KR20090053849A - 경구용 재조합 헬리코박터 파일로리 백신 및 그의 제조방법 - Google Patents

경구용 재조합 헬리코박터 파일로리 백신 및 그의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 헬리코박터 파일로리 감염의 면역예방용으로 이용하는 재조합 단백질 및 이로부터 제조된 분해성 서방성 미소구체-캡슐화된 경구용 백신 제제, 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 상술한 재조합 단백질은 장독성 대장균의 LT의 A2 서브유니트와 B 서브유니트 및 우레아제 B 서브유니트로 구성된다. 인간 헬리코박터 파일로리 감염에 사용한 본 발명에 따른 백신은 안전하고 효과적이며 경구 수용에 편리하다.

Description

경구용 재조합 헬리코박터 파일로리 백신 및 그의 제조방법 {ORAL RECOMBINANT HELICOBACTER PYLORI VACCINE AND PREPARING METHOD THEREOF}
본 발명은 생물약제학 분야, 특히 인간 헬리코박터 파일로리 감염의 면역예방용으로 사용되는 재조합 단백질 및 상기 재조합 단백질로부터 제조되는 것으로서 분해성 미소구체에 캡슐화된 서방성 경구용 백신 제제과 그의 제조방법에 관한 것이다.
2005년 노벨 의학/생리학상은 헬리코박터 파일로리균 (Hp)을 발견한 두명의 과학자에게 돌아갔다. 헬리코박터 파일로리균은 인간의 상부 소화관의 질환을 일으키는 중요한 병원균이면서 만성 위염, 위궤양 및 십이지장 궤양의 주요인으로 간주되고 있다. 세계 보건기구 (WHO)에 따르면, 위암과 밀접한 관계가 있는 병원균으로 확인된 헬리코박터 파일로리는 주요 발암 요인으로 분류되어 있다. Hp 는 전세계적으로 감염율이 높은 박테리아중 하나로서, 그 감염율은 현재 전인구의 50%에 달하며 개발도상국에서는 더 높은 것으로 알려져 있다. 중국의 경우 현재 6억명 정도가 Hp에 감염되어 있으며, 해마다 20여만명이 위암으로 사망한다. 그러므로, Hp는 인류의 건강을 크게 위협하고 있다. 긍정적인 치료 측면에도 불구하고 현재의 Hp 감염에 대한 항생제 요법은 다음과 같은 몇가지 중대한 문제점을 안고 있다: (1) 독성 및 부작용; (2) 약물에 대한 저항성; (3) 고비용; (4) 장기간의 투여 주기 및 환자의 순응성 열화; 및 (5) 불안정한 치료 효과. 한편, 백신은 감염 질환을 제어하는데 있어서 가장 비용대비 효율적인 수단으로 인정되고 있다. 체내에서 특정 면역 반응을 유도함으로써, 백신 접종은 Hp 감염의 예방 혹은 치료에 이용할 수 있다. 전(全)세포 백신에 대한 연구는 대규모 Hp 배양의 난점 및 초기 항원 내의 잠재적 발암 인자의 존재로 인해 한계가 있는 반면, 안전성, 효율, 저비용, 촉진 및 이용상의 용이성 등으로 인해서, 유전자 가공된 백신의 개발이 주된 경향이 되었다. 국내 및 해외에서 행한 수많은 연구에도 불구하고, 아직 Hp 백신의 개발은 성공하지 못하였다.
니켈계 효소인 우레아제는 요소가 암모니아와 카르복실산으로 가수분해될 때 촉매역할을 하며, 대부분 세포내 및 세포막 상에 있는 헬리코박터 파일로리 내에서 발현하는 풍부한 단백질로서 총 Hp 단백질의 5 내지 10%를 차지한다. 우레아제는 요소를 분해하여 암모니아를 생성함으로써 위산을 중화시켜 박테리아가 위내에서 집락(colony)을 형성하는 것을 도우며, 또한 박테리아 단백질 합성을 위해 암모니아를 공급하는 역할을 한다. 따라서, Hp 숙주 조직은 암모니아에 의해 직접적인 손상을 입거나 혹은 우레아제-유래의 염증 반응에 의해 간접적인 손상을 입는다. 우레아제 유전자 발현을 차단하면 숙주내 헬리코박터 파일로리의 집락화를 저해하고 박테리아 단백질 합성을 감소시키며, 또한 헬리코박터 파일로리 관련 염증 반응을 저하시킬 수 있다. 우레아제 B 항체는 Hp 감염 환자, 특히 그 증상이 뚜렷한 환자에게서 검출되며, 항체 수준은 질병 상태의 위중도와 대체로 관련이 있다. 헬리코 박터 파일로리 우레아제 혹은 재조합 우레아제 B 서브유니트 (rUreB)를 경구 주입시, 생쥐의 헬리코박터 파일로리 감염을 예방할 수 있으며, 또한 그 사전 감염을 없앨 수 있다 (Michetti et al., Gastroenterol, 1994). 우레아제 활성이 없는 Hp는 동물 모델에서 감염을 나타내지 않으므로, 상기 우레아제의 활성은 Hp 감염에 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 따라서, 우레아제 활성을 중화시키는 항체는 Hp 집락화를 저지하는데 핵심적인 역할을 할 수 있다. 이같은 발견에서, 우레아제 항체, 특히 우레아제의 활성을 중화시킬 수 있는 항체는 Hp 감염을 저지하는 것을 주된 역할로 하는 것을 알 수 있다.
점막형 면역계(mucosal immune system)는 인체의 면역계의 중요한 부분으로서, 주로 점막-관련 림프구 조직과 기관지-관련 림프구 조직 등을 포함하며, 인체 방어 기능에 관한 특수한 작용을 한다. 장간막의 림프절 및 점막 고유층과 장내 상피조직에 분포된 대량의 림프구 세포가 면역 유발 위치 및 면역 작용 위치를 구성한다. 항원의 흡수, 처리 및 추출을 통하여, 위장 점막 등의 표면에 있는 각종 면역세포가 항원 특이적 항체 (주로 sIgA)를 생성 분비하며, 이들 항체는 항원 운반 박테리아나 바이러스 벡터와 특이적으로 결합하여 이들이 점막의 표면에서 집락화하는 것을 방해하거나 혹은 체내 침투를 저지함으로써, 특정 면역 방어기능을 발휘하는 것이다.
그러나, 점막형 면역계의 가장 심각한 결점은 항원에 대한 면역 내성을 일으키기 쉽다는 것이다. 항원의 레벨이 높아도 인체나 점막에서 생성되는 항원 특이적 sIgA의 레벨은 매우 낮은 수준을 벗어나지 못하며, 항원 운반 미생물의 감염에 대 한 면역 방어력도 열악하다.
이열성 (heat-labile) 독소 (LT)는 장독성 대장균 (enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC)에 의해 생성되고 인체 및 일부 가축에게서 심함 설사를 유발할 수 있는 이열성 엔테로톡신이다. LT는 하나의 A 서브유니트 (LTA) 및 다섯개의 B 서브유니트 (LTB)로 구성된다. 공간 측면에서 5개의 동일한 LTB가 원형 펜타머(오량체)을 형성하며 그 중심에는 비공유결합을 통해 LTB와 결합된 C 말단을 가진 LTA가 위치한다. A 서브유니트는 이황화물 결합에 의해 서로 연결된 2개의 서브유니트 (A1 및 A2)로 구성되고, 여기서 A1은 독소의 독성부이며 A2는 B 서브유니트와 결합한다. 세포질 내의 모든 A 및 B 서브유니트는 신호 단백질을 운반하는 전구체 형태로 존재하며 세포막을 통과한 후 완전한 LT 속에만 접착한다. B 서브유니트는 진핵세포의 표면에서 GM1 강글리오시드 수용체와 특이적 결합하여 LT 분자의 배위 전이를 가져오는 역할을 하고; A 서브유니트는 B 서브유니트에서 분해되고, 세포막으로 들어가서 이황화물 결합 분해 작용 및 A1 펩티드 사슬 활성화 작용을 거치며; 또한 A1 서브유니트는 GTP-독립형 ADP 리보실화 전달효소의 활성을 가지므로, G 단백질 조절된 ADP 리보실화 반응을 통해 세포내 cAMP의 분해 및 균형을 파괴하고 cAMP 레벨의 증가를 촉발함으로써, 결국 독성 효과를 유발한다.
최근 LT는 점막형 면역 보강제(보조제)로서 기대를 모으고 있다. Rollwagen 등의 연구에 따르면, LT는 캄필로박테리아에 대한 점막성 면역 반응을 강화하고 장내 박테리아의 제거를 촉진할 수 있으며; 또한 LT 및 항원으로 초기 면역화된 동물은 장기간 관찰시에도 상기 항원에 대한 면역 내성을 보이지 않는 것으로 밝혀졌 다.
LT를 점막형 면역보강제(mucosal immune adjuvant)로 사용할 수 있다는 관점은 현재 광범위하게 수용되고 있다 (Lycke N, et al. immunology, 1986, 59(2):301-308; Clements JD, et al. Vaccine, 1988, 6(3):269-277; Giuliani MM, et al. J. Exp. Med., 1998, 187(7):1123-1132). LT는 매우 강한 장내 독성을 갖기 때문에, 이의 B 서브유니트 혹은 조성된 비독성 또는 저독성 LT 변이체는 주로 보강제로 이용되었다 (Yamamoto M, et al. J. Immunol., 1999, 162:7015-7021; Martin M, et al. J. Immunol., 2002, 169(4):1744-1752; Tamura SI, et al. Vaccine, 1994, 12:1238-1240). 그러나, LT의 A 서브유니트는 이의 ADP-리보실 효소 활성과 더불어 보강제 활성에도 관계가 있다 (Giuliani MM, et al. J. Exp. Med., 1998). LTA 사슬은 점막-관련 B 세포의 동형전환을 자극하는 한편, LTA는 점막형 면역 반응의 초기 단계에 관여하여 고정형 IgA B 세포가 생성 위치에서 원거리 효과 위치로 이동하도록 만든다 (DeHaan L, et al. Vaccine, 1996;(4):260-266). De Haan 등은 ADP-리보실 효소 활성이 결핍된 LT 변이체가 여전히 보강제 활성을 유지하고 있음을 발견하였고, 따라서 이러한 LT의 보강제 활성이 ADP-리보실 효소 활성을 가진 A1 서브유니트와 무관한 반면, A2 서브유니트는 LT의 보강제 활성에 기여할 수 있음을 제시한다. 또한 De Haan의 실험에서, 비강 점막을 통하여 생쥐를 면역 처리하면, 독성 활성이 없는 LT 변이체는 야생형 독소의 면역 성질을 지속적으로 유지하는 것을 확인하였다. 재조합 LTB의 단독 사용은, 독성 활성이 없는 LT 변이체보다 면역원성이 떨어지는 것으로 나타나며(De Haan L, et al. Infect Immun, 1996), 따라서 LTA의 ADP-리보실 효소 활성이 독소의 면역성에 직접적인 관계가 없다고 주장한다. 또한, LT 전체 독소는 고레벨의 계통적 IgG와 점막형 S-IgA 반응을 생성하며, 등량의 LTB는 저레벨의 IgG 반응을 일으키는데 불과하다. LT의 면역원성이 LTB 보다 강하다는 사실은 LTA가 독소의 면역반응에서 중요한 역할을 하는 것을 가리킨다. A1 서브유니트가 가진 GTP-의존형 ADP-리보실 전달효소 활성이 독성 효과와 관련이 있는 반면, LTA의 보강제 효과는 주로 LTA2 서브유니트에서 얻어지는 것으로 유추된다.
LTB는 현재 면역학적 보강제로 이용되고 있다. 예를 들어, LTB는 UreB와 융합하여 재조합 단백질 LTB-UreB를 형성하며 (Wuchao, Zou quanming 등, "헬리코박터 파일로리 UreB 및 대장균 LTB 유전자의 융합 및 발현에 대한 연구" Chinese Journal of Microbiology and Immunology, 2002, 22(2):175-179), 또한 분자내 보강제 백신으로 조제될 수도 있다. 그러나 재조합 단백질의 면역보호율은 아직 적절한 수준에 도달하지 못하였다.
상술한 내용에 근거하여, 종래의 방식대로 투여할 수 있으면서 헬리코박터 파일로리 감염에 대해 완전하고 강력한 예방 효과를 가진 재조합 Hp 서브유니트 분자내 애주반트 백신이 당해 분야에서 크게 요망되고 있다.
본 발명의 목적 중 하나는 인간 헬리코박터 파일로리 감염의 면역예방 및 치료용으로 이용하는 재조합 단백질을 제공하는 것으로서, 이 재조합 단백질은 인간 헬리코박터 파일로리 감염의 면역예방용으로 사용되는 재조합 헬리코박터 파일로리 백신으로 조제할 수 있다.
본 발명의 다른 목적은 인간 헬리코박터 파일로리 감염의 면역예방 및 치료용으로 사용되는 상술한 재조합 단백질을 조제하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 인간 헬리코박터 파일로리 감염의 면역예방 및 치료를 위한 것으로서, 상술한 바와 같이 인간 헬리코박터 파일로리 감염의 면역예방 및 치료를 위한 재조합 단백질을 포함하는 재조합 헬리코박터 파일로리 백신을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 인간 헬리코박터 파일로리 감염의 면역예방 및 치료를 위한 상술한 재조합 헬리코박터 파일로리 백신의 제조방법을 제공하는 것이다.
상술한 목적을 실현하기 위하여, 본 발명은 인간 헬리코박터 파일로리 감염의 면역예방 및 치료를 위한 재조합 단백질을 제공한다. 이 재조합 단백질 (LTA2B-UreB, 약칭하여 LU로 표시)은 장독성(enterotoxigenic) 대장균의 LT의 A2 서브유니트 및 B 서브유니트와 또한 헬리코박터 파일로리 우레아제 B 서브유니트를 융합시켜 얻는다. 재조합 단백질에서, LTA2B는 분자내 점막형 면역보강제로 이용되며 UreB는 면역원 역할을 한다. LTA2B는 LT 분자의 ADP-리보실 효소 활성을 가진 A1 부분이 결핍되어 있으므로, LT 보강제의 독성 효과 및 부작용을 극복할 수 있다. 한편, 통용되는 보강제 LTB와 비교시, LTA2B는 LT의 A2 부분에 최초로 첨가되어 그 보강제 활성 및 면역원성을 향상시킨다.
본 발명의 한 구현예에서, LTA2B-UreB 융합 단백질은 전장(full-length) UreB와 유사한 생체 활성, 면역원성 및 반응원성을 가지며, 또한 점막형 보강제의 활성을 개선하는 역할을 한다.
본 발명은 또한 인간 헬리코박터 파일로리 감염의 면역예방 및 치료 용도의 서방성 미소구체-캡슐화된 경구용 제제를 제공하며, 이 제제는 인간 헬리코박터 파일로리 감염의 면역예방 및 치료용으로 이용하는 상술한 재조합 단백질을 캡슐화한 것이다.
본 발명은 상술한 재조합 융합 단백질을 캡슐화하는 분해성의 서방성 미소구체 (microspheres, MS)를 사용한다. 먼저, 서방성 미소구체는 위산 및 소화관내 효소에 의해 항원이 분해 및 파괴되는 것을 효과적으로 방지하여 항원의 전체 안정성 및 활성을 유지할 수 있으며; 다음에, MS 입자 직경 크기는 여러 기관의 체내 분포를 결정하므로 MS 조제 공정을 조절하여 입경을 소정 범위 내에서 제어함으로써, 목적에 따라 타깃 기관으로 입자를 배향시켜 그 면역적 효능을 최대화할 수 있다. 항원을 캡슐화할 때 MS 입경 및 항원 물질과 MS 간의 접착 작용은 담체와 항원 및 생분해성 담체 물질 간의 상대비를 달리하여 변화시킬 수 있으며, 그 결과 항원이 장기간에 걸쳐서 지속적으로 천천히 방출되는 효과를 달성한다.
하나의 바람직한 구현예에서, 상기 캡슐화 물질은 알긴산염, 식물성 오일, 염화칼슘 및 키토산을 포함한다. 하나의 바람직한 구현예에서, 상기 미소구체-캡슐화된 제제의 입경은 3.33㎛ 이다.
하나의 바람직한 구현예에서, 상기 서방성 미소구체-캡슐화된 제제(slow-releasing microsphere-encapsuled preparation)는 경구 면역화 용도의 동결건조 제제로 최종 개발되며, 이 동결건조 제제의 부형제는 8% 만니톨이며 안정화제는 0.05% EDTA-Na2 이고, 또한 최적의 pH값은 10.0이다. 경구 투여는 다음과 같은 장점을 갖는다: 먼저, 백신의 항원 성분이 위장 점막-관련 림프 세포를 직접 자극하고 또한 장내 항원의 인지 및 표현 또한 면역 효과 등을 통해 이에 관한 점막형 면역 반응을 일으킴으로써, 헬리코박터 파일로리 감염에 의해 야기되는 관련 질환을 효과적으로 예방하는 목적을 달성한다; 다음에, 경구 면역화는 통증이 없는 비침입형 치료법(noninvasive therapy)이므로 편리하고 비용이 적으며, 실험자가 쉽게 순응할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 재조합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 제공하며, 이 서열은 장독성 대장균의 이열성 엔테로톡신의 A2 서브유니트의 암호화 유전자 및 B 서브유니트의 암호화 유전자, 또한 헬리코박터 파일로리의 우레아제 B의 암호화 유전자의 융합에 의해 형성된 ltA2B-ureB (줄여서 lu)이다.
본 발명은 또한 재조합 플라스미드를 제공하며, 이 플라스미드는 본원의 청구항 8에서와 같이 상술한 뉴클레오티드 서열을 플라스미드 pET-11c를 링크 결합시켜 형성한 것이다.
본 발명은 또한 청구항 1의 재조합 단백질의 제조방법을 제공하며 이 방법은:
(1) 헬리코박터 파일로리의 우레아제 B 서브유니트 UreB와 장독성 대장균의 이열성 엔테로톡신 LTA2B의 서브유니트의 암호화 뉴클레오티드 서열을 각각 클로닝하거나, 상기의 서열과 95%의 상동성을 갖고 또한 이들의 단백질 활성을 가진 아미노산 서열의 암호화 뉴클레오티드 서열을 클로닝하고;
(2) PCR 중복법(method of overlapping PCR)을 통해 상기 단계 (1)의 클로닝으로 수득된 뉴클레오티드 서열을 결찰 처리하여 융합 유전자 ltA2B-ureB를 형성하고;
(3) 융합 유전자 ltA2B-ureB를 벡터 상에서 구축하고, 숙주를 변환시키고 또한 재조합 단백질 LTA2B-UreB를 발현시키고;
(4) 상기 단계 (3)에서 수득된 재조합 단백질을 분리 정제하는 단계들을 포함한다.
하나의 바람직한 구현예에서, ltA2B-ureB 융합 유전자는 벡터 pET-11c로 구축되고 대장균 BL21(DE3)은 형질전환되어, 재조합 가공 박테리아 pET-11c-LU/BL21(DE3)가 구축된다. 수득된 재조합 플라스미드는 LU 아미노산 서열 혹은 이것과 95% 이상의 상동성 및 단백질 활성을 가진 아미노산 서열의 적어도 하나의 암호화 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
하나의 바람직한 구현예에서, 재조합 단백질 LTA2B-UreB는 80L 용적의 발효기 내에서 발효를 통해 상기 재조합 가공 박테리아로부터 발현된다.
본 발명은 또한 경구용 재조합 헬리코박터 파일로리 백신을 제조하는 방법을 제공하며 이 방법은:
(1) 본원의 청구항 9에서 수득한 재조합 단백질을 알긴산 나트륨, 식물성 오일, 염화칼슘 및 키토산과 적정 비율로 섞어(proportioning) 분해성의 서방성 미소구체-캡슐화된 제제로 제조하고; 및
(2) 선택적으로 상기 서방성 미소구체-캡슐화된 제제를 동결건조 산물로 제조하는 단계를 포함한다.
하나의 바람직한 구현예에서, 상기 수득된 재조합 단백질을 알긴산 나트륨 용액과 균일하게 혼합한 다음 식물성 오일을 첨가하여 유화시킨 후, 역상 적정법(reverse titration)으로 염화칼슘 용액에 점적 첨가하여 알긴산염-캡슐화된 단백질 미소구체 제제를 얻고; 상기 미소구체 제제를 부동화 처리한 후 세척 및 원심분리를 통해 펠릿을 형성 수거하여 이를 재현탁하고; 이것을 재-캡슐화를 위해 키토산 용액에 첨가하여 키토산 및 알긴산 나트륨으로 2중 캡슐화된 단백질 미소구체를 수득하고; 상기 미소구체 현탁액을 액수위가 1cm 미만인 유리병에 천천히 붓고 -40℃의 냉동기에 넣어 12시간 동안 사전 동결하고, 냉각된 진공 건조기에 직접 공급하여 건조한 후 천천히 온도를 상승시켜 물로 신속히 승화시키고, 기체 압력 표시계에서 기체가 전혀 생성되지 않은 것이 확인되면, 이 때의 동결건조 산물을 시험용으로 취한다.
본 발명의 구현예에서, 수득된 백신의 동물 실험을 통해 재조합 헬리코박터 파일로리 백신의 안전성 및 면역원성을 검출한다.
본 발명의 또다른 구현예에서, 상기 백신을 인체에 대해 임상 실험하여 재조합 헬리코박터 파일로리 백신의 면역 효과를 확인한다.
상술한 내용으로부터 알 수 있듯이, 본 발명은 점막형 면역 분자내 보강제인 장독성 대장균의 LT의 A2 서브유니트 및 B 서브유니트로부터 융합된 LTA2B와 또한 면역원으로서 우레아제 B 서브유니트를 이용하여 재조합 헬리코박터 파일로리 백신을 구축하며, 이 백신은 인간 헬리코박터 파일로리 감염을 효과적으로 면역예방하기 위해 편리하고 안전하게 이용할 수 있다.
상술한 본 발명의 목적, 특징 및 장점 등을 다음의 실시예 및 첨부된 도면을 통해 더 구체적으로 설명한다.
도 1은 중복-확장법으로 수득한 lu (ltA2B-ureB) 융합 유전자의 아가로스겔 전기영동 패턴을 나타내는 것으로, 여기서 제 1레인은 ureB 유전자의 PCR 증폭 산물; 제 2레인은 핵산 (DNA) 분자량 표식자; 제 3레인은 ltA2B 융합 유전자의 PCR 증폭 산물이다.
도 2는 재조합 플라스미드 pET-11c-lu의 효소 소화 동정(enzyme digestion identification)의 결과를 나타내는 것으로, 여기서 레인 M1은 PCR 표식자; 제 1레인은 ltA2B PCR 산물 (약 0.4kb); 제 2레인은 ureB PCR 산물 (1.7kb); 제 3레인은 lu PCR 산물 (약 2.1kb); 제 4레인은 pET-11c Ndel 소화물 (5.7kb); 제 5레인은 pET-11c-lu Ndel 소화물 (5.7kb + 2.0kb); 제 6레인은 pET-11c-lu의 감지 재조합물의 BamHI 효소 소화물 (6.0kb + 1.0kb + 0.7kb); 제 7레인은 pET-11c-lu의 항감지 재조합물의 BamHI 효소 소화물 (6.4kb + 1.0kb + 0.3kb); 및 레인 M2는 λDNA/HindⅢ 표식자이다.
도 3은 재조합 박테리아 내의 유전자 lu의 PAGE 전기영동 패턴을 나타내는 것으로, 여기서 제 1레인은 단백질 분자량 표식자; 제 2레인은 플라스미드 무함 유(plasmid-free) 박테리아의 유도(induction) 1시간 후; 제 3레인은 유전자형 재조합 박테리아의 유도 5시간 후; 제 4레인은 유전자 재조합 박테리아의 유도 4시간 후; 제 5레인은 유전자 재조합 박테리아의 유도 3시간 후; 제 6레인은 유전자 재조합 박테리아의 유도 2시간 후; 및 제 7레인은 유전자 재조합 박테리아의 유도 1시간후를 나타낸다. 이들 결과로부터, 유도후 유전공학 박테리아는 타깃 박테리아의 분자량과 동등한 72KDa의 분자량일 때, 또 다른 단백질 발현띠를 갖는 것을 확인할 수 있다. 또한, 유도 5시간 후 타깃 단백질의 발현율은 UVP 영상 주사 분석법으로 확인한 바, 약 26% 이다.
도 4는 타깃 단백질 LU의 정제 효과에 관한 PAGE 전기영동 패턴을 나타내는 것으로, 여기서 제 1레인은 용해된 내포체액(lysed inclusion body liquid) (정제전 시료); 제 2 및 3 레인은 불순물 단백질의 용리 피크 샘플; 제 4레인은 타깃 단백질의 용리 피크 샘플; 및 제 5레인은 단백질 분자량 표식자(marker)를 나타낸다. 이 결과에서, 타깃 단백질의 순도가 정제 단계후 현저히 개선되고, 또한 UVP 스캔으로 분석한 결과 수득된 타깃 단백질 피크의 순도가 85% 이상인 것을 확인할 수 있다.
도 5는 rHp(재조합 헬리코박터 파일로리 백신)의 동결 건조 곡선을 나타낸다.
실시예 1
융합 유전자 lu (ltA2B-ureB)의 구축
(1) 헬리코박터 파일로리 UreB 및 장독성 대장균 LTA2B의 유전자를 암호화 하는 클로닝
야생형 장독성 대장균 H44815 (의약품 및 생물학적 제품 관리 국립 연구소에서 구입) 및 헬리코박터 파일로리 NCTC 11637의 유전자형 DNA (미국 미생물 기탁 연구소 ATCC 에서 구입)을 템플레이트로 각각 이용했고; P1 및 P2, 또한 P3 및 P4를 각각 사용하여 ureB 및 ltA2B 유전자를 증폭했고; 또한 박테리아 게놈의 추출은 종래의 방법에 따라 수행했다 (Yan ziyin, Wang Hailin 번역. Short Protocols in Molecular Biology. Science Press, 1998, P39). PCR 증폭 시스템은 다음과 같이 구성했다: 10 ×마그네슘 이온 무함유 증폭용 완충액 10μL, MgCl2 (25 mmol/L) 10μL, dNTPs (각 2.5 mmol/L) 8μL, 업스트림(upstream) 및 다운스트림(downstream) 프라이머 (P1 및 P2 또는 P3 및 P4) 각각 2μL, 상술한 박테리아 게놈 2μL, Ex-Taq DNA 폴리머라제 (3U/μL) 1μL, 및 멸균수 100μL 첨가.
PCR 증폭 반응은 다음과 같이 실행했다: 94℃에서 5분간 사전 변성처리, 94℃에서 50초간 변성처리, 60℃에서 50초간 어닐링, 72℃에서 50초간 확장, 72℃에서 10분간 최종 확장 처리 단계를 35회 주기로 반복. 아가로스겔 전기영동후 타깃 절편을 회수했다 (밑줄 부분은 이에 상응하는 효소의 인지 서열이었다)
P1:cat atg gct cct cag tct att aca gaa cta tgt tc
NdeI
P2:tga tat cgg atc ctg agg gta gtt ttc cat act gat tgc c
BamHI
P3:tac cct cag gat ccg ata tca atg aaa aag att agc ag
BamHI
P4:cat atg cta gaa aat gct aaa gag ttg tgc caa gc
NdeI
TA 클론화 및 형질전환된 박테리아 균주의 플라스미드 DNA를 종래의 방법에 따라 추출했다 (J. Sambrook, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989 Polyacrylamide Gel Electrophoresis 1.21-1.32) 및 삽입 절편의 서열화는 디데옥시 말단법을 통해 수행했다.
(2) 융합 유전자 ltA2B-ureB의 구축
ureB 및 ltA2B의 PCR 산물을 각각 회수했다. 중복 확장 PCR은 상기 회수된 ureB 및 ltA2B 유전자를 템플레이트로, 또한 P1 및 P4를 프라이머로 이용하여 수행했다. PCR 증폭 시스템은 다음과 같이 구성했다: 10 × 마그네슘 이온 무함유 증폭용 완충액 5μL, MgCl2 (25 mmol/L) 4μL, dNTPs (25 mmol/L) 4μL, 업스트림(upstream) 및 다운스트림(downstream) 프라이머 (P1 및 P4) 각각 1μL, 상술한 ureB 및 ltA2B 유전자 각각 2μL, Ex-Taq DNA 폴리머라제 (5U/μL) 0.5μL, 및 멸균수 50μL 첨가.
중복 확장 PCR 증폭 반응(overlap extension PCR amplification reaction)은 다음과 같이 실행했다: 94℃에서 5분간 사전 변성처리, 94℃에서 60초간 변성처 리, 60℃에서 60초간 어닐링, 72℃에서 60초간 확장, 72℃에서 10분간 최종 확장 처리 단계를 35회 주기로 반복. 아가로스겔 전기영동후 타깃 절편을 회수했다.
PCR 산물의 클론화 및 서열화는 상술한 바와 마찬가지로 이루어진다.
중복 확장 PCR 반응 시스템
회수된 ureB DNA 절편 1㎕
회수된 ltA2B DNA 절편 1㎕
P1 (5 pmol/㎕) 2㎕
P4 (5 pmol/㎕) 2㎕
10 ×PCR 완충액 10㎕
dNTPs (5mmol/L) 4㎕
Taq + DNA 폴리머라제 (3U/㎕) 1㎕
ddH2O 79㎕
총 부피 100㎕
반응 시스템을 진동처리 및 균일하게 혼합하고, 원심분리후 20μL의 파라핀유를 가했다. 다음에, 94℃에서 10분간 사전 변성처리, 94℃에서 30초간 변성처리, 58℃에서 45초간 어닐링, 72℃에서 1분간 확장, 72℃에서 10분간 최종 확장 처리 단계를 35회 주기로 반복했다. 반응 완료후 3μL의 반응 산물을 취하고; 1% 아가로스겔 전기영동으로 PCR 증폭 산물을 검출하고 타깃 유전자 절편 ltA2B-ureB를 회수했다. 1% 아가로스겔 전기영동 분석 결과 (도 1 참조), 패턴에서 나타난 바와 같이 절편 크기는 예상값 (약 2.1kb)과 동일했으며, 이를 먼저 타깃 유전자 절편으로 판단하고 ltA2B-ureB 로 명명하여 서열번호 1 (SEQ ID NO:1)을 부여하였다. 도 2는 융합 유전자 절편의 크기가 예상치와 동일한 것을 보여주었으며, 이는 중복 확장에 의해 융합 유전자가 수득되었음을 입증한다.
실시예 2
재조합 공학 박테리아 pET-11c-LU/BL21(DE3)의 구축
1. 재조합 공학 박테리아 pET-11c-LU/BL21(DE3)의 구축
lu (ltA2B-ureB) 융합 유전자의 증폭(PCR) 산물을 1.0% 아가로스 전기영동, 겔 회수 및 정제처리한 후, 벡터 pMD-18T (TaKaRa 사에서 구입)와 결찰 처리(ligation)하고, 대장균 DH5α의 형질전환, 플라스미드 추출, NdeI를 이용한 소화처리(digesting)를 행한 후, 1.0% 아가로스겔 전기영동으로 동정했다.
플라스미드 DNA를 pMD-18-lu/DH5α의 양성 재조합 박테리아로부터 추출하고 NdeI를 이용한 소화처리, 2.0kb lu DNA 절편 회수, NdeI-소화된 디포스포릴화 pET-11c 벡터 (아메리카 노바겐사에서 구입)와 결찰, 대장균 DH5α의 형질전환, 암피실린-양성 LB 플레이트를 이용한 스크리닝, 플라스미드 추출에 관한 의심 콜로니를 선별, NdeI 소화를 통한 양성 재조합물을 동정확인, 또한 전방향 및 역방향 확인용 BamHI를 이용한 소화처리 등을 순차적으로 행하였다. 소화 동정의 결과는 도 2에 나타내었다. 양성 재조합 플라스미드 DNA는 NdeI 소화후 5.7kb 벡터 절편 및 2.1kb lu 유전자 (제 5레인) 절편을 생성했으며; 또한 항감지 재조합물은 BamHI 소화후 6.4kb + 1.0kb + 0.3kb의 3개의 절편 (제 7레인)을 생성했고; 또한 감지 재조합물은 6.0kb + 1.0kb + 0.7kb의 3개의 절편(제 6레인)을 각각 생성했다.
이에 관련한 특정의 조작 단계는 다음과 같았다:
1) 오메가사의 플라스미드 추출 키트를 이용하여 이 키트의 설명서에 따라 재조합법으로 플라스미드 DNA를 추출했다.
2) 플라스미드 DNA는 종래의 아가로스겔 전기영동법 (1.0% 아가로스겔, 1 × TAE 완충액, 전기영동은 120 내지 150mA에서 20 내지 40분간 실행함. 50 × TAE 저장용액: 2.0mol/L 트리스 염기, 1.0mol/L NaAc 및 0.1mol/L Na2EDTA로 구성되며; 용액의 pH값은 빙초산을 이용하여 8.3으로 조정).
3) 플라스미드 DNA의 소화 동정: 반응 혼합물은; 1㎍ 플라스미드 DNA; 1㎕의 10 × 완충액 (Shanghai shenggong사의 제품 설명서를 참조); 및 1㎕의 제한효소 NdeI (10u/㎕)를 포함하고; 2배 증류수를 가하여 총 부피를 10㎕로 조성 및 혼합한 후 37℃에서 1 내지 2시간 동안 배양하였다.
4) 타깃 DNA을 아가로스 전기영동겔로부터 회수 정제하였다;
타깃 DNA 전기영동띠를 자외선 램프로 관측하고 아가로스겔로부터 절단하여 1.5ml의 EP관에 옮겼다.
오메가사의 겔 회수 키트에 들어있는 DNA 결합용 완충액을 가하고, 65℃의 수조에 담가 겔을 완전히 용해시켜 이 용액을 pH 5.0 내지 6.0로 유지하고; 용해된 겔 용액을 분리관으로 옮겨 12,000g에서 1분간 원심분리한 후, 수거관에서 액상을 분리제거했다.
세정할 상응하는 완충액을 가한 다음 12,000g에서 1분간 원심분리한 후, 수거관에서 액상을 분리제거하고 다시 1회 세척했다.
12,000g에서 1분간 원심분리한 후 분리관을 또다른 깨끗한 1.5ml EP관에 담고, 소정량의 TE 완충액을 가한 다음, 65℃에서 10분간 배양하고, 다시 12,000g에서 1분간 원심분리하여 이 결과물을 전기영동을 위해 소정량 취하고, 마지막으로 UVP 자외선 스캐너를 이용하여 회수 및 정제 효율을 검출했다.
5) 결찰 반응 (Shanghai Shenggong 사의 결찰 키트를 이용함)
타깃 DNA 절편 및 벡터 절편의 농도를 자외선 분광광도계를 이용하여 측정했다; 외인성 절편 대 벡터의 상대 몰비가 통상 1:(2-10)인 사실에 기반하여, 결찰 반응 시스템을 다음과 같이 설계했다:
타깃 DNA 1㎕; 플라스미드 벡터 1 내지 2㎕; 결찰 용액 5㎕; ddH2O 2 내지 3㎕; 및 총 부피 10㎕. 결찰 반응은 22℃에서 12 내지 16시간 수행한다.
6) 수용성 박테리아의 조제 (CaCl2 법)
무균 접종 루프를 이용하여 -70℃에서 동결보관한 박테리아 보존액에 침지, 3선 줄무늬(three line)법으로 LB 플레이트에 도말 접종하여 37℃에서 12 내지 16시간 배양하고; 단일 콜로니를 선택하여 2ml의 LB 배양액에 접종 및 37℃에서 12 내지 16시간 흔들어 배양하고; 하룻밤 배양된 DH5α를 LB 배양액에 대해 1% 상대비로 접종, OD600이 될 때까지 37℃에서 0.2 내지 0.4시간 흔들어 배양하고 또한 8,000g에서 5분간 원심분리한 후 박테리아를 수거하고; 1ml의 사전 냉각한 0.1M CaCl2을 가하여 펠릿을 재현탁 및 얼음수조에 넣어 3시간 처리하고; 4℃에서 5분간 8,000g로 원심분리후 상등액을 분리제거하고; 100㎕의 사전 냉각한 0.1M CaCl2을 가하여 펠릿을 현탁 및 얼음수조에 넣어 1시간 처리함으로써 후속 용도에 이용했다.
7) 결찰 산물을 이용한 대장균 숙주 세포의 형질전환
100㎕의 수용성 박테리아(competent bacteria) 현탁액에 결찰 반응 산물을 가하고; 얼음수조에 넣어 60분간 처리 후 42℃의 수조에 넣어 100초간 열충격을 가하고, 다시 얼음수조 처리를 1 내지 2분간 행하며; 100㎕ LB 배양액을 첨가, 37℃에서 1시간 흔들어 배양하고; 8,000g에서 10분간 원심분리 후, 흡입을 통해 100㎕의 상등액을 분리제거, 펠릿 혼합 후 50㎕을 취하여 플레이트 상에 도말하고, 37℃의 배양기에서 하룻밤 배양했다.
2. 융합 단백질을 고발현하는 공학 박테리아(engineered bacteria)의 구축 및 스크리닝
LU 융합 유전자를 함유하는 재조합 발현 플라스미드를 대장균 BL21로 형질전환하고 플라스미드를 추출, 소화 및 동정처리했다. 도 2는 재조합 발현 플라스미드 pET-11c-LU/BL21(DE3)의 소화 동정을 위한 아가로스겔 전기영동 패턴을 나타내며, 여기서: 제 5레인은 재조합 플라스미드 pET-11c-LU/BL21(DE3)의 NdeI 소화 산물; 레인 M1 및 M2는 핵산(DNA)의 분자량 표식자; 제 4레인은 공백형 벡터 플라스미드의 NdeI 단일 효소 소화 산물 (5700bp)를 각각 나타낸다. 소화 절편의 크기는 실험 설계치와 동일했으며, 이는 재조합 플라스미드의 구축이 성공적이었음을 제시한다. 유전 가공된 대장균 BL21의 경쟁 박테리아의 조제 및 형질전환, 또한 재조합 박테리아의 플라스미드를 추출 및 소화처리하는 것은 모두 상술한 내용과 동일했다.
정밀 동정된 재조합 박테리아를 3ml의 카나마이신 함유 LB 배양액에 접종시키고 37℃에서 밤새도록 교반했다. 다음날 상기 배양된 재조합 박테리아를 20ml의 카나마이신 함유 LB 배양액에 대해 1% 상대비로 도입 접종 및 37℃에서 2.5시간 동 안 교반, IPTG로 5시간 유도처리, 또한 융합 단백질의 발현 패턴 및 발현량을 SDS-PAGE로 검출한 후, 고발현된 균주를 도 3에서와 같이 스크리닝했다.
본 발명은 또한 UreB 및 LTA2B의 안정성과 이들이 우레아제 B의 전길이 단백질을 대체할 수 있음을 실험을 통해 입증했다. PCR법을 채택하여 타깃 LTA2B, UreB 및 LTA2B 절편 유전자를 증폭하고, 이것으로 원핵 발현 벡터 pET-11c(+)를 구축 및 숙주 박테리아 대장균 BL21(DE3)로 형질전환시키고, 또한 IPTG로 유도 처리하여 LTA2B-UreB 융합 단백질을 안정적으로 발현하였다. 먼저, ELISA 및 면역블롯 분석으로 재조합 LTA2B-UreB가 우수한 면역원성 및 반응원성을 갖는 것을 확인하였고; 다음에, 정제 LTA2B-UreB로 면역화된 토끼에서 취한 항체가 시험관내 우레아제 활성을 중화시키고 자연 HP의 UreB와 유사한 생체 활성을 나타냈으며; 또한, BALB/c 생쥐에서 재조합 LTA2B-UreB의 경구 면역화가 체내를 효과적으로 자극시켜 Th1/Th2 균형잡힌 면역 반응을 형성할 수 있었고 이것이 재조합 UreB와 실질적으로 동일했으며 (Wuchao, Zou quanming etc. "헬리코박터 파일로리 UreB 및 대장균 LTB 유전자의 융합 및 발현에 관한 연구" Chinese Journal of Microbiology and Immunology, 2002, 22(2):175-179); 마지막으로, 생쥐에 대한 챌린지 보호 시험에서 LTA2B-UreB의 보호율이 전길이 UreB의 보호율 68%보다 훨씬 높은 91.6%인 것을 확인하였다. GM1-ELISA 시험에서 LTA2B-UreB 융합물이 ADP 리보실-효소 활성을 전혀 갖지 않는 대신 강글리오시드 GM1와 결합하는 생체 특성을 유지하는 것을 확인하였다. 생쥐에 대한 챌린지 보호 시험은 또한 LTA2B-UreB의 보호율이 UreB-LTB의 보호율 74.1% 및 UreB와 LTB의 물리적 혼합물의 보호율 78.6% 보다 훨씬 높다는 사 실을 보여주었다. LTA2B-UreB가 전길이 UreB와 생체 활성, 면역원성 및 반응원성 등에 있어서 유사하고 또한 점막형 보강제의 활성을 강화시키는 기능이 있다는 것도 처음 입증하였다.
실시예 3
재조합 공학 박테리아 pET-11c-LU/BL21(DE3)의 발효
발효 과정은 다음과 같다: 독일 B.Bron 80L 발효기를 준비하고; 발효를 위한 시드 균주의 접종비는 10%; 온도는 37℃; 및 pH값은 7.0으로 했다. 30% 암모니아수를 자동으로 가하여 pH값을 일정하게 유지하고; 초기 회전값은 500rpm으로 설정하고, 박테리아 세포수 증가에 따라 용존산소 캐스캐이드를 제어하기 위해 상기 회전값을 조절하며, 이때 산소 소모의 개선을 위해 PO2 제어기를 주제어기로, 또한 교반제어기를 부제어기로 이용하고; 캐스캐이드 조절 및 네가티브형 산소 바이패스의 조절을 통해 용존산소 농도를 제어함으로써, 용존산소 최종 농도를 45 내지 50%로 유지하고; 뱃치 내용물은 A600이 2시간 미만이면 공급하지 않으며, 그 이상이면 매 0.5시간마다 뱃치 내용물을 유입 첨가하여 글루코스, 트립톤 및 8% 이스트 추출물의 최종농도를 각각 0.5%, 0.2% 및 0.2%로 조정했다. 뱃치 내용물을 4회째 첨가시 및 글루코스 농도가 0.1%로 감소했을 때 500μmol/L의 IPTG를 가하고 4시간 동안 유도 처리하여 박테리아를 수거하고; 상기 뱃치물의 유입 첨가는 발효 과정에서 용존산소 캐스캐이드 제어에 의해 통제된 뱃치 배양물을 근거로 했다.
발효 공정에 이용된 배지는 변형 M9-CAA 배지로서, 이는 M9-CAA를 기초로 하 며 여기에 0.6% 이스트 추출액 및 2mg/L ZnCl2·4H2O, 2mg/L CoCl2·4H2O, 4mg/L FeSO4·16H2O, 5mg/L H3BO3, 1.6mg/L MnCl2·4H2O, 및 4mg/L CuSO4 등을 보충했다.
발효 종료후 박테리아 현탁액을 회수하고 8,000g에서 15분간 원심분리하였다. 상등액을 흡입 제거한 후 박테리아를 수거하여 무게를 측정하고 후속 사용시까지 동결 보관했다.
결과: 측정 결과, 박테리아 수율은 모두 75g/L 이상이었고; 또한 타깃 단백질의 발현량은 모두 30% 정도의 안정율을 갖는 것으로 나타났으며, 이는 중간규모의 발효 공정이 개선도가 크고 재현성 및 안정성 측면에서 높은 수준을 나타내는 것을 입증한다.
실시예 4
재조합 단백질 LU (LTA2B-UreB)의 정제
1. 내포체 (inclusion body)의 추출: 5,000g의 고발현 박테리아를 TE 완충액에 1:10 (W/V)의 비율로 현탁하고 4℃로 사전 냉각한 후 세포 균질화기를 이용하여 균일하게 혼합하였다. 고압 균질화기를 이용하여 40 내지 70Mpa의 압력 조건에서 박테리아 세포를 분쇄했다 (총 4 내지 6회). 처리가 완료되면, 소량의 박테리아 원액을 취해 도말, 염색하여 현미경으로 세포 밀집도를 관찰해서 세포들이 완전히 분쇄되었는지를 확인했다. 박테리아 원액을 다시 500g에서 25분간 원심분리하고 펠릿을 제거한 후, 또다시 15,000g에서 40분간 원심분리했다. 다음, 상등액을 버리고 펠릿만 수거하여; 동일한 세정 조건에서 1:10 (W/V) 상대비의 세정액 A 및 B로 상기 수거된 펠릿을 각각 2회씩 차례로 세척하고; 4℃에서 20분간 교반하고, 15,000g에서 40분간 원심분리하여 내포체 펠릿을 수거하고; 마지막으로 상기 내포체를 내포체 용리액과 1:10 (W/V) 비율로 혼합하고, 4℃에서 3시간 교반 및 15,000g에서 45분간 원심분리하고, 상등액을 취하여 후속의 정제단계에서 원료로 사용했다.
내포체 추출에 이용한 완충액은 다음과 같다: 1) TE 완충액: 20mmol/L 트리스, 5mmol/L EDTA, pH 8.0; 2) 내포체 세정액 A: 5mmol/L EDTA, 20mmol/L 트리스, 1% 트리톤 X-100, pH 8.0; 3) 내포체 세정액 B: 20mmol/L 트리스, 2mol/L 우레아, pH 8.0; 4) 내포체 용리액: 1mmol/L EDTA, 20mmol/L 트리스, 8mol/L 우레아 (pH 8.0).
2. 크로마토그래피 정제: 정제 단계는 Q 세파로스 HP 음이온 교환 컬럼 및 세파덱스 G-25 컬럼 크로마토그래피 정제법을 이용했다. 또한 중간규모의 정제는 AKTA 익스플로러100 시스템 상의 XK50/30 컬럼을 이용하여 시행했다. AKTA 익스플로러100 시스템은 정밀 자동화 특성이 있으므로 2세트의 AKTA 익스플로러 시스템을 채택하여 프로그래밍에 따른 연속 자동화 크로마토그래피 조작을 행하였다. rHp 백신이 담긴 각 뱃치에서 40g에 이르는 중간규모 수율을 얻을 수 있다. 타깃 단백질은 pH 8.0에서 20mmol/L 트리스 및 5mmol/L EDTA를 이용하여 정제했고 NaCl 구배 용리법을 택했다.
3. Q 세파로스 고성능 크로마토그래피로 정제한 재조합 단백질의 순도가 80%를 초과하는 경우라도, 다량의 염 및 요소가 존재한다. 따라서 겔여과 크로마토그래피법을 채택함으로써, 종래의 분자체 필러 세파덱스 G-25 배지를 이용하여 분자량 차이에 따라 탈염 및 요소제거 처리를 했다.
4. 정제된 타깃 단백질에 SDS-PAGE를 실시하고 그 순도를 측정했다. 최종 결과로 나온 타깃 단백질의 순도 및 수율은 각각 80% 및 79% 이상이었다.
5. 단백질 농도는 Lowry법으로 측정했다.
여기서, 상기 단계 1의 제조 및 중간규모 정제법에 이용된 고압 세포분쇄술의 세포 분쇄율은 98% 이상이었고, 내포체 펠릿은 분별 원심분리로 수득했다.
단계 2의 친화성 크로마토그래피 정제 필터는 킬레이팅 세파로스 패스트 플로우 (Chelating Sepharose Fast Flow) 중에서 선택했다.
단계 3의 음이온 정제 필터는 Q 세파로스 HP, Q 세파로스 FF, 및 Q 세파로스 XL 중에서 선택했다.
실시예 5
경구 재조합 HP 백신의 제조
1. 재조합 LU 단백질 미소구체의 제조
실시예 4에서 제조한 재조합 단백질을 2% 알긴산 나트륨 용액과 실온에서 균일하게 혼합하고 여기에 식물성 오일을 첨가하며, 이 때 식물성 오일 대 알긴산 나트륨 AGS 유탁액의 상대비는 2:8로 하고, 8,000r/분의 회전속도로 10분간 유화처리하고, 그 결과액을 CaCl2 용액에 점적 첨가하고, 800r/분의 회전속도로 30분간 교반 하여 O/W 에멀젼을 형성하고, 세척 및 재현탁하며; 상기 현탁액을 1% 농도의 키토산 용액에 첨가하고, 800rpm으로 30분간 교반하여 재-캡슐화 처리를 완료함으로써, 키토산-알긴산 나트륨 2중 캡슐화된 재조합 LU 단백질 미소구체를 제조하고, 이를 원심분리 및 3회 세척한 후 최종 결과물을 수거한다.
상기 미소구체 현탁액을 1cm 이하의 액위를 가진 유리판에 천천히 붓고, -40℃의 냉동기에 넣어 12시간 동안 사전 동결하고, 사전 냉각한 진공 건조기에 넣어 건조하고, 온도를 천천히 상승시켜 물로 신속히 승화처리하고, 기압 표시계를 관찰하여 더이상 기체가 발생하지 않는 것을 확인하고 동결건조 산물을 시험용으로 취하였다.
원심분리 및 세정된 MS, 동결건조 분말, 및 재현탁 동결건조 분말을 각각 소량씩 취하여 유리 슬라이드에 도말하고, 광학 현미경으로 동결건조 전후의 미소구체의 형태 변화를 관찰하였다. 광학 현미경 관찰 결과, 원심분리 및 세정 후 미소구체의 크기와 형태가 규칙적인 반면, 동결건조후 미소구체는 막대형, 방추형 및 편구형 등 다수의 불규칙한 형태를 포함한 불균일한 분포로 나타났으며, 한편으로 등량의 증류수에 재용해된 미소구체의 수와 형태는 실질적으로 동결건조 전의 고유 특징을 그대로 유지한 것을 확인하였다. 제조된 MS는 둥근 표면, 균일한 크기 및 3.33㎛의 평균 입경을 갖는다.
2. 재조합 LU 단백질 미소구체 용액의 동결건조
고순도 재조합 LU 단백질을 적절히 희석 조제 및 동결건조용 유리병에 담았다. 안정하고 성숙한 rHp 백신의 동결건조 곡선을 연구를 통해 수득했다: 산물의 사전 동결온도는 -45℃이고 사전 동결시간은 4시간이며; 제 1승화 온도는 20℃ 및 승화시간은 30시간; 제 2승화 온도는 30℃ 및 승화시간은 8시간; 전체 동결건조 과정에 소요되는 시간은 42시간이고; 또한 수분 함량은 3% 미만으로서 이는 <중국 약전>(2000년판)의 제2부에 게재되어 있는 동결건조물의 수분 함량에 관한 검출 요건을 만족하는 값이었다.
동결건조 파일럿 공정을 통한 계통 연구에서, 동결건조 rHp 백신 제제의 부형제는 8% 만니톨, 안정화제는 0.05% EDTA-Na2, 최적의 pH값은 10.0으로 결정되었으며; 또한 성숙도 파라미터로서 동결건조 곡선을 수득했다. 총 20개의 뱃치에 대한 확인 실험을 통해, 동결건조 파일럿 공정이 성능면에서 안정적이며, 대규모 생산 요건을 만족하는 것을 확인하였다. 각 동결건조 바이알당 15mg의 충진량으로 계산하여, 약 2600개의 바이알에 40g의 백신 단백질을 분배할 수 있다. 5m2 면적의 동결건조기를 이용하여, 대량의 산물을 동결건조하기 위한 요건을 만족시키는 1회당 약 32mm 직경을 가진 약 5000개의 동결건조 바이알을 준비하였다.
본 발명은 또한 rHp 백신의 안정성에 대한 인공 위액의 영향을 개시하였다. rHp 백신은 동결건조된 경구용 면역 제제이므로, 소화관을 통해 타깃 기관에 도달하는 동안 반드시 위 내의 산성 pH 환경을 통과해야 한다. 고유 성질상 단백질인 rHp 백신은 산의 작용으로 변성되거나 효소에 의해 분해되기 싶고, 따라서 면역 활성이 감소한다. 연구 결과, pH 1 내지 2의 합성 위액에서 rHp 백신 단백질의 항원 작용성이 현저히 감소하고 단백질 분해가 뚜렷했으며, 반면에 고항원성 및 단백질 안정성이 pH 3 내지 7의 환경에서는 유지되었음을 발견하였다. 연구 결과는 또한, 적용 과정에서, 위액 중화법을 이용하여 위내 환경의 pH값을 적절히 상승시킬 수 있으며, 이에 따라 rHp 백신 단백질의 생체 활성을 보존하면서 적절한 면역 효과를 얻을 수 있음을 보여주었다. 경구용 재조합 백신의 투약 형태와 관련하여, 위액 및 펩신에 대한 내성을 가진 다중-마이크로캡슐화 제제를 제조하기 위한 보다 개선되고 실용적인 방법을 확립하였으며, 이에 따라 위액과 펩신에 의한 파괴손상(destruction)을 극복할 수 있다. 결과적으로, 백신의 효능 및 안정성이 향상되었다.
실시예 6
경구용 재조합 HP 백신의 동물 실험
1. 동물에 대한 안전성 평가
LD50 그룹의 시험 생쥐에서는 비정상 반응, 독성 증상 및 죽음이 관측되지 않았으므로 LD50을 계산할 수 없었으며, 경구 수용시 rHp 백신의 최대 내성 약량 (MTD)은 최대 내성 약량 시험으로 검출시 150mg/kg (인간의 정상 권장량의 600배에 해당) 이상이었다. 3개의 rHp 백신 뱃치를 복강주사 후 관측하는 기간 동안, 3개의 기니아픽 뱃치는 모두 비정상 독성 반응 없이 생존했으며, 모든 기니아픽의 체중이 7일까지 정상적으로 증가했다. 다음의 실험을 각각 실행하였고, 실험 결과로부터 rHp 백신이 우수한 안전성 프로파일을 갖는 것을 확인했다.
2. 면역원성 연구
rHp 백신의 면역원성을 토끼, BALB/c 생쥐 및 붉은털 원숭이에 대해 각각 관찰했다.
(1) 토끼 면역화에 의한 rHp 백신의 면역원성 연구
rHp 백신으로 토끼를 면역화한 후 2중 면역확산 시험 및 ELISA 검출을 수행했으며, 검출 결과 백신에 의해 토끼가 UreB에 대한 높은 항혈청 역가를 생성하는 것으로 나타났으며, 이는 rHp 백신 단백질이 우수한 면역원성을 갖는다는 것을 입증한다.
(2) BALB/c 생쥐 면역화에 의한 rHp 백신의 면역원성 연구
최종 면역후 10일째에 각 BALB/c 생쥐군에 대해 제조된 Hp 박테리아 현탁액을 동시에 공급했다. 실험 동물은 모두 24시간 동안 먹이와 물의 공급을 중단했고 BALB/c 생쥐 각각에 약 108cfu/ml (1 mL 당 콜로니 형성 단위수)의 박테리아 현탁액을 아침 및 오후에 6시간 간격으로 0.3ml씩 공급하고, 또한 최종 공급 2시간 후에 규정식(diet)과 물을 제공했다. 챌린지 4주 후 실험 동물을 모두 희생시켜 시료를 수집했다. 여기서 먹이 및 물의 공급 중단은 희생 24시간 전에 시행하였으며, 그 후 BALB/c 생쥐를 해부하여 위를 절제하고 절제된 위의 큰 곡면부를 따라 절개하여, 규정 염수(normal saline)로 위의 잔사물을 약간 씻어내고, 위점막 조직의 절반을 Hp 배양 배지에 도말하고, 3선 줄무늬 접종 후 미호기성(microaerophilic) 배양을 실행했다. 면역화 후 생쥐의 Hp 집락화를 표 1에 나타내었다.
표 1
융합 단백질의 경구 투여후 생쥐의 챌린지 면역보호 효과
그룹 챌린지후 생존수 무감염 수 보호율 (%)
1. PBS 그룹 (인산염 완충용액, pH 7.0) 28 27 -
2. UreB 그룹 30 20 66.7
3. UreB + LTB 그룹 29 19 65.5
4. UreB + LTA2B 그룹 27 21 71.3
5. UreB - LTB 그룹 30 24 72.8
6. LTA2B - UreB 그룹 29 27 91.6
"UreB-LTB" 및 "LTA2B-UreB"는 융합 단백질을 표시하며, "UreB + LTB" 및 "UreB + LTA2B"는 2종류의 재조합 단백질의 물리적 혼합 상태를 나타낸다.
상기 결과는 LU-면역화 그룹 (제 6그룹)의 생쥐에서 보호율이 90%를 상회하는 것을 보여준다.
결론: 융합 백신 항원 LU으로 생쥐를 면역시키면 비면역화 그룹과 비교시 전세포 Hp 챌린지에 대해 보호 효과를 얻을 수 있다.
Hp 감염이 확인된 BALB/c 생쥐에 대해 LU 융합 단백질, 2가지 서브유니트의 시험관내 혼합물 및 대조군을 각각 근육주사하여 면역화하였으며, 상기 주사물은 모두 등량부피의 알루미늄 보강제와 혼합 조제한 것이다. 근육주사는 각 생쥐에 100㎍(100μL)의 투여량으로 제0주, 제2주 및 제4주에 각각 실시했다. 마지막 면역화 처리뒤 4주 후에 생쥐를 희생시켜 시료를 수거했다; 또한, 처치후 생쥐의 박테리아 전달 상태를 다양한 실험법에 따라 관측했다.
표 2
다중 서브유니트 단백질 백신으로 치료한 Hp-감염 생쥐의 관찰
그룹 Hp가 검출되지 않은 후처리 생쥐수 집락 Hp수가 크게 감소한 후처리 생쥐수
LU 치료 그룹 (생쥐 30마리) 21 9
2개의 서브유니트 혼합 그룹 (생쥐 30마리) 23 7
대조군 그룹 (생쥐 30마리) 0 1
p 값은 두 그룹의 결과에 대한 통계 분석에서 나타난 바와 같이 0.001 보다 낮았으며, 이는 백신 항원 LU 또는 2개의 시험관 혼합 서브유니트를 이용한 감염 생쥐의 면역치료시 생쥐의 박테리아 전달수를 효과적으로 감소시키거나 생쥐의 감염을 제거하는 것을 예시하였다. 융합 항원 LU를 함유하는 다중-서브유니트 백신 항원은 Hp 감염에 대한 소정의 치료 효과를 갖는다.
3. 붉은털 원숭이에 있어서 rHp 백신의 경구 면역화에 대한 실험 연구
연구 결과, 붉은털 원숭이를 rHp 백신으로 경구 면역하고, 면역 후 15주를 유지한 다음, 혈청내 항-UreB IgG 항체와 타액내 sIgA 항체의 레벨 모두 크게 상승한 것을 발견하였으며, 이는 상기 백신이 붉은털 원숭이에게서 중대한 계통 면역 반응 및 점막형 면역 반응을 유도할 수 있음을 입증하는 것이다.
백신량과 면역 반응 레벨 간의 관계를 조사하기 위해, 3가지 상이한 투약량을 선택하여 경구 면역하였고; 그 결과, 0.5 및 2.0mg/kg 투약량의 두 그룹에서 유도된 계통 및 점막형 면역 반응 레벨이 0.2mg/kg 투약량 그룹보다 훨씬 크다는 것을 확인하였다. 상기 두 고약량 그룹 간에는 현저한 차이가 없으며, 이는 붉은털 원숭이의 경구 면역용 백신의 적정 약량이 체중의 0.5mg/kg이라는 것을 제시한다.
토끼, BALB/c 생쥐 및 붉은털 원숭이에 대한 상술한 동물 실험로부터, rHp 백신이 체내의 점막형 면역 반응을 효과적으로 유도하고 또한 우수한 면역원성을 갖는다는 사실을 확인할 수 있었다.
실시예 7
인체에 대한 재조합 HP 백신의 효과
본 발명의 치료 효과를 입증하기 위하여, 본 발명의 임상 연구를 실시하였다. 본 발명의 임상 연구 데이터는 다음과 같이 나타낸다:
1. 기준 선택:
(1) 자발적 참여
(2) 병력 문진, 물리적 검사 및 임상 검사에서 건강이 확인된 경우
(3) 최근 헬리코박터 감염 병력이 없을 것
(4) 유사한 백신의 접종 이력이 없을 것
(5) 백신 접종에 대한 금기 사항이 없을 것
2. 치료 효과 및 안전성에 대한 판단
(1) 안전성 판단
실험 대상자에게 백신을 경구 제공한 후 30분간 실시간 관측을 실시했으며, 또한 백신의 경구 투여후 제6시간, 24시간, 48시간 및 72시간에 계통적 (체온) 및 국소적 (위장관) 반응이나 기타의 이상 징후 (발열 또는 배설, 설사, 구토 등의 횟수와 외형의 이상) 발생 여부를 구체적으로 관찰했다.
1) 계통적 (체온) 반응:
무반응: 37℃ 이하의 체온;
가벼운 반응: 37.1 내지 37.5℃의 체온;
중간 반응: 37.6 내지 38.5℃의 체온;
심한 반응: 38.6℃ 이상에서 반응.
2) 국소적 (위장관) 반응:
무반응: 위장관 반응이 없음;
가벼운 반응: 통상적 처치후 사라지는 약한 위장 징후;
중간 및 심한 반응: 반복적 치료 혹은 입원 치료가 필요한 경우.
(2) 면역원성 연구
전체 경로의 면역화 뒤 14일 후 항체 상태에 대해 면역원성을 평가했고, 항체의 증감을 전체 경로의 면역화 뒤 60일간 관측하였다. 혈장 특이적 IgG가 면역화전 1:100 미만이고 또한 면역화 후에는 1:100과 동등하거나 그 이상일 때 양성 전환 시점으로 규정되고; 또한 항체 특이적 총 Ig 및 타액 특이적 sIgA 항체의 양성 전환은 각각, 면역화 후에 대한 면역화 전의 역가 상대비가 4배 이상일 때로 한정된다.
3. 조사 방법
2단계로 조사를 실시했다. 임상 단계 I 연구는 30명의 건강한 아이들에게 면역 절차에 따라 매회 45mg의 약량으로 경구용 재조합 헬리코박터 파일로리 백신을 경구 공급하고 투여후 계통적 (체온) 및 국소적 (위장관) 반응을 관찰한 무비교형 연구조사였다. 반면, 임상 단계 II 연구는 심각한 비정상 반응이 관측되지 않았을 때 추가로 실시했다. 임상 단계 II 연구는 임의 연구, 이중 블라인드 조사, 및 비교 조사를 포함하였다. 조사는 4개의 그룹으로 나누었다 (표 4 참조). 면역화 절 차: 경구 면역화는 3회 실시했으며 격주간 즉 제0일, 14일 및 28일에 각각 실행했다.
4. 조사 대상
경구 재조합 헬리코박터 파일로리 백신에 대한 임상 단계 I 연구 대상자의 기본 정보 및 임상 반응을 표 3 내지 5에 수록하였다.
표 3
임상 단계 I 연구 대상자의 기본 정보
나이 (년수) 남성 (사람수) 여성 (사람수) 총계
10 0 1 1
11 6 6 12
12 6 7 13
13 4 0 4
총계 16 14 30
표 4
임상 단계 Ⅱ 연구 대상자의 기본 정보
그룹 대상자 수 성별 구성 평균연령 (년수)
남성 여성
위약 151 77 74 10.1
15mg/회 148 69 79 10.3
30mg/회 171 82 89 10.4
45mg/회 153 74 79 10.8
총계 623 317 306 10.2
5. 결과
1. 백신 안전성
임상 단계 I 연구에서, 30명의 대상자를 45mg/회의 약량으로 경구용 재조합 헬리코박터 파일로리 백신을 이용하여 면역화시켰다. 3회의 전과정 면역화시 30명의 대상자에게서 즉시적인 반응이나 계통적 혹은 국소적 반응은 없었으며, 또한 지연 반응 및 기타의 비정상 반응, 합병증 또는 임상적으로 심각한 질환이나 상황이 관찰되지 않았다 (표 5 및 6). 따라서 45mg/회 약량의 경구용 재조합 헬리코박터 파일로리 백신은 인체에 안전한 것으로 확인되었다. 임상 단계 I 연구의 결과에 따라, 백신의 임상 단계 Ⅱ 연구를 행하여 안전성에 대한 조사 집단을 확대하고 또한 면역화 효과 조사를 강조할 수 있었다.
표 5
경구용 재조합 헬리코박터 파일로리 백신의 임상 단계 I 연구에서 대상자의 위장 반응
백신 공급 시점 관찰한 인원수 무반응 치료 불필요 가벼운 반응 통상적 처치 중간 및 심각한 반응 반복 치료 및 입원 치료
인원수 % 인원수 % 인원수 %
1회 30 30 100.00 0 0.00 0 0.00
2회 30 30 100.00 0 0.00 0 0.00
3회 30 30 100.00 0 0.00 0 0.00
표 6
경구용 재조합 헬리코박터 파일로리 백신의 임상 단계 I 연구에서 대상자의 계통적 반응
백신 공급 시점 관찰한 인원수 무반응 (< 37.0) 가벼운 반응 (37.1-37.5) 중간 반응 (37.6-38.5) 심각한 반응 (≥38.6)
인원수 % 인원수 % 인원수 % 인원수 %
1회 30 30 100 0 0.00 0 0.00 0 0.00
2회 30 30 100 0 0.00 0 0.00 0 0.00
3회 30 30 100 0 0.00 0 0.00 0 0.00
2. 백신의 면역원성
임상 단계 Ⅱ 연구의 반응은 다음과 같았다: 15mg/회, 30mg/회 및 45mg/회 약량의 경구용 재조합 헬리코박터 파일로리 백신은 모두 인체를 자극하여 바람직한 혈청 특이적 IgG 항체, 혈청 특이적 총 Ig 항체, 및 타액 특이적 sIgA 항체 반응을 생성할 수 있으며, 또한 항체 반응은 장기간 지속되었으며 전과정 면역 화 뒤 2개월 후에도 고레벨을 유지했다 (표 7 내지 9).
표 7
경구용 재조합 헬리코박터 파일로리 백신의 임상 단계 Ⅱ 연구에서 대상자의 혈청 특이적 IgG 항체의 양성 전환
그룹 검출 시료수 전과정 면역화 14일 후 전과정 면역화 60일 후
양성전환수 양성전환율(%) 양성전환수 양성전환율(%)
위약 80 4 5.0 3 3.8
15mg/회 90 84 93.3 86 95.6
30mg/회 90 87 96.7 88 97.8
45mg/회 91 84 92.3 84 92.3
표 8
경구용 재조합 헬리코박터 파일로리 백신의 임상 단계 Ⅱ 연구에서 대상자의 혈청 특이적 IgG 항체 레벨
그룹 검출 시료수 면역화전 GMT (1:) 전과정 면역화 14일 후 GMT (1:) 전화정 면역화 60일 후 GMT (1:)
위약 101 50 54 54
15mg/회 116 50 844 1140
30mg/회 124 50 1097 1251
45mg/회 114 50 619 859
GMT: 기하평균 역가
표 9
경구용 재조합 헬리코박터 파일로리 백신의 임상 단계 Ⅱ 연구에서 대상자의 타액 특이적 sIgA 항체 레벨
그룹 검출 시료수 면역화전 GMT (1:) 전과정 면역화 14일 후 GMT (1:) 전화정 면역화 60일 후 GMT (1:)
위약 101 2.74 3.35 3.32
15mg/회 116 2.56 21.83 24.16
30mg/회 124 2.25 25.30 27.52
45mg/회 114 2.41 20.91 21.95
GMT: 기하평균 역가
<110> CHONGQING KANG WEI BIOTECHNOLOGY CO., LTD. <120> ORAL RECOMBINANT HELICOBACTER PYLORI VACCINE AND PREPARING METHOD THEREOF <130> DP1P070629ZX/CNKW/CY <150> CN200610095094.0 <151> 2006-09-05 <160> 6 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 2165 <212> DNA <213> E.coliBL21(DE3)LU <220> <221> gene <222> (1)..(2165) <400> 1 gctccccagt ctattacaga actatgttcg gaatatcgca acacacaaat atatacgata 60 aatgacaaga tactatcata tacggaatcg atggcaggta aaagagaaat ggttatcatt 120 acatttaaga gcggcgcaac atttcaggtc gaagtcccgg gcagtcaaca tatagactcc 180 caaaaaaaag ccattgaaag gatgaaggac acattaagaa tcacatatct gaccgagacc 240 aaaattgata aattatgtgt atggaataat aaaaccccca attcaattgc ggcaatcagt 300 atggaaaact agacaattac agatgatact tgtaatgagg agacccagaa tctgagcaca 360 atatatctca ggaaatatca atcaaaagtt aagaggcaga tattttcaga ctatcagtca 420 gaggttgaca tatataacag aattcgggat gaattatgaa aaagattagc agaaaagaat 480 atgtttctat gtatggccct actacaggcg ataaagtgag attgggcgat acagatttga 540 tcgctgaagt agaacatgac tacaccattt atggcgaaga gctaaaattt ggtggcggta 600 aaactttaag agaaggcatg agccaatcca gcaaccccag caaagaagaa ctggatttaa 660 tcatcactaa cgctttaatc gtggattaca ccggtattta taaagcggat attggtatta 720 aagatggcaa aatcgctggc attggcaaag gcggtaacaa agacatgcaa gatggcgtta 780 aaaacaatct tagcgtgggt cctgctactg aagccttagc tggtgaaggt ttgatcgtaa 840 ctgctggcgg tattgacaca cacatccact tcatctcccc ccaacaaatc cctacagctt 900 ttgcaagcgg tgtaacaact atgattggtg gcggaactgg ccctgctgat ggcactaacg 960 caaccactat cactccaggc agaagaaatt taaaatggat gctcagagcg gctgaagaat 1020 attctatgaa cttaggtttc ttagctaaag gtaacacttc taacgatgcg agcttagccg 1080 atcaaattga agccggtgcg attggtttta aaatccacga agactgggga acaactcctt 1140 ctgcaatcaa ccatgcgtta gatgttgcgg acaaatacga tgtgcaagtc gctatccaca 1200 cagacacttt gaatgaagcc ggttgtgtag aagacactat ggcagccatt gccgggcgca 1260 ctatgcacac tttccacact gaaggtgctg gtggtggaca cgctcctgat attattaaag 1320 tggccggcga acacaacatt ctgcccgctt ccactaaccc cactatccct ttcaccgtga 1380 atacagaagc agaacacatg gacatgctta tggtgtgcca ccacttggat aaaagcatta 1440 aagaagatgt tcagttcgct gattcaagga tccgccctca aaccattgcg gctgaagaca 1500 ctttgcatga catggggatt ttctcaatca ccagttctga ctctcaagct atgggtcgtg 1560 tgggtgaagt tatcaccaga acttggcaaa cagctgacaa aaacaaaaaa gaatttggcc 1620 gcttgaaaga agaaaaaggc gataacgaca acttcaggat caaacgctac ttgtctaaat 1680 acaccattaa cccagcgatc gctcatggga ttagcgagta tgtaggttct gtagaagtgg 1740 gcaaagtggc tgacttggta ttgtggagtc ccgcattctt tggcgtgaaa cccaacatga 1800 tcatcaaagg cgggttcatt gcattaagtc aaatgggcga tgcgaacgct tctatcccta 1860 ccccacaacc ggtttattac agagaaatgt tcgctcatca tggtaaagcc aaatacgatg 1920 caaacatcac ttttgtatcc caagcggctt atgacaaagg cattaaagaa gaattagggc 1980 ttgaaagaca agtgttgccg gtaaaaaatt gcagaaacat cactaaaaaa gacatgcaat 2040 tcaacgacac taccgctcac attgaagtca atcctgaaac ttaccatgtg ttcgtggatg 2100 gcaaagaagt aacttctaaa ccagccacta aagtgagctt ggcacaactc tttagcattt 2160 tctag 2165 <210> 2 <211> 728 <212> PRT <213> E.coli BL21(DE3)LU <400> 2 Met Ala Pro Gln Ser Ile Thr Glu Leu Cys Ser Glu Tyr Arg Asn Thr 1 5 10 15 Gln Ile Tyr Thr Ile Asn Asp Lys Ile Leu Ser Tyr Thr Glu Ser Met 20 25 30 Ala Gly Lys Arg Glu Met Val Ile Ile Thr Phe Lys Ser Gly Ala Thr 35 40 45 Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp Ser Gln Lys Lys 50 55 60 Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Thr Tyr Leu Thr Glu 65 70 75 80 Thr Lys Ile Asp Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro Asn Ser 85 90 95 Ile Ala Ala Ile Ser Met Glu Asn Thr Ile Thr Gly Asp Thr Cys Asn 100 105 110 Glu Glu Thr Gln Asn Leu Ser Thr Ile Tyr Leu Arg Lys Tyr Gln Ser 115 120 125 Lys Val Lys Arg Gln Ile Phe Ser Asp Tyr Gln Ser Glu Val Asp Ile 130 135 140 Tyr Asn Arg Ile Arg Asp Glu Leu Tyr Pro Gln Asp Pro Ile Ser Met 145 150 155 160 Lys Lys Ile Ser Arg Lys Glu Tyr Val Ser Met Tyr Gly Pro Thr Thr 165 170 175 Gly Asp Lys Val Arg Leu Gly Asp Thr Asp Leu Ile Ala Glu Val Glu 180 185 190 His Asp Tyr Thr Ile Tyr Gly Glu Glu Leu Lys Phe Gly Gly Gly Lys 195 200 205 Thr Leu Arg Glu Gly Met Ser Gln Ser Ser Asn Pro Ser Lys Glu Glu 210 215 220 Leu Asp Leu Ile Ile Thr Asn Ala Leu Ile Val Asp Tyr Thr Gly Ile 225 230 235 240 Tyr Lys Ala Asp Ile Gly Ile Lys Asp Gly Lys Ile Ala Gly Ile Gly 245 250 255 Lys Gly Gly Asn Lys Asp Met Gln Asp Gly Val Lys Asn Asn Leu Ser 260 265 270 Val Gly Pro Ala Thr Glu Ala Leu Ala Gly Glu Gly Leu Ile Val Thr 275 280 285 Ala Gly Gly Ile Asp Thr His Ile His Phe Ile Ser Pro Gln Gln Ile 290 295 300 Pro Thr Ala Phe Ala Ser Gly Val Thr Thr Met Ile Gly Gly Gly Thr 305 310 315 320 Gly Pro Ala Asp Gly Thr Asn Ala Thr Thr Ile Thr Pro Gly Arg Arg 325 330 335 Asn Leu Lys Trp Met Leu Arg Ala Ala Glu Glu Tyr Ser Met Asn Leu 340 345 350 Gly Phe Leu Ala Lys Gly Asn Thr Ser Asn Asp Ala Ser Leu Ala Asp 355 360 365 Gln Ile Glu Ala Gly Ala Ile Gly Phe Lys Ile His Glu Asp Trp Gly 370 375 380 Thr Thr Pro Ser Ala Ile Asn His Ala Leu Asp Val Ala Asp Lys Tyr 385 390 395 400 Asp Val Gln Val Ala Ile His Thr Asp Thr Leu Asn Glu Ala Gly Cys 405 410 415 Val Glu Asp Thr Met Ala Ala Ile Ala Gly Arg Thr Met His Thr Phe 420 425 430 His Thr Glu Gly Ala Gly Gly Gly His Ala Pro Asp Ile Ile Lys Val 435 440 445 Ala Gly Glu His Asn Ile Leu Pro Ala Ser Thr Asn Pro Thr Ile Pro 450 455 460 Phe Thr Val Asn Thr Glu Ala Glu His Met Asp Met Leu Met Val Cys 465 470 475 480 His His Leu Asp Lys Ser Ile Lys Glu Asp Val Gln Phe Ala Asp Ser 485 490 495 Arg Ile Arg Pro Gln Thr Ile Ala Ala Glu Asp Thr Leu His Asp Met 500 505 510 Gly Ile Phe Ser Ile Thr Ser Ser Asp Ser Gln Ala Met Gly Arg Val 515 520 525 Gly Glu Val Ile Thr Arg Thr Trp Gln Thr Ala Asp Lys Asn Lys Lys 530 535 540 Glu Phe Gly Arg Leu Lys Glu Glu Lys Gly Asp Asn Asp Asn Phe Arg 545 550 555 560 Ile Lys Arg Tyr Leu Ser Lys Tyr Thr Ile Asn Pro Ala Ile Ala His 565 570 575 Gly Ile Ser Glu Tyr Val Gly Ser Val Glu Val Gly Lys Val Ala Asp 580 585 590 Leu Val Leu Trp Ser Pro Ala Phe Phe Gly Val Lys Pro Asn Met Ile 595 600 605 Ile Lys Gly Gly Phe Ile Ala Leu Ser Gln Met Gly Asp Ala Asn Ala 610 615 620 Ser Ile Pro Thr Pro Gln Pro Val Tyr Tyr Arg Glu Met Phe Ala His 625 630 635 640 His Gly Lys Ala Lys Tyr Asp Ala Asn Ile Thr Phe Val Ser Gln Ala 645 650 655 Ala Tyr Asp Lys Gly Ile Lys Glu Glu Leu Gly Leu Glu Arg Gln Val 660 665 670 Leu Pro Val Lys Asn Cys Arg Asn Ile Thr Lys Lys Asp Met Gln Phe 675 680 685 Asn Asp Thr Thr Ala His Ile Glu Val Asn Pro Glu Thr Tyr His Val 690 695 700 Phe Val Asp Gly Lys Glu Val Thr Ser Lys Pro Ala Thr Lys Val Ser 705 710 715 720 Leu Ala Gln Leu Phe Ser Ile Phe 725 <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial primer sequence P1 <400> 3 catatggctc ctcagtctat tacagaacta tgttc 35 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial primer sequence P2 <400> 4 tgatatcgga tcctgagggt agttttccat actgattgcc 40 <210> 5 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial primer sequence P3 <400> 5 taccctcagg atccgatatc aatgaaaaag attagcag 38 <210> 6 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial primer sequence P4 <400> 6 catatgctag aaaatgctaa agagttgtgc caagc 35

Claims (10)

  1. 장독성 대장균의 이열성 엔테로톡신의 A2 서브유니트 및 B 서브유니트와, 헬리코박터 파일로리의 우레아제 B 서브유니트의 융합에 의하여 형성된 재조합 단백질.
  2. 제 1항의 재조합 단백질을 캡슐화하여 얻은 서방성 미소구체 캡슐화된 경구용 제제.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 캡슐화 물질은 알긴산 나트륨, 식물성 오일, 염화칼슘 및 키토산을 포함하는 경구용 제제.
  4. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 상기 경구용 제제의 입경은 3.33㎛인 경구용 제제.
  5. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 상기 경구용 제제는 동결건조 제제인 경구용 제제.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 동결건조 제제의 부형제는 8% 만니톨이고, 안정화제 는 0.05% EDTA-Na2 이며, 최적 pH값은 10.0인 경구용 제제
  7. 제 1항의 재조합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로서, 상기 서열은 장독성 대장균의 이열성 엔테로톡신의 A2 서브유니트를 암호화하는 유전자 및 B 서브유니트를 암호화하는 유전자와, 헬리코박터 파일로리의 우레아제 B 서브유니트를 암호화하는 유전자의 융합에 의해 형성된 ltA2B-ureB 인 뉴클레오티드 서열.
  8. 제 7항의 뉴클레오티드 서열과 플라스미드 pET-11c의 결찰 처리(ligation)에 의해 형성된 재조합 플라스미드.
  9. (1) 헬리코박터 파일로리의 우레아제 B 서브유니트 UreB와 장독성 대장균의 이열성 엔테로톡신 LTA2B의 서브유니트의 암호화 뉴클레오티드 서열을 각각 클로닝하거나, 상기의 서열과 95%의 상동성을 갖고 또한 이들의 단백질 활성을 가진 아미노산 서열의 암호화 뉴클레오티드 서열을 클로닝하고;
    (2) PCR 중복법을 통해 상기 단계 (1)의 클로닝으로 수득된 뉴클레오티드 서열을 결찰 처리하여 융합 유전자 ltA2B-ureB를 형성하고;
    (3) 융합 유전자 ltA2B-ureB를 벡터 상에서 구축하고, 숙주를 형질전환시키고, 재조합 단백질 LTA2B-UreB를 발현시키고;
    (4) 상기 단계 (3)에서 수득된 재조합 단백질을 분리 정제하는 단계를 포함 하는 제1항에 따른 재조합 단백질의 제조방법.
  10. (1) 제 9항에서 수득한 재조합 단백질을 알긴산 나트륨, 식물성 오일, 염화칼슘 및 키토산과 소정의 비율로 섞어 분해성의 서방성 미소구체-캡슐화된 제제로 제조하고;
    (2) 선택적으로 상기 서방성 미소구체-캡슐화된 제제를 동결건조 산물로 제조하는 단계를 포함하는 경구용 재조합 헬리코박터 파일로리 백신의 제조방법.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160086492A (ko) * 2015-01-09 2016-07-20 주식회사 엘지생활건강 캡슐화한 콘키올린을 함유한 화장료 조성물
KR20160093719A (ko) * 2013-12-06 2016-08-08 상하이 유나이티드 셀 바이오테크놀로지 컴퍼니 리미티드 항원 키메라, 항원 조성물, 백신, 이의 제조 방법 및 카세트

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103339250B (zh) * 2010-06-25 2016-04-13 翁德克控股有限公司 控制幽门螺杆菌感染的持续性的工具
US20150044251A1 (en) * 2011-12-23 2015-02-12 Novartis Ag Stable compositions for immunising against staphylococcus aureus
WO2013132891A1 (ja) * 2012-03-08 2013-09-12 ソニー株式会社 核酸増幅反応用マイクロチップの製造方法
PL218700B1 (pl) 2012-03-29 2015-01-30 Gdański Univ Medyczny Doustna szczepionka zawierająca przetrwalniki Bacillus subtilis oraz jej zastosowanie do immunizacji przeciwko Helicobacter pylori
EP2844301A2 (en) * 2012-05-04 2015-03-11 Ineb-instituto de Engenharia Biomédica Microspheres for treating helicobacter pylori infections
ZA201602963B (en) * 2015-05-07 2017-07-26 Csir Method for encapsulating pharmaceutical actives
KR20180096643A (ko) 2015-12-14 2018-08-29 테크니쉐 유니베르시테트 뮌헨 헬리코박터 파일로리 백신
EP3272354A1 (en) 2016-07-20 2018-01-24 Technische Universität München Agents and methods for the prevention or treatment of h. pylori infections
CN107184967A (zh) * 2017-03-27 2017-09-22 广州市妇女儿童医疗中心 一种基于枯草芽孢载体的幽门螺杆菌口服疫苗
CN109280669A (zh) * 2017-07-21 2019-01-29 刘开云 大肠杆菌不耐热肠毒素基因片段及其应用
CN107298716A (zh) * 2017-07-21 2017-10-27 成都亿妙生物科技有限公司 一种重组幽门螺杆菌蛋白疫苗及其制备方法
CN110075290A (zh) * 2018-01-25 2019-08-02 吴夙钦 流感黏膜疫苗组合物及其制备方法与应用
CN113144182B (zh) * 2021-04-22 2023-03-10 成都欧林生物科技股份有限公司 一种幽门螺杆菌口服缓释疫苗及其制备与应用
CN113151334A (zh) * 2021-04-22 2021-07-23 成都亿妙生物科技有限公司 一种幽门螺杆菌LuxS六聚体重组蛋白的发酵和纯化工艺

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1188416A (zh) * 1995-04-28 1998-07-22 奥拉瓦克斯有限公司 多体的重组尿素酶疫苗
US5837240A (en) * 1995-04-28 1998-11-17 Oravax-Merieux Co. Multimeric, recombinant urease vaccine
DE69637947D1 (de) * 1995-04-28 2009-07-23 Merieux Oravax Snc Multimerer, rekombinanter urease impfstoff
EP1105159A2 (en) * 1998-06-19 2001-06-13 Mérieux Oravax Lt and ct in parenteral immunization methods against helicobacter infection
US20030235557A1 (en) * 1998-09-30 2003-12-25 Corixa Corporation Compositions and methods for WT1 specific immunotherapy
ATE478145T1 (de) * 1999-06-02 2010-09-15 Genentech Inc Sekretierte und transmembran polypeptide und dafür kodierende nukleinsäuren
AU2001271268A1 (en) * 2000-05-19 2001-12-03 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Hybrid lt-a/ct-b holotoxin for use as an adjuvant
EP1379275A4 (en) * 2001-03-14 2005-12-21 Centocor Inc IMMUNOGLOBULIN-ASSOCIATED PROTEINS ASSOCIATED WITH OBSTRUCTIVE CHRONIC BRONCHOPNEUMOPATHY, COMPOSITIONS, METHODS AND USES
JP4902103B2 (ja) * 2002-04-11 2012-03-21 メディミューン・エルエルシー 凍結乾燥フォームによる生物活性材料の保存
ITMI20031617A1 (it) * 2003-08-06 2005-02-07 Fond Carlo E Dirce Callerio Onlus Microcapsule a doppio strato di polisaccaridi utilizzabili
KR100673872B1 (ko) * 2004-04-19 2007-01-25 학교법인 성균관대학 요로감염증의 예방 및 치료를 위한 재조합 디엔에이,플라스미드, 형질전환 미생물 및 경구용 백신 단백질
US20060141021A1 (en) * 2004-12-29 2006-06-29 Industrial Technology Research Polymeric microspheres and method for preparing the same
WO2007117339A2 (en) * 2006-01-11 2007-10-18 The United States Of America As Respresented By The Secretary Of The Navy Adhesin-enterotoxin chimera based immunogenic composition against entertoxigenic escherichia coli

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160093719A (ko) * 2013-12-06 2016-08-08 상하이 유나이티드 셀 바이오테크놀로지 컴퍼니 리미티드 항원 키메라, 항원 조성물, 백신, 이의 제조 방법 및 카세트
KR20160086492A (ko) * 2015-01-09 2016-07-20 주식회사 엘지생활건강 캡슐화한 콘키올린을 함유한 화장료 조성물

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Publication number Publication date
HK1137337A1 (en) 2010-07-30
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EP2082750B1 (en) 2011-05-25
JP2010502199A (ja) 2010-01-28
WO2008040155A8 (zh) 2009-07-30

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