℃继续培养，之后用佳能相机拍照并且图片经过Adobe Photoshop CS6处理(图4)。

实验结果表明PbrTTS1与不同PbrS-RNase之间并不存在特异性结合的现象，不能专一性的识别某种PbrS-RNase，从而特异性的参与SI的过程。

实施例4

PbrTTS1蛋白表达的构建

根据pCold-TF载体的多克隆位点和PbrTTS1基因的编码区序列上的酶切位点分析，如图5所示，分析并去除梨PbrTTS1基因的信号肽序列，选择BamHI和XbaI作为内切酶。按照一般设计引物的原则用PrimerPrimer 5.0软件设计出带有酶切位点的引物(下划线部分是酶切位点)，其引物对序列如下所示：

PbrTTS1-cutSignalP-F:5’-ggatccATGCACCCACCAGCCC-3’(SEQ ID No.5)

PbrTTS1-cutSignalP-R:5’-tctagaACGAGGACATGTGGGCTCA-3’(SEQ IDNo.6)

PCR反应体系及扩增程序同实施例2。回收目的条带，再连接pCold-TF载体上，从而构建一个重组载体PbrTTS1-cutSignalP-pCold-TF。双酶切反应体系与载体的连接过程同实施例3，得到重组载体S7-cutSignalP-pCold-TF。

取1ng重组表达载体S7-cutSignalP-pCold-TF转化大肠杆菌Rosetta(DE3)，涂布于含100μg/mL的氨苄青霉素平板上筛选重组基因，37℃培养箱培养12～16h，获得PbrTTS1-cutSignalP-pCold-TF的重组基因(图6)。

挑选菌落进行测序，得到阳性菌落。挑测阳性菌接种到4ml含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB液体培养基中，37℃、220rpm振荡培养过夜。随机选取1个单菌落进行划线培养，取少量长出的划线培养菌接种于1ml LB(含100μg/ml氨苄青霉素)液体培养基中，37℃、220rpm振荡培养12h，然后按700μl菌液加入300μl灭菌50％甘油，混匀后用液氮速冻贮存于﹣80℃冰箱，得到表达梨PbrTTS1-cutSignalP-pCold-TF重组表达菌株。

实施例5

PbrTTS1重组蛋白的表达与纯化

将上述制备得到的PbrTTS1重组表达菌株按1:50接种10ml LB(含100μg/ml氨苄青霉素)液体培养基中，37℃、220rpm振荡培养过夜，活化重组表达菌株。将活化的重组表达菌株再按1:50转至300ml LB培养基(含氨苄青霉素100μg/mL)中培养，培养条件为37℃，220rpm，振荡培养至OD₆₀₀为0.4～0.6h后，取出5ml的菌液作为阴性对照。迅速置于冰上5分钟，然后放入15℃摇床中静置40min，最后加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，诱导表达24小时。表达完成后4℃、12000rpm离心收集菌体沉淀，此时取出5ml的诱导后的菌液沉淀。用PBS重悬菌体后超声波破碎，功率240W，条件为：开启3s，停7s，破碎至溶液澄清。超声破碎完成后，于4℃下12000rpm离心20分钟，上清经0.22μm滤膜过滤去除杂质，收集上清。对照蛋白pCold-TF同样按照以上方法表达。

沉淀与阴性对照各加入200μl 10％SDS，混匀后100℃沸水水浴10min，置于冰中冷却2min钟，之后于4℃下12000rpm离心10分钟，各取上清20μl，加入5μl 5×蛋白上样缓冲液(购自生工)后取10μl进行12％常规SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色、脱色后检测重组蛋白表达情况。如图7-a所示两种重组蛋白在加IPTG诱导后蛋白的表达情况，泳道2和4分别显示在加入IPTG诱导后，目标蛋白在菌体内有表达。

采用Ni-NTA琼脂糖亲和层析填料纯化梨PbrTTS1重组蛋白(购自南京福麦斯生物科技有限公司)。具体操作为：采用10倍填料体积的PBS缓冲液(140mmol/L氯化钠，2.7mmol/L氯化钾，10mmol/L磷酸氢二钠，1.8mmol/L磷酸二氢钾，PH为7.9)平衡上述填料，控制流速为1ml/min；经滤膜过滤后的蛋白上清样经过纯化柱，控制流速为1ml/min；20倍填料体积含20mmol/L咪唑的清洗液(500mmol/L氯化钠，20mmol/L三(羟甲基)氨基甲烷，20mM咪唑，pH7.9)冲洗柱子，控制流速为1ml/min；10倍柱体积含300mmol/L咪唑的洗脱冲液(500mmol/L氯化钠，20mmol/L三(羟甲基)氨基甲烷，300mmol/L咪唑，pH值7.9)洗脱纯化柱，控制流速为1ml/min，收集洗脱液得纯化蛋白，使用超滤管进行浓缩、脱盐。取20ul纯化后的蛋白，加入5ul 5×蛋白上样缓冲液后(购自生工)取10μl进行12％常规SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色、脱色后检测重组蛋白纯化情况，如图7-b所示，PbrTTS1重组蛋白纯化后的条带比较单一，说明其含有的杂质蛋白相对较少。

使用花粉培养基(10％蔗糖，0.01％的硼酸，0.03％的硝酸钙，0.03mM的2-吗啉乙磺酸(MES)，pH值为6.2，用Tris来调节pH)对纯化的蛋白按照1：1000的比例在4℃下流动旋转透析24小时，之后放入-80℃备用。

实施例6

PbrTTS1重组蛋白对花粉管生长的鉴定

将上述透析过的PbrTTS1重组蛋白按照不同的浓度梯度来处理砀山酥梨花粉。其中PbrTTS1重组蛋白的浓度梯度设置分别为对照(0)，0.005μmol/L，0.075μmol/L，0.01μmol/L四个浓度梯度。具体的实验方法如下：

首先用4ml的梨花粉培养基预培养砀山酥梨花粉40min，花粉的培养条件在25℃，60rpm的摇床上。花粉培养基的配方如实施例4。之后将预培养的花粉按计算的相应体积分别分装到2ml的EP管子中，加入蛋白的体积和预花粉的体积总共200μl，每个浓度梯度做三次生物学重复实验。之后继续在25℃，60rpm的摇床上培养花粉2小时。使用NiKON ECLIPSEE100显微镜对培养过的花粉进行拍照(图8-a图8-b，图8-c)。

采用IPWin32软件统计花粉管的长度，每个浓度梯度统计大约30根左右的花粉管，计算三次的平均值和标准误(图8-d)。实验结果表明：使用不同浓度的PbrTTS1重组蛋白处理砀山酥梨的花粉，PbrTTS1对砀山酥梨花粉的生长表现出促进作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 砀山酥梨具有促进花粉管生长功能的蛋白、编码基因PbrTTS1及其应用

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 24

<211> 193

<212> PRT

<213> Pyrus bretschneideri

<400> 24

Met Gly Ser Pro Ala Val Phe Val Gln Leu Ser Val Leu Leu Leu Ser

1 5 10 15

Cys Phe Thr Val Phe Val His Pro Pro Ala His Ser Pro Val His Pro

20 25 30

Pro Ala His Ser Pro Val His Pro Pro Ser Pro Pro His His His Gly

35 40 45

His Pro Pro Val His Pro Pro Met Tyr Pro Pro Lys Lys Pro Phe Pro

50 55 60

Arg Ser Phe Val Ala Val Gln Gly Val Val Tyr Cys Lys Ser Cys Asn

65 70 75 80

Tyr Ser Gly Val Asp Thr Leu Asn Gly Ala Lys Pro Val Leu Gly Ala

85 90 95

Thr Val Lys Leu Gln Cys Asn Asn Arg Lys Phe Pro Leu Val Val Lys

100 105 110

Glu Thr Thr Asp Lys Asn Gly Tyr Phe Phe Ile Thr Ala Pro Lys Thr

115 120 125

Ile Thr Thr Phe Gly Ala His Lys Cys Lys Val Ser Leu Val Ser Ser

130 135 140

Pro Ser Ala Ala Cys Ser Lys Pro Ser Asp Leu His Gly Gly Leu Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Leu Lys Pro Ala Lys Pro Phe Met Ser Gln Lys Leu Pro

165 170 175

Phe Leu Leu Tyr Asn Val Gly Pro Phe Ala Phe Glu Pro Thr Cys Pro

180 185 190

Arg

<210> 3

<211> 582

<212> DNA

<213> Pyrus bretschneideri

<400> 3

atgggttctc ctgccgtgtt tgtgcagctc tcagtcctcc tactgagctg cttcactgtc 60

ttcgttcacc caccagccca ctctccggtg cacccaccag cccactctcc ggttcaccca 120

ccaagccccc cccaccacca cggccaccca ccggttcacc ctcctatgta cccacctaag 180

aaacctttcc caaggagctt tgtagcggtt caaggcgtcg tttactgcaa atcttgcaac 240

tactccggcg tcgacaccct taacggcgcc aagccagttc ttggtgctac agtaaagcta 300

cagtgcaaca acagaaagtt cccattggtt gtgaaggaaa ccactgataa aaatggctac 360

ttttttatca cggcacccaa gaccatcacc acctttggag ctcacaagtg caaggtgtca 420

ctcgtctcct ctccctccgc cgcctgctcc aagccgtccg atctgcatgg tggactgagc 480

ggtgctctcc tgaagcctgc gaagccattt atgtcccaga agctcccatt ccttctctac 540

aacgtcggtc cattcgcctt tgagcccaca tgtcctcgtt aa 582

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 3

atgggttctc ctgccgtg 18

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 4

ttaaacgagg acatgtgggc tca 23

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 5

ggatccatgc acccaccagc cc 22

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 6

tctagaacga ggacatgtgg gctca 25

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 7

tgtcttcgtt cacccaccag 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 8

cgctacaaag ctccttggga 20

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 9

tcagtcgccg ccggcctttt g 21

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 10

tgggctttgc tcctcttac 19

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 11

gaattcatgc acccaccagc cc 22

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 12

ggatccacga ggacatgtgg gctca 25

<210> 13

<211> 31

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 13

ggatccatgt acgattattt tcaatttacg c 31

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 14

gaattgatac tgaacactgg aggg 24

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 15

gaattcatgg cgagatacga ttatttt 27

<210> 16

<211> 27

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 16

agatctatac ttgatattgt tggtggg 27

<210> 17

<211> 31

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 17

gaattcatgt acgattattt tcaatttacg c 31

<210> 18

<211> 27

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 18

agatctatac ttgatattgt tggtggg 27

<210> 19

<211> 31

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 19

gaattgatgt acgattattt tcaatttacg c 31

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 20

agatctatac ttaacatcgg ccg 23

<210> 21

<211> 31

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 21

gaattgatgt acgattattt tcaatttacg c 31

<210> 22

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 22

agatctatac tgaatactat tgtttggg 28

<210> 23

<211> 31

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 23

gaattgatgt acgattattt tcaatttacg c 31

<210> 24

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 24

agatctatac tgaatactat tgtttggg 28

Claims

1.一种砀山酥梨促进砀山酥梨花粉管生长的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示。

2.权利要求1所述的砀山酥梨促进砀山酥梨花粉管生长的蛋白的编码基因PbrTTS1，其特征在于，所述编码基因PbrTTS1的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。

3.一种用于扩增权利要求2所述的编码基因PbrTTS1的引物，包括正向引物和反向引物，其特征在于：所述正向引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示；所述反向引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.4所示。

4.权利要求2所述的编码基因PbrTTS1的扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：

(2)以所述cDNA为模板，用权利要求3所述引物进行PCR反应，得到PCR反应产物为编码基因PbrTTS1。

5.根据权利要求4所述的扩增方法，其特征在于，所述PCR反应的体系为20μl，具体包括以下含量组分：2μL 50ng/μL cDNA，6μL 2×PCR Master Mix，1μL 1.0μmol/L正向引物、1μL1μmol/L反向引物和余量的ddH₂O。

6.根据权利要求4或5所述的扩增方法，其特征在于，所述PCR反应的程序如下：94℃，预变性3min，94℃变性30s|，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个热循环，72℃延伸10min，4℃保存。

7.一种花粉管生长促进剂，其特征在于，所述促进剂包括权利要求1所述蛋白。

8.根据权利要求7所述的花粉管生长促进剂，其特征在于，所述促进剂中所述蛋白的浓度不低于0.005μmol/L。

9.权利要求1所述蛋白、权利要求2所述编码基因PbrTTS1、权利要求3所述引物或权利要求4所述花粉管生长促进剂在授粉或花粉管生长中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述授粉的方法包括如下步骤：

C.用硫酸纸袋套到授粉的花柱上，固定硫酸纸袋。