BRPI0721746B1

BRPI0721746B1 - Polipeptídeo isolado, vacina, ácido nucléico isolado, vetor e células transformadas de bactérias e fungos

Info

Publication number: BRPI0721746B1
Application number: BRPI0721746-3A
Authority: BR
Inventors: Yu-Shen Hsu; Young -Sun Lin; Ta-Tung Yuan
Original assignee: Development Center For Biotechnology
Priority date: 2007-07-18
Filing date: 2007-08-13
Publication date: 2021-08-31
Also published as: EP2170377A1; BRPI0721746A2; JP5576792B2; JP5913406B2; CN101687026A; EP2170377B1; CN101687026B; JP2010533489A; RU2010105693A; ES2537094T3; KR20100054765A; JP2014148513A; KR101699521B1; RU2441879C2; EP2170377A4; WO2009011707A1

Abstract

polipeptídeo isolado, vacina, ácido nucléico isolado, vetor e célula transformada a presente invenção refere-se a uma subunidade a de enterotoxina instável ao valor de e. coli (lt) mutante de subunidade a contém uma substituição de aminoácido em uma posição correspondente à posição 61 de uma lt do tipo selvagem. uma lt que contém essa subunidade a que sofreu mutação exibe toxicidade reduzida em comparação com o seu parceiro do tipo selvagem.

Description

Antecedentes da Invenção

Linhagens enterotoxigênicas de Escherichia coli causam diarreia em seres humanos e animais domésticos produzindo dois tipos de enterotoxinas, ou seja, toxina instável ao calor (LT) e toxina estável ao calor (ST) (Hofstra et al, 1984, J. Bio. Chem. 259:15182-15187). LT é funcional, estrutural e imunologicamente relacionada à toxina da cólera (CT) (Clements et al, 1978, Infect. Immun. 21:1036-l039). LT e CT são sintetizadas na forma de moléculas de holotoxina compostas de cinco subunidades B idênticas e uma subunidade A enzimaticamente ativa (AB5) (Spangler, 1992, Microbiol, Rev. 56 (4): 622-647). O pentâmero B une gangliosídeo GMl na membrana de células epiteliais intestinais ou qualquer outra célula que contenha GMl (van Heyningen, 1974, Science 183:656657). Após a união das subunidades B a GMl sobre a superfície celular, a subunidade A é inserida em citosol, dividida e reduzida proteo1iticamente na sua ligação de dissulfeto isolada para produzir um peptídeo Al enzimaticamente ativo e um peptídeo A2 menor (Fishman, P. H., 1982, J. Membr. Biol. 69:85-97; Mekalanos et al, 1979, J. Biol. Chem. 254:5855-5861; Moss et al, 1981, J. Biol. Chem. 256:12861-12865). O peptídeo

Al é capaz de unir NAD e catalisar a ribosilação de ADP de Gsα, uma proteína reguladora da união de GTP associada a adenilato ciclase (Spangler, 1992, Microbiol. Rev. 56 (4): 622-647). O aumento resultante de cAMP eventualmente gera a liberação de eletrólitos e fluidos de células afetadas {Cheng et. al, 2000, Vaccine 18: 38-49).

Demonstrou-se que LT funciona como adjuvante da mucosa e induz reações imunológicas contra antígenos coadministrados pela mucosa (Clements et al; 1988, Vaccine 6: 269-277; Elson, C. O. , 1989, Immunol. Today 146: 29-33; Spangler, 1992, Microbiol. Rev. 56 (4): 622-647). A alta toxicidade de LT do tipo selvagem limitou, entretanto, o seu uso clínico. É desejável, portanto, gerar LTs que sofreram 5 mutação e possuem toxicidade reduzida, retendo ao mesmo tempo a imunogenicidade.

A expressão "enterotoxina instável ao calor de E. coli" ou "LT" utilizada no presente designa uma enterotoxina instável ao calor produzida por qualquer linhagem de E. coli 10 enterotoxigênica. A expressão "subunidade A de enterotoxina instável ao calor de E. coli" ou "LTA" indica a subunidade A de LT. Ela inclui o precursor LTA, que contém um peptídeo de r sinal e LTA madura que possui o peptídeo de sinal removido.

Resumo da Invenção

A presente invenção baseia-se na descoberta inesperada que uma LT que contém uma LTA que sofreu mutação exibe toxicidade reduzida em comparação com o seu parceiro do tipo selvagem, retendo ao mesmo tempo a imunogenicidade. Essa LTA que sofreu mutação possui uma substituição de aminoácido 2 0 na posição correspondente à posição 61 de uma LTA do tipo selvagem, cuja sequência de aminoácidos SEQ ID N° 5 é exibida abaixo.

Consequentemente, a presente invenção apresenta um polipeptídeo isolado que inclui uma LTA que sofreu mutação e 25 contém um resíduo de aminoácido diferente de S, T e F na r-. posição correspondente à posição 61 de SEQ ID N° 5. O resíduo de aminoácido substituto pode ser D, E, H, I, K, L, N, P, Q, R, Y ou W. Ele pode ser um aminoácido de ocorrência natural ou um aminoácido não de ocorrência natural, tal como um 3 0 aminoácido D ou um aminoácido β. Em um exemplo, a LTA possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 2, 4, 8 ou 10. Uma LT que contém essa LTA que sofreu mutação exibe toxicidade reduzida, ou seja, < 10'5 vezes a de uma LT do tipo selvagem que contém SEQ ID N° 5.

Em um outro aspecto, a presente invenção apresenta uma vacina que contém um antígeno e a LTA que sofreu mutação descrita acima. A vacina pode incluir adicionalmente 5 subunidade B de LT, que forma com a LTA que sofreu mutação a proteína LT inteira. O antígeno pode ser derivado de uma bactéria ou um vírus.

Em ainda outro aspecto, a presente invenção apresenta um ácido nucléico isolado que inclui uma sequência 10 de nucleotídeos que codifica o mutante de LTA descrito acima.

Em um exemplo, a sequência de nucleotídeos é SEQ ID N° 1, 3, 7 ou 9 . Também se encontra dentro do escopo da presente invenção um vetor que inclui o ácido nucléico recém descrito e uma célula transformada que contém o vetor.

Os detalhes de uma ou mais realizações da presente invenção são apresentados na descrição a seguir. Outras características, objetos e vantagens da presente invenção serão evidentes a partir do relatório descritivo e das reivindicações.

Descrição Detalhada

Uma LT desintoxicada, ou seja, que contém uma LTA que sofreu mutação, é um adjuvante de vacina desejado devido à sua alta imunogenicidade. A LTA que sofreu mutação conforme a presente invenção, projetada para atingir este objetivo, é 25 elaborada introduzindo-se uma substituição de aminoácido em uma LTA em uma posição correspondente à posição 61 de SEQ ID N° 5. LTA produzidas por diferentes linhagens de E, coli enterotoxigênicas são altamente homólogas. Desta forma, comparando-se a sequência de aminoácidos de uma LTA com SEQ 30 ID N° 5, os técnicos no assunto podem descobrir qual posição nessa LTA corresponde à posição 61 de SEQ ID N° 5. Da mesma forma que a LTA de SEQ ID N° 5, quase todas as LTAs do tipo selvagem incluem uma serina na posição correspondente à posição 61 de SEQ ID N° 5. Um aminoácido que é diferente de serina, por exemplo, no tamanho ou polaridade pode ser utilizado como substituinte. Exemplos dos aminoácidos substituintes incluem resíduos de aminoácidos hidrofóbicos 5 (tais como I e L), resíduos de aminoácidos carregados (tais como D, E, K, R e H) ou resíduos de aminoácidos com cadeias laterais volumosas (tais como N, Q, Y e W) . Prolina pode também ser utilizada como substituinte, pois ela geralmente altera a estrutura local de um polipeptídeo. Esses 10 aminoácidos substituintes incluem aminoácidos não de ocorrência natural, tais como D-aminoácidos ou β-aminoácidos.

O mutante LTA conforme a presente invenção pode ser preparado por meio de métodos bem conhecidos na técnica. O mutante é produzido, por exemplo, por meio de um método 15 recombinante conforme segue. Um cDNA que codifica uma LTA do tipo selvagem é isolado de uma linhagem de E. coli enterotoxigênica e submetido a mutagênese dirigida a local para produzir um cDNA que codifica o mutante de LTA desejado. Vide Ho et al, Gene, 77: 51-59, 1989. O cDNA que contém a 2 0 mutação é inserido em seguida em um vetor de expressão para células em transformação. Por fim, o mutante de LTA produzido nas células transformadas é purificado e montado com subunidade B de LT para formar proteína LT inteira.

A toxicidade de uma LT que contém um mutante de LTA 25 descrito acima pode ser determinada utilizando testes tais r. como o teste de células adrenais Y-l. Vide Cheng et al, Vaccine, 18: 38-49, 2000.

O mutante de LTA conforme a presente invenção pode ser utilizado como um adjuvante em uma vacina. A vacina (ou 3 0 seja, uma vacina humana ou uma vacina veterinária) pode conter um antígeno e o próprio mutante de LTA ou uma LT que contém o mutante de LTA. O antígeno pode ser derivado de uma bactéria tal como Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Neiseria gonorrhoea, Neisseria meningitides, CorynebacCerium diphtheriae, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella ozaenae, 5 Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Campylobacter jejuni, Aeromonas hydrophila, Bacillus cereus, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, Salmonella typhimurium, Treponema pallidum, Borrelia vincentii, Borrelia burgdorferi, Mycobacterium 10 tuberculosis, Pneumocystis carinii, Mycoplasma spp, Rickettsia prowazeki, Chlamydia spp e Helicobacter pylori. Ele pode também ser derivado de um vírus, tal como influenza, vírus simplex da herpes, vírus da imunodeficiência humana, citomegalovírus, vírus da hepatite c, vírus da hepatite delta, 15 poliovirus, vírus da hepatite A, vírus da hepatite B, vírus Epstein-barr, vírus zoster da varicela, vírus sincitial respiratório, enterovirus ou vírus da encefalite japonesa.

A vacina pode conter ainda um veículo farmaceuticamente aceitável tal como solução salina tamponada 20 com fosfato ou uma solução de bicarbonato. O veículo é selecionado com base no modo e via de administração, bem como na prática farmacêutica padrão. Veículos e diluentes farmacêuticos apropriados, bem como necessidades farmacêuticas para seu uso, são descritos em Remington' s 25 Pharmaceutical Sciences.

Os métodos de preparação de vacinas são geralmente bem conhecidos na técnica, conforme exemplificado pelas Patentes Norte-Americanas n° 4.601.903, 4.599.231, 4.599.230 e 4.596.792. Vacinas podem ser preparadas na forma de 30 injetáveis, soluções líquidas ou emulsões. O antígeno e o mutante LTA ou a LT que o contém podem ser misturados com excipientes fisiologicamente aceitáveis, que podem incluir água, solução salina, dextrose, glicerol, etanol e suas combinações. A vacina pode conter ainda quantidades menores de substâncias auxiliares, tais como agentes umectantes ou emulsificantes, ou agentes tamponadores do pH para aumentar a eficácia das vacinas. As vacinas podem ser administradas 5 parenteralmente, por meio de injeção por via subcutânea ou intramuscular. Alternativamente, podem ser desejáveis outros modos de administração que incluem supositórios, formulações orais ou tópicas. Para supositórios, aglutinantes e veículos podem incluir, por exemplo, polialcaleno glicóis ou 10 triglicérides. As formulações orais podem incluir excipientes normalmente empregados, tais como graus farmacêuticos de sacarina, celulose, carbonato de magnésio e similares. Estas composições assumem a forma de soluções, suspensões, pastilhas, pílulas, cápsulas, formulações de liberação prolongada ou pós.

A vacina é administrada de forma compatível com a formulação de dosagem e em uma quantidade que é terapeuticamente eficaz, protetora e imunogênica. A quantidade a ser administrada depende do paciente a ser 20 tratado, incluindo, por exemplo, a capacidade do sistema imunológico do indivíduo de sintetizar anticorpos e, se necessário, produzir uma reação imunológica mediada por células. Quantidades precisas de ingrediente ativo que necessitam ser administradas dependem do julgamento do 25 praticante. Faixas de dosagem apropriadas podem ser facilmente determinadas, entretanto, pelos técnicos no assunto e podem ser da ordem de microgramas do polipeptídeo conforme a presente invenção. Regimes apropriados de administração inicial e doses de incentivo também são 30 variáveis, mas podem incluir uma administração inicial, seguida por administrações subsequentes. A dosagem da vacina pode também depender da via de administração e varia conforme o tamanho do hospedeiro.

Os exemplos específicos abaixo devem ser considerados meramente ilustrativos e não limitadores do restante do relatório descritivo de nenhuma forma. Sem elaboração adicional, acredita-se que os técnicos no assunto, 5 com base no presente relatório descritivo, utilizem a presente invenção ao máximo possível. Todas as publicações mencionadas no presente são integralmente incorporadas ao presente como referência. Exemplo 1 Construção de genes que codificam LTA do tipo selvagem e LTA que sofreu mutação de LT

Um fragmento de DNA de 1,8 Kb de um gene LT, que < inclui a subunidade A e a subunidade B, foi isolado de E. coli H10407 enterotoxigenic© humano e clonado em vetor 15 pBluescript II KS(-) (pBluescript-LThWT). A sequência de nucleotídeos (SEQ ID N° 6) do gene LT (que codifica as Subunidades A e B) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID N° 5) da subunidade A da presente LT são exibidas abaixo. Sequência de nucleotídeos (SEQ ID N° 6) de LT (Subunidade A: 1-777; Subunidade B: 7 74-1148) atgaaaaata taactttcat tttttttatt ttattagcat cgccattata tgcaaatggc 60 gacaaattat accgtgctga ctctagaccc ccagatgaaa r. taaaacgttc cggaggtctt 120 atgcccagag ggcataatga gtacttcgat agaggaactc aaatgaatat taatctttat 180 gatcacgcga gaggaacaca aaccggcttt gtcagatatg atgacggata tgtttccact 240 tctcttagtt tgagaagtgc tcacttagca ggacagtcta tattatcagg atattccact 300 tactatatat atgttatagc gacagcacca aatatgttta atgttaatga tgtattaggc 360 gtatacagcc ctcacccata tgaacaggag gtttctgcgt taggtggaat accatattct 420 cagatatatg gatggtatcg tgttaatttt ggtgtgattg atgaacgatt acatcgtaac agggaatata 480 gagaccggta ttacagaaat ctgaatatag ctccggcaga ggatggttac agattagcag 540 gtttcccacc ggatcaccaa gcttggagag aagaaccctg gattcatcat gcaccacaag 600 gttgtggaaa ttcatcaaga acaattacag gtgatacttg taatgaggag acccagaatc 660 tgagcacaat atatctcagg aaatatcaat caaaagttaa gaggcagata ttttcagact 720 atcagtcaga ggttgacata tataacagaa ttcggaatga attatgaata aagtaaaatg 780 ttatgtttta tttacggcgt tactatcctc tctatgtgca tacggagctc cccagtctat 840 tacagaacta tgttcggaat atcgcaacac acaaatatat acgataaatg acaagatact 900 atcatatacg gaatcgatgg caggcaaaag agaaatggtt atcattacat ttaagagcgg 960 cgcaacattt caggtcgaag tcccgggcag tcaacatata gactcccaaa aaaaagccat 1020 tgaaaggatg aaggacacat taagaatcac atatctgacc gagaccaaaa ttgataaatt 1080 atgtgtatgg aataataaaa cccccaattc ■P- aattgcggca atcagtatg 1140 aaaactag Sequência de aminoácidos (SEQ ID N° 5) de LTA madura NGDKLYRADS RPPDEIKRSG GLMPRGHNEY FDRGTQMNIN LYDHARGTQT GFVRYDDGYV STSLSLRSAH 60 LAGQSILSGY STYYIYVIAT APNMFNVNDV LGVYSPHPYE QEVSALGGIP YSQIYGWYRV 120 NFGVIDERLH RNREYRDRYY RNLNIAPAED GYRLAGFPPD HQAWREEPWI 180 HHAPQGCGNS SRTITGDTCN EETQNLSTIY LRKYQSKVKR QIFSDYQSEV DIYNRIRNEL 240

Diversos mutantes de LTA foram construídos utilizando um método de mutagênese dirigida a local (Ho et al, 1989, Gene 77, 51-59). Mais especificamente, mutantes de LTA que incluem LTA (S61K) , LTA (S61R) , LTA (S61H) , LTA (S61Y) e LTA (S61F) foram construídos por meio de substituição da serina na posição 61 de SEQ ID N° 5 com K, R, H, Y e F, respectivamente. Os primers de oligonucleotídeos a seguir foram utilizados para construir estes mutantes: LTA (S61K) [5' TCT CAA ACT AAG AGA AGT TTT AAC ATA TCC GTC ATC ATA 3'] (SEQ ID NO:11), LTA (S61R) [S' ACT TCT CAA ACT AAG AGA AGT TCT AAC ATA TCC GTC ATC 3'] (SEQ ID NO:12), LTA (S61F) [5' ACT TCT CAA ACT AAG AGA AGT GAA AAC ATA TCC GTC ATC 3'] (SEQ ID NO: 13) , LTA (S61Y) [5' ACT TCT CAA ACT AAG AGA AGT ATA AAC ATA TCC GTC ATC 3'] (SEQ ID NO:14), LTA (S61H) [5' ACT TCT CAA ACT AAG AGA AGT ATG AAC ATA TCC GTC ATC 3' ] (SEQ ID N0:15). As sequências de nucleotídeos e sequências de aminoácidos dessa LTA são exibidas abaixo. Sequência de nucleotídeos (SEQ ID N° 1) de LTA (S61K): atgaaaaata taactttcat tttttttatt ttattagcat cgccattata tgcaaatggc gacaaattat 60 accgtgctga ctctagaccc ccagatgaaa r taaaacgttc cggaggtctt atgcccagag 120 ggcataatga gtacttcgat agaggaactc aaatgaatat taatctttat gatcacgcga 180 gaggaacaca aaccggcttt gtcagatatg atgacggata tgttaaaact tctcttagtt 240 tgagaagtgc tcacttagca ggacagtcta tattatcagg atattccact tactatatat 300 atgttatagc gacagcacca aatatgttta atgttaatga tgtattaggc 360 > gtatacagcc taggtggaat accatattct ctcacccata 420 tgaacaggag gtttctgcgt T 5 cagatatatg atgaacgatt acatcgtaac gatggtatcg 480 tgttaatttt ggtgtgattg agggaatata ctccggcaga ggatggttac gagaccggta 540 ttacagaaat ctgaatatag agattagcag aagaaccctg gattcatcat gtttcccacc 600 ggatcaccaa gcttggagag gcaccacaag gtgatacttg taatgaggag gttgtggaaa 660 ttcatcaaga acaattacag « acccagaatc caaaagttaa gaggcagata tgagcacaat 720 atatctcagg aaatatcaat ttttcagact ttcggaatga attatga 777 atcagtcaga 1 ggttgacata tataacagaa Sequência de aminoácidos (S61K): (SEQ ID N° 2) de LTA NGDKLYRADS LYDHARGTQT GFVRYDDGYV RPPDEIKRSG 60 GLMPRGHNEY FDRGTQMNIN 20 KTSLSLRSAH LGVYSPHPYE QEVSALGGIP LAGQSILSGY 120 STYYIYVIAT APNMFNVNDV YSQIYGWYRV GYRLAGFPPD HQAWREEPWI NFGVIDERLH 180 RNREYRDRYY RNLNIAPAED 25 HHAPQGCGNS QIFSDYQSEV DIYNRIRNEL SRTITGDTCN 240 EETQNLSTIY LRKYQSKVKR Sequência de nucleotídeos (S61R): (SEQ ID N° 3) de LTA atgaaaaata cgccattata tgcaaatggc taactttcat 60 tttttttatt ttattagcat 30 gacaaattat taaaacgttc cggaggtctt accgtgctga 120 ctctagaccc ccagatgaaa atgcccagag aaatgaatat taatctttat ggcataatga 180 gtacttcgat agaggaactc gatcacgcga gaggaacaca aaccggcttt gtcagatatg atgacggata tgttagaact tctcttagtt 240 tgagaagtgc tcacttagca ggacagtcta 5 tattatcagg atattccact tactatatat 300 atgttatagc gacagcacca aatatgttta atgttaatga tgtattaggc gtatacagcc 360 ctcacccata tgaacaggag gtttctgcgt taggtggaat accatattct cagatatatg 420 gatggtatcg tgttaatttt ggtgtgattg 10 atgaacgatt acatcgtaac agggaatata 480 gagaccggta ttacagaaat ctgaatatag < ctccggcaga ggatggttac agattagcag 540 gtttcccacc ggatcaccaa gcttggagag " 15 aagaaccctg gattcatcat gcaccacaag 600 gttgtggaaa ttcatcaaga acaattacag gtgatacttg taatgaggag acccagaatc 660 tgagcacaat atatctcagg aaatatcaat caaaagttaa gaggcagata ttttcagact 720 atcagtcaga ggttgacata tataacagaa 20 ttcggaatga attatga 777 Sequência de aminoácidos (SEQ ID N° 4) de LTA (S61R): NGDKLYRADS RPPDEIKRSG GLMPRGHNEY FDRGTQMNIN 25 LYDHARGTQT GFVRYDDGYV RTSLSLRSAH 60 LAGQSILSGY STYYIYVIAT APNMFNVNDV .• LGVYSPHPYE QEVSALGGIP YSQIYGWYRV 120 NFGVIDERLH RNREYRDRYY RNLNIAPAED GYRLAGFPPD HQAWREEPWI HHAPQGCGNS 180 SRTITGDTCN EETQNLSTIY LRKYQSKVKR 30 QIFSDYQSEV DIYNRIRNEL 240 Sequência de nucleotídeos (SEQ ID N° 7) de LTA (S61H): atgaaaaata taactttcat tttttttatt ttattagcat cgccattata tgcaaatggc 60 gacaaattat taaaacgttc cggaggtctt accgtgctga ctctagaccc ccagatgaaa 120 5 atgcccagag aaatgaatat taatctttat ggcataatga gtacttcgat agaggaactc 180 gatcacgcga atgacggata tgttcatact gaggaacaca aaccggcttt gtcagatatg 240 tctcttagtt tattatcagg atattccact tgagaagtgc tcacttagca ggacagtcta 300 10 tactatatat atgttaatga tgtattaggc atgttatagc gacagcacca aatatgttta 360 gtatacagcc taggtggaat accatattct ctcacccata tgaacaggag gtttctgcgt 420 15 cagatatatg atgaacgatt acatcgtaac gatggtatcg tgttaatttt ggtgtgattg 480 agggaatata ctccggcaga ggatggttac gagaccggta ttacagaaat ctgaatatag 540 agattagcag aagaaccctg gattcatcat gtttcccacc ggatcaccaa gcttggagag 600 20 gcaccacaag gtgatacttg taatgaggag gttgtggaaa ttcatcaaga acaattacag 660 acccagaatc caaaagttaa gaggcagata tgagcacaat atatctcagg aaatatcaat 720 25 ttttcagact ttcggaatga attatga 777 atcagtcaga ggttgacata tataacagaa !• Sequência de aminoácidos (SEQ ID N° 8) de LTA (S61H): NGDKLYRADS LYDHARGTQT GFVRYDDGYV RPPDEIKRSG GLMPRGHNEY FDRGTQMNIN 60 30 HTSLSLRSAH LGVYSPHPYE QEVSALGGIP LAGQSILSGY STYYIYVIAT APNMFNVNDV 120 YSQIYGWYRV GYRLAGFPPD HQAWREEPWI NFGVIDERLH RNREYRDRYY RNLNIAPAED 180 HHAPQGCGNS SRTITGDTCN EETQNLSTIY LRKYQSKVKR QIFSDYQSEV DIYNRIRNEL 240 Sequência de nucleotídeos (SEQ ID N° 9) de LTA 5 (S61Y): atgaaaaata taactttcat tttttttatt ttattagcat cgccattata tgcaaatggc gacaaattat 60 accgtgctga ctctagaccc ccagatgaaa taaaacgttc cggaggtctt atgcccagag 120 ggcataatga gtacttcgat agaggaactc 10 aaatgaatat taatctttat gatcacgcga 180 gaggaacaca aaccggcttt gtcagatatg atgacggata tgtttatact tctcttagtt 240 tgagaagtgc tcacttagca ggacagtcta 15 tattatcagg atattccact tactatatat 300 atgttatagc gacagcacca aatatgttta atgttaatga tgtattaggc gtatacagcc 360 ctcacccata tgaacaggag gtttctgcgt taggtggaat accatattct cagatatatg 420 gatggtatcg tgttaatttt ggtgtgattg 20 atgaacgatt acatcgtaac agggaatata 480 gagaccggta ttacagaaat ctgaatatag ctccggcaga ggatggttac agattagcag 540 gtttcccacc ggatcaccaa gcttggagag 25 aagaaccctg gattcatcat gcaccacaag 600 gttgtggaaa ttcatcaaga acaattacag r gtgatacttg taatgaggag acccagaatc 660 tgagcacaat atatctcagg aaatatcaat caaaagttaa gaggcagata ttttcagact 720 atcagtcaga ggttgacata tataacagaa 30 ttcggaatga attatga 777 Sequência de aminoácidos (SEQ ID N° 10) de LTA (S61Y): NGDKLYRADS RPPDEIKRSG GLMPRGHNEY FDRGTQMNIN LYDHARGTQT GFVRYDDGYV 60 YTSLSLRSAH LAGQSILSGY STYYIYVIAT APNMFNVNDV LGVYSPHPYE QEVSALGGIP 120 YSQIYGWYRV NFGVIDERLH RNREYRDRYY RNLNIAPAED 5 GYRLAGFPPD HQAWREEPWI 180 HHAPQGCGNS SRTITGDTCN EETQNLSTIY LRKYQSKVKR QIFSDYQSEV DIYNRIRNEL 240

Para comparação, outro mutante de LT, LTp (S63K), derivado de EWD299 (Dallas et al, 1979, J. Bacterial. 139, 10 850-859) também foi construído por meio de substituição de serina na posição de aminoácido 63 da subunidade A com lisina. Exemplo 2 Preparação com LT do tipo selvagem e LT que contém LTA que sofreu mutação

Vetores pBluescript II KS(-) que contêm genes LT mutantes ou nativos, incluindo subunidade A e subunidade B, foram transformados em E. coli HB101. As LTs mutantes e nativas foram purificadas a partir de cultivos que cresceram por uma noite em um frasco de três litros que contém caldo L suplementado com 100 μg de ampicilina por mililitro. As células foram colhidas por meio de centrifugação, novamente suspensas em tampão TEAN (0,2 M de NaCl, 5 0 mM de Tris, 1 mM de EDTA e 3 mM de NaN3, pH 7,4) e lisadas com microfluidificador (Microfluidics Corporation, Estados Unidos) . Após a clarificação dos lisados por meio de centrifugação, a LT foi fracionada por meio da adição de sulfato de amônio sólido até 65% de saturação. A preparação foi novamente suspensa em tampão TEAN, completamente dialisada contra o mesmo tampão e utilizada como LT bruta. A

LT bruta foi submetida a cromatografia sobre colunas de D- galactose imobilizada (Pierce, Rockford IL) equilibradas com tampão de TEAN a 4 °C (Uesaka et al, 1994, Microbial Pathogenesis 16: 71-76). LTs mutantes e nativas foram eluídas com 0,3 M de galactose em TEAN. Cada toxina purificada foi dialisada contra tampão de PBS para testes biológicos e imunológicos.

A LT mutante e do tipo selvagem purificada foram separadas por meio de SDS-PAGE, em que o peso molecular da subunidade A de LT foi de cerca de 2 8 a 2 9 kDa e o peso molecular da subunidade B de LT foi de cerca de 12 a 13 kDa, O rendimento da LT inteira que contém LTA (S61K), ou seja, LTh (S61K) e LTA (S61R) , ou seja, LTh (S61R) foi similar à LT que contém a LTA de SEQ ID N° 5.

Hetero-hexâmeros AB5 e pentâmeros Bs da LT foram separados por meio de gel de concentração isoelétrica com pH 3 a 10 (Invitrogen). A intensidade de faixas de proteína AB5 e B5 foi testada por meio de software UVIBand (UVItec Limited) para calcular o percentual dos hetero-hexâmeros AB5 e dos pentâmeros B5 (o valor do ponto isoelétrico (pi) de AB5 foi de 8,0 a 7,8 e o valor de pi de B5 foi de 8,3 a 8,1) . Os resultados encontram-se relacionados na Tabela 1.

Os percentuais de AB5 de LTh (S61K) e LTh (S61R) purificados foram de cerca de 90 a 100%. Exemplo 3 Determinação do efeito de LT do tipo selvagem e LT que contém LTA que sofreu mutação sobre níveis de cAMP intracelulares

Células Caco-2 (ATCC HTB-37) foram mantidas em meio MEM-a suplementado com 20% FBS em placa de 24 cavidades em uma concentração de 5 x 104 células por cavidade, cultivadas até perto da confluência e incubadas em MEM-a que Contém 1% 5 FBS e 1 mM de 3-isobutil-l-metilxantina (IBMX) por trinta minutos em CO2 a 5% antes da adição de toxinas (Grant et al, 1994, Infection and Immunity 62: 4270-4278). Adicionou-se LT mutante ou nativa a cada cavidade e incubou-se por quatro horas. As células foram colhidas em seguida por duas vezes 10 com PBS frio. cAMP intracelular foi extraído por meio de adição de 200 μl de 0,1 N HC1 a cada cavidade e incubado à temperatura ambiente por quinze minutos. Sobrenadante de lisados celulares foi recolhido após a adição de 0,1 N de NaOH a cada cavidade (Cheng et al, 2 000, Vaccine 18: 38-49; " 15 Park et al, 1999, Experimental and Molecular Medicine 31: 101-107). cAMP foi medido com um kit de imunoteste de enzimas cAMP (projetos de teste; Correlato-EIA). Os resultados obtidos a partir deste exemplo demonstram que LTh (S61K) não aumentaram a concentração de cAMP intracelular. Exemplo 4

Determinação da toxicidade de LT que contém LTA que sofreu mutação utilizando teste de células tumorosas adrenais Y1 Neste estudo, amostras de LT, que incluem LT do 25 tipo selvagem, mutante de local ativo de LT (h61K) e complexo r B de subunidade LT, B5, foram avaliadas para determinar o efeito enterotóxico. Células de tumores adrenais Y-l de camundongo (ATCC CCL-79) mantidas em meio F12 de Ham suplementado com 15% de soro de cavalo, 2,5% de soro de feto 30 bovino, 2 mM de L-glutamina e 1,5 g/1 de bicarbonato de sódio foram semeadas em placas com fundo plano e 96 cavidades em uma concentração de 2 x 104 células por cavidade (200 μl/cavidade) a 37 °C em CO2 a 5% por 48 horas. Células em placas com fundo plano e 96 cavidades foram lavadas por duas vezes com lx PBS (pH 7,4) e tratadas em seguida com amostras de LT diluídas em série (10 μg/200 μl - 10-10 μg/200 μl) a 37 °C em um ambiente de CO2 a 5%. As células foram examinadas por meio de microscopia ótica para arredondamento de células típico 24 horas após o tratamento com toxina. A atividade é definida como a concentração mínima da toxina necessária para iniciar o arredondamento celular (ECi) ou a concentração de toxina necessária para arredondamento celular de 50% (EC50). Vide David et al, 1975, Infection and Immunity, 11: 334-336; Cheng et al, 1999, Vaccine 18: 38-49. A toxicidade de LTh (S61K), LTh (S61R), LTh (S61H) é significativamente mais baixa em comparação com LT do tipo selvagem, ou seja, 10~s contra 1. Vide a Tabela 2 abaixo. A toxicidade de LTh (S61F) também é mais baixa (ou seja, 10’5) , mas a redução não é tão significativa quanto os demais mutantes.

Exemplo 5

Determinação da toxicidade de LT que contém LTA que sofreu mutação por meio de teste de circuito ileal de coelho 0 teste foi realizado conforme descrito anteriormente (Giannelli et al, 1997, Infection and Immunity 65: 331-334; Giuliani et al, 1998, J. Exp. Med. 187: 1123- 1132). Os coelhos adultos da Nova Zelândia, com cerca de 2,5 kg cada um, foram utilizados para este teste. Circuitos com cerca de 5 cm de comprimento foram realizados a partir do final do intestino delgado do coelho e movendo-se em direção ao estômago. Amostras de 0,5 ml com várias quantidades de LT 5 ou mutantes de LT foram injetadas em cada circuito e, em seguida, o abdômen foi fechado. Após dezoito horas, o líquido acumulado em cada circuito foi recolhido e medido. O experimento foi realizado por três vezes e os resultados expressos em milímetros por centímetro. Os resultados deste experimento demonstram que 500 μg de LTh (S61K) acumularam 1 ml de fluido no circuito ileal de coelho e o volume do fluido acumulado foi similar a controle nativo. Ao utilizar-se 0,1 μg de LT do tipo selvagem, o volume de fluido acumulado de LT do tipo selvagem era consideravelmente maior que o de LTh * 15 (S61K) . Além disso, o acúmulo de fluido de outro LTp (S63K) também foi consideravelmente maior que o de LTh (S61K). Exemplo 6 Determinação do efeito adjuvante de LT que contém LTA que sofreu mutação em imunização intranasal

Vírus da influenza desativado, A/Porto Rico/8/34 (H1N1) (PR8) (ATCC VR-95) foi utilizado neste exemplo. As partículas virais foram preparadas conforme descrito anteriormente em Aitken et al, 1980, Eur. J. Biochem. 107: 51-56; Gallagher et al, 1984, J. Clin. Microbiol. 20: 89-93; Johansson et al, 1989, J. Virol. 63: 1239-1246).

Resumidamente, o vírus foi propagado na cavidade alantoica de ovos de galinha embrionados com dez dias de idade a 35 °C por dois dias. O fluido alantoico de ovos infectados com PR8 foi centrifugado em primeiro lugar sob baixa velocidade e 30 centrifugado em seguida a 96.000 xg por uma hora para precipitar partículas virais, que foram novamente suspensas em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Estas partículas foram carregadas sobre um gradiente de densidade de sacarose de 3 0 a 60% e centrifugadas por cinco horas a 96.000 xg. A fração que contém o vírus foi recolhida e diluída com PBS. O vírus foi adicionalmente peletizado a 96.000 xg por uma hora e novamente suspenso em PBS. Vírus 5 purificado foi tratado com formalina a 0,025% a 4 °C por uma semana. A concentração de proteína foi medida e padronizada com base na densidade ótica, Teste de Proteínas Bio-Rad, e o teor de hemaglutinina (HA) foi determinado por meio de eletroforese de gel de SDS-poliacrilamida (Oxford et al, 1981, 10 J. Biol. Stand. 9: 483-491).

Fêmeas de camundongos BALB/c, com seis a oito semanas de idade, foram obtidas do Centro Nacional de Animais de Laboratório de Taiwan. Grupos que consistem de cinco camundongos cada foram imunizados por via intranasal com 25 15 μl de PBS contendo 2 0 μg de vírus influenza desativado (flu.Ag) isolado ou em combinação com 8 μg de LT nativa ou mutante sob anestesia. Os camundongos foram novamente imunizados três semanas mais tarde. Camundongos controle receberam PBS sob a mesma condição. Duas semanas após a 20 imunização final, os camundongos em cada grupo foram sacrificados para obter soro e conduzir teste de inibição de hemaglutinação (Hl) . Títulos de Hl significativamente aprimorados foram detectados em camundongos imunizados por via intranasal com a vacina de vírus desativada em combinação 25 com LTh (S61K) ou LTp (S63K) em comparação com camundongos imunizados por via intranasal com vacina de vírus desativado isoladamente. O título de HI de LTh (S61K) em combinação com o vírus desativado aumentou substancialmente. O título de Hl de LTh (S61K) em combinação com o vírus é 813, similar ao de 30 LTh (S63K) em combinação com o vírus, mas maior que o do vírus isoladamente. Exemplo 7 Determinação do efeito adjuvante de LT que contém LTA que sofreu mutação em imunização intramuscular

O procedimento conduzido no Exemplo 6 foi repetido, exceto pela utilização de fornecimento intramuscular para a imunização. Vacinas intramusculares foram preparadas em 50 μl 5 de PBS contendo 10 μg de vacina de vírus desativado isoladamente ou em combinação com 4 μg de LT nativa ou mutante e foram injetadas no músculo da coxa posterior. Os programas de imunização e amostragem foram realizados conforme descrito. O título de HI de LTh (S61K) em combinação 10 com o vírus desativado aumentou substancialmente. O título de HI de LTh (S61K) em combinação com o vírus foi de 512, que é significativamente mais alto que o de LT do tipo selvagem em combinação com vírus ou o do vírus isoladamente.

Outras Realizações

Todas as características descritas no presente relatório descritivo podem ser combinadas de qualquer forma. Cada característica descrita no presente relatório descritivo pode ser substituída por uma característica alternativa que atenda ao mesmo propósito, equivalente ou similar. Desta 20 forma, a menos que indicado expressamente em contrário, cada característica descrita é apenas um exemplo de uma série genérica de características equivalentes ou similares.

A partir da descrição acima, os técnicos no assunto podem determinar facilmente as características essenciais da 25 presente invenção e, sem abandonar o seu espírito e escopo, podem realizar várias alterações e modificações da presente invenção para adaptá-la aos vários usos e condições. Desta forma, outras realizações também se encontram dentro do escopo das reivindicações a seguir.

Claims

1. POLIPEPTÍDEO ISOLADO, caracterizado por compreender uma subunidade A de enterotoxina instável ao calor de E. coli que sofreu mutação, cuja posição corresponde à posição 61 de SEQ ID NO 5 e é um resíduo de aminoácido selecionado a partir de um grupo que consiste em K, R, H e Y, em que uma enterotoxina instável ao calor de E. coli que contém a subunidade A que sofreu mutação possui toxicidade reduzida em comparação com uma enterotoxina instável ao calor de E. coli do tipo selvagem que contém SEQ ID NO 5.

2. POLIPEPTÍDEO ISOLADO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela enterotoxina instável ao calor de E. coli que contém a subunidade A que sofreu mutação possuir toxicidade de menos de 10-6 vezes a da enterotoxina instável ao calor de E. coli do tipo selvagem

3. POLIPEPTÍDEO ISOLADO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela subunidade A que sofreu mutação possuir uma sequência de aminoácidos selecionado a partir de um grupo que consiste em SEQ ID NO 2, 4, 8 e 10.

4. VACINA, caracterizada por compreender um antígeno e um adjuvante, em que o adjuvante é uma subunidade A de enterotoxina instável ao calor de E. coli que sofreu mutação, cuja posição corresponde à posição 61 de SEQ ID NO 5 e é um resíduo de aminoácido selecionado a partir de um grupo que consiste em K, R, H e Y, em que uma enterotoxina instável ao calor de E. coli que contém a subunidade A que sofreu mutação possui toxicidade reduzida em comparação com uma enterotoxina instável ao calor de E. coli do tipo selvagem que contém SEQ ID NO5.

5. VACINA, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo antígeno ser de uma bactéria ou vírus.

6. VACINA, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pela bactéria ser selecionada a partir do grupo que consiste de Streptococcus pneumoniae, Escherichia cola, Helicobacter pylorit, Neisseria meningitidis e Haernophilus influenza B.

7. VACINA, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo vírus ser selecionado a partir do grupo que consiste em vírus de influenza, vírus da imunodeficiência humana, vírus da hepatite A, vírus da hepatite B, vírus da hepatite C, papilomavírus humano enterovírus e rotavírus.

8. VACINA, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pela enterotoxina instável ao calor de E. coli que contém a subunidade A que sofreu mutação possuir toxicidade de menos de 10-6 vezes a da enterotoxina instável ao calor de E. coli do tipo selvagem.

9. VACINA, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo mutante de subunidade A conter K na posição correspondente à posição 61 de SEQ ID NO 5.

10. VACINA, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo mutante de subunidade A conter R na posição correspondente à posição 61 de SEQ ID NO 5.

11. VACINA, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo mutante de subunidade A conter uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de um grupo que consiste de SEQ ID NO 2, 4, 8 e 10.

12. VACINA, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por compreender adicionalmente a subunidade B de LT, em que o mutante de subunidade A e a subunidade B formam enterotoxina instável ao calor de E. coli inteira.

13. ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADO, caracterizado por compreender uma sequência de nucleotídeos que codifica uma subunidade A de enterotoxina instável ao calor de E. coli que sofreu mutação, cuja posição corresponde à posição 61 de SEQ ID NO 5 e é um resíduo de aminoácido selecionado a partir de um grupo que consiste em K, R, H e Y, em que uma enterotoxina instável ao calor de E. coli que contém a subunidade A que sofreu mutação possui toxicidade reduzida em comparação com uma enterotoxina instável ao calor de E. coli do tipo selvagem que contém SEQ ID NO 5.

14. ÁCIDO NUCLÉICO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pela enterotoxina instável ao calor de E. coli que contém a subunidade A que sofreu mutação possuir toxicidade de menos de 10-6 vezes a da enterotoxina instável ao calor de E. coli do tipo selvagem.

15. ÁCIDO NUCLÉICO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pela sequência de nucleotídeos ser selecionada a partir de um grupo que consiste em SEQ ID NO 1, 3, 7 e 9.

16. VETOR, caracterizado por compreender o ácido nucléico, conforme definido na reivindicação 13.

17. CÉLULAS TRANSFORMADAS DE BACTÉRIAS E FUNGOS, caracterizada por compreender o vetor, conforme definido na reivindicação 16