CN1927394A - 口服重组幽门螺杆菌疫苗及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于预防人幽门螺杆菌感染的重组幽门螺杆菌粘膜疫苗及疫苗的制备方法，该疫苗主要由肠产毒性大肠杆菌LT的A2亚单位与B亚单位融合成的LTA2B和尿素酶B亚单位构成。

Description

口服重组幽门螺杆菌疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物制药领域，尤其涉及一种用于人幽门螺杆菌感染免疫预防的基因工程疫苗及其制备方法。
背景技术
2005年度诺贝尔医学/生理学奖授予了两位发现幽门螺杆菌的科学家，因为幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是人类上消化道疾病的重要致病菌，为慢性胃炎、胃溃疡及十二指肠溃疡的主要病因。世界卫生组织(WHO)确认其与胃癌密切相关的病原菌，同时将其列为第一级致癌因子。Hp是世界上感染率最高的细菌之一，世界人口的平均感染率达50％，发展中国家的感染率更高，中国Hp感染者达6亿，每年因为胃癌死亡者达20万人。人类健康正面临着Hp的严重威胁与危害。目前抗生素治疗Hp感染虽具有积极的临床意义，但仍存在明显不足：1)毒副作用；2)耐药菌株产生；3)费用高；4)疗程长，患者依顺性差；5)疗效欠稳定等。疫苗是控制感染性疾病最为经济有效的办法，通过疫苗刺激机体产生不同于自然感染导致的特异性免疫应答，可以达到预防或者治疗Hp感染的目的。由于Hp大规模培养困难，粗制抗原中有潜在致癌物等有害成分，大大制约了全菌疫苗的研究进展。基因工程疫苗具有安全、有效、价格低廉等特点，易于推广和应用，是Hp疫苗的一个主攻方向。国内外竟相研究Hp疫苗，但迄今尚未成功。
尿素酶是一种催化尿素水解成氨和碳酸的镍依赖性酶，为幽门螺杆菌中表达最丰富的蛋白质，在Hp细胞内和细胞膜上都有分布，占Hp总蛋白的5％-10％。尿素酶通过中和胃酸帮助细菌在胃内的定居并为细菌蛋白质合成提供氨。宿主组织可直接受到尿素酶介导的氨产生的损伤，或间接受到尿素酶诱导的炎性反应的刺激作用的损伤。阻断尿素酶基因的表达将抑制幽门螺杆菌在宿主内的定居、减少细菌蛋白质合成，并降低与幽门螺杆菌相关的炎性反应。在Hp感染患者中，尤其是有症状的患者中都能够检测到尿素酶B的抗体，抗体水平与病情的严重程度有一定的相关性。口服接种幽门螺杆菌尿素酶或重组尿素酶B亚单位(rUreB)可保护小鼠免受幽门螺杆菌的感染并可消除已存在的感染(Michetti etal.，Gastroenterol.1994)。尿素酶活性在Hp感染中具有重要作用，缺失尿素酶活性的Hp在动物模型中不能导致感染，中和尿素酶活性的抗体可能在抵抗Hp定植中起关键作用。从以上的研究结果可以认为尿素酶抗体，尤其是能够中和尿素酶活性的抗体，在抵抗Hp感染中发挥着主要作用。
粘膜免疫系统是机体免疫系统的重要组成部分，主要包括肠粘膜相关淋巴组织和支气管粘膜相关淋巴组织等，它在机体防御功能方面发挥着独特的作用。由肠系膜淋巴结，以及分散在粘膜固有层和肠上皮中的大量淋巴细胞组成免疫诱导部位和免疫效应部位。胃肠道等粘膜表面各种免疫细胞通过摄取、加工和提呈抗原，产生并分泌针对该抗原的抗体(主要为sIgA)，后者能与携带此抗原的载体如细菌、病毒等发生特异性结合反应，阻止其定植粘膜表面或侵袭机体，从而起到一定的免疫防御作用。
但是，粘膜免疫的最大缺陷是易对抗原产生免疫耐受，即使提高抗原量，机体或粘膜产生的抗原特异性sIgA水平却很低，对相应抗原的微生物感染几乎没有免疫防御能力或极弱、极易导致免疫耐受性的发生。不耐热肠毒素(heatlabile toxin，LT)是由肠产毒性大肠杆菌(enterotoxigenic escherichiacoli，ETEC)产生、能引起人和某些家畜严重腹泻的一种不耐热肠毒素，近年来被认为是非常有前景的粘膜免疫佐剂。Rollwagen等研究表明，LT可以加强弯曲菌的粘膜免疫应答，并加速肠道对该菌的清除，而且LT与抗原一起初次免疫动物后，将长期不会对该抗原产生免疫耐受。
LT作为粘膜免疫佐剂的观点已获公认(Lycke N，et al.Immunology，1986，59(2)：301-308；Clements JD，et al.Vaccine，1988，6(3)：269-277；Giuliani MM，et al.J.Exp.Med.，1998，187(7)：1123-1132)，但LT具有很强的肠毒性，所以目前主要以其B亚单位或构建LT无毒和低毒突变体作佐剂(Yamamoto M，et al.J.Immunol.，1999，162：7015-7021；Martin M，et al.J.Immunol.，2002，169(4)：1744-1752；TamuraSI，et al.Vaccine，1994，12：1238-1240)。但是，LT的A亚单位除了ADP核糖基酶活性外，还与佐剂活性相有关(Giuliani MM，et al.J.Exp.Med.，1998)。LTA链刺激粘膜相关B细胞的同型转换，同时LTA参与粘膜免疫系统的初始阶段，使定型的IgA B细胞从产生部位迁移到远端效应位点(DeHann L，et al.Vaccine，1996；(4)：260-266)。De Haan等发现缺乏ADP-核糖基酶活性的LT突变体仍存在辅佐性，这些结果表示LT的辅佐性不依赖于ADP-核糖基活性，而A亚单位对LT的佐剂活性具有贡献。De Haan实验还表明：没有毒性活性的LT突变体通过鼻腔粘膜免疫小鼠仍然保留野生型毒素的免疫特性，但单独使用重组LTB比无毒性活性的LT突变体的免疫原性弱(De Haan L，et al.Infect Immun，1996)，说明LTA的ADP核糖基酶活性与毒素的免疫性没有直接联系。此外，LT全毒素产生高水平的全身的IgG和粘膜S-IgA反应，而等量LTB仅产生低水平的IgG反应，LT比LTB的免疫原性强，说明LTA在毒素的免疫反应中起重要作用。
LT由1个A亚单位(LtA)和5个B亚单(LtB)位组成。5个完全相同的LtB在空间上形成环状五聚体，1个LtA位于环状五聚体中央，其C-端以非共价键与LtB结合。A亚单位分为A1和A2两个组成，A1是毒素的毒性部分，A2与B亚单位结合在一起，A1与A2间有二硫键连结。胞浆中的A、B亚单位均以携带信号肽的前体形式存在，当穿越细胞膜后才组装成完整的LT。B亚单位的作用是与真核细胞表面的GM1-神经节苷脂受体特异性结合，使LT分子变构，A亚单位脱离B亚单位进入细胞膜，随后二硫键降解，A1肽链活化，A1亚单位具有GTP依赖的ADP-核糖基化转移酶活性，通过G蛋白介导的ADP-核糖基化反应破坏胞内cAMP的降解与平衡，刺激cAMP水平增高，从而引发毒素效应。
综上所述，本领域特别需要提供一种以肠产毒性大肠杆菌LT的A2亚单位与B亚单位融合成的LTA2B作为粘膜免疫佐剂的、对幽门螺杆菌感染具有更强、更完全的保护效果的重组Hp亚单位分子内佐剂疫苗。
发明内容
本发明的一个目的是公开一种人幽门螺杆菌感染免疫预防用的重组幽门螺杆菌分子内佐剂粘膜疫苗。
本发明的另一个目的是提供上述人幽门螺杆菌感染免疫预防用的重组幽门螺杆菌分子内佐剂疫苗的设计、制备、生产工艺、动物实验及临床实验研究。
为达到上述目的，本发明提供的一种人幽门螺杆菌感染预防和治疗用的疫苗包含有由肠产毒性大肠杆菌LT的A2亚单位与B亚单位融合的LTA2B粘膜免疫佐剂和作为免疫原的尿素酶B亚单位。LTA2B缺少LT分子中具有ADP核糖基酶活性的A1部分，克服LT佐剂的毒副作用，同时在当前常用佐剂LTB的基础上，LTA2B首次增加LT的A2部分，可以提高佐剂活性和免疫原性。
本发明一较佳实施例中，还证实了该疫苗所含的UreB-LTA2B融合蛋白具有全长UreB相似的生物学活性和免疫原性及反应原性，同时具有增强粘膜佐剂活性的功能。
为了更好地达到上述目的，该疫苗制备过程中选用可降解的缓释微球(MS)包裹重组融合蛋白。首先，缓释微球可以有效防止胃酸以及消化道酶类物质对抗原的分解及破坏作用，保持抗原物质的整体稳定性及抗原活性；其次，MS粒径大小决定了其在体内各器官的分布，人为把握MS制作工艺，将其粒径控制在一定范围之内并定向诱导其被靶器官俘获，从而最大限度的发挥其免疫效力；包裹抗原时，通过改变载体材料与抗原的配成比例、调节载体材料的生物降解作用，从而改变MS的制作孔径以及抗原物质和MS的粘附作用，达到长期缓释抗原的功效。其中，上述包裹制剂主要由海藻酸钠、植物油、CaCl2和壳聚糖组成。
上述疫苗最后开发为口服免疫冻干制剂，其冻干制品的赋形剂为8％甘露醇，稳定剂为0.05％EDTA-Na2，最适pH值为10.0因为口服有如下优点：一是疫苗抗原成分直接刺激胃肠道粘膜相关的淋巴细胞，通过对肠道抗原的识别、呈递和免疫效应产生相关的粘膜免疫应答，达到有效预防幽门螺杆菌感染所致相关疾病；二是口服免疫属于无痛、无创、便利、成本较低、易于被受试者接受。
本发明提供的一种制备人幽门螺杆菌感染预防和治疗用的疫苗的方法主要包括以下步骤：
(1)分别克隆幽门螺杆菌尿素酶B亚单位UreB和产毒性大肠杆菌不耐热肠毒素LTA2B的编码核苷酸序列，或与其95％以上同源且具有其蛋白活性的氨基酸序列的编码核苷酸序列；
(2)采用重叠PCR的方法，将步骤(1)中克隆得到的核苷酸序列连接成融合基因ltA2B-ureB，命名为lu；
(3)将lu融合基因构建到载体上，转化宿主，表达重组蛋白LU；
(4)步骤(3)具体为将lu融合基因构建到载体pET11c上，转化大肠杆菌BL21(DE3)，构建重组工程菌pET-11c-LU/BL21(DE3)。所得到的重组质粒中至少包含了上述lu氨基酸序列或与其95％以上同源且具有其蛋白活性的氨基酸序列的编码核苷酸序列
(5)从上述步骤(4)所述的重组工程菌用80L发酵罐发酵表达重组蛋白LU(LTA2B-UreB)
(6)分离纯化由步骤(5)得到的重组蛋白；
(7)将上述步骤(6)中所得蛋白制成包裹缓释物质的微球剂冻干品。
(8)步骤(7)的具体方法为取步骤(6)中所得蛋白与海藻酸钠溶液混匀，加入植物油，乳化后，反向滴定方法滴入到CaCl2溶液中，制成海藻酸钠包裹蛋白微球剂，将得微球固化后洗涤，离心取沉淀物后重悬；再将其加入到壳聚糖溶液中，形成再包裹，得到壳聚糖海藻酸钠双重包裹蛋白微球，再将微球混悬液缓慢倒入西林瓶中，液面高度低于1cm。-40℃冰箱预冻12小时后直接置于已预冷的真空干燥机内干燥，并缓慢提升温度使水分迅速升华，待气体压力指示计显示无气体生成时取出冻干品待检。
本发明一较佳实施例中将所得疫苗进行动物实验检测该重组幽门螺杆菌疫苗的安全性和免疫原性
本发明另一较佳实施例中对该疫苗进行人体临床实验验证重组幽门螺杆菌疫苗的免疫效果。
综上所述，本发明以肠产毒性大肠杆菌LT的A2亚单位与B亚单位融合成的LTA2B作为粘膜免疫分子内佐剂、以尿素酶B亚单位为免疫原组成重组幽门螺杆菌疫苗，用于人幽门螺杆菌感染免疫预防，安全有效。
为让本发明的上述目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。
附图说明
图1为重叠延伸方法得到的lu(ltA2B-ureB)融合基因的琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道1为ureB基因的PCR扩增产物；泳道2为核酸(DNA)分子量标准(Marker)；泳道3为ltA2B融合基因的PCR扩增产物。
图2pET-11c-LU重组质粒的酶切鉴定，其中M1.PCR Marker；1.ltB PCR产物(0.4kb)；2.ureB PCR产物(1.7kb)；3.LU PCR产物(2.0kb)；4.pET-11c NdeI酶切(5.7kb)；5.pET-11c-LU NdeI酶切(5.7kb+2.0kb)；6.pET-11c-LU正向重组子BamHI酶切(6.0kb+1.0kb+0.7kb)；7.pET-11c-LU反向重组子BamHI酶切(6.4kb+1.0kb+0.3kb)；M2.λDNA/HindIII Marker。
图3是融合基因LU重组菌表达PAGE电泳图，其中泳道1：基因重组菌诱导5小时；泳道2：空质粒菌诱导1小时；泳道3：蛋白质分子量标准(Marker)。从中可见，基因重组菌经过诱导后在分子量7.2KDa处有增加的蛋白表达条带，与目的蛋白分子量一致。经过UVP图像扫描分析，诱导5小时目的蛋白表达量约26％。
图4为目的蛋白LU纯化效果PAGE电泳图，其中，泳道1：蛋白质分子量标准(Marker)；泳道2：包涵体溶解液(纯化前样品)空；泳道3，4，5，6，7，8，9：目的蛋白洗脱峰样品。结果显示经过纯化步骤，目的蛋白的纯度得到明显改善，收获的目的蛋白峰经UVP扫描分析纯度达到85-99％。
图5rHp(重组幽门螺杆菌疫苗)疫苗冻干曲线。
具体实施方式
实施例1融合基因lu(ltA2B-ureB)的构建
一、幽门螺杆菌的UreB和产毒大肠杆菌LTB编码基因的克隆
分别以野生型产毒大肠杆菌H44815(购自中国药品生物制品检定所，本室保存)的基因组DNA，及幽门螺杆菌CC59803(本室分离保存)的基因组DNA为模板，用P1和P2、P3和P4扩增ureB和ltA2B基因，细菌基因组抽提按常规方法(颜子颖，王海林译.精编分子生物学实验指南.科学出版社，1998，P39)进行。PCR扩增体系为：10×不含镁离子扩增缓冲液10μL，MgCl2(25mmol/L)10μL，dNTPs(2.5mmol/L each)8μL，上下游引物(P1和P2或P5和P6)各2μL，上述LTB基因组2μL，Ex-Taq DNA聚合酶(3单位/μL)1μL，加灭菌水至100μL。
PCR扩增反应：94℃预变性5分钟，94℃变性50s，60℃退火50s，72℃延伸50s，35个循环，72℃完全延伸10分钟。琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段。
(下划线的部分为相应的酶的识别序列)
P1： cat atg gct cct cag tct att aca gaa cta tgt tc
       NdeI
P2：tga tat cg g atc ctg agg gta gtt ttc cat act gat tgc c
                BamHI
P3：tac cct cag  gat ccg ata tca atg aaa aag att agc ag
                  BamHI
P4： cat atg cta gaa aat gct aaa gag ttg tgc caa gc
      NdeI
按常规方法(J.Sambrook，分子克隆，冷泉港实验室出版社1989聚丙烯酰胺凝胶电泳1.21-1.32)提取TA克隆转化菌株的质粒DNA，采用双脱氧末端终止法，对插入片段进行序列测定。
二、融合基因ltA2B-ureB的构建
分别回收ureB和ltA2B的PCR产物。以回收的ureB和ltA2B基因为模板，P1和P4为引物进行重叠延伸PCR反应。PCR扩增体系为：10×不含镁离子扩增缓冲液5μL，MgCl2(25mmol/L)4μL，dNTPs(25mmol/L)4μL，上下游引物(P7和P10)各1μL，上述ureB和ltA2B基因各2μL，Ex-Taq DNA聚合酶(5单位/μl)0.5μL，加灭菌水至50μL。
重叠延伸PCR扩增反应：94℃预变性5分钟，94℃变性60s，60℃退火60s，72℃延伸60s，35个循环，72℃完全延伸10分钟。琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段。
PCR产物的克隆及序列分析同前。
重叠延伸PCR反应体系
回收的ureB DNA片段            1μl
回收的ltA2B DNA片段           1μl
P1(5pmol/μl)                 2μl
P4(5pmol/μl)                 2μl
10×PCR缓冲液                 10μl
dNTPs(5mmol/L)                4μl
Taq plus DNA聚合酶(3U/μl)    1μl
ddH2O                        79μl
总体积                        100μl
将反应体系振荡混匀，离心处理后，加入20μl石蜡油。94℃预变性10分钟，94℃变性30秒，58℃退火45秒，72℃延伸1分钟，35个循环，72℃完全延伸10分钟。反应完毕后取3μl反应产物，1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物并回收目的基因片段ltA2B-ureB。采用PCR重叠延伸技术得到ltA2B-ureB融合基因片段。1％琼脂糖凝胶电泳分析(见图1)，图中所示片段大小与预计相符(1517bp)，初步判定为目的基因片段，并命名为ltA2B-ureB，如SEQ ID NO：1所示。图2中显示：融合基因片段大小与预计一致，表明重叠延伸得到融合基因。
实施例2重组工程菌pET-11c-LU/BL21(DE3)的构建
一.重组工程菌pET-11c-LU/BL21(DE3)的构建
将lu(ltA2B-ureB)融合基因扩增(PCR)产物经1.0％琼脂糖电泳、胶回收纯化后与载体pMD-18T连接，转化大肠杆菌DH5α，提取质粒，用NdeI酶切，1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
从pMD-18-lu/DH5α阳性重组菌中抽提质粒DNA，NdeI酶切，回收2.0kb luDNA片段与NdeI酶切且经过去磷酸化处理的pET-11c载体连接，转化E.coliDH5α，氨苄阳性LB平板筛选，挑取可疑菌落抽提质粒，NdeI酶切鉴定阳性重组子，BamHI酶切鉴定正反向。酶切鉴定结果如图2所示。阳性重组子质粒DNA经NdeI酶切后均产生5.7kb载体片段和2.0kb lu基因片段(第5泳道)，BamHI酶切后反向重组子产生6.4kb+1.0kb+0.3kb三个片段(第7泳道)，正向重组子产生6.0kb+1.0kb+0.7kb三个片段(第6泳道)。
有关操作具体步骤如下：
1)使用Omega公司提供的质粒抽提试剂盒，按照试剂盒使用说明书推荐的方法提取质粒DNA。
2)以常规琼脂糖凝胶电泳法：(1.0％琼脂糖凝胶，1×TAE缓冲液，120-150mA，电泳20-40分钟。50×TAE储存液配方：2.0mol/L Tris碱，1.0mol/LNaAc，0.1mol/LNa2EDTA；用冰醋酸调节pH8.3)分离质粒DNA。
3)质粒DNA的酶切鉴定：反应混合物包括：1μg质粒DNA；1μl 10×缓冲液(见上海生工公司产品说明书)；1μl限制性内切酶Nde I(10u/μl)；用双蒸水补齐至10μl。混合后37℃温育1-2小时。
4)琼脂糖电泳胶的目的DNA回收纯化：
在紫外灯下观察并切下琼脂糖凝胶上的目的DNA电泳带，移入1.5ml EP管。
加入Omega公司胶回收试剂盒的DNA结合缓冲液，65℃水浴使凝胶完全溶化并保持溶液pH在5.0～6.0之间。将溶胶液移入分离管，12000g离心1分钟，弃去收集管中的液体。
加入配套的洗涤缓冲液，12000g离心1分钟，弃去收集管中的液体。重复洗涤1次。
12000g离心1分钟，分离管移置另一干净1.5mlEP管，加入一定体积的TE缓冲液，65℃孵育10分钟，12000g离心1分钟，取一定量电泳，UVP紫外扫描仪检测回收纯化效果。
5)连接反应(使用上海生工公司连接试剂盒)
通过紫外分光光度计检测目的DNA片段和载体片段的浓度，根据外源片段与载体摩尔数比一般为1∶2～10的原则，设计连接反应体系如下：
目的DNA 1μl；质粒载体1～2μl；连接溶液5μl；ddH2O 2～3μl；总体积10μl。22℃连接反应12-16小时。
6)感受态菌的制备(CaCl2法)
无菌接种环蘸取-70℃冻存的细菌保种液，三线法划线接种于LB平板，37℃培养12～16小时。挑取单个菌落接种于2ml LB培养液中，37℃摇床培养12～16小时。将过夜培养的DH5α按1％比例转种至LB培养液中，37℃摇床培养至OD600为0.2～0.4小时，8000g离心5分钟收集细菌。加入1ml预冷的0.1M CaCl2重悬沉淀，冰水浴3小时。4℃ 8000g离心5分钟，弃上清。加入100μl了预冷的0.1M CaCl2悬浮沉淀，冰水浴1小时，备用。
7)用连接产物转化大肠杆菌宿主细胞
取感受态菌液100μl，加入连接反应产物；冰水浴60分钟，42℃水浴热休克100秒，迅速放置冰水浴1～2分钟。加100μlLB培养液，37℃摇床培养1小时。以8000g离心10分钟，吸弃100μl上清后混匀沉淀，各取50μl涂布平板，37℃孵箱培养过夜。
二.高效表达融合蛋白工程菌的构建及筛选
将含LU融合基因的重组表达质粒转化大肠杆菌BL21并提取质粒酶切鉴定。图2为pET-11c-LU/BL21(DE3)重组表达质粒的酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道1为pET-11c-LU/BL21(DE3)重组质粒NdeI酶切产物；泳道2为核酸(DNA)分子量标准(Marker)；泳道3为空载体质粒NdeI单酶切产物(5300bp)。酶切片段大小与设计一致，初步证明重组质粒构建成功。基因工程大肠杆菌BL21的感受态菌制备、转化及重组菌的质粒抽提酶切鉴定同前。
取鉴定无误的重组菌接种于3ml含卡那霉素的LB培养液中，37℃摇床培养过夜。次日将过夜培养的重组工程菌按1％的比例转种于20mL含卡那霉素的LB培养液中，37℃摇床培养2.5小时，以IPTG诱导5小时，SDS-PAGE检测融合蛋白的表达形式和表达量，筛选高效表达菌株，图3。
本发明还通过实验验证了UreB和LTA2B的稳定性及能否代替尿素酶B全长蛋白。采用PCR方法扩增目的UreB和LTA2B片段基因，并构建到原核表达载体pET-11c(+)上，转化宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)中，IPTG诱导稳定表达UreB-LTA2B融合蛋白。首先，ELISA及免疫印迹分析，证实重组UreB-LTA2B具有良好的免疫原性和反应原性；其次，纯化后的UreB-LTA2B免疫家兔，产生的抗体在体外能够中和尿素酶活性，表现出与天然HP的UreB相似的生物学活性；再者，重组UreB-LTA2B口服免疫BalB/c小鼠，能有效激发机体产生Th1、Th2平衡的免疫应答反应，与重组UreB(吴超，邹全明等.幽门螺杆菌UreB与大肠杆菌LTB基因融合及表达的研究。中华微生物学和免疫学杂志，2002，22(2)：175-179)一致；最后，小鼠攻毒保护试验表明，UreB-LTA2B的保护率为88.7％，明显高于全长UreB 68％的保护率。GM1-ELISA试验表明融合UreB-LTA2B无ADP核糖基酶活性，但保留了与神经节苷脂GM1相结合的生物学特性，小鼠攻毒保护试验表明，UreB-LTA2B的保护率，明显高于UreB-LTB74.1％和UreB与LTB物理混合组合78.6％的保护率。首次证实了UreB-LTA2B具有全长UreB相似的生物学活性和免疫原性及反应原性，同时具有增强粘膜佐剂活性的功能。
实施例3重组工程菌pET-11c-LU/BL21(DE3)的发酵
发酵工艺如下：采用德国B.Bron 80L发酵罐，发酵过程中种子菌10％比例接种；温度37℃；pH7.0，通过自动加入30％氨水使pH值保持恒定；转数起始设定为500rpm，随着菌体密度的增大、耗氧的升高，转数改为级联溶氧控制，即以PO2控制器为主控制器，搅拌控制器为伺服控制器；溶解氧浓度采用级联控制及负氧旁路控制，使其终浓度控制在45％-50％；在A600未达到2时不加补料，之后每0.5小时流加补料一次使葡萄糖、胰化蛋白胨和8％酵母抽提物的终浓度分别为0.5％、0.2％、和0.2％。在第4次补料后待葡萄糖浓度降为0.1％时加入IPTG 500μmol/L诱导4小时收菌；发酵过程在级联溶氧控制的分批培养基础上，流加补料。
发酵过程所用培养基为改良M9-CAA培养基，在M9-CAA的基础上添加0.6％酵母浸出液和2mg/L ZnCl2·4H2O、2mg/LCoCl2·4H2O、4mg/L FeSO4·16H2O、5mg/LH3BO3、1.6mg/LMnCl2·4H2O、4mg/L CuSO4而成。
发酵结束后回收菌液，4℃离心(8000g)15分钟。吸弃上清，收集细菌，称重后冻存备用。
结果：结果显示菌体产量均在75g/L以上。目的蛋白表达量均稳定在30％左右。证明此中试发酵工艺先进，工艺重复性及稳定性均达了较高水平。
实施例4重组蛋白LU(LTA2B-UreB)的纯化
1.包涵体提取：将高效表达的菌体5000g以TE缓冲液1∶10(W/V)比例悬浮，4℃预冷后采用细胞匀浆机使其混合均匀。采用高压均质机在压力为40-70Mpa的条件下进行破菌(共破菌4～6次)，破菌完毕后，取少量菌液涂片染色，显微镜下观察细胞的完整性，确保细胞破碎完全，随后以500g离心25分钟，弃沉淀，再以15,000g离心40分钟，弃上清收集沉淀。以1∶10(W/V)的比例分别用洗涤液A和B各洗涤2次。洗涤条件为：4℃搅拌20分钟，15,000g离心40分钟，收集包涵体沉淀；最后将包涵体用包涵体溶解液以1∶10(W/V)的比例混合，4℃搅拌3小时，15,000g离心45分钟，取上清作为下一步纯化的原料。
包涵体提取所用缓冲液：1)TE缓冲液：20mmol/L Tris，5mmol/L EDTA，pH8.0；2)包涵体洗涤液A：5mmol/L EDTA、20mmol/L Tris、1％Triton X-100，pH 8.0；3)包涵体洗涤液B：20mmol/L Tris、2mol/L Urea，pH 8.0；4)包涵体溶解液：1mmol/L EDTA、20mmol/L Tris、8mol/L尿素(pH 8.0)。
2.层析纯化：该步纯化确定为Q Sepharose HP阴离子交换柱及SephadexG-25柱层析纯化，中试纯化采用XK50/30柱，在KTA explorer100系统上进行纯化。由于KTA explorer100系统具有精确的自动化操作特点，通过编制程序，采用2套KTA explorer100进行连续自动化层析操作，每批rHp疫苗的中试产量可达40g。使用20mmol/L Tris，5mmol/L EDTA，pH 8.0对目的蛋白进行纯化，采用NaCl梯度洗脱。
3.经过Q Sepharose High Performance层析纯化的重组蛋白纯度达到80％以上，但有大量的盐和尿素存在，根据分子量的差异，故选用分子筛层析方法来脱盐和去除尿素，使用传统的分子筛填料Sephadex G-25medium。
4.纯化后的目的蛋白进行SDS-PAGE，检定其纯度最终获得的目的蛋白纯度＞80％，收率＞79％。
5.Lowry法检测蛋白浓度。
其中，步骤1所述采用生产或中试纯化中使用的高压破菌技术，破菌至细菌破解率大于98％，差速离心获得包涵体沉淀物。
步骤2所述亲和层析纯化填料选自Chelating Sepharose Fast Flow。
步骤3所述阴离子纯化填料选自Q Sepharose HP、Q Sepharose FF和QSepharose XL。
实施例5口服重组HP疫苗的制备
一.重组LU蛋白微球的制备
在室温下，将实施例4中制备的重组蛋白与2％的海藻酸钠溶液混匀，加入植物油，植物油与海藻酸钠AGS乳液的比例为2∶8。8000r/分钟乳化10分钟后逐滴滴入到CaCl2溶液中，800r/分钟搅拌30分钟后，形成O/W乳液，离心取沉淀物洗涤后重悬。将悬液加入到1％浓度的壳聚糖溶液中，800rpm×30分钟搅拌完成再包裹制备出壳聚糖-海藻酸钠包裹重组LU蛋白微球，离心洗涤3次后收集。
将上述微球混悬液缓慢倒入玻璃平皿中，液面高度低于1cm。-40℃冰箱预冻12小时后直接置于已预冷的真空干燥机内干燥，并缓慢提升温度使水分迅速升华，待气体压力指示计显示无气体生成时取出冻干品待检。
分别取洗涤离心后MS、冻干粉以及冻干粉复溶物微量涂于载玻片上，光镜下观察其冻干前后微球形态变化，离心洗涤后的微球大小形态规则；冻干后则呈不规则分布，形态呈现出杆状、梭状以及扁圆状等诸多不规则形状；而用等量蒸馏水复溶后镜下可见微球数量以及形态基本恢复冻干前原有特征。应用粒径分布仪进行检测，参照图4和图5。所制备MS表面饱满、大小均一，平均粒径为3.33μm。
二.重组LU蛋白微球溶液的冻干
经高度纯化的重组LU蛋白，经适当稀释配制后，再分装入冻干瓶进行冻干。通过研究获得了稳定成熟的rHp疫苗冻干曲线：制品预冻温度为-35℃，时间3小时；第一次升华温度为10℃，时间20小时；第二次升华温度为30℃，时间5小时，整个冻干过程共耗时28小时。水分含量均＜3％，符合《中华人民共和国药典》(2000年版)二部对冻干制品水分含量的检测要求。
通过较系统的冻干中试工艺研究，确定了rHp疫苗冻干制品的赋形剂为5-8％蔗糖、糊精及葡萄糖，最适pH值为7.0，并获得了成熟的冻干曲线等参数。经20余批次的反复验证表明，该中试冻干工艺性能稳定，能满足规模化生产的要求。以每支冻干瓶装量15mg计算，40g疫苗蛋白可装2 600支左右。所采用的5m2冻干机一次可冻干制备32mm直径的冻干瓶5 000支左右，能满足大批量制品冻干的需要。
本发明还研究了人工胃液对rHp疫苗稳定性的影响。rHp疫苗为口服免疫冻干制剂，在通过消化道到达靶器官的过程中，必须经过胃内酸性pH环境。由于rHp疫苗本身为蛋白质物质，易受酸作用而变性或酶降解，从而降低其免疫活性。研究发现，rHp疫苗蛋白在pH值为1和2的人工胃液中其抗原反应活性降低明显，蛋白降解显著，但在pH 3～7的环境中能够保持较高的抗原反应性及蛋白稳定性。该研究结果提示，在疫苗使用过程中，可以采取对胃酸进行中和的方法，适当提高胃内环境的pH值，以保持rHp疫苗蛋白的生物活性，从而获得良好的免疫效果。在口服重组疫苗的剂型上，建立了先进实用的抗胃酸、抗胃蛋白酶的多聚微囊包裹制剂工艺，克服了胃酸和胃蛋白酶的破坏，提高了疫苗的有效性和稳定性。
实施例6服重组HP疫苗的动物实验
一.动物安全性评价
LD50测定组各试验小鼠均未见异常反应，无中毒症状，无死亡发生，未测出LD50，同时经最大耐受剂量试验测出rHp疫苗口服的最大耐受剂量(MTD)大于150mg/kg(相当于推荐人体正常用药量的600倍)。在腹腔注射三批rHp疫苗后的观察期内，三批豚鼠均健存，未见异常毒性反应，至第7天体重均有正常增加。分别进行了以下试验，试验结果提示rHp疫苗安全性良好。
二.免疫原性研究
分别采用家兔、BALB/c小鼠和恒河猴观察了rHp疫苗的免疫原性。
1.rHp疫苗免疫接种家兔的免疫原性研究
将rHp疫苗免疫接种家兔后，经双向免疫扩散试验和ELISA检测，结果该疫苗可诱生家兔产生高效价的抗UreB的抗血清，证实rHp疫苗蛋白具有良好的免疫原性。
2.rHp疫苗免疫接种沙鼠的免疫原性研究
各组沙鼠于末次免疫后10天同时灌喂制备好的Hp菌液。所有实验动物提前24小时断食、断水，每次每只灌喂菌液0.3ml，约108cfu/ml(每毫升菌落形成数)；上、下午各一次，间隔6小时，末次灌喂后2小时供食水。攻毒后第4周所有实验动物均处死并采集标本，处死前24小时断食水，解剖沙鼠，取出鼠胃，沿胃大弯剖开，用生理盐水轻轻冲掉胃内残留物，将一半胃粘膜组织涂布Hp培养基，三线法划线接种，微需氧培养，本观察免疫后小鼠Hp的定植情况如表1。
表1融合蛋白口服免疫小鼠后攻毒免疫保护效果
组别   攻毒后存活数(只)   感染数(只)   保护率(％)
    PBS组(磷酸盐缓冲1液pH7.0)2 UreB组3 UreB+LTB组4 UreB+LTA2B组5 UreB-LTB组 2830292730 2720192124 -66.765.571.372.8
 6 UreB+LTA2B组     29    27     91.6
结果显示，LU免疫组小鼠的保护率达到90％以上。
结论：融合疫苗抗原LU免疫小鼠，与未免疫组相比可产生针对Hp全菌攻击有效的保护作用。
以融合蛋白与三个亚单位体外混合后肌肉注射免疫已经确定Hp感染的BalB/c小鼠模型，每0，2，4周各免疫一次，免疫剂量为100ug(100uL)/只与等体积铝佐剂混合。末次免疫后4周，处死小鼠，采集不用样本，以不同实验方法观察治疗后小鼠带菌情况。
表2多亚单位蛋白疫苗治疗Hp感染小鼠观察
组别 治疗后小鼠未检测到Hp只数 治疗后小鼠Hp量明显减少只数 定植数
LU治疗组(30只)两个亚单位混合组(30只)对照组(30只) 21230 971
两组结果经统计学分析，p＜0.001。说明疫苗抗原LU或者四个亚单位抗原体外混合后对已经感染小鼠进行免疫治疗后可有效减少小鼠带菌量或者能够清楚小鼠的感染。多亚单位疫苗抗原包括融合抗原LU对Hp感染有一定治疗作用。
3.rHp疫苗口服免疫恒河猴的实验研究
研究发现，恒河猴经rHp疫苗口服免疫后，血清中抗UreB IgG抗体和唾液中sIgA抗体水平均有明显升高，且维持到免疫后15周，表明该疫苗可诱导恒河猴产生显著的系统免疫反应和粘膜免疫反应。
为探讨疫苗剂量与免疫应答水平的关系，采用了三个不同的剂量进行口服免疫，结果显示0.5、2.0mg/kg剂量组诱导的系统及粘膜免疫应答水平均明显高于0.2mg/kg剂量组，而两个高剂量组间未见明显差异，提示该疫苗口服免疫恒河猴的最佳剂量为0.5mg/kg体重。
通过以上家兔、BALB/c小鼠及恒河猴动物试验，证实rHp疫苗可有效诱导机体的粘膜免疫应答，具有良好的免疫原性。
实施例7口服重组HP疫苗的人体实验
为表明本发明的治疗效果，本发明作了临床研究。本发明临床研究资料如下：
一.入选标准：
  1.自愿参加。
  2.经查问病史、体检和临床判定健康者。
  3.近期无幽门螺杆菌感染史。
  4.无同类疫苗接种史。
  5.无疫苗接种禁忌症。
二.疗效和安全性判定
(一)安全性判定
受试者仔服苗后进行30分钟的即时观察，并于6、24、48及72小时详细观察全身(体温)和局部(胃肠道)反应及它异常反应的发生情况(包括发热、大便形状及次数异常、腹泻、呕吐等)。
1.全身(体温)反应：
  无反应：体温在37℃及以下；
  轻度反应：体温在37.1℃～37.5℃；
  中度反应：体温在37.6℃～38.5℃；
  重度反应：体温在38.6℃或以上；
2.局部(胃肠道)反应：
  无反应：无胃肠道反应；
  轻度反应：经一般处理，胃肠道症状消失；
中、重度反应：需经多次处理或住院治疗；
(二)疗效判定
以全程免疫后14天抗体状态评价免疫原性，以全程免疫后60天观察抗体消长情况。血清特异性IgG以免疫前＜1∶100而免疫后≥1∶100为阳转；血清特异性总Ig、唾液特异性sIgA、粪便特异性sIgA免疫后与免疫前滴度比值≥4倍者为转阳。
三.研究方法
分I、II期两个阶段进行。I期临床研究为非对照研究。II期临床研究为随机、双盲、对照研究。
四.研究对象
I期临床研究受试者对象共30名，其中男16名，女14名，最大年龄为13岁，最小年龄10岁，平均年龄为11.7岁。II期临床研究受试者对象共623名，其分组情况表：
  组别   受试人数   性别构成   平均年龄(岁)
  男   女
  安慰剂15mg/次30mg/次45mg/次合计   151148171153623   77698274317   74798979306   10.110.310.410.810.2
五.结果
15mg/次、30mg/次和45mg/次剂量的口服重组幽门螺杆菌疫苗对人体均具有良好的安全性，其中15mg/次剂量的口服重组幽门螺杆菌疫苗对人体更具有安全性。
15mg/次、30mg/次和45mg/次剂量的口服重组幽门螺杆菌疫苗对人体均能刺激人体产生较好的血清特异性IgG抗体、血清特异性总Ig抗体、唾液特异性sIgA抗体、粪便特异性sIgA抗体应答，各受试组产生抗体阳性率为80％以上，且持续时间较长，在全程免疫后两个月仍处于较高的水平。
                            序列表
<110>中国人民解放军第三军医大学
<120>口服重组幽门螺杆菌疫苗
<160>2289
<210>1
<211>2289
<212>DNA
<213>E.coli BL21(DE3)LU
<220>
<221>gene
<222>(1)...(42289)
<400>
GCTCC CCAGT CTATT ACAGA ACTAT GTTCG GAATA TCGCA ACACA CAAAT ATATA CGATA AATGA
CAAGA TACTA TCATA TACGG AATCG ATGGC AGGTA AAAGA GAAAT GGTTA TCATT
ACATTTAAGAGCGGCGCAACATTTCAGGTCGAAGTCCCGGGCAGTCAACATATAGACTCCCAAAAAA
AAGCCATTGAAAGGATGAAGGACACATTAAGAATCACATATCTGACCGAGACCAAAATTGATAAATTA
TGTGTATGGAATAATAAAACCCCCAATTCAATTGCGGCAATCAGTATGGAAAACTAGACAATTACAGAT
GATACTTGTAATGAGGAGACCCAGAATCTGAGCACAATATATCTCAGGAAATATCAATCAAAAGTTAA
GAGGCAGATATTTTCAGACTATCAGTCAGAGGTTGACATATATAACAGAATTCGGGATGAATTATGAAA
AAG ATT AGC AGA AAA GAA TAT GTT TCT ATG TAT GGC CCT ACT ACA GGC GAT AAA GTG AGA TTG GGC GAT ACA
GAT TTG ATC GCT GAA GTA GAA CAT GAC TAC ACC ATT TAT GGC GAA GAG CTA AAA TTT GGT GGC GGT AAA ACT
TTA AGA GAA GGC ATG AGC CAA TCC AGC AAC CCC AGC AAA GAA GAA CTG GAT TTA ATC ATC ACT AAC GCT TTA
ATC GTG GAT TAC ACC GGT ATT TAT AAA GCG GAT ATT GGT ATT AAA GAT GGC AAA ATC GCT GGC ATT GGC AAA
GGC GGT AAC AAA GAC ATG CAA GAT GGC GTT AAA AAC AAT CTT AGC GTG GGT CCT GCT ACT GAA GCC TTA
GCT GGT GAA GGT TTG ATC GTA ACT GCT GGC GGT ATT GAC ACA CAC ATC CAC TTC ATC TCC CCC CAA CAA ATC
CCT ACA GCT TTT GCA AGC GGT GTA ACA ACT ATG ATT GGT GGC GGA ACT GGC CCT GCT GAT GGC ACT AAC GCA
ACC ACT ATC ACT CCA GGC AGA AGA AAT TTA AAA TGG ATG CTC AGA GCG GCT GAA GAA TAT TCT ATG AAC TTA
GGT TTC TTA GCT AAA GGT AAC ACT TCT AAC GAT GCG AGC TTA GCC GAT CAA ATT GAA GCC GGT GCG ATT GGT
TTT AAA ATC CAC GAA GAC TGG GGA ACA ACT CCT TCT GCA ATC AAC CAT GCG TTA GAT GTT GCG GAC AAA TAC
GAT GTG CAA GTC GCT ATC CAC ACA GAC ACT TTG AAT GAA GCC GGT TGT GTA GAA GAC ACT ATG GCA GCC ATT
GCC GGG CGC ACT ATG CAC ACT TTC CAC ACT GAA GGT GCT GGT GGT GGA CAC GCT CCT GAT ATT ATT AAA GTG
GCC GGC GAA CAC AAC ATT CTG CCC GCT TCC ACT AAC CCC ACT ATC CCT TTC ACC GTG AAT ACA GAA GCA
GAA CAC ATG GAC ATG CTT ATG GTG TGC CAC CAC TTG GAT AAA AGC ATT AAA GAA GAT GTT CAG TTC GCT GAT
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<400>6
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Claims (6)

1.一种以肠产毒性大肠杆菌LT的A2亚单位与B亚单位融合成的LTA2B作为粘膜免疫佐剂、以尿素酶B亚单位为免疫原的重组幽门螺杆菌疫苗。
2.根据权利要求1所述的重组疫苗，其中所述的疫苗为口服免疫冻干制剂。
3.根据权利要求2所述的的重组疫苗，其中所述的疫苗冻干制品的赋形剂为8％甘露醇，稳定剂为0.05％EDTA-Na2，最适pH值为10.0。
4.根据权利要求1所述的的重组疫苗，其中所述的疫苗制备过程中选用可降解的缓释微球包裹重组融合蛋白。
5.根据权利要求4所述的的重组疫苗，其中所述的疫苗的包裹制剂由海藻酸钠、植物油、CaCl2和壳聚糖组成。
6.一种制备口服重组幽门螺杆菌疫苗疫的方法，其包括以下步骤：
(1)分别克隆幽门螺杆菌尿素酶B亚单位UreB和产毒性大肠杆菌不耐热肠毒素LTA2B的编码核苷酸序列，或与其95％以上同源且具有其蛋白活性的氨基酸序列的编码核苷酸序列；
(2)采用重叠PCR的方法，将步骤(1)中克隆得到的核苷酸序列连接成融合基因lu(ltA2B-ureB)；
(3)将lu融合基因构建到载体上，转化宿主，表达重组蛋白LU(LTA2B-UreB)；
(4)分离纯化由步骤(3)得到的重组蛋白；
(5)将上述步骤(4)中所得蛋白制成包裹缓释物质的微球剂冻干品。
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