KR101699521B1 - 돌연변이된 대장균 이열성 엔테로톡신 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항원보강제로 사용될 수 있는 돌연변이된 대장균 이열성 엔테로톡신(LT) 소단위체 A에 관한 것이다. 상기 소단위체 A 돌연변이체는 야생형 LT의 61번의 위치에 상당하는 위치에 아미노산 치환을 갖는다. 상기 돌연변이된 소단위체 A를 포함하는 LT는 그에 대응되는 야생형에 비하여 감소된 독성을 보인다.
대장균 이열성 엔테로톡신, LT, 돌연변이, 항원보강제, 소단위체

Description

돌연변이된 대장균 이열성 엔테로톡신{MUTATED E.COLI HEAT-LABILE ENTEROTOXIN}
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2007년 7월 18일에 출원된 미국 특허 출원 제11/779,419호로부터의 우선권을 주장하며, 상기 문헌의 전체 내용이 참고로 본원에 포함된다.
기술분야
본 발명은 항원보강제로 사용될 수 있는 돌연변이된 대장균 이열성 엔테로톡신(LT) 소단위체 A에 관한 것이다. 상기 돌연변이된 소단위체 A는 야생형 LT의 61번의 위치에 상당하는 위치에 아미노산 치환을 갖는다. 상기 돌연변이된 소단위체 A를 포함하는 LT는 그에 대응되는 야생형에 비하여 감소된 독성을 보인다.
장독소형 대장균 균주는 2가지 타입의 엔테로톡신, 즉, 이열성 독소(LT) 및 내열성 독소(ST)를 생성함으로써 사람 및 가축에게 설사를 일으킨다(Hofstra 등, 1984, J. Bio. Chem. 259:15182-15187). LT는 기능적, 구조적 및 면역학적으로 콜레라 독소(CT)와 관련있다(Clements 등, 1978, Infect . Immun . 21:1036-1039). LT 및 CT는 5개의 동일한 소단위체 B 및 효소적으로 활성인 소단위체 A로 구성된 홀로 톡신 분자(AB5)로 합성된다(Spangler, 1992, Microbio. Rev. 56(4):622-647). 상기 B 펜타머는 장상피세포 막 내의 강글리오시드 GM1과 결합하거나 또는 GM1을 포함하는 다른 세포와 결합한다(van Heyningen, 1974, Science 183:656-657). 세포 표면상에서 GM1과 소단위체 B와의 결합이 일어난 후에, 소단위체 A는 세포질 내로 삽입되고 단백질 가수분해로 절단되며, 하나의 이황화 결합에서 환원되어 효소적으로 활성인 A1 펩타이드 및 더 작은 A2 펩타이드가 생성된다(Fishman PH, 1982, J. Membr. Biol. 69:85-97; Mekalanos 등, 1979, J. Biol. Chem. 254:5855-5861; Moss 등, 1981, J. Biol. Chem. 256:12861-12865). 상기 A1 펩타이드는 NAD와 결합할 수 있으며, 아데닐레이트 사이클레이즈와 관련된 GTP-결합 조절 단백질인 Gsα의 ADP-리보실화를 촉매할 수 있다(Spangler, 1992, Microbio. Rev. 56(4)622-647). 상기 결과로 인한 cAMP의 증가는 결국 감염된 세포들로부터 전해질 및 체액의 방출을 유발한다(Cheng 등, 2000, Vaccine 18:38-49).
LT는 점액성 항원보강제(mucosal adjuvant)로 기능하고, 점액성으로 공동 투여된 항원들에 대하여 면역 반응을 유도한다는 사실이 밝혀졌다(Clements 등, 1988, Vaccine 6:269-277; Elson CO. 1989, Immunol. Today 146:29-33; Spangler, 1992, Microbio. Rev. 56(4):622-647). 그러나, 야생형 LT의 높은 독성으로 인해 임상적 사용이 제한되었다. 따라서, 면역원성(immunogenicity)은 유지하면서 독성은 감소된 돌연변이 LT를 생성하는 것이 바람직하다.
본원에 사용된 "대장균 이열성 엔테로톡신(E.coli heat-labile enterotoxin)" 또는 "LT"란 용어는 특정 장독소형 대장균 균주에 의해 생산된 이열성 엔테로톡신을 의미한다. "대장균 이열성 엔테로톡신 소단위체 A" 또는 "LTA"라는 용어는 LT의 소단위체 A를 의미한다. 이는 시그널 펩타이드를 갖는 전구체 LTA 및 시그널 펩타이드가 제거된 성숙 LTA 양쪽을 모두 포함한다.
본 발명의 요약
본 발명은 돌연변이 LTA를 포함하는 LT가 면역원성은 유지하면서도 야생형 LT에 비하여 감소된 독성을 나타낸다는 사실을 우연히 발견한 데에 기초한다. 상기 돌연변이 LTA는 야생형 LTA의 61번의 위치에 상당하는 위치에서 아미노산 치환을 가지는데, 상기 야생형 LTA의 아미노산 서열인 서열번호 5는 하기에 예시되어 있다.
따라서, 본 발명은 서열번호 5의 61번의 위치에 상당하는 위치에서, S, T 및 F 이외의 아미노산 잔기를 포함하는 돌연변이 LTA를 포함하는 단리된 폴리펩타이드에 관한 것이다. 상기 치환되는 아미노산 잔기는 D, E, H, I, K, L, N, P, Q, R, Y 또는 W일 수 있다. 이는 자연적으로 발생하는 아미노산일 수도 있으며, 또는 D-아미노산이나 β-아미노산과 같은 비-자연적으로 발생하는 아미노산일 수도 있다. 일 실시예에서, 상기 LTA는 서열번호 2, 4, 8 또는 10의 아미노산 서열을 갖는다. 이러한 돌연변이 LTA를 포함하는 LT는 감소된 독성을 보이는데, 즉, 서열번호 5를 갖는 야생형 LT 독성보다 ＜10-5배의 독성을 보인다.
다른 관점에서, 본 발명은 항원 및 상술한 돌연변이된 LTA를 포함하는 백신에 관한 것이다. 상기 백신은 LT 소단위체 B를 추가로 포함할 수 있는데, 이는 돌연변이 LTA와 함께 전체 LT 단백질을 구성한다. 상기 항원은 박테리아 또는 바이러스 중 어느 하나로부터 유래될 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상술한 LTA 돌연변이체를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 핵산에 관한 것이다. 일 실시예에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1, 3, 7 또는 9이다. 또한, 본 발명의 범주 내에는 상술한 핵산을 포함하는 벡터 및 상기 벡터를 포함하는 형질전환된 세포를 포함한다.
본 발명의 하나 이상의 구현예들에 대한 상세한 설명은 하기에 기술된다. 본 발명의 다른 특성, 목표 및 장점들은 본 발명의 상세한 설명 및 청구항들로부터 명백해질 것이다.
본 발명의 상세한 설명
예를 들어, 돌연변이 LTA를 포함하는 해독된(detoxified) LT는 그의 높은 면역원성으로 인하여 백신 항원보강제(adjuvant)로 바람직하다. 이러한 목적을 달성하기 위하여 고안된 본 발명의 상기 돌연변이된 LTA는 서열번호 5의 61번의 위치에 상당하는 위치에서 LTA 내의 아미노산 치환을 도입함으로써 수득된다. 상이한 장독소형 대장균 균주에 의해 생성된 LTA는 상동성이 매우 높다. 따라서, LTA의 아미노산 서열과 서열번호 5를 비교함으로써, 당업자는 상기 LTA 내의 어느 위치가 서열번호 5의 61번째 위치에 상당하는지를 찾을 수 있다. 서열번호 5의 LTA와 같이, 거의 모든 야생형 LTA는 서열번호 5의 61번의 위치에 상당하는 위치에서 세린을 포함한다. 예를 들어, 크기나 극성이 세린과 상이한 아미노산이 치환체로 사용될 수 있다. 치환체 아미노산의 예로는 소수성 아미노산 잔기(예: I 및 L), 전하를 띤 아미노산 잔기(예: D, E, K, R 및 H), 또는 벌키한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기(예: N, Q, Y 및 W)를 포함한다. 프롤린은 또한 치환체로 사용될 수 있는데, 이는 일반적으로 폴리펩타이드의 국부적인 구조를 변경한다. 이들 치환체 아미노산은 비-자연적으로 발생된 아미노산, 예를 들어, D-아미노산 또는 β-아미노산을 포함한다.
본 발명의 LTA 돌연변이체는 당해 분야에서 공지된 방법들에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 돌연변이체는 하기와 같은 재조합 방법에 의해 제조된다. 야생형 LTA를 코딩하는 cDNA를 장독소형 대장균 균주로부터 분리하고, 특정 부위에 돌연변이를 일으켜 원하는 LTA 돌연변이체를 코딩하는 cDNA를 제작한다(참조: Ho 등, Gene, 77:51-59, 1989). 그 후, 돌연변이를 포함하는 cDNA를 발현벡터에 삽입하여 형질전환된 세포를 수득한다. 마지막으로, 상기 형절전환된 세포 내에 생성된 LTA 돌연변이체를 정제하고 LT 소단위체 B와 조합하여 전체 LT 단백질을 형성시킨다.
상술한 LTA 돌연변이체를 포함하는 LT의 독성은 Y-1 부신 세포 분석과 같은 분석법을 사용하여 평가할 수 있다(참조: Cheng 등, Vaccine, 18:38-49, 2000).
본 발명의 LTA 돌연변이체는 백신 내의 항원보강제로 사용될 수 있다. 상기 백신(즉, 인간 백신 또는 동물 백신)은 항원 및 LTA 돌연변이체 자체 또는 LTA 돌연변이체를 포함하는 LT를 포함할 수 있다. 상기 항원은 박테리아로부터 유래될 수 있는데, 예를 들어, 화농성 연쇄구균(Streptococcus pyogenes), 폐렴 연쇄구균(Streptococcus pneumoniae), 임질균(Neiseria gonorrhoea), 수막 구균(Neisseria meningitides), 디프테리아균(Corynebacterium diphtheriae), 보툴리눔균(Clostridium botulinum), 가스괴저균(Clostridium perfringens), 파상풍균(Clostridium tetani), 헤모필러스 인플루엔자균(haemophilus influenzae), 폐렴간균(Klebsiella pneumoniae), 클렙시엘라 오제네(Klebsiella ozaenae), 포도상구균(Staphylococcus aureus), 콜레라균(Vibrio cholerae), 대장균(Escherichia coli), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 에로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 페스트균(Yersinia pestis), 살모넬라균(Salmonella typhimurium), 매독균(Treponema pallidum), 보렐리아 빈센티(Borrelia vincentii), 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi), 결핵균(Mycobacterium tuberculosis), 폐포자충(Pneumocystis carinii), 마이코플라즈마 종(Mycoplasma spp.), 발진티푸스균(Rickettsia prowazeki), 클라미디아 종(Chlamydia spp.), 헬리코박터 파이로리균(Helicobacter pylori)으로부터 유래될 수 있다. 또한, 상기 항원은 바이러스로부터 유래될 수도 있는데, 예를 들어, 인플루엔자(influenza), 단순포진 바이러스(herpes simplex virus), 인간 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus), 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus), C형 간염 바이러스(hepatitis c virus), 델타 간염 바이러스(delta hepatitis virus), 폴리오바이러스(poliovirus), A형 간염 바이러스(hepatitis A virus), B형 간염 바이러스(hepatitis B virus), 엡스타인-바 바이러스(Epstein-barr virus), 대상포진 바이러스(varicella zoster virus), 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus), 장바이러스(enterovirus) 또는 일본뇌염 바이러스(Japanese encephalitis virus)로 부터 유래될 수 있다.
상기 백신은 인산 완충 식염수 또는 중탄산염과 같은 약제학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 담체는 투여 방법 및 경로, 그리고 표준 약제학 지침에 기초하여 선택된다. 약제학적 용도를 위한 필수성분뿐만 아니라 적절한 약제학적 담체 및 희석제들은 레밍턴의 약제 과학(Remington's Pharmaceutical Sciences)에 기술되어 있다.
백신 제조방법은 일반적으로 당해 분야에 널리 알려져 있으며, 예를 들어, 미국특허 제4,601,903호; 제4,599,231호; 제4,599,230호; 및 제4,596,792호에 예시된다. 백신은 주사용 물질, 액상 용액 또는 에멀젼으로 제조될 수 있다. 상기 항원 및 LTA 돌연변이체 또는 이를 포함하는 LT는 생리학적으로 허용가능한 부형제들과 혼합될 수 있는데, 상기 부형제들은 물, 식염수, 덱스트로스, 글라이세롤, 에탄올 및 이의 조합을 포함할 수 있다. 상기 백신은 상기 백신의 유효성을 증강시키기 위하여 습식제 또는 유화제와 같은 소량의 보조 물질, 또는 pH 완충제를 추가로 포함할 수 있다. 백신은 비경구적으로, 피하 주사 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 대안적으로, 좌약, 경구 또는 국부 제형을 포함하는 다른 투여방식이 바람직할 수 있다. 좌약에 있어서, 결합제 및 담체는 예를 들어, 폴리알칼렌 글리콜 또는 트라이글리세라이드를 포함할 수 있다. 경구 제형은 예를 들어, 약제 등급의 사카린, 셀룰로스, 마그네슘 카보네이트 등과 같은 통상 이용되는 부형제를 포함할 수 있다. 이들 조성물들은 용액, 현탁액, 정제, 알약, 캡슐, 지속방출 제형 또는 파우더의 형태를 취한다.
상기 백신은 투약 제형에 적합한 방식으로 투여되며, 치료적으로 유효하고 방어효과를 나타내며 면역성이 생기게 하는 양으로 투여된다. 상기 투여될 양은 치료받을 개체에 좌우되는데, 예를 들어, 항체를 합성하는 각 개체의 면역 시스템의 능력, 필요한 경우 세포-매개의 면역 반응을 생성하는 능력에 좌우된다. 투여가 요구되는 정확한 활성 성분의 양은 의료 전문가의 판단에 따른다. 그러나, 적합한 투여 범위는 당해 분야의 숙련자에 의해 용이하게 결정될 수 있으며, 본 발명의 폴리펩타이드가 마이크로그램 단위로 결정될 것이다. 초기 투여 및 추가 투여에 대한 적합한 처방 계획 또한 가변적이지만, 초기 투여에 이은 후속 투여를 포함할 수 있다. 상기 백신의 투약량은 또한 투여 경로에 좌우될 수 있으며, 숙주의 크기에 따라 다르다.
하기의 특정 실시예들은 단순히 예시를 위해 고안된 것이며, 본 개시의 나머지 부분을 어떠한 방식으로든 제한하려는 것이 아니다. 추가적인 상세 설명이 없이도, 당업자는 본원의 설명에 의존하여 본 발명을 최대한의 범위로 이용할 수 있으리라 믿어진다. 본원에 인용된 모든 문헌들은 참고로 그 전체가 본원에 포함된다.
실시예 1: 야생형 LT A , LT 및 돌연변이된 LT A 를 코딩하는 유전자의 구축
소단위체 A 및 소단위체 B를 포함하는 1.8kb DNA 절편의 LT 유전자를 인간 장독소형 대장균 H10407로부터 단리하였으며, pBluescript II KS(-) 벡터(pBluescript-LThWT) 내로 복제하였다. 상기 LT 유전자(소단위체 A 및 B 모두를 코딩하는 유전자)의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 6) 및 상기 LT의 소단위체 A의 아미노산 서열(서열번호 5)은 하기와 같다:
LT(소단위체 A:1-777; 소단위체 B: 774-1148)의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 6)
atgaaaaata taactttcat tttttttatt ttattagcat cgccattata tgcaaatggc 60
gacaaattat accgtgctga ctctagaccc ccagatgaaa taaaacgttc cggaggtctt 120
atgcccagag ggcataatga gtacttcgat agaggaactc aaatgaatat taatctttat 180
gatcacgcga gaggaacaca aaccggcttt gtcagatatg atgacggata tgtttccact 240
tctcttagtt tgagaagtgc tcacttagca ggacagtcta tattatcagg atattccact 300
tactatatat atgttatagc gacagcacca aatatgttta atgttaatga tgtattaggc 360
gtatacagcc ctcacccata tgaacaggag gtttctgcgt taggtggaat accatattct 420
cagatatatg gatggtatcg tgttaatttt ggtgtgattg atgaacgatt acatcgtaac 480
agggaatata gagaccggta ttacagaaat ctgaatatag ctccggcaga ggatggttac 540
agattagcag gtttcccacc ggatcaccaa gcttggagag aagaaccctg gattcatcat 600
gcaccacaag gttgtggaaa ttcatcaaga acaattacag gtgatacttg taatgaggag 660
acccagaatc tgagcacaat atatctcagg aaatatcaat caaaagttaa gaggcagata 720
ttttcagact atcagtcaga ggttgacata tataacagaa ttcggaatga attatgaata 780
aagtaaaatg ttatgtttta tttacggcgt tactatcctc tctatgtgca tacggagctc 840
cccagtctat tacagaacta tgttcggaat atcgcaacac acaaatatat acgataaatg 900
acaagatact atcatatacg gaatcgatgg caggcaaaag agaaatggtt atcattacat 960
ttaagagcgg cgcaacattt caggtcgaag tcccgggcag tcaacatata gactcccaaa 1020
aaaaagccat tgaaaggatg aaggacacat taagaatcac atatctgacc gagaccaaaa 1080
ttgataaatt atgtgtatgg aataataaaa cccccaattc aattgcggca atcagtatg 1140
aaaactag
성숙 LTA의 아미노산 서열(서열번호 5)
NGDKLYRADS RPPDEIKRSG GLMPRGHNEY FDRGTQMNIN LYDHARGTQT GFVRYDDGYV 60
STSLSLRSAH LAGQSILSGY STYYIYVIAT APNMFNVNDV LGVYSPHPYE QEVSALGGIP 120
YSQIYGWYRV NFGVIDERLH RNREYRDRYY RNLNIAPAED GYRLAGFPPD HQAWREEPWI 180
HHAPQGCGNS SRTITGDTCN EETQNLSTIY LRKYQSKVKR QIFSDYQSEV DIYNRIRNEL 240
부위 특이적 돌연변이 방법을 사용하여 다양한 LTA 돌연변이체를 구축하였다(Ho 등, 1989, Gene 77, 51-59). 보다 구체적으로, 서열번호 5의 61번 위치의 세린을 각각 K, R, H, Y 및 F로 치환시킴으로써, LTA(S61K), LTA(S61R), LTA(S61H), LTA(S61Y) 및 LTA(S61F)를 포함하는 LTA 돌연변이체를 구축하였다. 이들 돌연변이체를 구축하기 위하여 하기의 올리고뉴클레오타이드 프라이머들이 사용되었다: LTA(S61K)[5' TCT CAA ACT AAG AGA AGT TTT AAC ATA TCC GTC ATC ATA 3'](서열번호 11), LTA(S61R)[5' ACT TCT CAA ACT AAG AGA AGT TCT AAC ATA TCC GTC ATC 3'](서열번호 12), LTA(S61F)[5' ACT TCT CAA ACT AAG AGA AGT GAA AAC ATA TCC GTC ATC 3'](서열번호 13), LTA(S61Y)[5' ACT TCT CAA ACT AAG AGA AGT ATA AAC ATA TCC GTC ATC 3'](서열번호 14), LTA(S61H)[5' ACT TCT CAA ACT AAG AGA AGT ATG AAC ATA TCC GTC ATC 3'](서열번호 15). 이들 LTA들의 뉴클레오타이드 서열 및 아미노산 서열은 하기와 같다:
LTA(S61K)의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 1)
atgaaaaata taactttcat tttttttatt ttattagcat cgccattata tgcaaatggc 60
gacaaattat accgtgctga ctctagaccc ccagatgaaa taaaacgttc cggaggtctt 120
atgcccagag ggcataatga gtacttcgat agaggaactc aaatgaatat taatctttat 180
gatcacgcga gaggaacaca aaccggcttt gtcagatatg atgacggata tgttaaaact 240
tctcttagtt tgagaagtgc tcacttagca ggacagtcta tattatcagg atattccact 300
tactatatat atgttatagc gacagcacca aatatgttta atgttaatga tgtattaggc 360
gtatacagcc ctcacccata tgaacaggag gtttctgcgt taggtggaat accatattct 420
cagatatatg gatggtatcg tgttaatttt ggtgtgattg atgaacgatt acatcgtaac 480
agggaatata gagaccggta ttacagaaat ctgaatatag ctccggcaga ggatggttac 540
agattagcag gtttcccacc ggatcaccaa gcttggagag aagaaccctg gattcatcat 600
gcaccacaag gttgtggaaa ttcatcaaga acaattacag gtgatacttg taatgaggag 660
acccagaatc tgagcacaat atatctcagg aaatatcaat caaaagttaa gaggcagata 720
ttttcagact atcagtcaga ggttgacata tataacagaa ttcggaatga attatga 777
LTA(S61K)의 아미노산 서열(서열번호 2)
NGDKLYRADS RPPDEIKRSG GLMPRGHNEY FDRGTQMNIN LYDHARGTQT GFVRYDDGYV 60
KTSLSLRSAH LAGQSILSGY STYYIYVIAT APNMFNVNDV LGVYSPHPYE QEVSALGGIP 120
YSQIYGWYRV NFGVIDERLH RNREYRDRYY RNLNIAPAED GYRLAGFPPD HQAWREEPWI 180
HHAPQGCGNS SRTITGDTCN EETQNLSTIY LRKYQSKVKR QIFSDYQSEV DIYNRIRNEL 240
LTA(S61R)의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 3)
atgaaaaata taactttcat tttttttatt ttattagcat cgccattata tgcaaatggc 60
gacaaattat accgtgctga ctctagaccc ccagatgaaa taaaacgttc cggaggtctt 120
atgcccagag ggcataatga gtacttcgat agaggaactc aaatgaatat taatctttat 180
gatcacgcga gaggaacaca aaccggcttt gtcagatatg atgacggata tgttagaact 240
tctcttagtt tgagaagtgc tcacttagca ggacagtcta tattatcagg atattccact 300
tactatatat atgttatagc gacagcacca aatatgttta atgttaatga tgtattaggc 360
gtatacagcc ctcacccata tgaacaggag gtttctgcgt taggtggaat accatattct 420
cagatatatg gatggtatcg tgttaatttt ggtgtgattg atgaacgatt acatcgtaac 480
agggaatata gagaccggta ttacagaaat ctgaatatag ctccggcaga ggatggttac 540
agattagcag gtttcccacc ggatcaccaa gcttggagag aagaaccctg gattcatcat 600
gcaccacaag gttgtggaaa ttcatcaaga acaattacag gtgatacttg taatgaggag 660
acccagaatc tgagcacaat atatctcagg aaatatcaat caaaagttaa gaggcagata 720
ttttcagact atcagtcaga ggttgacata tataacagaa ttcggaatga attatga 777
LTA(S61R)의 아미노산 서열(서열번호 4)
NGDKLYRADS RPPDEIKRSG GLMPRGHNEY FDRGTQMNIN LYDHARGTQT GFVRYDDGYV 60
RTSLSLRSAH LAGQSILSGY STYYIYVIAT APNMFNVNDV LGVYSPHPYE QEVSALGGIP 120
YSQIYGWYRV NFGVIDERLH RNREYRDRYY RNLNIAPAED GYRLAGFPPD HQAWREEPWI 180
HHAPQGCGNS SRTITGDTCN EETQNLSTIY LRKYQSKVKR QIFSDYQSEV DIYNRIRNEL 240
LTA(S61H)의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 7)
atgaaaaata taactttcat tttttttatt ttattagcat cgccattata tgcaaatggc 60
gacaaattat accgtgctga ctctagaccc ccagatgaaa taaaacgttc cggaggtctt 120
atgcccagag ggcataatga gtacttcgat agaggaactc aaatgaatat taatctttat 180
gatcacgcga gaggaacaca aaccggcttt gtcagatatg atgacggata tgttcatact 240
tctcttagtt tgagaagtgc tcacttagca ggacagtcta tattatcagg atattccact 300
tactatatat atgttatagc gacagcacca aatatgttta atgttaatga tgtattaggc 360
gtatacagcc ctcacccata tgaacaggag gtttctgcgt taggtggaat accatattct 420
cagatatatg gatggtatcg tgttaatttt ggtgtgattg atgaacgatt acatcgtaac 480
agggaatata gagaccggta ttacagaaat ctgaatatag ctccggcaga ggatggttac 540
agattagcag gtttcccacc ggatcaccaa gcttggagag aagaaccctg gattcatcat 600
gcaccacaag gttgtggaaa ttcatcaaga acaattacag gtgatacttg taatgaggag 660
acccagaatc tgagcacaat atatctcagg aaatatcaat caaaagttaa gaggcagata 720
ttttcagact atcagtcaga ggttgacata tataacagaa ttcggaatga attatga 777
LTA(S61H)의 아미노산 서열(서열번호 8)
NGDKLYRADS RPPDEIKRSG GLMPRGHNEY FDRGTQMNIN LYDHARGTQT GFVRYDDGYV 60
HTSLSLRSAH LAGQSILSGY STYYIYVIAT APNMFNVNDV LGVYSPHPYE QEVSALGGIP 120
YSQIYGWYRV NFGVIDERLH RNREYRDRYY RNLNIAPAED GYRLAGFPPD HQAWREEPWI 180
HHAPQGCGNS SRTITGDTCN EETQNLSTIY LRKYQSKVKR QIFSDYQSEV DIYNRIRNEL 240
LTA(S61Y)의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 9)
atgaaaaata taactttcat tttttttatt ttattagcat cgccattata tgcaaatggc 60
gacaaattat accgtgctga ctctagaccc ccagatgaaa taaaacgttc cggaggtctt 120
atgcccagag ggcataatga gtacttcgat agaggaactc aaatgaatat taatctttat 180
gatcacgcga gaggaacaca aaccggcttt gtcagatatg atgacggata tgtttatact 240
tctcttagtt tgagaagtgc tcacttagca ggacagtcta tattatcagg atattccact 300
tactatatat atgttatagc gacagcacca aatatgttta atgttaatga tgtattaggc 360
gtatacagcc ctcacccata tgaacaggag gtttctgcgt taggtggaat accatattct 420
cagatatatg gatggtatcg tgttaatttt ggtgtgattg atgaacgatt acatcgtaac 480
agggaatata gagaccggta ttacagaaat ctgaatatag ctccggcaga ggatggttac 540
agattagcag gtttcccacc ggatcaccaa gcttggagag aagaaccctg gattcatcat 600
gcaccacaag gttgtggaaa ttcatcaaga acaattacag gtgatacttg taatgaggag 660
acccagaatc tgagcacaat atatctcagg aaatatcaat caaaagttaa gaggcagata 720
ttttcagact atcagtcaga ggttgacata tataacagaa ttcggaatga attatga 777
LTA(S61Y)의 아미노산 서열(서열번호 10)
NGDKLYRADS RPPDEIKRSG GLMPRGHNEY FDRGTQMNIN LYDHARGTQT GFVRYDDGYV 60
YTSLSLRSAH LAGQSILSGY STYYIYVIAT APNMFNVNDV LGVYSPHPYE QEVSALGGIP 120
YSQIYGWYRV NFGVIDERLH RNREYRDRYY RNLNIAPAED GYRLAGFPPD HQAWREEPWI 180
HHAPQGCGNS SRTITGDTCN EETQNLSTIY LRKYQSKVKR QIFSDYQSEV DIYNRIRNEL 240
비교를 위하여, EWD299(Dallas 등, 1979, J. Bacteriol. 139, 850-859)로부터 유래된 다른 LT 돌연변이체, LTp(S63K) 또한 소단위체 A의 아미노산 위치 63에서의 세린을 라이신으로 치환하여 구축하였다.
실시예 2: 야생형 LT, 및 돌연변이된 LT A 를 포함하는 LT의 제조
소단위체 A 및 소단위체 B 모두에 대한 유전자들을 포함하는, 야생 또는 돌연변이체 LT 유전자를 함유하는 pBluescript II KS(-) 벡터를 대장균 HB101 내로 형질전환하였다. ㎖당 100㎍의 암피실린이 보충된 L-배지를 포함하는 3-리터 플라스크 내에서 밤새 배양한 배양물로부터 상기 야생 및 돌연변이체 LT를 정제하였다. 상기 세포들을 원심분리로 수집하고, TEAN 완충액(0.2M NaCl, 50mM Tris, 1mM EDTA 및 3mM NaN3, pH7.4)으로 재현탁시켰으며, 마이크로플루다이저(Microfluidics 사, USA)로 세포용해하였다. 세포용해물을 원심분리를 사용하여 상청액으로 분리시킨 후, 고체 암모늄 설페이트를 65% 포화상태까지 첨가하여 분획하였다. 그 후, 상기 분획물을 TEAN 완충액으로 현탁하고, 동일 완충액에 대하여 완전히 투석하여 조(crude) LT로 사용하였다. 상기 조 LT를 4℃에서 TEAN 완충액으로 평형화시킨 고정화된 D-갈락토스(Pierce, Rockford, IL) 컬럼 상에서 크로마토그래피하였다(Uesaka 등, 1994, Microbial Pathogenesis 16:71-76). 야생 및 돌연변이체 LT를 TEAN 내의 0.3M 갈락토스로 용출시켰다. 각 정제된 독소를 생물학적 및 면역학적 분석을 위하여 PBS 완충액에 대해 투석하였다.
상기 정제된 야생형 및 돌연변이체 LT를 SDS-PAGE로 분리하였는데, LT 소단위체 A의 분자량은 약 28 내지 29kDa이었으며, LT 소단위체 B의 분자량은 약 12 내지 13kDa이었다. LTA(S61K), 즉 LTh(S61K) 및 LTA(S61R), 즉 LTh(S61R)를 포함하는 전체 LT의 수율은 서열번호 5의 LTA를 포함하는 LT와 비슷하였다.
LT의 AB5 헤테로헥사머 및 B5 펜타머를 pH 3-10의 등전점 전기영동 젤(invitrogen)로 분리하였다. AB5 및 B5 단백질 밴드의 세기를 UVIBand 소프트웨어(UVItec Limited)로 분석하여 AB5 헤테로헥사머 및 B5 펜타머의 비율을 계산하였는데(AB5의 등전점(pI) 값은 8.0 내지 7.8이었으며, B5의 pI 값은 8.3 내지 8.1이었다), 그 결과를 아래 표 1에 기록하였다.
야생형 LT, 및 돌연변이된 LTA를 포함하는 LT의 제조
대장균 이열성 엔테로톡신(LT) AB5/AB5+B5의 비율(%)
LTh(WT) 91(%)
LTh(S61K) 92(%)
LTh(S61R) 85(%)
LTh(S61H) 60(%)
LTh(S61F) 70(%)
LTh(S61Y) 57(%)
정제된 LTh(S61K) 및 LTh(S61R)의 AB5 비율은 약 90-100%이었다.
실시예 3: 야생형 LT, 및 돌연변이된 LTA를 포함하는 LT의 세포내 cAMP 농도에 대한 결정 효과
Caco-2 세포(ATCC HTB-37)를 20% FBS가 첨가된 MEM-α 배지를 사용하여 24-웰 플레이트에서 웰당 5×104 세포의 농도로 유지시키고, 거의 컨플루언시(confluency) 상태가 될 때까지 성장시켰으며, 독소들을 첨가하기 전에 5% CO2 상태에서 30분간 1% FBS 및 1mM 3-아이소부틸-1-메틸크산틴(IBMX)을 함유하는 MEM-α에 정치하였다(Grant 등, 1994, Infection and Immunity 62: 4270-4278). 야생 및 돌연변이체 LT를 각 웰에 첨가하고 4시간 동안 배양하였다. 그 후, 상기 세포들을 차가운 PBS로 2번 세척하였다. 각 웰에 200㎕의 0.1N HCl을 첨가하여 세포내 cAMP를 추출하고 15분간 실온에 정치하였다. 세포용해물의 상청액을 수집하고 각 웰에 0.1N NaOH를 첨가하였다(Cheng 등, 2000, Vaccine 18: 38-49; Park 등, 1999, Experimental and Molecular Medicine 31: 101-107). cAMP를 cAMP 효소 면역분석 키트(Assay designs; Correlate-EIA)를 사용하여 측정하였다. 본 실시예로부터 수득된 결과들은 LTh(S61K)가 세포내 cAMP의 농도를 증가시키지 않았음을 보여주었다.
실시예 4: Y1 부신 종양세포 분석을 이용한, 돌연변이된 LT A 를 포함하는 LT의 독성 결정
본 연구에서, 야생형 LT, LT 활성부위 돌연변이체(h61K) 및 LT 소단위체 B, B5를 포함하는 LT 샘플들에 대하여 장독소 영향을 평가하였다. 15% 말혈청, 2.5% 태아소혈청, 2mM L-글루타민 및 1.5g/L 중탄산나트륨이 첨가된 Ham F12 배지에서 유지시킨 Y-1 부신 종양세포(ATCC CCL-79)를 96웰 평저 플레이트에 웰당 2×104 세포의 농도(200㎕/웰)로 접종하고, 37℃, 5% CO2 상태에서 48시간 배양하였다. 96웰 평저 플레이트 내의 세포들을 1x PBS(pH 7.4)로 2번 세척한 후, 연속적으로 희석된 LT 샘플들(10㎍/200㎕ ~ 10-10㎍/200㎕)을 처리하고, 37℃, 5% CO2 상태에서 밤새 두었다. 독소 처리 24시간 후에, 전형적인 세포 라운딩(cell rounding) 현상을 관찰하기 위하여 광학 현미경으로 세포들을 조사하였다. 활성은 세포 라운딩을 개시하는데 요구되는 최소한의 독소 농도(ECi) 또는 50% 세포 라운딩을 위해 요구되는 독소 농도(EC50)로 정의된다. David 등, 1975, Infection and Immunity, 11:334-336; Cheng 등, 1999, Vaccine 18:38-49를 참조하라. LTh(S61K), LTh(S61R), LTh(S61H)의 독성은 야생형 LT와 비교하면 현저히 더 낮은데, 바꿔말해, 10-6 대 1로 낮다. 하기 표 2를 참조하라. LTh(S61F)의 독성 또한 더 낮지만(즉, 10-5), 다른 돌연변이체들만큼 감소가 현저하지는 않다.
야생형 또는 돌연변이된 LTA를 포함하는 LT의 독성
대장균 이열성 엔테로톡신
(LT)		 LT의 양
(pg/웰)		 독성 강도
(야생형 LT를 1로 기준)
LTh(WT) 0.1 1
LTh(S61K) 100,000 10-6
LTh(S61R) 100,000 10-6
LTh(S61H) 100,000 10-6
LTh(S61F) 10,000 10-5
LTh(S61Y) 100,000 10-6
LTh(S63K) 10,000 10-5
실시예 5: 토끼 회장 루프 분석(rabbit ileal loop assay)에 의한, 돌연변이된 LT A 를 포함하는 LT 의 독성 결정
상기 분석을 선행 기술된 문헌의 방법대로 수행하였다(Giannelli 등, 1997, Infection and Immunity 65: 331-334; Giuliani 등, 1998, J. Exp. Med. 187:1123-1132). 각각 ~2.5㎏의 뉴질랜드산 성체 토끼를 본 분석에 사용하였다. 토끼의 소장 말단을 시작점으로 하여 위장쪽으로 이동하면서 각 5㎝ 길이의 루프를 제조하였다. 다양한 양의 LT 또는 LT 돌연변이체를 갖는 0.5㎖ 샘플들을 각 루프에 주입한 후, 복부를 닫았다. 18시간 후, 각 루프 내에 축적된 체액을 수집하고 양을 측정하였다. 실험을 3회 수행하였으며 그 결과를 센티미터당 밀리리터로 표시하였다. 본 실험의 결과, 500㎍의 LTh(S61K)만이 토끼 회장 루프 내에 1㎖의 체액을 축적하였으며, 축적된 체액의 양은 음성 대조구와 비슷함을 보여주었다. 0.1㎍의 야생형 LT가 사용된 경우, 야생형 LT의 축적된 체액량은 LTh(S61K)의 것보다 현저히 많았다. 또한, 다른 LTp(S63K)의 체액 축적량 또한 LTh(S61K)의 것보다 현저히 많았다.
실시예 6: 돌연변이된 LT A 를 포함하는 LT의 비강내 면역화에서의 면역 증강 효과 결정
불활성화된 인플루엔자 바이러스, A/Puerto Rico/8/34(H1N1)(PR8)(ATCC VR-95)가 본 실시예에서 사용되었다. 바이러스 입자는 선행 기술된 문헌(Aitken 등, 1980, Eur. J. Biochem. 107:51-56; Gallagher 등, 1984, J. Clin. Microbiol. 20:89-93; Johansson 등, 1989, J. Virol. 63:1239-1246)의 방법대로 제조되었다. 요약하면, 35℃에서 이틀 동안, 10일된 암탉의 발육란의 요막강(allantoic cavity) 내에서 바이러스를 증식하였다. PR8로 감염된 발육란으로부터 요막액을 먼저 저속으로 원심분리한 후, 바이러스 입자를 침전시키기 위하여 1시간 동안 96,000xg로 원심분리하여, 이를 인산-완충 식염수(PBS) 내에 재현탁하였다. 이들 입자들을 30-60% 슈크로스 밀도 구배상에 로딩하고 5시간 동안 96,000xg로 원심분리하였다. 상기 바이러스를 함유하는 분획을 수집하고 PBS로 희석하였다. 상기 바이러스를 추가로 1시간 동안 96,000xg로 펠릿화하고 PBS로 재현탁하였다. 정제된 바이러스를 4℃에서 1주일간 0.025% 포르말린으로 처리하였다. 단백질 농도를 광학 밀도, Bio-Rad 단백질 분석에 기초하여 측정하고 표준화하였으며, 헤마글루티닌(HA) 함량을 SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동으로 결정하였다(Oxford 등, 1981, J. Biol . Stand . 9:483-491).
6주 내지 8주령의 암컷 BALB/c 마우스를 대만 국립 연구소 동물센터로부터 수득하였다. 각 5마리의 마우스로 이루어진 군들을 20㎍의 불활성화된 인플루엔자 바이러스(flu.Ag) 단독, 또는 8㎍의 야생 또는 돌연변이체 LT와 조합한 것을 포함하는 25㎕의 PBS로 마취상태에서 비강내에 면역화하였다. 상기 마우스들을 3주 후에 재면역하였다. 대조구 마우스들은 동일 조건 하에서 PBS를 주입받았다. 최종 면역화 2주 후에, 각 군의 마우스들을 도살하여 혈청을 수득하고 혈구응집 억제(HI) 시험을 실시하였다. 불활성화된 바이러스 백신만으로 비강내 면역화시킨 마우스에 비하여, LTh(S61K) 또는 LTp(S63K)와 조합된 불활성화 바이러스 백신으로 비강내 면역화시킨 마우스에서 현저하게 증가된 항체생성율(HI titer)이 검출되었다. 불활성화된 바이러스와 조합된 LTh(S61K)의 항체생성율도 실질적으로 증가되었다. 상기 바이러스와 조합된 LTh(S61K)의 항체생성율은 813으로, 상기 바이러스와 조합된 LTh(S63K)의 것과 비슷하지만, 바이러스 단독의 경우보다는 높았다.
실시예 7: 돌연변이된 LT A 를 포함하는 LT의 근육내 면역화에서의 면역 증강 효과 결정
실시예 6에서 수행된 절차를, 근육내 전달을 사용하는 면역화를 한다는 점을 제외하고는 동일하게 반복하였다. 10㎍의 불활성화된 바이러스 백신 단독, 또는 4㎍의 야생 또는 돌연변이체 LT와 조합한 것을 포함하는 50㎕의 PBS로 근육내 백신을 제조하여, 이를 대퇴후부 근육 내로 주사하였다. 면역화 및 샘플링 절차는 상술한 바와 같이 수행하였다. 상기 불활성화된 바이러스와 조합된 LTh(S61K)의 항체생성율은 실질적으로 증가되었다. 상기 바이러스와 조합된 LTh(S61K)의 항체생성율은 512였으며, 이는 바이러스와 조합된 야생형 LT 또는 바이러스 단독으로 사용된 경우보다 현저히 더 높은 수치였다.
다른 구현예들
본 명세서에 개시된 모든 특성들은 특정 조합으로 결합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각 특성은 동일, 등가 또는 유사 목적을 제공하는 대안적인 특성으로 치환될 수 있다. 따라서, 달리 표현되지 않는 한, 개시된 각 특성은 등가 또는 유사 특성들의 포괄적인 계열 내의 일례에 지나지 않는다.
상술한 내용으로부터, 당업자는 본 발명의 필수적인 특징들을 용이하게 확인할 수 있으며, 본 발명의 정신 및 범주로부터 벗어남 없이, 다양한 용도 및 상황들에 본 발명을 적용하기 위하여 본 발명에 다양한 변화 및 수정을 가할 수 있다. 따라서, 다른 구현예들 또한 하기 청구항의 범주 내에 속한다.
<110> DEVELOPMENT CENTER FOR BIOTECHNOLOGY <120> MUTATED E.COLI HEAT-LABILE ENTEROTOXIN <130> DCP09268KR <150> US 11/779,419 <151> 2007-07-18 <160> 15 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 777 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 1 atgaaaaata taactttcat tttttttatt ttattagcat cgccattata tgcaaatggc 60 gacaaattat accgtgctga ctctagaccc ccagatgaaa taaaacgttc cggaggtctt 120 atgcccagag ggcataatga gtacttcgat agaggaactc aaatgaatat taatctttat 180 gatcacgcga gaggaacaca aaccggcttt gtcagatatg atgacggata tgttaaaact 240 tctcttagtt tgagaagtgc tcacttagca ggacagtcta tattatcagg atattccact 300 tactatatat atgttatagc gacagcacca aatatgttta atgttaatga tgtattaggc 360 gtatacagcc ctcacccata tgaacaggag gtttctgcgt taggtggaat accatattct 420 cagatatatg gatggtatcg tgttaatttt ggtgtgattg atgaacgatt acatcgtaac 480 agggaatata gagaccggta ttacagaaat ctgaatatag ctccggcaga ggatggttac 540 agattagcag gtttcccacc ggatcaccaa gcttggagag aagaaccctg gattcatcat 600 gcaccacaag gttgtggaaa 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  21. 하나의 돌연변이된 소단위체 A 및 5개의 대장균 이열성 엔테로톡신 소단위체 B를 포함하는 해독된(detoxified) 대장균 이열성 엔테로톡신으로서, 상기 돌연변이된 소단위체 A는 서열번호 5의 61번의 위치에 아미노산 잔기 K를 가지고, 상기 해독된 대장균 이열성 엔테로톡신은 AB5 구조를 가지는 것인, 해독된 대장균 이열성 엔테로톡신.
  22. 제21항에 있어서, 상기 돌연변이된 소단위체 A는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 해독된 대장균 이열성 엔테로톡신.
  23. 항원 및 항원보강제를 포함하는 백신으로서, 상기 항원보강제는 제21항에 기재된 해독된 대장균 이열성 엔테로톡신인 백신.
  24. 제23항에 있어서, 상기 해독된 대장균 이열성 엔테로톡신은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이된 소단위체 A를 포함하는 백신.
  25. 제23항에 있어서, 상기 항원은 박테리아 또는 바이러스로부터 유래된 백신.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 박테리아는 폐렴 연쇄구균(Streptococcus pneumoniae), 대장균(Escherichia coli), 헬리코박터 파이로리균(Helicobacter pylori), 수막 구균(Neisseria meningitidis) 및 B형 헤모필러스 인플루엔자균(Haemophilus influenzae b)으로 이루어진 군에서 선택되며,
    상기 바이러스는 인플루엔자 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 인유두종 바이러스(human papillomavirus), 장바이러스(enterovirus) 및 로타바이러스(rotavirus)로 이루어진 군에서 선택되는 백신.
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