下面的具体实施例应理解为只是说明性的,而绝不是以任何方式限制其余的公开内容。不需要进一步的详细说明,可以相信,本领域技术人员基于此处的记载就可以最大限度地利用本发明。此处引用的所有出版物在此全文引入作为参考。
实施例1:构建编码野生型LTA和LT突变LTA的基因
将LT基因的1.8-kb DNA片段,包括亚单位A和亚单位B,从人肠产毒性大肠杆菌H10407中分离出来,并克隆到pBluescript IIKS(-)载体(pBluescript-LThWT)中。LT基因(编码亚单位A和B)的核苷酸序列(SEQ ID NO:6)和该LT的亚单位A的氨基酸序列(SEQ IDNO:5)如下所示:
LT的核苷酸序列(SEQ ID NO:6)(亚单位A:1-777;亚单位B:774-1148):
atgaaaaata taactttcat tttttttatt ttattagcat cgccattata tgcaaatggc 60
gacaaattat accgtgctga ctctagaccc ccagatgaaa taaaacgttc cggaggtctt
120
atgcccagag ggcataatga gtacttcgat agaggaactc aaatgaatat taatctttat
180
gatcacgcga gaggaacaca aaccggcttt gtcagatatg atgacggata tgtttccact
240
tctcttagtt tgagaagtgc tcacttagca ggacagtcta tattatcagg atattccact
300
tactatatat atgttatagc gacagcacca aatatgttta atgttaatga tgtattaggc
360
gtatacagcc ctcacccata tgaacaggag gtttctgcgt taggtggaat accatattct
420
cagatatatg gatggtatcg tgttaatttt ggtgtgattg atgaacgatt acatcgtaac
480
agggaatata gagaccggta ttacagaaat ctgaatatag ctccggcaga ggatggttac
540
agattagcag gtttcccacc ggatcaccaa gcttggagag aagaaccctg gattcatcat
600
gcaccacaag gttgtggaaa ttcatcaaga acaattacag gtgatacttg taatgaggag
660
acccagaatc tgagcacaat atatctcagg aaatatcaat caaaagttaa gaggcagata
720
ttttcagact atcagtcaga ggttgacata tataacagaa ttcggaatga attatgaata
780
aagtaaaatg ttatgtttta tttacggcgt tactatcctc tctatgtgca tacggagctc
840
cccagtctat tacagaacta tgttcggaat atcgcaacac acaaatatat acgataaatg
900
acaagatact atcatatacg gaatcgatgg caggcaaaag agaaatggtt atcattacat
960
ttaagagcgg cgcaacattt caggtcgaag tcccgggcag tcaacatata gactcccaaa
1020
aaaaagccat tgaaaggatg aaggacacat taagaatcac atatctgacc gagaccaaaa
1080
ttgataaatt atgtgtatgg aataataaaa cccccaattc aattgcggca atcagtatg
1140
aaaactag
成熟LTA的氨基酸序列(SEQ ID NO:5):
NGDKLYRADS RPPDEIKRSG GLMPRGHNEY FDRGTQMNIN LYDHARGTQT GFVRYDDGYV 60
STSLSLRSAH LAGQSILSGY STYYIYVIAT APNMFNVNDV LGVYSPHPYE QEVSALGGIP
120
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使用定点诱变法(Ho等人,1989,Gene 77,51-59)构建各种LTA突变体。更具体来说,通过分别用K、R、H、Y和F替换SEQ ID NO:5第61位的丝氨酸构建LTA突变体,包括LTA(S61K)、LTA(S61R)、LTA(S61H)、LTA(S61Y)和LTA(S61F)。利用以下寡核苷酸引物构建这些突变体:LTA(S61K)[5’TCT CAA ACT AAG AGA AGT TTTAAC ATA TCC GTC ATC ATA 3’](SEQ ID NO:11),LTA(S61R)[5’ACT TCT CAA ACT AAG AGA AGT TCT AAC ATA TCC GTC ATC3’](SEQ ID NO:12),LTA(S61F)[5’ACT TCT CAA ACT AAG AGAAGT GAA AAC ATA TCC GTC ATC 3’](SEQ ID NO:13),LTA(S61Y)[5’ACT TCT CAA ACT AAG AGA AGT ATA AAC ATA TCC GTCATC 3’](SEQ ID NO:14),LTA(S61H)[5’ACT TCT CAA ACT AAGAGA AGT ATG AAC ATA TCC GTC ATC 3’](SEQ ID NO:15)。这些LTA的核苷酸序列和氨基酸序列如下所示:
LTA(S61K)的核苷酸序列(SEQ ID NO:1):
atgaaaaata taactttcat tttttttatt ttattagcat cgccattata tgcaaatggc 60
gacaaattat accgtgctga ctctagaccc ccagatgaaa taaaacgttc cggaggtctt
120
atgcccagag ggcataatga gtacttcgat agaggaactc aaatgaatat taatctttat
180
gatcacgcga gaggaacaca aaccggcttt gtcagatatg atgacggata tgttaaaact
240
tctcttagtt tgagaagtgc tcacttagca ggacagtcta tattatcagg atattccact
300
tactatatat atgttatagc gacagcacca aatatgttta atgttaatga tgtattaggc
360
gtatacagcc ctcacccata tgaacaggag gtttctgcgt taggtggaat accatattct
420
cagatatatg gatggtatcg tgttaatttt ggtgtgattg atgaacgatt acatcgtaac
480
agggaatata gagaccggta ttacagaaat ctgaatatag ctccggcaga ggatggttac
540
agattagcag gtttcccacc ggatcaccaa gcttggagag aagaaccctg gattcatcat
600
gcaccacaag gttgtggaaa ttcatcaaga acaattacag gtgatacttg taatgaggag
660
acccagaatc tgagcacaat atatctcagg aaatatcaat caaaagttaa gaggcagata
720
ttttcagact atcagtcaga ggttgacata tataacagaa ttcggaatga attatga
777
LTA(S61K)的氨基酸序列(SEQ ID NO:2):
NGDKLYRADS RPPDEIKRSG GLMPRGHNEY FDRGTQMNIN LYDHARGTQT GFVRYDDGYV 60
KTSLSLRSAH LAGQSILSGY STYYIYVIAT APNMFNVNDV LGVYSPHPYE QEVSALGGIP
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LTA(S61R)的核苷酸序列(SEQ ID NO:3):
atgaaaaata taactttcat tttttttatt ttattagcat cgccattata tgcaaatggc 60
gacaaattat accgtgctga ctctagaccc ccagatgaaa taaaacgttc cggaggtctt
120
atgcccagag ggcataatga gtacttcgat agaggaactc aaatgaatat taatctttat
180
gatcacgcga gaggaacaca aaccggcttt gtcagatatg atgacggata tgttagaact
240
tctcttagtt tgagaagtgc tcacttagca ggacagtcta tattatcagg atattccact
300
tactatatat atgttatagc gacagcacca aatatgttta atgttaatga tgtattaggc
360
gtatacagcc ctcacccata tgaacaggag gtttctgcgt taggtggaat accatattct
420
cagatatatg gatggtatcg tgttaatttt ggtgtgattg atgaacgatt acatcgtaac
480
agggaatata gagaccggta ttacagaaat ctgaatatag ctccggcaga ggatggttac
540
agattagcag gtttcccacc ggatcaccaa gcttggagag aagaaccctg gattcatcat
600
gcaccacaag gttgtggaaa ttcatcaaga acaattacag gtgatacttg taatgaggag
660
acccagaatc tgagcacaat atatctcagg aaatatcaat caaaagttaa gaggcagata
720
ttttcagact atcagtcaga ggttgacata tataacagaa ttcggaatga attatga
777
LTA(S61R)的氨基酸序列(SEQ ID NO:4):
NGDKLYRADS RPPDEIKRSG GLMPRGHNEY FDRGTQMNIN LYDHARGTQT GFVRYDDGYV 60
RTSLSLRSAH LAGQSILSGY STYYIYVIAT APNMFNVNDV LGVYSPHPYE QEVSALGGIP
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LTA(S61H)的核苷酸序列(SEQ ID NO:7):
atgaaaaata taactttcat tttttttatt ttattagcat cgccattata tgcaaatggc 60
gacaaattat accgtgctga ctctagaccc ccagatgaaa taaaacgttc cggaggtctt
120
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tctcttagtt tgagaagtgc tcacttagca ggacagtcta tattatcagg atattccact
300
tactatatat atgttatagc gacagcacca aatatgttta atgttaatga tgtattaggc
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gtatacagcc ctcacccata tgaacaggag gtttctgcgt taggtggaat accatattct
420
cagatatatg gatggtatcg tgttaatttt ggtgtgattg atgaacgatt acatcgtaac
480
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agattagcag gtttcccacc ggatcaccaa gcttggagag aagaaccctg gattcatcat
600
gcaccacaag gttgtggaaa ttcatcaaga acaattacag gtgatacttg taatgaggag
660
acccagaatc tgagcacaat atatctcagg aaatatcaat caaaagttaa gaggcagata
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ttttcagact atcagtcaga ggttgacata tataacagaa ttcggaatga attatga
777
LTA(S61H)的氨基酸序列(SEQ ID NO:8):
NGDKLYRADS RPPDEIKRSG GLMPRGHNEY FDRGTQMNIN LYDHARGTQT GFVRYDDGYV 60
HTSLSLRSAH LAGQSILSGY STYYIYVIAT APNMFNVNDV LGVYSPHPYE QEVSALGGIP
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LTA(S61Y)的核苷酸序列(SEQ ID NO:9):
atgaaaaata taactttcat tttttttatt ttattagcat cgccattata tgcaaatggc 60
gacaaattat accgtgctga ctctagaccc ccagatgaaa taaaacgttc cggaggtctt
120
atgcccagag ggcataatga gtacttcgat agaggaactc aaatgaatat taatctttat
180
gatcacgcga gaggaacaca aaccggcttt gtcagatatg atgacggata tgtttatact
240
tctcttagtt tgagaagtgc tcacttagca ggacagtcta tattatcagg atattccact
300
tactatatat atgttatagc gacagcacca aatatgttta atgttaatga tgtattaggc
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gtatacagcc ctcacccata tgaacaggag gtttctgcgt taggtggaat accatattct
420
cagatatatg gatggtatcg tgttaatttt ggtgtgattg atgaacgatt acatcgtaac
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ttttcagact atcagtcaga ggttgacata tataacagaa ttcggaatga attatga
777
LTA(S61Y)的氨基酸序列(SEQ ID NO:10):
NGDKLYRADS RPPDEIKRSG GLMPRGHNEY FDRGTQMNIN LYDHARGTQT GFVRYDDGYV 60
YTSLSLRSAH LAGQSILSGY STYYIYVIAT APNMFNVNDV LGVYSPHPYE QEVSALGGIP
120
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为了比较,也通过用赖氨酸替换亚单位A的氨基酸位点63处的丝氨酸构建了来源于EWD299的另一个LT突变体LTp(S63K)(Dallas等人,1979,J.Bacteriol.139,850-859)。
实施例2:制备野生型LT和含有突变LTA的LT
用含有天然或突变LT基因(包括亚单位A和亚单位B的基因)的pBluescript II KS(-)载体转化大肠杆菌HB101。在含有补充有100μg/ml氨苄青霉素的L-肉汤的3升摇瓶中培养过夜,从其培养物中纯化天然和突变LT。通过离心收集细胞,将其重悬浮于TEAN缓冲液(0.2M NaCl,50mM Tris,1mM EDTA和3mM NaN3,pH 7.4),并用微射流均质机(microfluidizer)(Microfluidics Corporation,USA)裂解。经离心澄清裂解液后,通过添加固体硫酸铵至65%饱和将LT分级分离。然后将制品悬浮在TEAN缓冲液中,对相同的缓冲液充分透析,并用作粗LT。粗LT于4℃在用TEAN缓冲液平衡的固定化D-半乳糖(Pierce,Rockford,IL)柱上进行层析(Uesaka等人,1994,Microbial Pathogenesis 16:71-76)。用TEAN中的0.3M半乳糖洗脱天然和突变LT。每种纯化的毒素对PBS缓冲液透析,用于生物学和免疫学分析。
纯化的野生型和突变LT通过SDS-PAGE分离,其中LT亚单位A的分子量约为28-29kDa,LT亚单位B的分子量约为12-13kDa。含有LTA(S61K)的完整LT(即LTh(S61K))和含有LTA(S61R)的LT(即LTh(S61R))的收率类似于含有SEQ ID NO:5的LTA的LT。
LT的AB5杂六聚体和B5五聚体通过pH 3-10等电聚焦凝胶(invitrogen)分离。AB5和B5蛋白带的强度通过UVIBand软件(UVItecLimited)进行分析,以计算AB5杂六聚体和B5五聚体的百分比(AB5的等电点(pI)值介于8.0和7.8之间,B5的pI值介于8.3和8.1之间),结果在表1中列出。
表1.野生型LT和含有突变LTA的LT的制备
大肠杆菌不耐热肠毒素(LT) |
AB5/AB5+B5的比例(%) |
LTh(WT) |
91(%) |
LTh(S61K) |
92(%) |
LTh(S61R) |
85(%) |
LTh(S61H) |
60(%) |
LTh(S61F) |
70(%) |
LTh(S61Y) |
57(%) |
纯化的LTh(S61K)和LTh(S61R)的AB5的百分比约为90-100%。
实施例3:确定野生型LT和含有突变LTA的LT对细胞内cAMP水平的影响
Caco-2细胞(ATCC HTB-37)以每孔5×104个细胞的浓度在24孔板中在补充了20%FBS的MEM-α培养基中维持,生长至接近铺满,并在5%CO2下在含有1%FBS和1mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)的MEM-α中温育30min,然后添加毒素(Grant等人,1994,Infection and Immunity 62:4270-4278)。向每孔加入天然或突变LT,并且温育4小时。然后用冷PBS洗涤细胞两次。通过向每孔加入200μl 0.1N HCl并在室温下温育15分钟提取细胞内cAMP。向每孔加入0.1N NaOH后收集细胞裂解液的上清液(Cheng等人,2000,Vaccine18:38-49;Park等人,1999,Experimental and Molecular Medicine 31:101-107)。用cAMP酶免疫测定试剂盒(Assay designs;Correlate-EIA)测定cAMP。从该实施例获得的结果显示,LTh(S61K)没有提高细胞内cAMP的浓度。
实施例4:利用Y1肾上腺肿瘤细胞分析测定含有突变LTA的LT的毒性
在本研究中,评价LT样品的肠毒性效应,这些LT样品包括野生型LT、LT活性位点突变体(h61K)和LT亚单位B复合物B5。在补充了15%马血清、2.5%胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺和1.5g/L碳酸氢钠的Ham’s F 12培养基中维持的小鼠Y-1肾上腺肿瘤细胞(ATCCCCL-79)以每孔2x104个细胞(200ul/孔)的浓度接种到96孔平底板中,于37℃、5%CO2中48小时。96孔平底板中的细胞用1xPBS(pH7.4)洗涤两次,然后在37℃、5%CO2下用系列稀释的LT样品(10μg/200μl~10-10μg/200μl)处理过夜。毒素处理24小时后用光学显微镜检查细胞的典型细胞变圆(cell rounding)。活性定义为启动细胞变圆所需的毒素的最小浓度(ECi)或50%细胞变圆所需的毒素浓度(EC50)。参见David等人,1975,Infection and Immunity,11:334-336;Cheng等人,1999,Vaccine 18:38-49。LTh(S61K)、LTh(S61R)、LTh(S61H)的毒性显著低于野生型LT,即,10-6比1。参见下面的表2。LTh(S61F)的毒性也较低(即10-5),但是其降低程度没有其它突变体那么明显。
表2含有野生型或突变的LTA的LT的毒性
大肠杆菌不耐热肠毒素(LT) |
LT的量(pg/孔) |
毒性强度(野生型LT为1) |
LTh(WT) |
0.1 |
1 |
LTh(S61K) |
100,000 |
10-6 |
LTh(S61R) |
100,000 |
10-6 |
LTh(S61H) |
100,000 |
10-6 |
LTh(S61F) |
10,000 |
10-5 |
LTh(S61Y) |
100,000 |
10-6 |
LTh(S63K) |
10,000 |
10-5 |
实施例5:通过兔回肠袢试验测定含有突变LTA的LT的毒性
该试验如以前所述进行(Giannelli等人,1997,Infection andImmunity 65:331-334;Giuliani等人,1998,J.Exp.Med.187:1123-1132)。各重约2.5Kg的新西兰成年兔用于该试验。通过在兔小肠末端开始,并向胃移动,形成各长5cm的袢。将含有不同含量的LT或LT突变体的0.5ml样品注射到各个袢内,然后闭合腹部。18小时后,收集并测量每个袢中积累的液体。实验进行三次,结果以毫升/厘米表示。来自该实验的结果显示,500μg LTh(S61K)在兔回肠袢中只积累1ml流体,积累的流体的体积类似于天然对照。当使用0.1μg野生型LT时,野生型LT积累的流体的体积显著大于LTh(S61K)。另外,其它LTp(S63K)的流体积累也显著大于LTh(S61K)。
实施例6:测定含有突变LTA的LT在鼻内免疫中的佐剂效应
在该实施例中使用灭活的流感病毒A/Puerto Rico/8/34(H1N1)(PR8)(ATCC VR-95)。病毒颗粒如以前所述制备(Aitken等人,1980,Eur.J.Biochem.107:51-56;Gallagher等人,1984,J.Clin.Microbiol.20:89-93;Johansson等人,1989,J.Virol.63:1239-1246)。简要地说,病毒在35℃下在10天大的鸡胚胎蛋的尿囊腔中繁殖2天。将来自感染PR8的鸡蛋的尿囊液首先低速离心,然后以96,000xg离心1小时,以沉淀病毒颗粒,将该病毒颗粒重悬浮在磷酸盐缓冲液(PBS)中。将这些颗粒加载到30-60%蔗糖密度梯度上,并以96,000xg离心5小时。收集含有病毒的级分并用PBS稀释。病毒进一步以96,000xg沉淀1小时,并重悬浮在PBS中。纯化的病毒用0.025%甲醛在4℃下处理一周。基于光密度通过Bio-Rad蛋白质分析测定并标准化蛋白质浓度,并通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Oxford等人,1981,J.Biol.Stand.9:483-491)测定血细胞凝集素(HA)的含量。
6-8周大的雌性BALB/c小鼠从台湾National Laboratory AnimalCenter获得。各由5只小鼠组成的组在麻醉下用含有单独的或与8μg天然或突变LT联合的20μg灭活流感病毒(flu.Ag)的25μl PBS鼻内免疫。三周后再免疫小鼠。对照小鼠在相同条件下给予PBS。最后一次免疫两周后,杀死各组的小鼠,获得血清并进行血细胞凝集抑制(HI)试验。与单独用灭活病毒疫苗鼻内免疫的小鼠相比,在用灭活病毒疫苗联合LTh(S61K)或LTp(S63K)鼻内免疫的小鼠中检测到显著提高的HI滴度。LTh(S61K)联合灭活病毒的HI滴度显著提高。LTh(S61K)联合病毒的HI滴度为813,类似于LTh(S63K)联合病毒的HI滴度,但是大于单独病毒的HI滴度。
实施例7:测定含有突变LTA的LT在肌肉内免疫中的佐剂效应
除了免疫采用肌肉内施用以外,重复在实施例6中进行的程序。肌肉内疫苗在含有单独的或与4μg天然或突变LT联合的10μg灭活病毒疫苗的50μl PBS中制备,并注射到股后肌(posterior thighmuscle)中。免疫和采样程序如前所述进行。LTh(S61K)联合灭活病毒的HI滴度显著提高。LTh(S61K)联合病毒的HI滴度为512,显著高于野生型LT联合病毒或单独的病毒的HI滴度。
其它实施方案
本说明书中公开的所有特征可以任意组合。本说明书中公开的每个特征可以用具有相同、等同或类似目的替代特征来代替。因此,除非另外明确说明,公开的每个特征只是总的一系列等同或类似特征的一个实例。
基于上述描述,本领域技术人员可以容易地确定本发明的基本特征,并且在不偏离其精神和范围的情况下,可以对本发明进行各种改变和修改,以使其适应各种应用和条件。因此,其它实施方案也在以下权利要求的范围内。