CN113151334A - 一种幽门螺杆菌LuxS六聚体重组蛋白的发酵和纯化工艺 - Google Patents

一种幽门螺杆菌LuxS六聚体重组蛋白的发酵和纯化工艺 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种幽门螺杆菌LuxS六聚体重组蛋白的发酵和纯化工艺，涉及生物技术领域。本发明对构建的含LTA1‑LuxS‑LTA1‑LTA2‑LTB基因的表达载体转入大肠杆菌工程菌扩大培养后进行诱导和纯化，确定最佳诱导和纯化工艺。本发明提供的LuxS六聚体含有单聚体抗原LTA1‑LuxS‑LTA1‑LTA2和分子内佐剂LT(B)5五聚体，通过发酵能上清表达LuxS六聚体重组蛋白，能一步亲和层析纯化LuxS六聚体重组蛋白，提供的LuxS六聚体重组蛋白能够有效激发机体引起保护性免疫应答。LuxS六聚体重组蛋白兼具佐剂和抗原，为幽门螺杆菌口服黏膜疫苗的开发提供了新的方法。

Description

一种幽门螺杆菌LuxS六聚体重组蛋白的发酵和纯化工艺
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种幽门螺杆菌LuxS六聚体重组蛋白的发酵和纯化工艺。
背景技术
幽门螺杆菌感染人数占全球人口半数以上，在一些感染者中，它能引起慢性胃炎、胃溃疡，同时胃粘膜相关性淋巴组织淋巴瘤(MALT)的发生与幽门螺杆菌感染密切相关，且世界卫生组织已将幽门螺杆菌列为一类致癌物质。
幽门螺杆菌定植于胃粘膜层，目前研究较多的疫苗多为口服免疫，其佐剂多为LT、CT、LT(B)5、CT(B)5。上述佐剂与幽门螺杆菌候选抗原多采用物理混合后进行口服免疫，或进行分子间融合后得到重组蛋白进行黏膜免疫。但目前为止，还没有通过物理混合或分子间融合开发的幽门螺杆菌疫苗上市。物理混合或分子间融合开发的幽门螺杆菌疫苗虽具有免疫保护效应，但物理混合的口服幽门螺杆菌疫苗稳定性难于控制；分子间融合开发的重组蛋白其佐剂效应低于天然LT或CT中的分子内佐剂效应，且多为沉淀表达，通过包涵体复性来纯化制备成疫苗，其工艺复杂，成本高。
因此，提供一种对幽门螺杆菌具有免疫效果的疫苗是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种幽门螺杆菌LuxS六聚体重组蛋白的发酵和纯化工艺。通过本发明方法获得的LuxS六聚体重组蛋白具有仿大肠杆菌不耐热肠毒素LT天然六聚体构象，具有分子内佐剂特点，LuxS六聚体重组蛋白作为分子内佐剂和抗原复合物能有效激发机体产生免疫应答，从而达到抵抗幽门螺杆菌在胃内定植的效果。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种幽门螺杆菌LuxS六聚体重组蛋白的发酵工艺，构建含LTA1-LuxS-LTA1-LTA2-LTB基因的表达载体转入大肠杆菌工程菌扩大培养6-8h后进入诱导阶段，设置诱导温度16-25℃，诱导时间6-12h，诱导剂IPTG浓度0.4-3.2mM；
所述LTA1-LuxS-LTA1-LTA2-LTB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
所述LTA1-LuxS-LTA1-LTA2-LTB基因对应的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
群体感应(Quorum Sensing)是细菌间相互交流的一种信号分子，通过此信号分子可控制细菌生长的密集度。LuxS基因为革兰氏阴性菌中存在一种密度感应信号分子，LuxS缺陷菌株细菌间的密度更大，不利于细菌正常生长。本发明将LuxS作为幽门螺杆菌候选抗原进行疫苗开发，构建了pET28a-LTA1-LuxS-LTA1-LTA2-LTB工程菌，并对该工程菌进行诱导表达。在诱导温度16-25℃，诱导时间6-12h，诱导剂IPTG浓度0.4-3.2mM的条件下，可获得高得率，LTA1-LuxS-LTA1-LTA2单聚体与LT(B)5五聚体比例优的Luxs六聚体重组蛋白。
优选地，所述诱导温度为16-20℃，所述诱导时间为10-12h，所述诱导剂IPTG浓度为0.8-3.2mM。
有益效果：诱导温度为16-20℃、诱导时间为10-12h、诱导剂IPTG浓度为0.8-3.2mM时，获得的LuxS六聚体重组蛋白六聚体的比例更优，且LuxS六聚体重组蛋白表达量更高。
更优选地，所述诱导温度为20℃，所述诱导时间为10h，所述诱导剂IPTG浓度为1.6mM。
有益效果：诱导温度20℃，诱导时间为10h，诱导剂IPTG浓度为1.6mM时，LuxS六聚体重组蛋白的六聚体比例最优，产量最高，更有利于产业化扩大培养。
优选地，诱导表达之前发酵罐中加入体积分数0.05-0.2％的消泡剂，诱导表达过程中，维持体积分数10-30％的溶解氧，并以体积分数0.5-2％分次补加甘油作为碳源。
优选效果：消泡效果好；湿菌产率高；分次补加甘油不需要专人看守，单次以体积分数0.5-2％补加甘油，可以保证工程菌对碳源的需求。
更优选地，消泡剂浓度为体积分数0.05％，溶解氧浓度为体积分数20％，每次补加甘油浓度为体积分数1％。
有益效果：消泡效果好，无消泡剂残留，且获得的湿菌产率更高。
本发明的另一目的，是提供一种幽门螺杆菌LuxS六聚体重组蛋白的纯化工艺，将上述诱导所得菌体，以质量体积比为1:10-1:20的比例加入碳酸盐缓冲液，用高压均质机在300-800ba下破菌，离心，上清液经真空抽滤后的上清液2进行上柱，用碳酸盐缓冲液B1进行洗涤，碳酸盐缓冲液B2洗脱，收集蛋白。
优选地，菌体与碳酸盐缓冲液的质量体积比为1:15；破菌压力为500ba。
有益效果：菌体与缓冲盐比例较小时，菌悬液比较浓稠，需要较多的破菌次数，菌体与缓冲盐比例较大时，纯化过程增加操作时间，浪费试剂，降低生产效率，菌体与碳酸盐缓冲液的质量体积比为1:15可以获得最优的效果。破菌压力过大，可使LuxS六聚体重组蛋白发生解聚，压力过小，则需要增加破菌次数。当破菌压力为500ba时，破菌5次，可获得最优的破菌效果，获得的LuxS六聚体重组蛋白LTA1-LuxS-LTA1-LTA2单聚体与LT(B)5五聚体比例最佳。
优选地，所述碳酸盐缓冲液B1组成为乙二胺四乙酸二钠0.11％，氯化钠1.17％，碳酸钠0.01％～0.105％，碳酸氢钠0.011％～0.30％，甘油1.25％；所述碳酸盐缓冲液B2组成为乙二胺四乙酸二钠0.11％，氯化钠1.17％，碳酸钠0.03％，碳酸氢钠0.18％，D-半乳糖2.50％～6.50％，甘油1.25％。
更优选地，碳酸盐缓冲液B1组成中所述碳酸钠为0.03％，碳酸氢钠为0.18％；碳酸盐缓冲液B2组成中所述D-半乳糖为4.50％。
本发明的再一目的，提供上述LuxS六聚体重组蛋白在制备检测、预防或治疗幽门螺杆菌感染的生物制品中的应用。
优选地，LuxS六聚体重组蛋白在制备检测、预防或治疗幽门螺杆菌感染的疫苗中的应用。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种幽门螺杆菌LuxS六聚体重组蛋白的发酵和纯化工艺。本发明利用生物技术，用幽门螺杆菌抗原LuxS替换LT中具有毒性的LTA1片段，通过发酵上清表达LuxS六聚体重组蛋白，再进行一步亲和层析纯化LuxS六聚体重组蛋白。开发的LuxS六聚体重组蛋白发酵和纯化工艺简便、稳定，纯化的LuxS六聚体重组蛋白得率高、纯度高。LuxS六聚体重组蛋白通过口服免疫，其免疫效应强，为幽门螺杆菌口服疫苗的开发开辟了新的方向。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为实施例1扩增的LTA1-LuxS-LTA1-LTA2-LTB基因电泳图；M：DNA分子量标准；1：LTA1-LuxS-LTA1-LTA2-LTB基因片段(978bp)PCR产物；
图2附图为重组质粒pET28a-LTA1-LuxS-LTA1-LTA2-LTB构建图；
图3附图为pET28a-LTA1-LuxS-LTA1-LTA2-LTB重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE)3感受态细胞后PCR电泳图；其中M：DNA分子量标准；1：LTA1-LuxS-LTA1-LTA2-LTB基因片段(978bp)PCR产物；
图4附图为不同诱导温度对LuxS六聚体重组蛋白表达的影响；M：蛋白质分子质量标准；1，诱导温度16℃；2，诱导温度20℃；3，诱导温度25℃；
图5附图为不同诱导剂IPTG浓度对LuxS六聚体重组蛋白表达的影响；M：蛋白质分子质量标准；1，0.4mM；2，0.8mM；3，1.6mM；4，3.2mM；
图6附图为不同诱导时间对LuxS六聚体重组蛋白表达的影响；M：蛋白质分子质量标准；1，6h；2，8h；3，10h；4，12h；
图7附图为LuxS六聚体大肠杆菌工程菌破菌纯化后SDS-PAGE电泳图；其中M：蛋白质分子质量标准；1，全菌；2，上清；3，沉淀；4，流穿1；5，流穿2；6，洗涤样品；7，样品(洗脱)；
图8附图为不同破菌压力对LuxS六聚体纯化影响，其中M为蛋白质分子质量标准，1，300ba；2，500ba；3，800ba；
图9附图为碳酸盐缓冲液纯化LuxS六聚体的验证；M：蛋白质分子质量标准；1，全菌；2，上清；3，沉淀；4，流穿1；5，流穿2；6，洗涤样品；7，样品(洗脱)；
图10附图为LuxS六聚体大肠杆菌工程菌纯化放大SDS-PAGE电泳图；其中，M：蛋白质分子质量标准；1，全菌；2，上清；3，沉淀；4，流穿1；5，流穿2；6，洗涤样品；7，样品(洗脱)；
图11附图为LuxS六聚体SDS-PAGE电泳图；
图12附图为LT六聚体SDS-PAGE电泳图；
图13附图为LT(B)5五聚体SDS-PAGE电泳图；
图14附图为SEC法检测B2缓冲液高效液相色谱图；
图15附图为SEC法检测LT(B)5五聚体高效液相色谱图；
图16附图为SEC法检测LT六聚体高效液相色谱图；
图17附图为SEC法检测LuxS六聚体高效液相色谱图；
图18附图为唾液IgA、血清IgG效价检测结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例公开了一种幽门螺杆菌LuxS六聚体重组蛋白的发酵和纯化工艺。
所用菌株-幽门螺杆菌SS1国际标准株由中国食品药品检定研究院提供。所用菌株-菌株大肠杆菌BL21(DE)3来源于北京全式金生物技术有限公司。所用质粒-质粒pET28a来源于美国Merck。
所用试剂：
高保真PCR酶(KOD-Plus-Neo)、连接酶(Ligation high)为东洋纺上海生物科技有限公司。
琼脂糖、Tris、Na2EDTA·2H2O、冰乙酸、琼脂粉、硫酸卡那霉素、甘氨酸为生工生物工程(上海)股份有限公司。
核酸染色剂(Goldview I)、福林酚为索莱宝科技有限公司。
琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒小提试剂盒、为天根生化科技有限公司。
DNA Marker、细菌基因组DNA提取试剂盒为上海捷瑞生物工程有限公司。
NdeI酶、XhoI酶、Ex Taq酶为宝日医生物技术(北京)有限公司。
氯化钠为江苏省勤奋药业有限公司。
胰蛋白胨北京奥博星生物技术有限责任公司。
酵母提取物为OXOID LTD。
酵母浸粉为安琪酵母股份有限公司。
甘油为湖南尔康制药股份有限公司。
磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、无水碳酸钠、碳酸氢钠、成都市科龙化工试剂厂。
IPTG、D-半乳糖、甘氨酸为湖南汇百侍科技有限公司。
消泡剂为陶氏化学(中国)有限公司。
Protein Marker为Thermo Fisher。
Goat Anti-Mouse-IgG-HRP为北京中杉金桥生物技术有限公司。
牛血清白蛋白为Amresco公司。
Goat Anti-Mouse-IgA-HRP为艾博抗(上海)贸易有限公司。
以上生物材料和试剂来源仅为充分公开本发明，不作为对本发明的限制。
实施例1 LTA1-LuxS-LTA1-LTA2-LTB基因构建
(一)LTA1、LuxS、LTA2、LTB基因克隆及连接
1、LTA1、LTA2、LTB基因来源于LT，LT来源于全基因合成(上海捷瑞生物工程有限公司)。
2、LuxS基因来源于幽门螺杆菌SS1菌株。
3、根据引物设计原则，设计相应引物，并加入酶切位点。引物序列如表1所示：
表1
Figure BDA0003033872280000061
Figure BDA0003033872280000071
4、LTA1、LuxS、LTA2、LTB基因连接
(1)采用高保真PCR方法扩增基因序列，高保真体系及程序参照说明书。
(2)以LT为模板，F-82、R-82a为引物进行高保真PCR。
(3)以幽门螺杆菌SS1菌株全基因组为模板，F-83a、R-83a为引物进行高保真PCR。
(4)以(2)、(3)高保真PCR产物为模板，F-82、R-83a为引物进行高保真PCR。
(5)以LT为模板，F-84a、R-4为引物进行高保真PCR。
(6)以(4)、(5)高保真PCR产物为模板，F-82、R-4为引物进行高保真PCR。
高保真PCR后将其产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳参数为220V、30min，电泳结束后在成像系统下观察结果(如附图1所示)。
当高保真PCR片段与原始序列片段大小相符时，则进行琼脂糖凝胶回收，凝胶回收操作参照说明书。
(二)LTA1-LuxS-LTA1-LTA2-LTB基因与pET28a质粒连接
将LTA1-LuxS-LTA1-LTA2-LTB基因(核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示、LTA1-LuxS-LTA1-LTA2-LTB基因对应的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示)、pET28a分别进行双酶切，酶切位点为NedI/XhoI。酶切体系及程序参照说明书。
将双酶切的产物分别进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后在成像系统下观察结果。
切胶回收需要的片段，琼脂糖凝胶回收操作同上。
用连接酶将双酶切好的LTA1-LuxS-LTA1-LTA2-LTB基因与pET28a质粒进行连接，连接体系及程序参照说明书。连接后的产物命名为pET28a-LTA1-LuxS-LTA1-LTA2-LTB。重组质粒构建过程(如附图2所示)。
(三)pET28a-LTA1-LuxS-LTA1-LTA2-LTB重组质粒转化DH5a
将连接后的产物转入大肠杆菌DH5a感受态细胞，转化体系及程序参照说明书。
将转化产物加入500μL LB液体培养基中，37℃、220rpm振荡培养1h，此为培养物1。LB液体培养基组成为：酵母提取物0.500％，胰蛋白胨1.000％，氯化钠1.000％，溶剂为水。
取100μL培养物1涂布于含0.001％卡那霉素的LB琼脂平板上，37℃过夜培养。含0.001％卡那霉素的LB琼脂平板组成为：酵母提取物0.500％，胰蛋白胨1.000％，氯化钠1.000％，琼脂粉1.750％，卡那霉素0.001％，溶剂为水。
在过夜培养LB琼脂平板上挑取菌落进行普通PCR鉴定，鉴定体系及程序参照TaKaRa Ex Taq说明书，引物为F-82、R-4。
取菌落PCR扩增液10μL与10×loadingbuffer 1μL进行混合，后进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳参数为220V、30min，电泳结束后在成像系统下观察结果。
将菌落PCR鉴定阳性菌接种于含0.001％卡那霉素的LB液体培养基中，后在37℃、220rpm振荡培养过夜，此为培养物2。
将培养物2进行保种，保种参数为培养物2：30％甘油比例为1:1，保存条件为-80℃。
(四)pET28a-LTA1-LuxS-LTA1-LTA2-LTB重组质粒鉴定
取培养物2进行质粒抽提，质粒抽提程序参照说明书。
将抽提质粒进行普通PCR鉴定，引物为F-82、R-4，鉴定体系及程序参照TaKaRa ExTaq说明书。
将质粒PCR扩增液10μL与10×loadingbuffer 1μL进行混合，后进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳参数为220V、30min，电泳结束后在成像系统下观察结果。
将经普通PCR鉴定符合质粒进行-20℃保存备用。
将质粒进行测序，测序公司为生工生物工程(上海)股份有限公司，测序结果与原始序列符合率为100％。
(五)pET28a-LTA1-LuxS-LTA1-LTA2-LTB重组质粒转化BL21(DE)3
将pET28a-LTA1-LuxS-LTA1-LTA2-LTB重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE)3感受态细胞，转化体系及程序参照TaKaRaExTaq说明书。
将转化产物加入500μL LB液体培养基中，37℃、220rpm振荡培养1h，此为培养物3。
取100μL培养物3涂布于含0.001％卡那霉素LB琼脂平板上，37℃过夜培养。
在过夜培养LB琼脂平板上挑取菌落进行普通PCR鉴定，TaKaRa Ex Taq来源、普通PCR鉴定体系及程序同上。
取菌落PCR扩增液10μL与10×loadingbuffer 1μL进行混合，后进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳参数为220V、30min，电泳结束后在成像系统下观察结果(如附图3所示)。
将菌落PCR鉴定阳性菌接种于含0.001％卡那霉素的LB液体培养基中，后在37℃、220rpm振荡培养过夜，此为培养物4。
将培养物4进行保种，保种参数为过夜培养物4：30％甘油比例为1:1，保存条件为-80℃。
实施例2、pET28a-LTA1-LuxS-LTA1-LTA2-LTB大肠杆菌工程菌的发酵工艺
(一)、发酵基本程序
1、pET28a-LTA1-LuxS-LTA1-LTA2-LTB大肠杆菌接种培养
将构建好的pET28a-LTA1-luxs-LTA1-LTA2-LTB大肠杆菌工程菌(培养物4)从-80℃超低温冰箱中取出，将工程菌接种于含0.001％卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、220rpm恒温培养过夜。
2、pET28a-LTA1-luxs-LTA1-LTA2-LTB大肠杆菌转种10L发酵罐培养
取出过夜培养的工程菌以10％接种比例移种于10L发酵罐中，发酵培养基为TB培养基，接种体积为5L。在37℃、溶氧浓度在30％下培养8h。TB培养基组成为：磷酸二氢钾0.2312％，磷酸氢二钾1.2540％，酵母提取物2.4000％，胰蛋白胨1.2000％，甘油0.4000％，消泡剂0.1000％，溶剂为水。
3、pET28a-LTA1-luxs-LTA1-LTA2-LTB大肠杆菌诱导表达
扩大培养8h后设置诱导温度为16℃，加入0.8mM IPTG进行诱导表达，诱导时间为6h。
4、pET28a-LTA1-LuxS-LTA1-LTA2-LTB大肠杆菌菌体收集
诱导结束时，采用离心机离心收集菌体，离心参数为：10000g，8℃，10min，离心结束后将菌体放置在-80℃保存备用。菌体产率为50g/L湿菌。
(二)不同诱导温度对LuxS六聚体重组蛋白表达的影响
设置25℃、20℃、16℃三个不同诱导温度来摸索诱导温度对蛋白表达量的影响，诱导时间均为6h，诱导剂IPTG浓度0.8mM，溶氧浓度30％，流加补充甘油，甘油浓度0.4000％，消泡剂0.1000％，在诱导结束后收集菌体。
取20g湿菌菌体破碎后，采用D-半乳糖填料进行纯化，收集目标峰进行15％SDS-PAGE电泳(结果如附图4所示)。
对图4进行成像系统拍照，20℃时诱导表达最好，形成的LTA1-LuxS-LTA1-LTA2单聚体与LT(B)5五聚体的比例为1：2.96，25℃形成的LTA1-LuxS-LTA1-LTA2单聚体与LT(B)5五聚体的比例为1:3.01。LTA1-LuxS-LTA1-LTA2单聚体与LT(B)5五聚体形成的理论比例为1:2.79，当诱导温度过高，LTA1-LuxS-LT A2单聚体与LT(B)5五聚体来不及自组装为六聚体。当诱导温度过低时，其产量不能满足产业化需求，同时能耗过高也不利于生产。故选择pET28a-LTA1-LuxS-LTA1-LTA2-LTB大肠杆菌工程菌发酵的诱导温度为20℃。
(三)不同IPTG浓度对LuxS六聚体重组蛋白表达的影响
选择0.4mM、0.8mM、1.6mM、3.2mM四个不同IPTG浓度来摸索IPTG诱导浓度对蛋白表达量的影响，诱导温度为20℃，诱导时间为6h，溶氧浓度30％，流加补充甘油，甘油浓度为0.4000％，消泡剂0.1000％，在诱导结束后收集菌体。
取20g湿菌菌体破碎后，采用D-半乳糖填料进行纯化，收集目标峰进行15％SDS-PAGE电泳(结果如附图5所示)。
对图5进行成像系统拍照，0.4mM时诱导表达量(湿菌产率为39.3g/L)低于0.8mM(湿菌产率为51.9g/L)、1.6mM(湿菌产率为60.7g/L)、3.2mM(湿菌产率为65.1g/L)，1.6mM时形成的LTA1-LuxS-LTA1-LTA2与LT(B)5五聚体的比例(1:2.85)比3.2mM(1：3.14)时好。故从生产成本出发，选择1.6mM IPTG进行诱导表达。
(四)不同消泡剂浓度对pET28a-LTA1-LuxS-LTA1-LTA2-LTB大肠杆菌工程菌生长的影响
pET28a-LTA1-LuxS-LTA1-LTA2-LTB大肠杆菌工程菌在诱导表达时易产生泡沫，随着表达时补液的添加，液面升高，泡沫会堵塞发酵罐滤芯，因此消泡剂浓度对发酵过程影响非常重要。选择体积分数0.01％、0.05％、0.1％、0.2％的消泡剂来摸索对大肠杆菌工程菌生长的影响。
Luxs六聚体重组蛋白表达参数为：诱导温度为20℃，诱导时间为6h，IPTG浓度为1.6mM，溶氧浓度30％，流加补充甘油，甘油浓度为0.4000％。
当消泡剂浓度达到0.2％时，其湿菌产率低于0.05％、0.1％；当消泡剂浓度为0.01％，其抑制泡沫的效果不明显，堵塞了发酵罐滤芯；消泡剂浓度在0.05％、0.1％，其湿菌产率相当，从消泡剂残留量考虑，选择0.05％消泡剂浓度进行发酵。
(五)不同溶解氧浓度对pET28a-LTA1-LuxS-LTA1-LTA2-LTB大肠杆菌工程菌生长的影响
pET28a-LTA1-LuxS-LTA1-LTA2-LTB大肠杆菌工程菌是兼性厌氧菌，溶液中适宜的溶解氧对大肠杆菌的生长至关重要，溶解氧过低，不利于大肠杆菌高密度生长，大肠杆菌工程菌湿菌产量低；溶解氧过高，会抑制大肠杆菌生长，且生产成本上升。
选择10％、20％、30％溶解氧来研究大肠杆菌工程菌高密度发酵，诱导表达参数为：诱导温度为20℃，诱导时间为6h，IPTG浓度为1.6mM，消泡剂浓度为0.05％，流加补充甘油，甘油浓度为0.4000％。
发酵结果显示，在10％溶解氧时，大肠杆菌工程菌湿菌产率为60g/L；在20％溶解氧时，大肠杆菌工程菌湿菌产率为80g/L；在30％溶解氧时，大肠杆菌工程菌湿菌产率为90g/L。20％溶解氧和30％溶解氧时大肠杆菌工程菌湿菌产率显著高于10％溶解氧，20％溶解氧和30％溶解氧时大肠杆菌工程菌湿菌产率相当，但维持30％溶解氧所需空气进气量和纯氧进气量过大、发酵转速过高，故选择20％溶解氧来进行大肠杆菌高密度发酵。
(六)补液甘油用量对工程菌生长的影响
大肠杆菌工程菌高密度发酵时需要补充氮源和碳源，氮源的补充来源氨水，碳源的补充来源甘油。当培养基中碳源消耗完时，培养液的溶解氧瞬间升高，显示大肠杆菌不生长；如果不及时补充碳源，其pH也瞬间升高，显示大肠杆菌在死亡。
当碳源消耗完时，一般选择流加补充甘油，但是需要专人看护，增加人工成本。本工艺采用分时段一次补加甘油，当甘油补充少时，需频繁多次补加，不利于高效生产和节约成本；当一次补加甘油过大时，会造成大肠杆菌工程菌死亡。
诱导表达参数为：诱导温度为20℃，诱导时间为6h，IPTG浓度为1.6mM，消泡剂浓度为0.05％，溶解氧浓度为20％。
发酵结果显示，选择一次补加甘油浓度为0.5％、1％、2％来研究大肠杆菌工程菌的高密度发酵，甘油补加浓度为2％时，其发酵产率为60g/L，低于0.5％和1％甘油浓度发酵时75g/L和82g/L；0.5％和1％甘油补加浓度时，其大肠杆菌产率相当，甘油补加浓度为0.5％时，需1h补加一次，甘油补加浓度为1％时，为2h补加一次，从提高生产效率出发，选择1％甘油补加浓度进行高密度发酵。
(七)不同诱导时间对LuxS六聚体重组蛋白表达的影响
选择6h、8h、10h、12h四个不同诱导表达时间来摸索表达时间对蛋白表达量的影响，诱导表达参数为：诱导温度为20℃，IPTG浓度为1.6mM，消泡剂浓度为0.05％，溶解氧浓度为20％，甘油补加浓度为1％，每2h补加一次。
诱导结束后收集菌体。
取20g湿菌菌体破碎后，采用D-半乳糖填料进行纯化，收集目标峰进行15％SDS-PAGE电泳(结果如附图6所示)。
发酵结果显示，6h诱导表达大肠杆菌湿菌产率为71g/L，8h诱导表达大肠杆菌湿菌产率为82g/L，10h诱导表达大肠杆菌湿菌产率为100g/L，12h诱导表达大肠杆菌湿菌产率为110g/L。可知，诱导10h、12h湿菌产率显著高于6h和8h，同时12h的湿菌产率比10h略高。从发酵整个流程时间、发酵补液体积及工艺放大考虑，选择诱导表达时间为10h。
(八)pET28a-LTA1-LuxS-LTA1-LTA2-LTB大肠杆菌工程菌发酵工艺放大验证
按照诱导温度为20℃，诱导时间10h，IPTG浓度为1.6mM，消泡剂浓度为0.05％，溶解氧浓度为20％，甘油补加浓度为1％，每2h补加一次的条件进行100L放大发酵，10L发酵罐培养时间为2h，100L发酵罐扩大培养时间为8h。pET28a-LTA1-LuxS-LTA1-LTA2-LTB大肠杆菌工程菌湿菌产量为100g/L。
将LuxS六聚体大肠杆菌工程菌进行破菌纯化，其SDS-PAGE电泳结果(如附图7所示)。结果显示LuxS六聚体大肠杆菌工程菌工艺放大完全符合预期，能满足产业化生产。
实施例3 LuxS六聚体重组蛋白的纯化工艺
(一)纯化基本条件
仪器系统：AKTAprimer(GE)
填料：D-Galactose
纯化柱型号：7510081(Bio-Rad)
装柱体积：2mL
缓冲液C1组成：乙二胺四乙酸二钠0.11％，氯化钠1.17％，Tris0.30％，甘油1.00％。
缓冲液C2组成：乙二胺四乙酸二钠0.11％，氯化钠1.17％，Tris0.30％，甘油1.00％，D-半乳糖4.50％。
(二)纯化流程
1、破菌
取发酵所得菌体10g，按质量(g)：体积(mL)比1:20加入缓冲液C1，在4℃条件下使用剪切机对含菌体的缓冲液进行剪切悬浮。
使用RO水冲洗高压均质机(AH-1500，ATS工业系统有限公司)管道。打开低温制冷系统进行预冷，备用。将预冷的悬浮菌液加入高压均质机，破菌后取全菌样品。
将破菌后的液体装入离心桶，10000g离心30min，离心温度为8℃，收集上清，此为上清液1。
将上清液1使用真空抽滤泵进行过滤，收集过滤后的上清备用，此为上清液2。
将沉淀用缓冲液C1进行悬浮，悬浮后取此样品，命名为沉淀。
2、上样纯化
用缓冲液C1进行平衡填料至电导、紫外平衡。
在4℃低温条件下上样上清液2，上样流速为2mL/min，上样1个柱体积后，取流穿，此为流穿1。
上样结束后，取流穿，此为流穿2。
用缓冲液C1进行洗涤，流速为2mL/min。取洗涤样品进行后续SDS-PAGE鉴定。
当洗涤紫外值小于10mAu，用缓冲液C2进行洗脱。
缓冲液C2洗脱流速为2mL/min，当紫外值为超过50mAu开始收集蛋白，当紫外值小于50mAu停止收集蛋白。
取此样品进行后续SDS-PAGE鉴定。
(三)破菌压力选择
由于LTA1-LuxS-LTA1-LTA2单聚体与LT(B)5五聚体通过共价键结合。当破菌压力过高时，会将LuxS六聚体破坏，形成LTA1-LuxS-LTA1-LTA2单聚体和LT(B)5五聚体，从而纯化不到目的蛋白LuxS六聚体。当破菌压力低时，需增加破菌次数，降低生产效率。
选择300ba、500ba、800ba的破菌压力来研究破菌压力对LuxS六聚体纯化的影响，湿菌与缓冲液质量体积比为1g:20ml，破菌后采用D-半乳糖填料进行纯化，收集目标峰进行15％SDS-PAGE电泳(结果如附图8所示)。
对图8进行成像系统拍照，后采用系统对LTA1-LuxS-LTA1-LTA2单聚体与LT(B)5五聚体的比例进行分析，300ba形成的LTA1-LuxS-LTA1-LTA2单聚体与LT(B)5五聚体的比例为1:2.70，500ba形成的LTA1-LuxS-LTA1-LTA2单聚体与LT(B)5五聚体的比例为1:2.92，800ba形成的LTA1-LuxS-LTA1-LTA2单聚体与LT(B)5五聚体的比例为1:3.5。800ba时纯化得到的LuxS六聚体中LTA1-LuxS-LTA1-LTA2单聚体明显比300ba、500ba少，说明压力过大，LuxS六聚体发生了部分解聚。300ba和500ba破菌时得到LuxS六聚体中LTA1-LuxS-LTA1-LTA2单聚体与LT(B)5五聚体比例符合理论比例。由于300ba时需破菌15次以上，500ba时仅需破菌6次，故选择破菌压力为500ba。
(四)pET28a-LTA1-LuxS-LTA1-LTA2-LTB大肠杆菌工程菌湿菌与缓冲液稀释比例选择
pET28a-LTA1-LuxS-LTA1-LTA2-LTB大肠杆菌工程菌湿菌(重量)与tris缓冲液(体积)稀释比例对破菌完全、纯化得率和纯化效率有较大影响。当湿菌(重量)与缓冲液(体积)稀释比例过小，菌悬浮液浓稠，破菌不彻底且重组蛋白与填料结合率低；当湿菌(重量)与缓冲液(体积)稀释比例过大时，本工艺纯化时所需时间过长，不利于放大生产。
选择湿菌(重量)与缓冲液(体积)稀释比例为1g：10mL、1g：15mL、1g：20mL，破菌压力为500ba。破菌后采用D-半乳糖填料进行纯化，收集目标峰进行产量测定。
结果显示，稀释比例为1g：10mL产率为0.5mg(LuxS六聚体重组蛋白)/g(大肠杆菌工程菌湿菌)，1g：15mL、1g：20mL产率相等，产率均为0.6mg/g。另一方面，稀释比例为1g：10mL时，菌悬液过于浓稠，破菌次数增加至8次；1g：20mL时，当纯化工艺放大至破菌600g时，纯化上样时间增加100min，降低了生产效率，同时浪费了试剂。
故本工艺纯化湿菌(重量)与缓冲液(体积)稀释比例选择为1g：15mL。
(五)不同缓冲液对LuxS六聚体重组蛋白纯化的影响
LuxS六聚体重组蛋白的应用为幽门螺杆菌口服疫苗，目前经国家权威机构较认可的口服缓冲液有碳酸盐缓冲液，但其成分碳酸钠、碳酸氢钠受热时易分解，以此缓冲液作为幽门螺杆菌口服疫苗缓冲液需摸索验证。
本工艺上述研究缓冲液采用的Tris缓冲液，其成分稳定，对LuxS六聚体重组蛋白纯化工艺不会引入干扰项，但国内未将其应用于人体口服。因此本工艺继续对Tris缓冲液和碳酸盐缓冲液进行纯化LuxS六聚体重组蛋白效果进行比较。
采用碳酸盐缓冲液纯化LuxS六聚体重组蛋白时，在LuxS六聚体大肠杆菌工程菌制备成菌悬液、均质机破菌、破菌后离心收集上清菌液、上清菌液过填料柱纯化、纯化收集目的蛋白时，均采用冰水浴。
碳酸盐缓冲液B1组成：乙二胺四乙酸二钠0.11％，氯化钠1.17％，碳酸钠0.03％，碳酸氢钠0.18％，甘油1.25％。
碳酸盐缓冲液B2组成：乙二胺四乙酸二钠0.11％，氯化钠1.17％，碳酸钠0.03％，碳酸氢钠0.18％，D-半乳糖4.50％，甘油1.25％。
将收集目的蛋白进行15％SDS-PAGE电泳(结果如附图9所示)。对图9进行成像系统拍照，后采用系统对条带含量进行分析，碳酸盐缓冲液形成的LTA1-LuxS-LTA1-LTA2单聚体与LT(B)5的比例为1:2.98，Tris缓冲液形成的LTA1-LuxS-LTA1-LTA2单聚体与LT(B)5的比例为1:2.85。可见，碳酸盐缓冲液和Tris缓冲液纯化LuxS六聚体重组蛋白，其效果相当，可用碳酸盐缓冲液代替Tris缓冲液。
(六)LuxS六聚体重组蛋白纯化工艺放大验证
按照破菌压力为500ba，湿菌(重量)与碳酸盐缓冲液(体积)稀释比例为1g：15mL，破菌次数为6次条件，对LuxS六聚体重组蛋白进行产业化放大。所用仪器系统为APPS200D纯化系统(利穗科技(苏州)有限公司)；所用高压均质机为AH-2020(ATS工业系统有限公司)；所用纯化柱规格为50mm×200mm。将填料放大至150mL，湿菌重量为600g。
将纯化后的蛋白进行15％SDS-PAGE电泳(如附图10所示)，测得LTA1-LuxS-LTA1-LTA2单聚体与LT(B)5五聚体的蛋白分子质量比例为1:2.85，符合理论比例，达到纯化效果。LuxS六聚体重组蛋白产率为0.55mg(LuxS六聚体重组蛋白)/g(大肠杆菌工程菌湿菌)。以上结果显示LuxS六聚体重组蛋白纯化放大工艺完全符合预期，能满足产业化应用。
实施例4 LuxS六聚体重组蛋白的SDS-PAGE鉴定
1、大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)在大肠杆菌体内自组装形成六聚体，分为LTA1-LTA2单聚体、LT(B)5五聚体，本发明参照天然LT基因序列设计，当LuxS六聚体重组蛋白在大肠杆菌中自组装表达，其多聚体形成含有如下几种可能：
单聚体：
(1)LTA1-LuxS-LTA1-LTA2单聚体，经15％SDS-PAGE电泳，目的条带仅为一条，且大小为21.0KDa。
(2)LTB单聚体，经15％SDS-PAGE电泳，目的条带仅为一条，且大小为11.7KDa。
(3)LTA1-LuxS-LTA1-LTA2-LTB单聚体，经15％SDS-PAGE电泳，目的条带仅为一条，且大小为32.7KDa。
二聚体：
(1)LTA1-LuxS-LTA1-LTA2单聚体、LTB单聚体，经15％SDS-PAGE电泳，目的条带有2条，大小为21.0KDa，11.7KDa。
(2)LTB二聚体，经15％SDS-PAGE电泳，目的条带仅有1条，大小为11.7KDa。
三聚体：
(1)LTA1-LuxS-LTA1-LTA2单聚体、LT(B)2二聚体，经15％SDS-PAGE电泳，目的条带有2条，大小为21.0KDa，11.7KDa。
(2)LTB三聚体，经15％SDS-PAGE电泳，目的条带仅有1条，大小为11.7KDa。
四聚体：
(1)LTA1-LuxS-LTA1-LTA2单聚体、LT(B)3三聚体，经15％SDS-PAGE电泳，目的条带有2条，大小为21.0Kda，11.7KDa。
(2)LTB四聚体，经15％SDS-PAGE电泳，目的条带仅有1条，大小为11.7KDa。
五聚体：
(1)LTA1-LuxS-LTA1-LTA2单聚体、LT(B)4四聚体，经15％SDS-PAGE电泳，目的条带有2条，大小为21.0Kda，11.7KDa。
(2)LTB五聚体，经15％SDS-PAGE电泳，目的条带仅有1条，大小为11.7KDa。
六聚体：
LTA1-LuxS-LTA1-LTA2单聚体、LT(B)5五聚体，经15％SDS-PAGE电泳，目的条带有2条，大小为21.0KDa，11.7KDa。
2、取LuxS六聚体、LT六聚体、LT(B)5五聚体重组蛋白各40uL，分别与10μL 5x SDS-PAGE LoadingBuffer混匀，后沸水浴15min，5min/次，共3次。
取10uL样品进行15％SDS-PAGE电泳，电泳参数为80V电泳15min，后220V电泳40min。
电泳结束后采用考马斯亮蓝法进行染色和脱色，脱色结束后在成像系统下观察结果，LuxS六聚体电泳结果如附图11所示，LT六聚体电泳结果如附图12所示，LT(B)5五聚体电泳结果如附图13所示。
LT六聚体经15％SDS-PAGE电泳后发生了解聚，附图12中从上往下含有2条目的条带，25KDa-35KDa间有一目的条带，10KDa-15KDa间有一目的条带。LT(B)5五聚体分子量为58.6KDa、LTA1-LTA2单聚体分子量为27.8KDa、LTB单聚体分子量为11.7KDa，说明LT六聚体完全解聚，形成了LTA1-LTA2单聚体和LTB单聚体，且第一条为LTA1-LTA2单聚体，第二条为LTB单聚体。
LT(B)5经15％SDS-PAGE电泳后仅有1条条带(如附图13所示)，大小在10KDa-15KDa之间。此条带大小与LT六聚体第二条带位置一致，即进一步证明了LT六聚体完全解聚，且此条带为LTB单聚体。
LuxS六聚体经15％SDS-PAGE电泳后含有2条带(如附图11所示)，其大小分别为15KDa-25KDa，10KDa-15KDa。说明LuxS六聚体含有LTA1-LuxS-LTA1-LTA2、LTB组分。
实施例5 LuxS六聚体重组蛋白中LTA1-LuxS-LTA1-LTA2与LTB含量比例检测
从LuxS六聚体重组蛋白SDS-PAGE鉴定结果可知，LuxS六聚体重组蛋白含有LTA1-LuxS-LTA1-LTA2和LTB组分，但LTA1-LuxS-LTA1-LTA2与LTB形成了几聚体还需进一步证明。需结合LuxS六聚体中LTA1-LuxS-LTA1-LTA2与LTB的含量比例进行鉴定(采用Bio-RadChemiDoc MP对条带进行含量分析)。
(一)LuxS六聚体组成判定标准：
当LuxS六聚体为LTA1-LuxS-LTA1-LTA2单聚体与LTB单聚体时，LTA1-LuxS-LTA1-LTA2单聚体与LTB单聚体的含量比例为1:0.56。
当LuxS六聚体为LTA1-LuxS-LTA1-LTA2单聚体与LT(B)2二聚体时，LTA1-LuxS-LTA1-LTA2单聚体与LTB单聚体的含量比例为1:1.12。
当LuxS六聚体为LTA1-LuxS-LTA1-LTA2单聚体与LT(B)3三聚体时，LTA1-LuxS-LTA1-LTA2单聚体与LTB单聚体的含量比例为1:1.67。
当LuxS六聚体为LTA1-LuxS-LTA1-LTA2单聚体与LT(B)4四聚体时，LTA1-LuxS-LTA1-LTA2单聚体与LTB单聚体的含量比例为1:2.23。
当LuxS六聚体为LTA1-LuxS-LTA1-LTA2单聚体与LT(B)5五聚体时，LTA1-LuxS-LTA1-LTA2单聚体与LTB单聚体的含量比例为1:2.79。
(二)LT六聚体中LTA1-LTA2单聚体与LTB单聚体含量比例检测
将LT六聚体经15％SDS-PAGE电泳后进行成像系统拍照(结果如附图12所示)，后采用Bio-Rad ChemiDoc MP对条带进行含量分析，第一条带LTA1-LTA2单聚体和第二条带LTB单聚体的比例为1:2.25，LTA1-LTA2单聚体和LTB单聚体的理论比例为1:2.10，说明通过此方法进行比例确定可行。
(三)LuxS六聚体中LTA1-LuxS-LTA1-LTA2单聚体与LTB单聚体含量比例检测和结果判定
将LuxS六聚体经15％SDS-PAGE电泳后进行成像系统拍照(结果如附图11所示)，后采用系统对条带进行含量分析，第一条带和第二条带的比例为1:2.90。LuxS六聚体中LTA1-LuxS-LTA1-LTA2单聚体与LTB单聚体含量理论比例为1:2.79，说明LuxS六聚体含有LTA1-LuxS-LTA1-LTA2单聚体与LT(B)5五聚体。
实施例6、LuxS六聚体重组蛋白Size Exclusion Chromatography(SEC)定性检
上述研究通过LuxS六聚体中LTA1-LuxS-LTA1-LTA2单聚体与LTB单聚体含量比例确定了LuxS为六聚体，现通过LuxS六聚体重组蛋白SEC法检测进行定性鉴定。
1、SEC法检测基本条件：
仪器系统：高效液相色谱仪LC-100(上海伍丰科学仪器有限公司)
色谱柱：SEC-3(安捷伦，150A)
流动相组成：磷酸二氢钠1％，磷酸氢二钠4.85％，异丙醇1％，pH7.0，溶剂为水。
2、SEC法检测操作流程：
打开高效液相色谱仪，使用UP水进行上样，上样流速为3ml/min，运行5min。
使用流动相进行上样，上样流速为3ml/min，运行5min。
将色谱柱接入纯化仪，上样流速调整为0.35ml/min，运行30min。
将上样样品与流动相混合，后进行上样。
上样量10uL，紫外检测波长为214nm，等度洗脱。
上样结束后，再次上样流动相，清洗30min后再次上样。
3、LuxS六聚体、LT六聚体、LT(B)5五聚体SEC法检测
利用SEC法分别检测B2缓冲液(如附图14所示)、LT(B)5五聚体(如附图15所示)、LT六聚体(如附图16所示)、LuxS六聚体(如附图17所示)。
结果显示：
1、B2缓冲液中含有D-半乳糖，出峰时间为11.27min。
2、LT(B)5五聚体重组蛋白SEC法检测有2个峰，出峰时间分别为8.46min和11.20min，根据B2缓冲液SEC法检测结果推测，故LT(B)5五聚体重组蛋白的出峰时间为8.46min。
3、LT六聚体进行SEC法检测时，含有3个峰，出峰时间为8.52min、10.22min、11.28min。从出峰个数判定，LT六聚体在SEC法检测过程中解聚了。LT六聚体相对分子质量为86.4KDa，LT(B)5五聚体相对分子质量为58.6KDa，LTA1-LTA2单聚体分子量为27.8KDa，LTB单聚体分子量为11.7KDa。
根据LT六聚体相对分子质量、LT(B)5五聚体相对分子质量、LTA1-LTA2单聚体相对分子质量、LTB单聚体相对分子质量大小及LT(B)5五聚体SEC法检测结果说明，LT六聚体第一个峰与LT(B)5五聚体出峰时间一致，即第一个峰为LT(B)5五聚体，且LT(B)5五聚体在SEC法过程中未解聚。
从出峰时间判定，LT六聚体第一个峰与LT(B)5五聚体出峰时间一致，且早于第二个峰，即第一个峰对应相对分子质量大于第二个相对分子质量。故第二个峰为LTA1-LTA2单聚体，且LT(B)5五聚体与LTA1-LTA2单聚体之间的共价键在SEC法检测过程中的高压下断裂了。
4、LuxS六聚体进行SEC法检测时，含有3个峰，出峰时间分别为8.48min，10.48min，11.70min。第一个出峰时间与LT(B)5五聚体出峰时间、LT六聚体第一个出峰时间均相同，说明LuxS六聚体中含有LT(B)5五聚体。LTA1-LuxS-LTA1-LTA2单聚体相对分子质量为21.0KDa，LTA1-LTA2单聚体相对分子质量为27.8KDa，从理论上推测，LTA1-LuxS-LTA1-LTA2单聚体出峰时间晚于LTA1-LTA2单聚体出峰时间。如附图17所示，LuxS六聚体第二个出峰时间晚于LT(B)5五聚体，且晚于LTA1-LTA2单聚体出峰时间相同，说明LuxS六聚体中含有LTA1-LuxS-LTA1-LTA2单聚体。
通过LuxS六聚体重组蛋白SEC法定性检测说明LuxS六聚体重组蛋白形成了六聚体，且LTA1-LuxS-LTA1-LTA2为单聚体，LT(B)5为五聚体。
实施例7、LuxS六聚体重组蛋白SEC定量检测
LT六聚体重组蛋白进行SEC法检测后，计算第一个峰LT(B)5五聚体的峰面积为27314.1，第二个峰LTA1-LTA2单聚体的峰面积为13345.9，LTA1-LTA2单聚体与LT(B)5五聚体的峰面积比例为1:2.05(即LTA1-LTA2单聚体与LT(B)5五聚体的含量比例为1:2.05)，这与LTA1-LTA2单聚体与LT(B)5五聚体的理论含量比例(1:2.1)一致。
对LuxS六聚体重组蛋白进行SEC法检测，计算第一个峰LT(B)5五聚体的峰面积为37255.9，第二个峰LTA1-LuxS-LTA1-LTA2单聚体的峰面积为14437.2，LTA1-LuxS-LTA1-LTA2单聚体与LT(B)5五聚体的峰面积比例为1:2.58(即LTA1-LuxS-LTA1-LTA2单聚体与LT(B)5五聚体的含量比例为1:2.58)，这与LTA1-LuxS-LTA1-LTA2单聚体与LT(B)5五聚体的理论含量比例(1:2.79)一致。
综上所述，通过LuxS六聚体重组蛋白SEC定量检测，再次证明了LuxS六聚体重组蛋白形成了六聚体，且LTA1-LuxS-LTA1-LTA2为单聚体，LT(B)5为五聚体。
实施例8、LuxS六聚体重组蛋白纯度检测
将实施例3最后放大培养所得LuxS六聚体经15％SDS-PAGE电泳后进行成像系统拍照(如附图11所示)，后经Bio-Rad ChemiDoc MP软件对条带进行含量分析，LuxS六聚体重组蛋白纯度为91.2％。
将LuxS六聚体重组蛋白进行SEC检测，后对峰面积进行计算(峰面积计算参照高效液相色谱仪LC-100使用说明书)，LuxS六聚体重组蛋白纯度为93.3％。
综上，LuxS六聚体重组蛋白的纯度在90％以上，完全满足口服疫苗所需标准。
实施例9、LuxS六聚体重组蛋白免疫动物及抗体检测
(一)口服灌胃免疫动物
实验动物：6周龄雌性Balb/c小鼠，90只，18g±2g。小鼠自购买后采用随机分组法对鼠进行分组，10只/笼。免疫组30只，感染组30只，空白对照组30只。过渡饲养1天进行免疫实验。
LuxS六聚体疫苗组成：LuxS六聚体重组蛋白1mg/mL，溶剂为：乙二胺四乙酸二钠0.11％，氯化钠1.17％，碳酸钠0.03％，碳酸氢钠0.18％，D-半乳糖4.50％，甘油1.25％；其中LuxS六聚体重组蛋白实施例3最后放大培养所得。
口服灌胃免疫程序：共免疫3次，免疫时间点为0天、7天、28天。每次免疫前需提前24h断食断水，免疫结束后2h恢复食水。
口服灌胃免疫操作：
(1)、免疫前将LuxS六聚体疫苗从-80℃取出放置在4℃冰箱解冻备用。
(2)、用无菌注射器吸取LuxS六聚体疫苗，免疫剂量为LuxS六聚体抗原1mg/只。
(二)末次免疫后口服灌胃感染幽门螺杆菌
末次免疫后第10天进行口服灌胃幽门螺杆菌SS1活菌进行攻毒实验，每只小鼠感染剂量为4×106CFU。
(三)末次免疫结束后唾液和血样本采集
1、小鼠唾液样本采集
末次免疫结束后第10天(口服灌胃幽门螺杆菌前)、第38天对小鼠进行采集唾液。提前24h对小鼠断食断水，采集小鼠唾液前，需给小鼠腹腔注射5mg/mL毛果芸香碱20uL，采集唾液放置在-80℃保存备用。
2、小鼠血样本采集
末次免疫结束后第10天对小鼠进行采集尾静脉血(口服灌胃幽门螺杆菌前)，第38天采集小鼠眼眶静脉血。提前24h对小鼠断食断水，将采集的血室温静置4h，采用3000g离心2min，吸上清，后再重复上述操作一次，将分离的血清放置在-80℃保存备用。
(四)、唾液IgA和血清IgG样本Elisa间接法检测
1、Elisa检测准备
封闭液组成如下：0.01M PBS，1％BSA，溶剂为水。
PBST洗涤液组成如下：0.01M PBS，0.05mL/100mLTween-20，溶剂为水。
抗体稀释液组成如下：0.01M PBS，0.05mL/100mLTween-20，0.5％BSA，溶剂为水。
底物缓冲液组成如下：磷酸氢二钠1.4％，一水合柠檬酸1％，溶剂为水。
2M硫酸组成如下：浓硫酸11.22mL/100mL，溶剂为水。
1mg/mLTMB组成如下：TMB 0.1％，溶剂为DMSO。
显色液组成如下：1mg/mLTMB：底物缓冲液：30％双氧水配制体积比例为100:900:1。
LuxS六聚体抗原包被酶标板：用2ug/mL免疫抗原包被酶标板，包被条件为37℃下孵育2h，后用PBST洗涤液洗板三次。300μL/孔将封闭液加入上述酶标板，放入4℃冰箱中，封闭过夜。再用PBST洗涤液洗上述酶标板三次，将此酶标板命名为酶标板1并放入4℃冰箱保存备用。
2、血清IgG样本Elisa检测
将血清样本用抗体稀释液以1:800进行稀释，100μL/孔加入酶标板1中，37℃、孵育45min，PBST洗涤液洗板三次，此酶标板命名为酶标板2。
将羊抗鼠IgG二抗用抗体稀释液1:10000进行稀释，100μL/孔加入酶标板2，37℃、孵育45min，PBST洗涤液洗板三次，此酶标板命名为酶标板3。
将显色液按100μL/孔加入酶标板3中，37℃、孵育15min，后按50μL/孔加入2MH2SO4终止液，此酶标板命名为酶标板4。
将酶标板4放入酶标分析仪中，选择OD450进行检测，将检测数据保存并进行后续分析。
3、唾液IgA样本Elisa检测
将唾液样本用抗体稀释液以1:5进行稀释，100μL/孔加入酶标板1中，37℃、孵育45min，PBST洗涤液洗板三次，此酶标板命名为酶标板5。
将羊抗鼠IgA二抗用抗体稀释液1:5000进行稀释，100μL/孔加入酶标板5，37℃、孵育45min，PBST洗涤液洗板三次，此酶标板命名为酶标板6。
将显色液按100μL/孔加入酶标板6中，37℃、孵育15min，后按50μL/孔加入2MH2SO4终止液，此酶标板命名为酶标板7。
将酶标板7放入酶标分析仪中，选择OD450进行检测，将检测数据保存并进行后续分析。
4、唾液IgA和血清IgG效价检测结果
检测结果判定：将样本(免疫组)/阴性(感染组)值≥2.1定义为阳性。将感染组效价检测阳性小鼠/感染组小鼠×100％定义为阳转率。
(1)、唾液IgA效价检测结果：小鼠免疫组保护率判定终点时唾液IgA(1:5)效价检测阳转率为60％；
(2)、血清IgG效价检测结果：小鼠免疫组保护率判定终点时血清IgG(1:800)效价检测阳转率为100％(如附图18所示)。
(3)、通过唾液IgA和血清IgG效价检测结果说明本发明的LuxS六聚体疫苗具有良好的免疫原性，能够诱导机体产生免疫应答，为LuxS六聚体疫苗用于清除胃内幽门螺杆菌定植提供了支撑。
(五)、LuxS六聚体疫苗保护效果
末次免疫结束后第38天通过平板培养法检测各组小鼠幽门螺杆菌感染定植率，以此计算LuxS六聚体疫苗保护率。
保护率＝(免疫组只数×感染组感染率—免疫组感染只数)/(免疫组只数×感染组感染率)×100/100。
幽门螺杆菌平板培养参考本领域中常规的条件、配方及操作方法。
LuxS六聚体疫苗保护率检测结果见表5：
表5
批次 保护率
第一轮 10％(1/10)
第二轮 11.1％(1/9)
第三轮 20％(2/10)
LuxS六聚体连续3轮动物保护实验的平均保护率为13.7％，相比于目前幽门螺杆菌疫苗未上市销售的现状，为幽门螺杆菌口服疫苗的开发开辟了新的方向。
本发明的LuxS六聚体重组蛋白不仅具有分子内佐剂特点，同时通过佐剂增加了候选疫苗抗原的摄入，即疫苗候选抗原与LT(B)5共价结合，LT(B)5能与肠黏膜上的GM1受体结合，通过此方式增加了疫苗候选抗原对肠道免疫系统的刺激，使其具有良好的免疫原性。同时通过发酵能上清表达LuxS六聚体，并能通过一步亲和层析得到抗原，其生产工艺简单、稳定，得到的蛋白纯度高，这为幽门螺杆菌口服疫苗的开发开辟了新的方向。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 成都亿妙生物科技有限公司
<120> 一种幽门螺杆菌LuxS六聚体重组蛋白的发酵和纯化工艺
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 978
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaaaaata taactttcat tttttttatt ttattagcat cgccattata tgcaaatggc 60
gacaaattat accgtgctga ctctagaccc ccagatgaaa taaaacgttc cggaggtctt 120
atgcccagaa aaaagggcgt taatggggat ttgattgtca aatacgatgt gcgcttcaaa 180
cagcccaaca aagatcacat ggacatgcca agcttgcact ctttagagca tttagtcgct 240
gagattatcc gcaaccacgc tagttatgtt gtggattggt cgcctatggg ttgccaaacg 300
ggattttatc tcacggtgtt aaaccatgac aattacacag agattttaga ggttttagaa 360
aagacgatgc aagatgtgtt aaaggctaca gaagtgcctg ccagcaatga aaagtggatt 420
catcatgcac cacaaggttg tggaaattca tcaagaacaa ttacaggtga tacttgtaat 480
gaggagaccc agaatctgag cacaatatat ctcaggaaat atcaatcaaa agttaagagg 540
cagatatttt cagactatca atcagaggtt gacatatata acagaattcg ggatgaatta 600
tgaatgaaca aagtcaaatg ttatgtttta tttacggcgt tactgtcctc tctgtgtgca 660
tacggagctc cgcagtctat tacagaactg tgttcggaat atcgcaacac acaaatttat 720
acgattaatg acaagattct gtcatatacg gaatcgatgg caggcaaacg cgaaatggtt 780
atcattacat ttaagagcgg cgcaacattt caggtcgaag tcccgggcag tcaacatatt 840
gactcccaaa aaaaagccat tgaacgcatg aaggacacat tacgcatcac atatctgacc 900
gagaccaaaa ttgataaatt atgtgtatgg aataataaaa ccccgaattc aattgcggca 960
atcagtatgg aaaactag 978
<210> 2
<211> 697
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asn Gly Asp Lys Leu Tyr Arg Ala Asp Ser Arg Pro Pro Asp Glu Ile
1 5 10 15
Lys Arg Ser Gly Gly Leu Met Pro Arg Lys Lys Gly Val Asn Gly Asp
20 25 30
Leu Ile Val Lys Tyr Asp Val Arg Phe Lys Gln Pro Asn Lys Asp His
35 40 45
Met Asp Met Pro Ser Leu His Ser Leu Glu His Leu Val Ala Glu Ile
50 55 60
Ile Arg Asn His Ala Ser Tyr Val Val Asp Trp Ser Pro Met Gly Cys
65 70 75 80
Gln Thr Gly Phe Tyr Leu Thr Val Leu Asn His Asp Asn Tyr Thr Glu
85 90 95
Ile Leu Glu Val Leu Glu Lys Thr Met Gln Asp Val Leu Lys Ala Thr
100 105 110
Glu Val Pro Ala Ser Asn Glu Lys Trp Ile His His Ala Pro Gln Gly
115 120 125
Cys Gly Asn Ser Ser Arg Thr Ile Thr Gly Asp Thr Cys Asn Glu Glu
130 135 140
Thr Gln Asn Leu Ser Thr Ile Tyr Leu Arg Lys Tyr Gln Ser Lys Val
145 150 155 160
Lys Arg Gln Ile Phe Ser Asp Tyr Gln Ser Glu Val Asp Ile Tyr Asn
165 170 175
Arg Ile Arg Asp Glu Leu Ala Pro Gln Ser Ile Thr Glu Leu Cys Ser
180 185 190
Glu Tyr Arg Asn Thr Gln Ile Tyr Thr Ile Asn Asp Lys Ile Leu Ser
195 200 205
Tyr Thr Glu Ser Met Ala Gly Lys Arg Glu Met Val Ile Ile Thr Phe
210 215 220
Lys Ser Gly Ala Thr Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile
225 230 235 240
Asp Ser Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile
245 250 255
Thr Tyr Leu Thr Glu Thr Lys Ile Asp Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn
260 265 270
Lys Thr Pro Asn Ser Ile Ala Ala Ile Ser Met Glu Asn Ala Pro Gln
275 280 285
Ser Ile Thr Glu Leu Cys Ser Glu Tyr Arg Asn Thr Gln Ile Tyr Thr
290 295 300
Ile Asn Asp Lys Ile Leu Ser Tyr Thr Glu Ser Met Ala Gly Lys Arg
305 310 315 320
Glu Met Val Ile Ile Thr Phe Lys Ser Gly Ala Thr Phe Gln Val Glu
325 330 335
Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp Ser Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg
340 345 350
Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Thr Tyr Leu Thr Glu Thr Lys Ile Asp
355 360 365
Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro Asn Ser Ile Ala Ala Ile
370 375 380
Ser Met Glu Asn Ala Pro Gln Ser Ile Thr Glu Leu Cys Ser Glu Tyr
385 390 395 400
Arg Asn Thr Gln Ile Tyr Thr Ile Asn Asp Lys Ile Leu Ser Tyr Thr
405 410 415
Glu Ser Met Ala Gly Lys Arg Glu Met Val Ile Ile Thr Phe Lys Ser
420 425 430
Gly Ala Thr Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp Ser
435 440 445
Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Thr Tyr
450 455 460
Leu Thr Glu Thr Lys Ile Asp Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr
465 470 475 480
Pro Asn Ser Ile Ala Ala Ile Ser Met Glu Asn Ala Pro Gln Ser Ile
485 490 495
Thr Glu Leu Cys Ser Glu Tyr Arg Asn Thr Gln Ile Tyr Thr Ile Asn
500 505 510
Asp Lys Ile Leu Ser Tyr Thr Glu Ser Met Ala Gly Lys Arg Glu Met
515 520 525
Val Ile Ile Thr Phe Lys Ser Gly Ala Thr Phe Gln Val Glu Val Pro
530 535 540
Gly Ser Gln His Ile Asp Ser Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys
545 550 555 560
Asp Thr Leu Arg Ile Thr Tyr Leu Thr Glu Thr Lys Ile Asp Lys Leu
565 570 575
Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro Asn Ser Ile Ala Ala Ile Ser Met
580 585 590
Glu Asn Ala Pro Gln Ser Ile Thr Glu Leu Cys Ser Glu Tyr Arg Asn
595 600 605
Thr Gln Ile Tyr Thr Ile Asn Asp Lys Ile Leu Ser Tyr Thr Glu Ser
610 615 620
Met Ala Gly Lys Arg Glu Met Val Ile Ile Thr Phe Lys Ser Gly Ala
625 630 635 640
Thr Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp Ser Gln Lys
645 650 655
Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Thr Tyr Leu Thr
660 665 670
Glu Thr Lys Ile Asp Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro Asn
675 680 685
Ser Ile Ala Ala Ile Ser Met Glu Asn
690 695
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggaattccat atgaaaaata taactttcat t 31
<210> 4
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccattaacgc ccttttttct gggcataaga cctc 34
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaggtcttat gcccagaaaa aagggcgtta atgg 34
<210> 6
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggtgcatgat gaatccactt ttcattgctg gcag 34
<210> 7
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctgccagcaa tgaaaagtgg attcatcatg cacc 34
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccgctcgagc tagttttcca tactgattg 29

Claims (10)

1.一种幽门螺杆菌LuxS六聚体重组蛋白的发酵工艺，其特征在于，构建含LTA1-LuxS-LTA1-LTA2-LTB基因的表达载体转入大肠杆菌工程菌扩大培养6-8h后进入诱导阶段，设置诱导温度16-25℃，诱导时间6-12h，诱导剂IPTG浓度0.4-3.2mM；
所述LTA1-LuxS-LTA1-LTA2-LTB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述的幽门螺杆菌LuxS六聚体重组蛋白的发酵工艺，其特征在于，所述诱导温度为16-20℃，所述诱导时间为10-12h，所述诱导剂IPTG浓度为0.8-3.2mM。
3.根据权利要求2所述的幽门螺杆菌LuxS六聚体重组蛋白的发酵工艺，其特征在于，所述诱导温度为20℃，所述诱导时间为10h，所述诱导剂IPTG浓度为1.6mM。
4.根据权利要求1-3任一所述的一种幽门螺杆菌LuxS六聚体重组蛋白的发酵工艺，其特征在于，诱导表达之前发酵罐中加入0.05-0.2％的消泡剂，诱导表达过程中，维持10-30％溶解氧浓度，并以0.5-2％浓度分次补加甘油作为碳源。
5.根据权利要求4所述的幽门螺杆菌LuxS六聚体重组蛋白的发酵工艺，其特征在于，消泡剂浓度为0.05％，溶解氧浓度为20％，每次补加甘油浓度为1％。
6.一种幽门螺杆菌LuxS六聚体重组蛋白的纯化工艺，其特征在于，权利要求1-5任一诱导所得菌体，以质量体积比为1:10-1:20的比例加入碳酸盐缓冲液，用高压均质机在300-800ba下破菌，离心，上清液经真空抽滤后的上清液2进行上柱，用碳酸盐缓冲液B1进行洗涤，碳酸盐缓冲液B2洗脱，收集蛋白。
7.根据权利要求6所述的幽门螺杆菌LuxS六聚体重组蛋白的纯化工艺，其特征在于，菌体与碳酸盐缓冲液的质量体积比为1:15；破菌压力为500ba。
8.根据权利要求6或7所述的幽门螺杆菌LuxS六聚体重组蛋白的纯化工艺，其特征在于，所述碳酸盐缓冲液B1组成为乙二胺四乙酸二钠0.11％，氯化钠1.17％，碳酸钠0.01％～0.105％，碳酸氢钠0.011％～0.30％，甘油1.25％；所述碳酸盐缓冲液B2组成为乙二胺四乙酸二钠0.11％，氯化钠1.17％，碳酸钠0.03％，碳酸氢钠0.18％，D-半乳糖2.50％～6.50％，甘油1.25％。
9.根据权利要求8所述的幽门螺杆菌LuxS六聚体重组蛋白的纯化工艺，其特征在于，碳酸盐缓冲液B1组成中所述碳酸钠为0.03％，碳酸氢钠为0.18％；碳酸盐缓冲液B2组成中所述D-半乳糖为4.50％。
10.权利要求1-9任一所述工艺表达的LuxS六聚体重组蛋白在制备检测、预防或治疗幽门螺杆菌感染的生物制品中的应用。
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