CN1188416A - 多体的重组尿素酶疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于预防和/或治疗螺杆菌(如幽门螺杆菌)感染的方法和组合物。用于本发明的方法(该方法包括经粘膜施用这些组合物)的本发明的组合物,包括含有存在于药用载体或稀释剂中的重组无酶活性螺杆菌尿素酶的多体复合物的组合物;和含有(a)一种螺杆菌抗原,及(b)一种抗生素,一种抗分泌剂,一种铋盐,或其聚合形式的组合物。

Description

多体的重组尿素酶疫苗

                    发明背景

本发明涉及用于预防和/或治疗螺杆菌感染的方法和组合物。

螺杆菌是螺形、革兰氏阴性细菌的一个属，它们定居在哺乳动物的胃肠道中。其中好几个种定居在胃里，特别引人注意的有幽门螺杆菌、H.heilmanii、猫螺杆菌和鼬鼠螺杆菌。虽然幽门螺杆菌是最常见的与人类感染相关的一个种，但H.heilmann和猫螺杆菌也已发现能感染人类，只是感染发生率低于幽门螺杆菌。

螺杆菌感染在发达国家超过成人人口的50％，在发展中国家及太平洋周边国家几乎达100％，使它成为全世界人类的最流行传染病之一。尽管与螺杆菌感染相关的临床胃十二指肠疾病一般在原始感染之后几年甚至几十年后才出现，但在所有受幽门螺杆菌感染的个体内均引起慢性胃部炎症。幽门螺杆菌是大多数人类胃溃疡和慢性浅表性(B型)胃炎的致病因素。幽门螺杆菌感染还与胃粘膜萎缩、胃腺癌、及胃非何杰金氏淋巴瘤有关(见，例如，Blaser《传染病杂志》161卷626-633页，1990年；Scolnick等人《传染原疾病》1卷294-309页，1993年；Coodwin等人，《幽门螺杆菌的生物学和临床实践》CRC出版社，BocaRaton FL 465页，1993年；Northfield等人“幽门螺杆菌”《感染》Kluwer Acad.Pub.，Dordrecht，178页，1994年)。

                     发明概述

我们已显示，含有多体的重组螺杆菌尿素酶的疫苗组合物能有效防止和治疗螺杆菌感染。此外，我们已显示，含有幽门螺杆菌尿素酶和一种粘膜佐剂，并联合一种抗生素及一种铋盐的组合物在治疗螺杆菌感染时比单独使用这些组分的任何一种，或使用任意三者之组合或少于三者之组合都更为有效。

因此，在第一个方面，本发明的特征在于一种疫苗，它用于诱导出患病个体(如患病的人)对螺杆菌(如幽门螺杆菌)的免疫应答，这种患病个体可以是(a)目前尚未感染螺杆菌但有将被感染的危险(此时诱导“保护性”免疫应答)，或(b)已被螺杆菌感染(此时诱导的是“治疗性”免疫应答)的。这种疫苗含有重组、无酶活性的螺杆菌(如幽门螺杆菌)尿素酶多体复合物，以及一种药用载体或稀释剂(如，无菌水或浓度为2％(重量/体积比)的蔗糖溶液)。该疫苗可含有的这种多体复合物可能包括8个尿素酶A亚单位和8个尿素酶B亚单位，也可能包括6个尿素酶A亚单位和6个尿素酶B亚单位，还可能包括4个尿素酶A亚单位和4个尿素酶B亚单位，或者包括它们的混合物。另外，该疫苗可能包含一种粘膜佐剂，如肠产毒性大肠杆菌的不耐热肠毒素(LT)，霍乱毒素(CT)，艰难杆菌毒素，或它们的丧失毒性但仍保留佐剂活性的亚单位或衍生物(如，一个片段，突变子，或类毒素)，或其混合物。例如，可使用含有艰难杆菌毒素A的794个羧基端氨基酸的片段(见，如Dove等人，出处同上，关于艰难杆菌毒素A的序列)。而且，该重组、无酶活性的螺杆菌尿素酶的多体复合物可能是先冻干再用到本发明的疫苗中。

第二方面，本发明的特征在于一种在病体内(如病人)诱导对螺杆菌(如幽门螺杆菌)的保护性和/或治疗性粘膜免疫应答的方法。在该方法中，含有有效致敏剂量的重组无酶活性螺杆菌(如幽门螺杆菌)尿素酶多体复合物的组合物被施用到病体的粘膜表面(如口腔或鼻内表面，或经诸如肛门栓剂形式施用到直肠表面)。该组合物可能包含一种多体复合物，后者可以包含8个尿素酶A亚单位和8个尿素酶B亚单位，也可以包含6个尿素酶A亚单位和6个尿素酶B亚单位，也可以包含4个尿素酶A亚单位和4个尿素酶B亚单位，或者包含它们的混合物。该组合物可能在未用诸如碳酸氢钠进行胃中和的情况下用药。

除了重组、无酶活性螺杆菌尿素酶多体复合物外，该方法中所用的组合物可能还包含一种粘膜佐剂。如该组合物可能包含肠产毒性大肠杆菌的不耐热肠毒素(LT)，霍乱毒素(CT)，艰难杆菌毒素，或其失去毒性但仍有佐剂活性的亚单位或衍生物(如有佐剂活性的片段、突变子，或类毒素)，或其混合物。例如可使用含有艰难杆菌毒素A的794个羧基端氨基酸的片段(见于如Dove等，出处同上，关于艰难杆菌毒素A的序列)。且组合物中的重组、无酶活性螺杆菌尿素酶多体复合体可能是先冻干再应用于此方法中。

第三方面，本发明的特征在于一种用于治疗病体中(如人)螺杆菌(如幽门螺杆菌)感染的组合物，该组合物含有(a)一种螺杆菌(如幽门螺杆菌)抗原(如尿素酶)，及(b)一种抗生素，一种抗分泌剂，一种铋盐，或它们的一种组合形式。可用于该组合物的螺杆菌尿素酶抗原的一个例子是含有如上所述的重组、无酶活性螺杆菌尿素酶多体复合物的抗原。可使用的其它螺杆菌抗原包括，例如Hsp A、Hsp B、Alp A、Alp B、Clp B，及由单克隆抗体IgG 50所识别的抗原(见下)。该组合物可能还包含一种粘膜佐剂(如粘膜佐剂的联合形式)，就象上文中列举的那些粘膜佐剂。

该组合物中可能含有的抗生素包括但不限于羟氨苄青霉素、甲基红霉素、四环素、灭滴灵和红霉素；可能含有的铋盐有，如次柠檬酸铋和次水杨酸铋。可能在组合物中包含的抗分泌剂是，如质子泵抑制剂(如奥美拉唑、兰索拉唑和邦托拉唑)，H₂受体拮抗剂(如雷尼替丁、西咪替丁(cimetidine)、法莫替丁、尼扎替丁和罗沙替丁)，以及前列腺素类似物(如米索前列腺素(misoprostil)或恩前列腺素)。

最后一个方面，本发明的特征在于一种用于治疗病体(如病人)的螺杆菌(如幽门螺杆菌)感染的方法。在该方法中，一种组合物被施用于病体内，该组合物包含(a)一种螺杆菌(如幽门螺杆菌)抗原(如上文列举的抗原)，及(b)一种抗生素，一种抗分泌剂，一种铋盐，或它们的组合。任一种标准用药方式，或几种标准方式的某一组合形式都可应用于此方法中。例如，可使用粘膜给药(如在口腔或鼻内表面用药，或用诸如肛门栓剂之类的方式在直肠表面用药)。该方法中施用于粘膜表面的组合物可能还包含一种粘膜佐剂(或粘膜佐剂的一种联合形式)，如象上文所述的那些粘膜佐剂。本方法中组合物里含有的抗生素、铋盐及抗分泌因子均如上所述。

“疫苗”指包含至少一种抗原(如来自致病性微生物，象幽门螺杆菌的抗原)的组合物，其中，当将该组合物施用于病体时，能诱发或增强对该抗原的免疫应答，而这种免疫应答能有效防止疾病(如由微生物感染引起的疾病)，或治疗已存在的疾病。

“有效致敏剂量”指某种抗原(如重组、无酶活性螺杆菌尿素酶多体复合物，或上文列举的其他抗原中任一种)施用于诸如病人的病体中时能有效地诱发免疫应答(如体液免疫应答或粘膜免疫应答)的量。

“螺杆菌”指螺杆菌属的任一种细菌，尤其指感染人的螺杆菌(如幽门螺杆菌)。“尿素酶”指催化尿素转化成氢氧化铵和二氧化碳的一种酶(如幽门螺杆菌尿素酶)。

“多体复合物”指多肽(如尿素酶多肽)的一种大分子复合物。这些多肽在复合体中的联接可能通过诸如共价键(如二硫键)、氢键、及离子键等多种分子间相互作用来完成。

“粘膜佐剂”指一种化合物(如一种免疫调节物)，它能非特异性地刺激或增强粘膜免疫应答(如产生IgA抗体)。在致免疫组合物中联合施用粘膜佐剂有利于对组合物中抗原的粘膜免疫应答的诱导。

“抗生素”指来自真菌或细菌的抑制其他微生物生长的化合物。

本发明的其它特征和优点从以下的详述和权利要求书里将是显而易见的。

                          详述

首先对附图进行描述附图

图1图示了克隆自pSCP1的2.5kb PCR产物的限制酶图谱。图谱上方的数字指的是将BL1的第一个碱基对(bp)作为第1号核苷酸的各核苷酸位置。ureA及ureB基因的所在位置以及这些基因的转录方向均显示在图上。限制性酶切位点的位置均显示在基因下方。每种限制酶名称后面的数字指该酶所识别序列中第一个碱基对的位置。

图2是表达质粒pORV214的遗传图谱。ureA及ureB基因均表示为带箭头的空心框。实心箭头和实心框分别代表T7启动子和终止子序列。细线代表pBR322 DNA。质粒上的噬菌体及质粒复制起点均用大阴影箭头显示，分别指示为“f1起点”及“ori”，图中还指明了DNA合成的方向。编码卡那霉素抗性(kan)和乳糖抑制物(lac I)的基因均显示为阴影框。用于克隆PCR产物的BamHI和EcoRI位点也显示在图上。在代表lacI、ureA、ureB和kan基因的各框内的箭头指示了转录的方向。

图3是编码ureA和ureB基因的幽门螺杆菌基因座及来自pORV214的转录调控序列(SEQ ID NO：1)的核苷酸序列的图解。推断的ureA的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)和ureB的氨基酸序列(SEQ IDNO：3)均示于DNA序列之上。序列左边的数字相应于核苷酸位置，而序列右边的数字则指示氨基酸位置。相应于PCR引物的序列在其下方划线，用于克隆PCR产物的BamHI和EcoRI位点均已指出。推断的转录起始点(G)和转录方向均用箭头显示。核糖体结合点(RBS)已示出。调控转录起始(T7启动子和lac操纵子)和终止的序列均在下面划线并标记出来。

图4示用分析型大小排阻HPLC分析重组尿素酶的结果。

图5是一系列图形，显示了细菌量与用重组幽门螺杆菌尿素酶和霍乱毒素(CT)免疫的小鼠的血清IgA，血清IgG，及粪便IgA抗体水平之比。

图6是一系列图，显示了细菌量与用重组幽门螺杆菌尿素酶和肠产毒性大肠杆菌不耐热毒素免疫的小鼠的血清IgA、血清IgG，及粪便IgA抗体水平之比。

图7是一份图表，显示了用于比较鼻内和口服途径免疫接种重组尿素酶的实验程序。

图8是一系列图，显示了在按图7中表示的程序处理过的小鼠组中血清IgG(血清G)，血清IgA(血清A)，粪便IgA(粪便A)及唾液IgA(SalA)的水平。

图9是一个表，显示了用于比较鼻内和胃内途径免疫接种重组尿素酶的实验程序。

图10是一系列图，显示了对根据图9的程序处理的小鼠进行尿素酶测试的结果。

图11是一个图，显示了经鼻内途径施用重组尿素酶(10μg)和CT(5μg)在防止猫螺杆菌感染中至少等效于经口服途径给予重组尿素酶(25μg)和CT(10μg)。

图12是一个图，显示了用重组尿素酶加10μg LT免疫接种小鼠减弱了或消除了已有的猫螺杆菌感染。当这些动物再用猫螺杆菌感染时，它们能抵抗攻击，受到保护。

图13是一份图，显示了用重组幽门螺杆菌尿素酶和CT一起，或用CT单独进行治疗性免疫接种4周和10周后，小鼠的平均抗体应答。

图14是一份图，显示了免疫小鼠和未免疫小鼠在用猫螺杆菌感染之前，以及之后的一定间隔阶段，胃粘膜中能分泌IgA抗体的细胞数。

图15是一份图，显示了事先用重组幽门螺杆菌尿素酶和CT免疫接种的小鼠体内猫螺杆菌感染的排除率。克隆ureA和ureB基因

编码尿素酶的结构基因，ureA和ureB，已被克隆(Clayton等人，《核酸研究》1990年18卷362页；Labigne等人，《细菌学杂志》1991年173卷1920-1931页)，由这些基因编码的重组尿素酶已纯化(Hu等人，《感染与免疫》1992年60卷2657-2666页)。为了能用于本发明，尿素酶克隆自幽门螺杆菌的一株临床分离株(CPM630)，该株得自一份临床样品，后者由伦敦大学St.Bartholomew’s医学院的SoadTabaqchali博士提供。CPM630株的基因组DNA文库已在λ噬菌体载体EMBL3中制备。噬菌斑用免抗螺杆菌尿素酶多克隆抗体来筛选活性，分离到一个单活性噬菌斑。该克隆子有一个17kb的Sal I酶切片段，该片段编码ureA和ureB基因。将此17kb片段亚克隆至pUC18，得到的质粒命名为pSCP1。一个2.7kb的TaqI片段也被亚克隆(所得质粒为pTCP3)并完全测序。该2.7kb Taq I片段编码ureA和ureB。

引物BL1(CGG GAT CCA CCT TGA TTG CGT TAT GTC T；SEQID NO：4)和BL2(CGG AAT TCA GGA TTT AAG GAA GCG TTG；SEQ ID NO：5)被用于从pSCP1中扩增并克隆一个2.5kb片段。BL1和BL2对应于GenBank登记号M60398的核苷酸2605-2624(BL1引物)和EMBL登记号X17079的核苷酸2516-24998(BL2引物)。2.5kb片段PCR产物的限制性酶切图谱显示在图1中。该2.5kb片段包含ureA和ureB的全长编码区，以及位于ureA上游的来自幽门螺杆菌的翻译起始信号。重组尿素酶的表达

已纯化并含有编码ureA和ureB的基因的2.5kb PCR片段被EcoRI和BamHI消化后，插入表达载体pET24+(Novagen，Madison，Wisconsin)以产生质粒pORV214(图2)。pET24+包括colE1复制起点，用于修补单链的丝状噬菌体(f1)复制起点，以及卡那霉素抗性基因Tn903。此片段被插入T7启动子下游，后者能启动尿素酶基因转录。乳糖操纵子(lacO)序列存在于T7启动子和克隆位点之间，以使尿素酶基因诱导型表达。T7转录终止序列位于克隆位点下游。载体还包括乳糖抑制物基因(lacI)以确保对表达的完全抑制。载体中出现的其他序列均衍生自pBR322，后者提供了用于载体构建的基本骨架。

初始连接混合物用于转化经CaCl₂方法制备的XL1-Blue(Stratagene LaJolla，CA)，该初始连接混合物包括2.5kb的PCREcoRI-BamHI片段和用EcoRI及Bam HI消化过的pET24+载体。XL1-Blue是一株不表达T7 RNA聚合酶的大肠杆菌(E.coli)菌株。抗卡那霉素菌落直接用PCR筛选。PCR中用到尿素酶特异性引物。来自几个阳性克隆子的质粒DNA用Qiagen mimspin柱(Qiagen，Chatsworth，CA)抽提并经正确的限制酶切图谱确认。

纯化的pORV214 DNA用于转化经CaCl₂方法制备的大肠杆菌BL21-DE3(Novagen，Madison，Wisconsin)。BL21-DE3是经λ噬菌体DE3溶原化而产生的一株大肠杆菌B株，而DE3是在lanUV5启动子控制下编码T7 RNA聚合酶的重组噬菌体。BL21缺失在lon和ompT蛋白酶，及hsdS_B限制/修饰系统和dcm DNA甲基化方面是缺陷型。从抗卡那霉素菌落中用Qiagen minispin柱制备出DNA并用BamHI和EcoRI进行限制酶分析进行筛选，以证实质粒的存在。尿素酶的表达通过用SDS-PAGE和Western印迹检查BL21-DE3(pORV214)的细胞裂解物来评价。一些阳性克隆子有着正确的限制性核酸内切酶消化图谱并表达了尿素酶。

一个包含pORV214的单克隆被选择出，置于含卡那霉素(50μg/ml)的LB平板中生长，收获并贮于-80℃含50％甘油的LB中。从甘油贮藏样品中取出一份置于含卡那霉素的LB平板上生长，挑选一个单菌落，接种到含卡那霉素的LB肉汤培养基上，就制备出了一个研究用细胞库。上述肉汤培养物长至OD₆₀₀为1.0，沉淀，再重新悬浮于等体积的含50％甘油的LB中。然后这些研究用细胞库(RCB)等分试样(100μl)贮存于-80℃。用来自研究用细胞库的一个单菌落按类似方法制备一个主细胞库(MCB)，用来自MCB的一个单菌落制备出一个商品化工作细胞库(MWCB)。

MCB和MWCB细胞有活力，抗卡那霉素，并表现出正常E.coli菌落的形态。T7 RNA聚合酶的表达和λ噬菌体的溶原性用本领域熟知的适当测试证实。经测定，尿素酶在MCB细胞和MWCB细胞中的表达可被IPTG诱导，测定方法是检查在有IPTG存在时生长的培养物，并在SDS-PAGE上分析来自这些细胞培养物的裂解产物。随温育时间的延长，MCB细胞和MWCB细胞所产生的60kD和29kD的蛋白(分别为ureB和ureA)也增多。

质粒DNA从MCB细胞和MWCB细胞中分离出来，用限制酶分析、限制性片段长度多态性(RFLP)及DNA序列分析进行测试以证实质粒的结构，MCB细胞包含一个具有适当的限制性核酸内切酶消化图谱的质粒，该图谱中不存在质粒的缺失或重排。同样地，pSCP1的RFLP指纹和MCB细胞、MWCB细胞中质粒DNA的RFLP指纹没有差别，说明尿素酶基因在克隆过程中或在细胞库制备时并未产生可以检测到的(＞50bp)的缺失或重排。

ureA和ureB的编码区，以及分离自MCB细胞的质粒的启动子区和终止区序列，均已测序。测序反应使用双脱氧循环测序试剂盒(Di-Deoxy Cycle Sequence Kit)和荧光标记的双脱氧核苷酸依照厂商说明(Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)进行。具有预期蛋白质序列的ureA和ureB的基因序列，推测的蛋白序列以及两侧区域的DNA序列均显示在图3中。重组尿素酶的大规模生产

所用的发酵罐均按改进程序洗净并灭菌。培养基含24g/l酵母浸出汁，12g/l胰蛋白胨，6-15g/l甘油，均溶于RO/DI水中。因pORV214在不存在抗生素时很稳定，故大规模发酵培养基中未加抗生素。抑泡剂被加入培养基，各单元适当灭菌。

为了在40升的发酵罐中生产，复苏一小瓶MWCB细胞，并接种至一个含有1升LB肉汤(1％胰蛋白胨，0.5％酵母浸出汁，1％NaCl)，不含抗生素的4升摇瓶中。37℃振荡培养16-24小时。接种物再转入含有上述生产培养基的40升发酵罐(工作体积为30升)中。发酵在通气并搅拌的状态下进行，直至经OD₆₀₀测得的细胞密度约为8-10。异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)随后加入其中，直至终浓度为0.1mM，诱导16-24小时。离心收获细胞，湿糊状细胞沉淀被等分后装入聚丙烯贮藏管内-80℃保存。为进行400升规模的生产(其中工作体积300升)，40升容器内的接种物和培养物按上述制备。当40升容器内OD₆₀₀达到近5.0时，用于接种至400升发酵罐中。此培养物再温育至OD₆₀₀达到8-10。培养物再经诱导，收获，并保存，均如上述。此过程比40升的过程需要多出2-3代。重组幽门螺杆菌尿素酶的纯化

由上述发酵过程产生的细胞管从贮备中取出，室温复苏，重新悬浮于20mM磷酸钠/1mM EDTA缓冲液(pH 6.8)中。这些重新悬浮的细胞经加压挤过一个窄口(Microfluidizer cell Disruptor)时破裂。破裂的细胞4℃离心沉淀细胞碎片，而含有可溶解尿素酶的上清被收集起来。

向细胞上清中加3M氯化钠溶液至终浓度为0.1M。DEAE-Sepharose层析柱在20mM磷酸钠/1mM EDTA中平衡后，将上清过柱，收集过柱液以备进一步处理。将过柱液在20mM磷酸钠/1mM  EDTA(pH 6.8)中用截留100kD的膜透析过滤以去除低分子量杂质并减小离子强度。

该物质再次在已于20mM磷酸钠/1mM  EDTA中平衡好的DEAE-Sepharose柱上通过。弃去过柱液，柱子用20mM磷酸钠/1mM EDTA(pH 6.8)洗一次。结合在柱子上的物质用约三倍柱体积的0.1MNaCl/1mM β-巯基乙醇洗脱。对结合的尿素酶通过洗脱缓冲液的体积和流速控制其有效洗脱。

这种部分纯化的尿素酶再用25mM Tris-HCl(pH 8.6)透析过滤，并过Q-Sepharose柱。柱子用同样的缓冲液以约2倍柱体积洗脱，收集包含高纯度的尿素酶的过柱液。然后浓缩经Q-Sepharose步骤所得的过柱液并在含2％蔗糖的注射用水(WFI)(pH 7.5)中透析过滤。纯化的重组幽门螺杆菌尿素酶的抗原性和亚单位组成的鉴定

为比较重组的与天然的幽门螺杆菌尿素酶的抗原性和亚单位组成，将天然的幽门螺杆菌尿素酶纯化并用作抗原以生产多克隆抗尿素酶抗体，以及单-特异性多克隆抗-ureA，抗-ureB，及抗尿素酶全酶的抗体。

天然幽门螺杆菌尿素酶用改良的Hu和Mobley方法(《感染与免疫1990年58卷992-998页)纯化。幽门螺杆菌株ATCC 43504(美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD)在Mueller-Hmton琼脂(Difco实验室，Detroit，MI)上生长，该琼脂中包含5％绵羊红细胞(CraneLabs，Syracuse，NY)和抗生素(5μg/ml三甲氧苄氨嘧啶，10μg/ml万古霉素和10U/ml硫酸多粘菌素B)(TVP，Sigma  Chemical Co.，St.Louis，MO)。琼脂平板在37℃7％CO₂ 90％湿度下温育3-4天，离心收获细菌。细菌重新悬浮于含蛋白酶抑制剂的水或20mM磷酸盐，1mM EDTA，1mM β-巯基乙醇(pH 6.8)溶液中，超声破碎并离心澄清。澄清后的上清与3M氯化钠混合至氯化钠终浓度为0.15M，然后过DEAE-Sepharose柱(Fast Flow)。收集过柱的活性尿素酶，在Filtron Macrosep 100离心过滤单位中浓缩，再过Superose-12或Superdex 200大小排阻层析柱。大小排阻层析用Pharmacia FPLC预装柱进行。将含尿素酶活性的各部分集中，浓缩，再在Pharmacia Mono-Q Sepharose预装柱上经FPLC阴离子交换层析纯化。结合在柱上的尿素酶用氯化钠梯度洗脱。集中有尿素酶活性的各部分并用Filtron公司的Macrosep 100离心过滤器浓缩。在几批样品中，用Superose-12柱上分析利用大小排阻FPLC实现最终纯化。

用纯化的天然幽门螺杆菌尿素酶免疫3只雌性新西兰白兔制备出抗幽门螺杆菌尿素酶的多克隆抗血清。动物事先抽血证实非免疫状态后，用在完全弗氏佐剂中的150μg尿素酶皮下免疫接种。第27和45天后再分别皮下接种加强免疫一次，每次剂量为150μg，均联合不完全弗氏佐剂。用针对纯化尿素酶的ELISA和Western印迹证实有免疫应答后，动物被放血。血液经4℃凝集过夜，离心收集血清。用(50％)硫酸铵沉淀4℃过夜提纯血清IgG。沉淀重新悬浮于PBS并透析除去硫酸铵。发现每只动物的IgG抗尿素酶效价是1∶10⁷，集中来自三只动物的抗体。测得蛋白浓度为17.3mg/ml。制备各0.2ml的等分试样并且贮存于-80℃。

经过在第0天给5只小鼠皮下注射在完全弗氏佐剂中的10μg天然重组酶全酶制备抗幽门螺杆菌尿素酶全酶的鼠多克隆腹水(“MPA3”)。在第10天和17天加强免疫小鼠。在第24天抽血以证实有了抗尿素酶的免疫应答，再在第26天加强一次。在第28天小鼠腹膜内注射S180肉瘤细胞。在第31天最后一次腹膜内加强注射剂量为10μg的尿素酶，7天后收集腹水。

腹水室温置2小时后4℃置16小时；涡旋打碎凝块，10,000rpm离心10分钟除去。塑料管中4℃过夜后，腹水形成坚固的凝块。搅匀，用PBS稀释5倍，再经10,000rpm离心10分钟重新澄清。收集36ml稀释的腹水，以300μl的等分试样冻存在-20℃。Western印迹分析证实该抗体与ureA和ureB亚单位反应。ELISA试验中抗尿素酶的终点滴度为1∶300,000。

抗幽门螺杆菌ureA的鼠多克隆腹水(“MPA4”)制备方法如下：从SDS-PAGE凝胶上经电洗脱分离到天然的幽门螺杆菌尿素酶ureA亚单位，再给小鼠皮下注射即可。抗ureA腹水制备的后续步骤同上述抗全酶抗体的制备。

从SDS-PAGE凝胶上电洗脱分离到天然ureB，对小鼠皮下注射就制备出抗天然幽门螺杆菌ureB亚单位的小鼠多克隆腹水(“MPA6”)。后续制备抗ureB腹水的步骤如上文所述的抗全酶抗体的制备。

MAB71是一种抗猫螺杆菌尿素酶的IgA单克隆抗体，它识别B亚单位上的一种保护性表位。该抗体的制备如Czinn等人在《疫苗杂志》1993年11卷6期637-642页所述，产生它的杂交瘤细胞系保存在ATCC且指定的保存号为HB 11514。上述各抗体均用于鉴定纯化的重组幽门螺杆菌尿素酶的Western印迹实验。重组尿素酶的SDS-PAGE分析和Western印迹分析

重组尿素酶先在还原条件下进行SDS-PAGE(12.5％)进行分析。有2条主要的蛋白带(29kD和60kD)及几条较轻带(约38kD)均较明显。为鉴别这些电泳带中的蛋白质，用上述抗尿素酶和抗尿素酶亚单位的抗体进行Western印迹，60kD蛋白与MPA3(抗尿素酶全酶)和MPA6(抗ureB)反应，但不与MPA4(抗ureA)反应。29kD蛋白与MPA3(抗尿素酶全酶)及MPA4(抗ureA)反应，但不与MPA6(抗ureB)反应。较轻的38kD带与MPA3(抗尿素酶全酶)及MPA6(抗ureB)反应，说明该蛋白是ureB的一部分。

在SDS-PAGE凝胶上能明显看到2条微弱的高分子量(＞150kD)电泳带。这两条带均能微弱地与既抗ureA又抗ureB的抗体反应，说明一小部分重组尿素酶亚单位在所用条件下形成了抗巯基还原的共价结合单位。考马斯亮兰染色后的凝胶中未发现其它蛋白带。因此，在纯化产物中测得的所有蛋白质是ureA，ureB，或ureA或ureB的衍生物。

湿的考马斯亮兰染过色的SDS-PAGE凝胶用Ultroscan XL激光密度计和Gel Scan XL软件程序(Pharmacia-LKB Biotechnology，Piscataway NJ)扫描。密度测定法测得的数据与1∶1摩尔比的ureA∶ureB亚单位比一致，正如由天然幽门螺杆菌尿素酶的结构所推测的那样。在纯化的尿素酶制品中ureA和ureB占总蛋白的95％以上。估计ureA+ureB的合并峰值平均为95.2％±1.2％。纯化的重组尿素酶的分析型大小排阻HPLC

已纯化的重组尿素酶的纯度和分子组成用分析型大小排阻高效液相层析来测定。层析用Beckman System Gold HPLC来完成，后者组成如下：蠕动泵126，二极管排列双波长检测器168，System GoldSoftware V 7.11版，Progel-TSK G4000 SWXL柱(内径为5mm×30cm)(Beckman Instrumenats，Brea，Cal而rnia)，及Supel Co.提供的SWXL防护柱。层析时采用恒溶剂成分的洗脱条件，所用缓冲液为100mM磷酸盐，100mM氯化钠，pH 7.0。层析柱的校准用Pharmacia-LKB的分子量标志物进行。

代表性的已纯化的粗样品经HPLC分离后典型的图形显示在图4中。纯化的尿素酶产物显示着在甲状腺素(分子量669kD)和铁蛋白(分子量440kD)的滞留时间之间有一个明显的蛋白峰。经系列层析估计出其大概分子量为550-600kD。该峰暂定名六体尿素酶。在不同批产品中此六体尿素酶的面积占总蛋白面积的至少70％。

还检测到一个比较明显的蛋白峰，其滞留时间较短(意即分子量较大些)。该峰面积在5-20％的范围内。这个分子量大于600kD的峰被命名为八体尿素酶。六体尿素酶加八体尿素酶峰总面积超过90％。

这两个特性峰均被分离出来以备进一步鉴定。将冻干的尿素酶复原后经HPLC纯化得到上述两峰，将它们在4℃贮存超过一周。贮存期内，八体尿素酶形式增多而六体尿素酶形式减少。两峰分别用还原性SDS-PAGE和ELISA分析了与抗尿素酶的单克隆及多克隆抗体的反应性。在SDS-PAGE上，两峰均显示类似比例的尿素酶A和尿素酶B带。此外，在用多克隆抗尿素酶全酶抗体(MPA3)和单克隆抗尿素酶B抗体(MAB71)进行ELISA时两峰显示出几乎相同的免疫反应性。重组尿素酶的酶活性(尿素水解活性)

为调查重组尿素酶的酶活性用了三种方法：先电泳再做尿素酶特异性银染色，pH敏感性酚红尿素肉汤试验，及直接氨测定。尿素酶特异性银染，如deLlano等人所述(《分析生物化学》1989年177卷37-40页)，是基于尿素酶使尿素产生氨的反应。该反应导致局部pH值上升，从而促进胶片的氧化还原反应，最后产生金属银。仅用1.0μg样品就测出天然的幽门螺杆菌尿素酶的酶活性，对比之下，20μg纯化的重组尿素酶没有酶活性。

本领域众所周知的pH值敏感性酚红尿素肉汤试验是基于因尿素水解产生氨使pH值改变。试验证实尿素酶活性与0.2μg/ml纯化的幽门螺杆菌尿素酶一样少。相反，纯化重组尿素酶没有尿素酶活性，甚至当浓度高达750μg/ml时也是如此。

用Nessler’s试剂定量直接估计出了尿素酶催化尿素水解产生出的氨(Koch等人，《美国化学协会杂志》1924年46卷2066-2069页)。天然幽门螺杆菌尿素酶的酶活性在1μg/ml浓度时可检测出。纯化的重组尿素酶浓度高达500μg/ml也测不出酶活性。

根据尿素酶特异性银染色试验，pH值敏感性酚红尿素肉汤试验和氨直接估计法的结果，重组尿素酶产物没有可检测到的尿素酶活性。纯化的重组尿素酶的保护和治疗功效

猫螺杆菌-小鼠模型被用于测试重组幽门螺杆菌尿素酶在预防和治疗螺杆菌感染中的功效。该模型中，细菌的胃部定居易于建立，并伴随有胃部炎症。这一动物模型是研究螺杆菌的一种成熟系统，已广泛用于螺杆菌所致疾病的发病机理和治疗的实验研究(见，如Fox等人，《感染与免疫》1993年61卷2309-2315页；Goodwin和Worsley《幽门螺杆菌生物学和临床实践》，CRC出版社，Boca Raton，FL，465页，1993年)。幽门螺杆菌和猫螺杆菌尿素酶之间存在抗原性交叉反应性，因此本发明中可以用人疫苗候选者重组幽门螺杆菌尿素酶(rUre)去免疫已感染或将被猫螺杆菌攻击的动物。

无菌小鼠和常规小鼠均易感于猫螺杆菌的感染，且形成终生的胃上皮感染，其特征是炎症细胞的浸润(Fox等人，前述)。剂量反应研究指示，只经口服10⁴个猫螺杆菌攻击后，100％的Swiss-Webster特异性无病原菌(SPF)小鼠被感染。除非另有特别说明，只用10⁷这一单一剂量在治疗性免疫之前感染小鼠或在预防性免疫之后攻击小鼠。用大约10³倍的该螺杆菌的感染剂量(I.D.90)进行的攻击说明对免疫的测试是严格的。胃感染试验

为检测胃组织中的螺杆菌用了好几种方法，包括测定胃尿素酶活性、组织学检查及胃组织培养。胃尿素酶活性的测定既有定性(有或无)又有定量。在定性试验中，胃从胃食管括约肌到幽门被纵向分成两个半边。其中一个纵剖块，代表约1/4的胃，被置于1ml尿素肉汤(0.1g酵母浸出汁，0.091g磷酸单钾，0.095g磷酸二钠，20g尿素，及0.1g/l酚红，pH 6.9)中。室温温育4小时后出现明显的颜色变化(是因为尿素受酶催化而水解，产生氨，则pH值升高)，这说明有阳性结果。在定量试验中，将全胃切片加入澄清的尿素肉汤中温育4小时，测得550nm的吸光率就测出了尿素酶活性。该试验可检测至少1-2×10⁴猫螺杆菌/0.1g胃组织。该试验与用于人体样品的商用尿素酶检测试剂盒具有同样的敏感性。而商用试剂盒已证实特异性相当于活检/组织学检查的100％，而敏感性相当于其90-92％(Szeto等人，Postgrad Med.J.1988年64卷935-936页；Borromeo等人，《临床病理学杂志》1987年40卷462-468页)。

经A₅₅₀分光光度测定的定量胃尿素酶试验比目测更敏感一点，还能估计感染的严重程度。阴性尿素酶试验的临界值定为未受攻击/未被感染的小鼠平均A₅₅₀以上2个标准差。阳性胃尿素酶试验的临界值定为未免疫/攻击后小鼠平均A₅₅₀以下2个标准差。低级别感染动物其试验值介于阴性和阳性临界值之间。目测尿素酶反应的级别，测出了11/12(92％)的阳性标本。

组织学检查如下进行：用10％福尔马林固定胃组织，再将其包埋进石蜡，切片并用改进的Warthin-Starry银染法(Steiner’s染色；Garvey等人，《组织学技术》1985年8卷15-17页)将猫螺杆菌染得可见，再经苏木精和伊红染色来评价组织中的炎症反应。染过色的切片由经验丰富的病理学家在不知道标本编号的情况下进行检查。

一种半定量分级系统被用于测定细菌数和炎症强度。该系统是被广为接受的Sydney系统的改进版，后一系统用于人类胃炎的组织学鉴定(Price《胃肠道学与肝脏学》1991年6卷209-222页)。全厚度粘膜切片受到检查，以便查明炎症强度(淋巴细胞、血浆细胞、中性粒细胞数量增加及出现淋巴滤泡)，并查明这些细胞浸润的深度，分成0-4+的级别。对猫螺杆菌密度定级可这样完成：在幽门窦(或胃体，若特别说明的话)的完整纵向切片中计数有典型的螺旋形态的细菌数目。级别可根据看到的细菌数范围来划定(0为无细菌，1+为1-20个细胞，2+为21-50个细菌，3+为51-100个细菌，而4+为多于100个细菌)。免疫途径

本发明中给药途径对疫苗功效的影响在小鼠感染模型中进行了检查。6-8周龄雌性特异性无病原菌(SPF)Swiss-Webster小鼠用200μg重组幽门螺杆菌尿素酶(含或不含0.24M NaHCO₃)免疫。同时对所有动物施用的还有作为粘膜佐剂的10μg霍乱毒素(CT)。胃内(IG)免疫实施如下：将0.5ml抗原通过20号注射针头传送给已麻醉的动物。口腔免疫实施如下：将50μl抗原通过移液管头传至未麻醉动物的颊腔。至于肠胃外免疫，是使小鼠经皮下接受10μg重组尿素酶。第一次皮下免疫接种时用的是弗氏完全佐剂，随后的加强免疫中用的是弗氏不完全佐剂。对所有给药途径来说，均是每隔七天给予总共有四种剂量的疫苗。最末次接种二周后用10⁷猫螺杆菌攻击小鼠，攻击二周后就验尸。用尿素酶活性和组织学测定胃的猫螺杆菌感染。确定某只小鼠体内有保护作用是通过尿素酶试验阴性，以及通过组织学测得的细菌量为0或1+级。

口服和胃内施用重组尿素酶提供了对抗猫螺杆菌攻击的显著保护作用(86-100％)(表1)。口腔给药在有或无NaHCO₃伴随重组酶时均有效。胃内给药在有NaHCO₃与重组酶共同使用时更有效。疫苗抗原的肠胃外注射作用最小。免疫小鼠比未免疫小鼠在受细菌攻击后其胃组织中的细菌数显著下降。口腔途径免疫的小鼠体内血清和分泌液中IgA抗体应答最强。肠胃外免疫接种则未能诱发出IgA抗体。

                   表1

      重组幽门螺杆菌尿素酶经粘膜而非肠胃

      外免疫后保护小鼠抵抗猫螺杆菌的攻击

疫苗	免疫途径	佐剂	碳酸氢盐a	保护百分率％(受保护的数目/总数)
						尿素酶试验	组织学检查b
				PBS	口腔			CT	无	0(0/8)	0(0/7)
200μg rUre	口腔	CT	无			100(8/8)*	100(7/7)*
				200μg rUre	口腔			CT	有	100(7/7)*	86(6/7)*
200μg rUre	胃内	CT	无			75(6/8)*	38(3/8)*
				200μg rUre	胃内			CT	有	100(7/7)*	100(7/7)*
10μg rUre	皮下	弗氏	NA			38(3/8)	25(2/8)

a 0.24M碳酸氢钠与疫苗和佐剂同时使用。

b保护百分率(有0～1+级细菌量的小鼠数/所有受测试小鼠数)。

^*p＜0.01，Fisher’s真实检验，与只给CT的小鼠相比。

在小鼠中检查了免疫途径对抗尿素酶抗体应答的影响。Swiss-Webster小鼠每隔10天进行免疫，一共免疫4次，方式用的是下列任一种：1)口腔给予200μg重组纯化幽门螺杆菌尿素酶及10μg CT(有或无NaHCO₃)；2)胃内给予200μg重组纯化幽门螺杆菌尿素酶及10μgCT(有NaHCO₃)；3)皮下给予带弗氏佐剂的10μg重组纯化幽门螺杆菌尿素酶。第4次接种一周后，检查粘膜和血清的抗体应答，方式是在包被有0.5μg天然幽门螺杆菌尿素酶的微滴板上做ELISA。血清样品稀释至1∶100，试验测定尿素酶特异性IgA和IgG。新鲜粪便块用蛋白酶抑制剂缓冲液(含5％脱脂干牛奶，0.2μM AEBSF，1μg/ml抑肽酶及10μM亮抑酶肽的PBS)提取，检测其中抗尿素酶的IgA抗体。在某些实验中，粪便抗体值被标准化为ELISA所测定的总IgA含量，即每份样品中将尿素酶特异性粪便IgA表示为若干A405吸收单位/总IgAmg数。在氯胺酮麻醉下用毛果云香碱刺激后收集唾液标本，稀释至1∶5测尿素酶特异性IgA。

在有或无NaHCO₃时经口腔免疫的小鼠其抗体应答未测出明显区别，数据都集中以备分析。皮下给予抗原的小鼠形成了尿素酶特异性血清IgG，但血清和粪便IgA应答的诱发只在抗原经粘膜途径(口腔或胃内)给予时出现。

不管经口腔或是经胃内，只要是用尿素酶/CT免疫了的小鼠均用10⁷猫螺杆菌攻击。口腔或胃内免疫后小鼠的攻击前抗体水平相关于猫螺杆菌攻击后组织学测得的细菌数(图5)。尽管各只小鼠间IgA应答很不一样，但总的来说，具有较高的血清和粪便IgA水平的小鼠其细菌数减少。这些数据说明IgA在抑制感染和保护小鼠抗感染时有作用。对比之下，血清IgG抗体与保护作用无关。某些受到保护的小鼠体内并未测到IgA抗体，而那些受攻击后发展到4+级感染的小鼠体内也未发现有高水平的抗尿素酶IgA。这些结果不仅支持了粘膜免疫应答参与保护的说法，而且提示除粪便和血清IgA外另有免疫介质对消除猫螺杆菌感染有效。

这些数据显示：i)保护性免疫必需经粘膜免疫接种；ii)口腔免疫途径的效果等同于，或更强于胃内途径；iii)要获得有效的胃内(而非口腔)免疫效果需用NaHCO₃中和胃酸；和iv)肠胃外免疫不能刺激粘膜免疫或提供有效地对抗细菌攻击的保护作用。免疫程序

比较了几种免疫接种程序以确定能诱发保护性免疫应答的最佳免疫接种程序。用总量为100μg的重组尿素酶按表2所示程序分二、三或四次口服给药来免疫Swiss-Webster小鼠。与重组尿素酶同时给予的还有粘膜佐剂CT(10μg)。根据定性的胃尿素酶试验的评价，那些每周一次共四次接受了抗原的小鼠呈现出最高水平的保护作用。在那些于第0、7和21天共被给予三次抗原的小鼠体内也发现有明显的保护作用。分泌型IgA抗体应答以那些按一周间隔共被给予四剂重组尿素酶的小鼠最高。根据保护率和抗体应答，选择最后一个程序以便进一步改进疫苗的治疗和预防功效。

                      表2

     不同的口服免疫程序对尿素酶疫苗的预防功效的影响

组别	疫苗剂量/免疫接种(μg)a	程序(免疫接种时间，天)	保护百分率(保护数/总数)b
				1	25	0，7，14，21	70(7/10)*
2	50	0，14	20(2/10)
				3	50	0，14	30(3/9)
4	33.3	0，7，21	40(4/10)*
				5	50，25和25	0，7，21	60(6/10)*
6	无	0，7，14，21	0(0/10)

a：每组小鼠均经口腔免疫接种总剂量为100μg的重组幽门螺杆菌尿素酶，每次免疫均用到CT(10μg)，它悬浮于无菌双蒸水中，作为粘膜佐剂，第6组在与第1组相同的程序内只接受了CT，它被作为对照组。第4组和第5组比较了在前面两次间隔为一周的免疫之后加强免疫所用剂量不同造成的影响。

b：免疫完两周后以10⁷剂量的猫螺杆菌攻击小鼠的保护百分率(被保护的小鼠数/参加测试的小鼠数)。小鼠在攻击二周后被处死，用定性胃尿素酶试验测定保护作用。

^*：p＜0.05 Fisher’s真实试验，是与只给予CT的小鼠比较的结果。

不同免疫程序对抗尿素酶抗体产生的影响在小鼠体内进行了检查。用表2所述五种不同免疫程序之一对小鼠免疫，其抗体应答受到检测。每周一次用疫苗接种小鼠，第21天加强免疫，免疫了四次或两次的小鼠可见明显的保护作用。由以上两种免疫程序之一免疫的小鼠还有着最高的平均免疫应答。每周一次共四次接种疫苗的小鼠体内血清IgG和唾液IgA水平最高。剂量-保护作用的关系

将重组尿素酶剂量以不同剂量经口服给予小鼠以决定免疫作用和保护作用所需的最小和最佳剂量。重组尿素酶按5、10、25、50和100μg的剂量经口腔途径给予每八只一组的小鼠，每次同时给予的还有溶于PBS的10μg CT。抗原每周口服一次，共四次。根据胃尿素酶试验和组织学细菌量的结果，所有剂量组均发现具有对抗猫螺杆菌攻击的显著保护作用，且不同剂量组之间没有显著性差别(表3)。剂量反应效应清楚地表现在抗重组尿素酶的血清和粘膜抗体应答中，其中100μg剂量水平的免疫应答最强。

                   表3

      重组幽门螺杆菌尿素酶在5μg剂量或更多

       剂量时，保护小鼠抵抗猫螺杆菌的攻击

疫苗	佐剂	免疫接种途径	保护百分率％A(受保护数目/总数)
					尿素酶试验	组织学
			无	10μg  CT			口腔	0(0/7)	0(0/7)
5μg rUre	10μg CT	口腔			86(6/7)*	71(5/7)*
			10μg rUre	10μg CT			口腔	88(7/8)*	63(5/8)*
25μg rUre	10μg CT	口腔			100(9/9)*	100(9/9)*
			50μg rUre	10μg CT			口腔	100(8/8)*	88(7/8)*
100μg rUre	10μg  CT	口腔			100(7/7)*	71(5/7)*

^A根据胃切片银染检查测得的保护百分率(每张切片上有0-20个细菌的小鼠数/受检小鼠数)

^*与假免疫对照组比较，Fisher’s真实检验，p≤0.02。

重组尿素酶剂量对抗尿素酶抗体应答的效应在小鼠体内进行检查。Swiss-Webster小鼠经口腔用分级剂量(0、5、10、25、50或100μg)的重组尿素酶加上10μg CT作粘膜佐剂进行免疫。随着所给的重组尿素酶量增加，血清、粪便和唾液中的IgA抗体应答也增强。100μg剂量的重组尿素酶产生了最高抗体水平。

Swiss-Webster小鼠经口腔用分级剂量(0、5、25或100μg)的重组尿素酶加上25μg肠产毒性大肠杆菌不耐热毒素(CT)作为粘膜佐剂进行免疫。另有一组小鼠接受了25μg重组尿素酶和10μg作粘膜佐剂的CT，作为对照组。小鼠每7天口腔免疫一次共4次。最后一次免疫后10到13天收集血清、粪便和唾液，尿素酶特异性抗体水平用ELISA测定。用重组尿素酶和CT免疫的小鼠血清和分泌液的抗尿素酶抗体水平升高，有明显的剂量反应效应。在这些小鼠中发现有强烈的唾液IgA抗体应答。

小鼠按上述经尿素酶和LT免疫后用10⁷猫螺杆菌攻击(见图4)。经尿素酶/LT免疫的小鼠用组织学检测的细菌级数与攻击前抗体的应答相关(图6)。各组中受到完全保护的(切片中细菌级数为0)和那些有较低级感染(切片细菌级数为1+级)的小鼠比有更严重感染的小鼠抗体水平更高。少数受保护小鼠未测到免疫应答，提示除IgA抗体外另有免疫介质在抗猫螺杆菌感染时发挥作用。

高剂量重组尿素酶诱发粘膜免疫应答的能力检查如下：胃内给予不加佐剂的1μg、200μg或5mg尿素酶。另一组小鼠胃内用200μg尿素酶加10μg CT免疫作为对照组。末次免疫5到8天后收集血液、粪便和唾液。小鼠在末次免疫的10天后用10⁷猫螺杆菌攻击，又过14天处死。用胃组织中的尿素酶活性查明猫螺杆菌的感染。

经ELISA测定，高剂量的重组尿素酶激发了尿素酶特异性血清IgG，但激发的粘膜抗体水平相对较低。出现尿素酶特异性血清IgG应答的小鼠在猫螺杆菌攻击时完全易感，说明血清IgG对保护无作用。

总之，上述各实验研究了不同给药途径，不同给药程序和不同的粘膜佐剂，所获数据证实：给予有效的粘膜佐剂时，口腔或胃内给予相对较低剂量的重组尿素酶就能诱发分泌型IgA抗体和血清IgA及IgG的应答。分泌型IgA有保护作用，而血清IgG应答没有保护作用。当用组织切片细菌计数来测保护性时，有着较高IgA抗体效价的小鼠与只有较低的IgA抗体效价的小鼠相比，前者受到完全保护，或是感染显著减轻。未测出IgA抗体水平的小鼠在攻击后发生严重感染。抗体应答呈剂量依赖并随给药程序的不同选择而变化。当抗原剂量为100-200μg时获得了最高抗体水平。按一周间隔给予4剂抗原为最佳免疫程序。另一种给药途径，鼻内途径，在后面进行调查。鼻内接种重组尿素酶

Swiss-Webster小鼠口腔或鼻内(IN)免疫接种重组尿素酶或福尔马林固定的尿素酶。抗原和佐剂的用量、给药途径(IN或口腔)及免疫程序均示于图7。福尔马林固定的尿素酶(Form-ure)按以下程序制备：

(1)含1mg重组尿素酶的小瓶用150μl RO/DI水重配；

(2)50μl福尔马林(37％甲醛)用RO/DI水1∶1000稀释后加入小瓶中(尿素酶终浓度为5mg/ml)；

(3)小瓶置35℃温育48小时。

IN+CT组比口腔+CT组的血清IgG、IgA、粪便IgA和唾液IgA的应答要强，尽管口腔免疫所用的重组尿素酶和佐剂用量要更高(图7和表4)。保护作用用尿素酶检验和测处死小鼠的胃组织上细胞级数的方法测定。当用尿素酶检验法测定保护时，IN组100％保护，而口腔组仅80％。口腔免疫的8只小鼠有7只的胃组织为细菌阳性，而IN组只有1/10的小鼠为细菌阳性(见表4中第3组和第6组和图8)。

在第二种试验中，小鼠用重组尿素酶经胃内(IG)或鼻内免疫，LT作为粘膜佐剂一起接种。(试验和免疫接种程序的细节参见图9)。该试验中，尽管IG免疫所用的抗原和佐剂量较多，但是IN+LT组的血清IgG、血清IgA和唾液IgA应答高于IG+LT组(图10，及表5中的第4和第8组)。根据尿素酶检验测定，IN+LT组小鼠在猫螺杆菌攻击时受到完全保护(实验组10只小鼠被保护的为10只，而对照组9只小鼠被保护的只有3只)(见表5的第4和第5组)。

                表4 鼻内免疫接种重组尿素酶和霍乱毒素

	尿素酶						4小时
										小鼠#	处理	接种途径/佐剂	血清IgG	血清IgA	粪便IgA	唾液IgA	尿素酶	细菌数	病理学
1A1	10μg/HCH0	IN/无佐剂	3.398	3.318	3.377	3.339	+
										1A2			3.119	3.218	0.786	3.249	+
1A3			2.967	2.535	0.893	3.153
										1A4			3.064	2.390	1.065	3.311	+
1A5			3.009	2.647	0.617	3.244	+
										1B1			2.994	2.068	0.497	3.329	-
1B2			3.099	2.611	-0.010	3.235	+
										1B3			3.306	1.823	0.323	3.295	+
1B4			3.424	2.931	0.522	3.372	+
										1B5			3.175	0.832	0.803	2.439	+
										2A1	10μg	IN/无佐剂	3.021	2.562	2.090	3.204	+
2A2			2.971	2.806	1.475	3.304	+
										2A3			2.894	1.943	0.584	3.288	+
2A4			2.918	2.804	2.291	3.363	+
										2A5			2.926	3.264	0.118	3.418	+
2B1			3.220	3.505	1.634	3.415	+
										2B2			3.383	2.708	0.410	3.336	+
2B3			3.092	1.814	0.411	3.253	+
										2B4			3.033	3.090	2.672	3.266	+

2B5			3.055	2.076	1.193	3.263	+
3A1	10μg	IN/CT	2.969	0.405	0.192	1.670	-	0	2
										3A2			2.871	0.097	0.154	0.526	-	0	2
3A3			2.984	0.677	0.081	0.473
										3A4			3.092	0.563	1.824	3.398	-
3A5			3.335	0.256	1.052	0.587	-	1	2
										3B1			3.013	0.148	0.142	0.586	-	0	2
3B2			3.068	0.388	0.867	2.410	-	0	2
										3B3			3.008	0.255	0.468	0.778	-	0	2
3B4			2.908	0.985	1.086	1.172	-	0	2
										3B5			2.879	0.186	1.904	1.317	-	0	2
										4A1	100μg/HCHO	口腔/无佐剂	-0.006	0.024	0.021	0.009	+
4A2			0.050	0.097	0.079	0.041	+
										4A3			0.001	0.097	0.056	-0.019	+
4A4			3.195	0.598	0.190	2.097	+	0	3
										4A5			1.271	0.027	0.034	0.010	+
4B1			0.096	0.045	0.165	0.309	+
										4B2			0.021	0.033	0.043	0.059	+
4B3			1.109	0.055	0.080	0.019	+
										4B4			0.006	0.022	0.083	0.017	+
4B5			0.013	0.027	0.039	0.010	+

5A1	100μg/--	口腔/无佐剂	0.032	0.042	0.151	0.030	+
										5A2			0.7 56	0.077	2.957	0.156	+
5A3			2.362	0.075	0.104	0.262	+
										5A4			0.012	0.034	0.146	0.065	+
5A5			0.011	0.035	0.163	0.013	+
										5B1			0.012	0.042	0.089	0.017	+
5B2			0.017	0.017	0.076	0.049	+
										5B3			1.583	0.058	0.058	0.182	+/-
5B4			0.602	0.030	0.093	0.093	+
										5B5			1.672	0.059	0.060	0.093	+
										6A1	25μg/--	口腔/CT	0.698	0.267	0.076	0.387	-	1	2
6A2			2.139	0.065	0.089	0.206	-	1	2
										6A3			0.006	0.013	0.098	0.011	-	3	2
6A4			2.957	0.354	0.185	2.999	-	1	2
										6A5			0.011	0.019	0.042	0.026	-	0	2
6B1			0.000	0.022	0.041	0.005	-	1	2
										6B2			0.009	0.002	0.067	0.069	-	2	2
6B3			0.320	0.022	0.041	0.048	+	4	2
										6B4			0.010	0.009	-0.021	0.023	+	4	2
6B5			2.633	0.090	0.047	0.647	-	1	2
7A1	未处理		0.011	0.018	0.074	0.019	+	4	1

7A2			0.007	0.025	0.042	-0.004	+	4	2
										7A3			0.000	0.019	0.082	0.018	+	4	2
7A4			0.004	0.028	0.024	-0.002	+	4	2
										7A5			0.011	0.005	0.041	0.029	x
7B1			0.019	0.004	0.089	-0.005	+	4	1
										7B2			0.006	-0.003	-0.009	0.008	+	4	2
7B3			0.006	0.024	0.066	0.167	+	4	2
										7B4			0.015	0.018	0.063	0.018	+	4	1
7B5			0.007	0.023	0.111	0.011	+
平板1	对照
										+			2.265	3.280	1.651	3.315
-			-0.010	0.040	0.065	0.056
平板2	对照
										+			1.969	3.289	1.700	3.298
-			-0.001	0.034	-0.004	0.019

表5鼻内接种重组尿素酶和LT

	尿素酶				2周后处死
						小鼠#	处理	血清IgG	血清IgA	唾液IgA	吸光率550
1AN	25μg  5×IN	3.530	0.350	0.340	0.802
						1AL	200μg 2×IG	3.263	0.154	1.544	0.768
1AR		3.231	0.630	0.204	0.805
						1ALL		3.233	0.318	0.251	0.806
1BN		3.344	0.401	0.112	0.726
						1BL		3.322	0.724	2.015	0.168
1BR		3.424	0.225	0.426	0.748
						1BLL		3.285	0.591	0.719	0.807
1BRR		3.262	0.141	0.202	0.675
2AN	25μg 5×IN	3.164	0.054	0.014	0.814
						2AL	200μg 1×IG	3.232	0.231	0.747	0.823
2AR		3.236	0.981	0.412	0.695
						2ALL		3.303	0.122	0.832	0.813
2BN		3.357	0.690	0.993	0.747
						2BL		3.264	1.002	0.840	0.704
2BR		3.284	1.377	.0934	0.161
						2BLL		3.241	.0458	0.191	0.748

2BRR		3.280	0.129	0.134	0.720
3AN	25μg 2×IN	0.165	0.031	0.001	0.791
						3AL	200μg 2×IG	3.364	0.332	0.356	0.824
3AR		1.731	0.031	-0.003	0.810
						3ALL		3.321	0.450	0.541	0.798
3ARR		3.358	0.158	0.001	0.675
						3BN		3.199	0.276	0.212	0.820
3BL		3.174	2.463	2.838	0.839
						3BR		3.274	0.607	1.517	0.481
3BLL		3.284	1.279	2.593	0.829
						3BRR		3.254	0.427	1.684	0.852
						4AN	25μg 4×IN	3.375	0.118	0.212	0.111
4AL	和2μg LT	3.482	0.346	0.546	0.107
						4AR		3.330	3.237	3.302	0.109
4ALL		3.343	3.067	3.229	0.103
						4ARR		3.220	1.625	2.156	0.106
4BN		3.287	1.263	2.943	0.224
						4BL		3.305	0.496	2.029	0.139
4BR		3.283	0.809	2.307	0.114
						4BLL		3.313	1.019	3.346	0.106
4BRR		3.474	0.674	1.683	0.119

5AN	未处理	0.075	0.023	0.001	0.126
						5AL		0.005	0.016	-0.002	0.881
5AR		0.011	0.008	-0.001	0.839
						5ARR		0.005	0.007	0.000	0.834
5BN		0.033	0.016	0.001	0.134
						5BL		0.013	0.009	0.004	0.814
5BR		0.025	0.014	0.007	0.833
						5BLL		0.028	0.019	0.008	0.155
5BRR		0.095	0.012	0.003	0.818
6AN	25μg 5×IN	3.353	0.680	0.498
						6AL	200μg 1×IG	3.470	0.248	0.100
6AR		3.387	1.236	0.741
						6ALL		3.362	0.409	0.322
6ARR		3.244	1.036	1.056
						6BN		3.211	2.749	2.014
6BL		3.286	0.360	0.328
						6BR		3.269	0.749	1.882
6BLL		3.347	0.275	0.030
						6BRR		3.321	0.311	0.989
						7AN	25μg 4×IN	3.415	0.756	2.584
7AL	和2μg LT	3.428	3.080	3.287

7AR		3.249	2.054	3.188
						7ALL		3.269	1.010	3.240
7ARR		3.255	0.713	3.243
						7BN		3.310	3.081	3.274
7BL		3.439	2.298	3.222
						7BR		3.359	1.026	1.757
7BLL		3.370	1.441	3.025
						7BRR		3.330	0.689	1.169
						8AN	200μg 4×IG	0.281	0.031	0.000
8AL	和10μg LT	3.234	0.925	1.872
						8AR		3.285	0.827	2.751
8ALL		3.313	0.547	0.395
						8ARR		3.363	0.382	1.144
8BN		3.407	1.189	1.880
						8BR		3.315	1.608	2.536
8BLL		3.271	0.438	0.599
9AN	未处理	0.011	0.003	0.000
						9AL		0.017	0.005	0.001
9AR		0.007	0.002	0.001
						9ALL		0.011	0.013	0.000
9ARR		0.006	0.019	-0.002

9BN		0.017	0.010	-0.001
						9BL		0.020	0.008	-0.002
9BR		0.031	0.012	-0.002
						9BLL		0.005	0.016	0.005
9BRR		0.019	0.011	0.000

鼻内免疫接种功效的进一步证明示于图11。简而言之，该试验显示：经鼻内途径与CT(5μg)一起接种重组尿素酶(10μg)与经口腔途径与CT(10μg)一起接种重组尿素酶(25μg)在预防猫螺杆菌感染中至少具有同样的效果。粘膜佐剂的选择

大肠杆菌不耐热毒素(LT)是多亚单位毒素，与CT不论生化上还是免疫学上都密切相关，由于LT毒性小于CT，故实际用于人体的粘膜佐剂是LT(Walker和Clements，《疫苗研究》1993年2卷1-10页)。

小鼠每周一次共4次经口腔免疫接种总量为5μg、25μg或100μg的重组尿素酶及25μg重组LT(瑞士血清疫苗研究所，Berne，瑞士)。对照小鼠只接种LT或接种含CT的25μg尿素酶疫苗。第4次给药2周后攻击小鼠，攻击2周后进行尸检。

在所有疫苗剂量的被免疫小鼠体内，胃尿素酶试验指示有显著的针对感染的保护或抑制作用(表6)。组织学评价证实接受了少于5μg或5μg尿素酶及LT的小鼠体内细菌数显著减少。经胃尿素酶试验和组织学检查测定保护作用直接相关于剂量，其中最强的保护作用由100μg重组尿素酶与LT共同用药而产生。抗体测定证实了剂量应答关系，其中100μg剂量引起最强的粘膜免疫应答。当重组尿素酶以相当剂量(25μg)用药时，LT作为粘膜佐剂效果优于CT。这些数据说明尽管CT增强了经口腔给予重组尿素酶的粘膜免疫应答，但LT是更好的粘膜佐剂，并因此比CT更优选与重组尿素酶一起给药。

                          表6

              大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)作为重组

                幽门螺杆菌尿素酶免疫的粘膜佐剂

疫苗	佐剂	保护百分率％a(受保护的数目/总数)
				尿素酶试验	组织学检查
		无	25μg LT			0(0/9)	0(0/9)
25μg rUre	10μg  CT			70(7/10)*	60(6/10)*
		5μg  rUre	25μg LT			787(7/9)*	56(5/9)*
25μg rUre	25μg LT			90(9/10)*	80(8/10)*
		100μg rUre	25μg LT			100(8/8)*	100(8/8)*

^a经胃切片银染后的细菌量测得的保护百分率(尿素酶试验阴性或细菌量为0至1+级的小鼠数/受检小鼠总数)

^* 假免疫对照组小鼠比较，Fisher’s真实检验，p＜0.03。

为确定低剂量LT的佐剂活性，小鼠经口腔以25μg重组尿素酶及1、5、10或25μg LT免疫。在所有LT剂量下观察到相似的保护率和抗体的应答。

另外还进行了几项研究以评价除CT和LT以外的其他佐剂，并确定能否通过单独施用较高剂量的抗原而无需使用粘膜佐剂。霍乱毒素B亚单位(CTB)作为尿素酶免疫的粘膜佐剂与CT比较。根据胃尿素酶活性测定，当用0.24M碳酸氢钠中的200μg尿素酶与100μg CTB(Calbiochem，La Jolla，CA)一起经胃内给药时未观察到保护效应，而同样剂量的重组酶与10μg CT一起给药却获得了100％的保护。

一种口腔活性的胞壁酰二肽半合成类似物，GMDP(N-乙酰葡糖胺酰-(b1-4)-N-乙酰-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺)按2、20和200μg的量与25μg尿素酶一起施用。结果没有保护小鼠抵抗猫螺杆菌攻击。

大剂量(200μg、1mg或5mg)重组尿素酶在有或无CT时经胃内给予小鼠，一周一次，共4次。胃内途径是必需的，因为高抗原剂量的体积超出了重复式口腔给药能承受的限度，同时给予NaHCO₃中和胃酸。每隔10天给药一次共4次。末次免疫5至8天后收集血液、粪便和唾液。小鼠经1×10⁷猫螺杆菌攻击，用胃组织中尿素酶活性确定感染。

缺少CT时，高抗原剂量未能提供抗猫螺杆菌攻击的保护作用，而对照组在给予了200μg重组尿素酶和CT后显著地受保护(表7)。无佐剂的高剂量重组尿素酶诱导了尿素酶特异性血清IgG。但血清、粪便和唾液IgA的应答未出现或很弱。从给予5mg尿毒酶的小鼠体内取样编号后作组织学检查，与未免疫动物比较未见细菌量或白细胞浸润的差别。

                                             表7

                      粘膜佐剂使重组尿素酶引发的保护作用增强

疫苗	佐剂	保护百分率(受保护者/受试全体)	攻击前平均抗体水平a(±标准差)
							血清IgG	血清IgG	粪便IgA	唾液IgA
			无	PBS	0(0/5)	0.01(±0.00)					0.03(±0.07)	0.01(±0.02)	0.02±0.03)
200μg rUre	10μg CT	88(7/8)*					＞2.97(±1.84)	＞1.02(±1.41)	0.16(±0.14)	0.59±0.73)
			200μg rUre	无	0(0/9)	＞2.06(±1.98)					0.07(±0.11)	0.02(±0.02)	0.06(±0 13)
1mg rUre	无	0(0/9)					＞3.28(±1.48)	0.12(±0.17)	0.02(±0.03)	0.18(±0.40)
			5mg rUre	无	0(0/9)	＞2.68(±1.98)					0.22(±0.17)	0.02(±0.02)	0.08(±0.11)

^a以血清(稀释至1∶100)、粪便抽提物(稀释至1∶20)或唾液(稀释至1∶5)的A₄₀₅单位数表示的平均(±SD)尿素酶特异性血清IgG或IgA水平。当计算平均值包括4.0的数值(A₄₀₅读数的最大值)时，平均值表示为＞。

^*与假免疫对照组相比，Fisher’s真实检验，p＝0.005。猫螺杆菌胃炎小鼠的治疗性免疫

重组尿素酶疫苗在治疗螺杆菌对小鼠感染中的功效检查如下：Balb/c小鼠胃内感染10⁷猫螺杆菌，4周后口腔给予总剂量为100μg的重组尿素酶和10μg的LT，一周一次共4次。对照组小鼠只接受LT(图12)。

末次免疫4周后每组取10只小鼠尸检，用定量胃尿素酶检查螺杆菌感染的程度，10只Balb/c小鼠中有9只未出现感染，这是依据定量尿素酶试验的测定，另一方面所有的对照组小鼠均被感染。

第4周，12只接受LT的小鼠和40只接受尿素酶+LT的小鼠用猫螺杆菌再感染。攻击10周后，处死动物以便用定量尿素酶试验确定感染的程度。根据胃尿素酶活性测得，9只给予尿素酶加LT但未受再次感染的小鼠中有5只仍没有感染(57％)。所有12只经LT处理后又被再次攻击的小鼠均受到感染。40只接受尿素酶加LT，并再次受猫螺杆菌攻击的小鼠中有37只(93％)受到保护。因为测得的胃尿素酶活性下降。该试验显示尿素酶接种不仅消除了已存在的螺杆菌感染，而且保护宿主抵抗再次感染。

14只免疫过的Swiss-Webster小鼠中有5只(36％)痊愈或感染减弱，而所有对照动物均被感染，只是实验组与对照组之间感染率的差别不是很明显(p＝0.26，Fisher’s真实检验，双尾)。Swiss-Webster小鼠的感染比Balb/c小鼠严重，因为测得的未免疫小鼠体内平均胃尿素酶活性较高些(p＜0.0001，单侧方差分析(one-way，ANOVA))，这也许能解释为什么Swiss-Webster小鼠比Balb/c小鼠的治愈率低。人们已注意到不同株小鼠对猫螺杆菌的易感性有差别(Sakagami等人，《美国胃肠道杂志》1994年89卷1345页)。

根据组织学评价，所有未免疫的Balb/c小鼠有着4+级感染(即＞100个细菌/切片)，而免疫小鼠第4周可见有43％其细菌级数下降。第10周时，6只中有4只尿素酶活性减弱，不过6只中只有1只细菌级数减少。螺杆菌治疗中抗体的作用

抗尿素酶抗体在螺杆菌治疗中的作用，即从被感染小鼠体内清除猫螺杆菌，通过首批用10⁷猫螺杆菌感染的Balb/c小鼠进行了检查。感染4周后，小鼠口腔免疫200μg重组尿素酶加10μg CT。对照组小鼠只给10μg CT。抗原给予是一周一次，共4次。末次免疫后的4周和10周后处死小鼠，收集血清和粪便样品以便做ELISA试验。

感染了猫螺杆菌的小鼠产生了血清抗尿素酶IgG抗体，但未测出分泌型抗尿素酶IgA的应答。而用尿素酶/CT免疫后仍感染了的动物存在较强的分泌型抗尿素酶IgA抗体应答(图13)。免疫过的小鼠中，维持感染状态的和细菌级数减少的小鼠之间尿素酶特异性粘膜IgA水平没有明显差别。

这些数据说明猫螺杆菌感染并未激发分泌型抗尿素酶抗体应答。这样一来，对IgA抗体应答的抑制可能就使猫螺杆菌能逃避免疫系统的清除。相反，对猫螺杆菌感染了的小鼠用重组酶和某种粘膜佐剂免疫就能产生强烈的粘膜抗尿素酶应答，而这种应答又与猫螺杆菌感染的清除相关。抗螺杆菌感染的保护作用与胃免疫应答的相关性

用小鼠感染模型所做的几个试验显示，某些小鼠经重组尿素酶疫苗接种后，缺乏可检测的抗体应答，或只有血清、唾液或粪便中的低水平抗体，但仍能产生抗感染性。因此直接在胃粘膜内测免疫应答，以确定是否存在与保护作用更精确相关的免疫应答。

对胃粘膜中免疫应答的评价方式是用免疫组织化学法测定鼠的肠道和胃组织中的IgA抗体及IgA阳性抗体分泌细胞。胃的各部分，包括幽门端十二指肠、胃窦、胃体及贲门均被封固在OCT混合物中，迅速冷冻，再制成冰冻切片。切片(7μm厚)在冷丙酮中固定，IgA阳性细胞的鉴别所用方法是：用生物素标记的单克隆抗IgA抗体染色，再用偶联有生物素标记的葡萄糖氧化酶的抗生物素蛋白(ABC-GO，VectorLaboratories，Burlmgame，CA)与之作用，然后以甲基绿负染。尿素酶特异性抗体分泌细胞(ASC)通过依次将切片与重组尿素酶、兔抗尿素酶、生物素标记的驴抗兔Ig(Amersham，Arlmgton Heights，IL)，ABC-GO，TNBT和甲基绿温育进行鉴别。对照切片未与尿素酶或尿素酶加兔抗尿素酶一起温育，目的是确定切片与驴源第二抗体的反应性以及内源性葡萄糖氧化酶活性本底。有两种细胞，其一为产生抗猫螺杆菌ureB的单克隆IgA抗体(MAB71)的杂交瘤细胞，其二为产生与本实验无关的抗呼吸道合胞病毒F糖蛋白的IgA单克隆抗体(HNK20)的杂交瘤细胞，将这两种细胞的沉淀的冰冻切片分别作为阳性和阴性对照。

Swiss-Webster小鼠经口腔免疫100μg重组尿素酶加佐剂(CT)，分四次完成，每周一次。对照小鼠只接受佐剂。每组3只小鼠在末次免疫后的第3、7、14或21天时分别作尸检。从肠道上取下集合淋巴结(Peyer’s结)，在40-70％的Percoll梯度上分离出固有层淋巴细胞(LPL)。IgA阳性B细胞用96孔滤板上的EUSPOT试验检测，板上包被了1μg/孔的重组尿素酶并用牛血清白蛋白封闭。10倍系列稀释的LPL加入小孔中，起始孔有1×10⁶细胞。IgA阳性ASC检测如下：加生物素标记的抗小鼠IgA试剂，再加链霉抗生物素蛋白-碱性磷酸酶，显微镜下计数阳性细胞。

末次免疫后仅3天就在肠固有层中用ELISPOT发现了抗尿素酶的IgA阳性ASC，第7天达到峰值，随后开始减少(表8)。尿素酶特异性ASC代表了免疫组织化学所观察到的全部IgA阳性细胞的10％左右。双色免疫荧光显微镜观察证实尿素酶特异性ASC也是IgA阳性。这些观测结果证实口腔抗原刺激后，在肠粘膜水平上发生了强烈的抗尿素酶IgA应答。该应答的时间进程和动力学类似于对其它口服疫苗的描述(Czerkinsky等人，《感染与免疫》1991年59卷996-1001页；McGhee和Kyono，《传染原人类疾病》1993年2卷55-73页)。

                       表8

             口服重组尿素酶免疫后对于抗

             尿素酶IgA分泌细胞的诱导动力学

免疫	ASC数目/106固有层淋巴细胞
					第3天a	第7天	第14天	第21天
	重组尿素酶+CTb	17c	7400	10					2
PBS+CT					1	200	0	0

^a末次口服免疫后的天数。

^b霍乱毒素。

^c平行孔的平均值(孔内含有来自3只不同小鼠的肠淋巴细胞)。

为确定IgA阳性细胞是否补充到胃粘膜中，如上述经免疫组织化学检查了口服免疫小鼠的胃。IgA阳性细胞在仅进行了免疫的小鼠和对照小鼠的胃粘膜中其实并未出现，这说明胃部处于免疫“沉默”状态，直至受螺杆菌攻击来刺激它打破此状态。

胃在已攻击的免疫小鼠体内作为免疫效应器官的作用受到检查。小鼠以一周间隔共4次口服总量为200μg的重组尿素酶及10μg的CT。对照小鼠只服CT。免疫一周后，攻击小鼠。攻击前及攻击后第7、14、28、70和133天时对小鼠进行尸检。

攻击前未发现IgA阳性ASC。攻击后的所有间隔时间内，IgA阳性细胞大量出现在免疫小鼠的胃粘膜中，第7天达峰值(图14)。IgA阳性ASC数在未免疫(只给CT)小鼠体内非常多，特别是在攻击后的7-28天内。IgA阳性ASC的解剖学定位也各不一样，免疫鼠整个粘膜，在肠固有层中和胃体四周都具有细胞，但很少见于表皮之下。尿素酶特异性和IgA阳性的ASC揭示胃粘膜中绝大多数尿素酶特异性细胞均是IgA阳性的。

这些现象说明预先经免疫接种致敏的鼠胃粘膜只有在猫螺杆菌抗原刺激后才变成免疫活化状态。导致的组织应答特点是快速、强烈、并持续补充IgA阳性B细胞，其中大多数是尿素酶特异性的。该应答大大强于攻击后免疫学上首次用于实验的小鼠体内的应答。且IgA阳性细胞在免疫小鼠中的定位也不同于免疫学上首次用于实验的小鼠，后者以猫螺杆菌攻击，处于持续感染状态。在胃粘膜中增强的IgA阳性ASC反应表明由抗猫螺杆菌攻击的免疫提供保护的基础。这些数据与霍乱疫苗的有关研究一致，在后一研究中攻击后数小时后内触发的记忆性免疫应答足以提供保护(Lycke和Holmgren，《斯堪的纳维亚免疫学杂志》(Scand.J.Immunol.)1987年25卷407-412页)。胃免疫应答与胃部所含细菌量的相关性

胃组织免疫应答与细菌感染之间的关系在结构水平上得到解释。Swiss-Webster小鼠用200μg重组尿素酶和10μg CT分4次每次间隔一周进行免疫。末次免疫一周后，用10⁷猫螺杆菌攻击小鼠。在攻击后第0、1、7、14、28、70和133天时处死小鼠，用光学显微镜和电子显微镜检查评价猫螺杆菌的定位。

攻击后24小时内，免疫鼠和非免疫鼠都有大量的猫螺杆菌分布在胃小凹的腔内(图15)。攻击后7天内，细菌从免疫小鼠中被清除，但仍大量出现在非免疫鼠的胃小凹和腔内。细菌还与非免疫小鼠粘液分泌细胞的顶端膜有关。细菌从免疫鼠胃粘膜上的清除相关于胃组织中IgA阳性ASC和抗尿素酶ASC的出现。

这些结果提示了以下事件的顺序：1)对免疫鼠攻击导致猫螺杆菌在胃上皮中短暂停留；2)非免疫鼠持续感染，而经重组尿素酶免疫的小鼠在攻击后第一周内就从胃中清除了细菌；3)感染的清除相关于IgA阳性尿素酶特异性ASC向胃粘膜的补充。类似的机理可能成为慢性感染动物从胃粘膜清除细菌的原因，这些动物均接受治疗性免疫。幽门螺杆菌不同株之间尿素酶的抗原保守性

各种抗血清结合幽门螺杆菌的多种临床分离株的能力受到检验。抗血清包括MPA3，一种制备成抗纯化幽门螺杆菌尿素酶的超免疫兔血清，还有来自重组尿素酶免疫小鼠的血清和分泌物(胃引流纱布样本及唾液)。抗体制品用免疫印迹检验，可识别同源幽门螺杆菌菌株(Hp630)，ATCC 43504模式株，及5株临床分离株，后者是从伦敦St.Bartholomew’s医院近五年内收治的溃疡病人中分离得到的。

所有抗血清都识别所有幽门螺杆菌菌株的ureA和ureB亚单位，以及纯化的天然和重组幽门螺杆菌尿素酶，天然和重组猫螺杆菌尿素酶，及天然鼬鼠螺杆菌尿素酶。此外，免疫小鼠胃切片和唾液中的尿素酶特异性IgA抗体可与所有幽门螺杆菌菌株的ureA和ureB以及异源性尿素酶反应。对ureB的免疫识别强于对ureA的识别。假免疫小鼠未显示出与任一种尿素酶亚单位有反应。这些结果证明幽门螺杆菌表达了在抗原性水平上高度保守的尿素酶。因此，幽门螺杆菌菌株间抗原性的不同对于开发重组尿素酶疫苗并非有意义的因素。用于治疗螺杆菌感染的联合方法和组合物

螺杆菌感染等胃十二指肠感染可以按如下方式处理：口服给予疫苗抗原(如幽门螺杆菌尿素酶)和粘膜佐剂，同时还给予一种抗生素、一种抗分泌剂、一种铋盐、一种抗酸药硫糖铝，或它们的联合形式。能与疫苗抗原和佐剂同时给予的这类化合物的实例有：抗生素，包括诸如大环内酯类、四环素、β-内酰胺类、氨基糖苷类、quinolone青霉素，以及它们的衍生物(抗生素中可能用于本发明的具体实例包括羟氨苄青霉素、甲基红霉素(clarithromycin)、四环素、灭滴灵、红霉素、头孢呋辛和红霉素等)；抗分泌剂包括诸如H₂-受体拮抗剂(如西咪替丁、雷尼替丁、法莫替丁、尼扎替丁和罗沙替丁，质子泵抑制剂(如奥美拉唑、兰索拉唑和邦托拉唑)，前列腺素类似物(如米索前列腺素和恩前列腺素)，以及抗胆碱能剂(如哌仑西平、替仑西平、甘珀酸和丙谷胺；还有铋盐，包括胶态次柠檬酸铋、二柠檬酸三钾铋盐、次水杨酸铋、二柠檬肽(bicitropeptide)和pepto-bismol(见，如，Goodwin等人，《幽门螺杆菌的生物学和临床实践》CRC出版社，Boca Raton，FL，366-395页，1993年；Physician’s Desk Reference，49版，MedicalEconomics Data Production Company，Montvale，New Jersey，1995)。此外，包含有不止一种上文所列组分偶联的化合物，如雷尼替丁与次柠檬酸铋偶联，也会被用到。

本发明的方法和组合物中所用的上列化合物的量对本领域的技术人员来说是易于确定的。另外，本领域技术人员也很容易设计出治疗/免疫程序。如，非疫苗组分可以在第1-14天用药，而疫苗抗原加佐剂可在第7、14、21和28天用药。

除尿素酶外，其它螺杆菌抗原也可用于本发明有关联合治疗的方法和组合物中。例如，可使用螺杆菌热休克蛋白A或B(HspA或HspB；WO 94/26901)，螺杆菌粘附脂蛋白A(AlpA；编码AlpA的核苷酸序列示于SEQ ID NO：6中。对应的AlpA氨基酸序列示于SEQ IDNO：7)，螺杆菌(如幽门螺杆菌)clpB(clpB由菌株XLOLR HP CP6的质粒上插入片段编码，该菌株保存于苏格兰Aberdeen的国家工业和海洋细菌保藏中心，指定为NCIMB登记号40748)，或由单克隆抗体IgG50识别的16-19kD螺杆菌抗原(IgG50得自杂交瘤细胞系#50-G₆-B₇，这一细胞株保存于ATCC并指定为ATCC登记号HB-11952)。此外，用Haas等人的转座子穿梭诱变法鉴定的螺杆菌表面暴露或分泌抗原可在本发明中用作疫苗抗原(Haas等人，《基因》1993年130卷23-31页；Haas等人，《胃十二指肠病理学和幽门螺杆菌第六届专题讨论会摘要》，Brussels，1993年9月21-25日，Odenbreit等人，内脏，国际胃肠道学和肝脏学杂志，胃十二指肠病理学和幽门螺杆菌第八届专题讨论会摘要，Edinburgh，Scotland，1995年7月7-9日)。该方法中，克隆化的幽门螺杆菌基因在大肠杆菌中用转座子插入诱变法诱变。这些失活基因经DNA转化重新导入幽门螺杆菌。等位置换的结果产生相应的幽门螺杆菌突变子。此方法的一种修改方法中所用转座子携带blaM，它是β-内酰胺酶基因的一种5′端截断形式。用这个转座子有利于标记可编码含引导肽的外运蛋白的基因，因而能直接选择出带有外运蛋白(如，细胞表面蛋白，象粘附素、细胞毒素及其他潜在的细胞表面毒力因子)突变的克隆，这些克隆均为疫苗抗原的主要候选物。除螺杆菌抗原外，非螺杆菌的胃十二指肠病原菌抗原也可用在防止和/或治疗分别由这些病原菌引起的感染的方法和组合物中。本发明中也可用到含上列抗原的保护性和/或治疗性表位的多肽片段。

本发明的方法和组合物中使用的佐剂包括粘膜佐剂，如大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)、霍乱毒素、艰难杆菌毒素，或其衍生物(如片段，突变子，或有佐剂活性的类毒素)或联合形式。如可使用含有艰难杆菌毒素A的794个羧基端氨基酸(如见，Dove等人，出处同上，关于艰难杆菌毒素A序列)的一种片段。本发明的组合物和方法中所用疫苗抗原和佐剂的量如上所述。

含有一种疫苗(幽门螺杆菌尿素酶+CT)、一种抗生素(羟氨苄青霉素及一种铋盐(pepto-bismol)的组合物对螺杆菌感染的治疗效果见下文描述。小鼠螺杆菌感染的联合治疗

在用大约107猫螺杆菌感染了一个月后，小鼠每天一次共14天用羟氨苄青霉素(1.5mg/30g小鼠)和/或pepto-bismol(0.2mg/30g小鼠)，和/或在第7、14、21和28天时给予一种含有100μg重组幽门螺杆菌尿素酶加5μg LT的疫苗组合物(见表9对所用到的联合形式的描述)进行治疗。这些小鼠体内的螺杆菌感染在末次处理(第28天)后的一周和四周后用定量胃尿素酶试验(见上)测定。正如表9所示，最有效的治疗方案(细菌清除率可达100％)包含了施用一种疫苗(尿素酶加LT)、一种抗生素(羟氨苄青霉素)和一种铋盐(pepto-bismol)。

                  表9

        猫螺杆菌感染已清除的小鼠百分数治疗周数                            1周          4羟氨苄青霉素                    60％         40％pepto-bismol                    0％          0％羟氨苄青霉素+pepto-bismol       80％         40％疫苗                            70％         40％疫苗+羟氨苄青霉素               89％         56％疫苗+pepto-bismol               ～70％疫苗+羟氨苄青霉素+pepto-bismol  100％(疫苗＝尿素酶+佐剂)鉴定病人以便施用重组幽门螺杆菌疫苗

本发明的重组幽门螺杆菌尿素酶疫苗可以用于未感染者作为预防性措施，或用于已感染螺杆菌患者进行抗菌治疗。被选出预防性施用重组尿素酶的人包括任何一名有感染螺杆菌危险的人，这种危险的确定是基于年龄、地理分布或存在某种能使人易感染螺杆菌的状况。感染的特别高危个体，或有可能被严重感染的人包括发展中国家的人、发展中国家和发达国家的婴幼儿和儿童、先天或人为胃酸pH值偏低者、潜水艇艇员以及军人。

接受重组幽门螺杆菌尿素酶疫苗治疗的病人包括那些有胃炎或其它可能与幽门螺杆菌感染有关的胃肠道疾病症状的人。与胃炎(一种胃粘膜炎症)有关的临床症状包括范围广泛的难以确诊、又通常治疗不当的症状，诸如消化不良、“心烧”消化不良和过度嗳气。在Sleisenger和Fordtran之间有一场关于胃炎的全面讨论，发表在《胃肠道疾病》第4版第772-902页，该书由宾夕法尼亚州费城的Sauders出版公司于1989年出版。

胃肠道紊乱的患者也可施用本发明的疫苗来进行治疗。胃肠道紊乱包括任何一种属于人或其它哺乳动物胃肠道的疾病或其它紊乱。如胃肠道紊乱可包括未表现为胃粘膜溃疡的紊乱(非溃疡性胃肠道紊乱)，包括慢性或萎缩性胃炎、肠胃炎、非溃疡性消化不良、食管反流病、胃功能紊乱和消化性溃疡疾病(如胃和十二脂肠溃疡)。消化性溃疡包括食管、胃或十二指肠粘膜表面损伤的形成和溃疡，而且通常表现出的特点是因消化性酸、胃蛋白酶或其它因素的作用使组织损失。另一方面，可将疫苗施用于无症状的人，特别是当个体有可能受幽门螺杆菌攻击或存在某种使个体易感的情况时。

螺杆菌的感染可方便地用本领域技术人员熟知的多种方法诊断，这些方法包括如血清学，¹³C呼吸检测，和/或胃镜检查。用干人的纯化重组尿素酶的制备

配制重组尿素酶的程序包括将尿素酶与某种稳定剂(如一种甘露糖醇)结合，并将制品冷冻干燥(即冻干)。该过程可防止因凝聚和碎裂所致降解。此外，冻干后制品可稳定数月。导致不稳定的过程包括在蛋白质亚单位间形成二硫键，冻干可有效抑制这种过程。

最后一步纯化后重组尿素酶被冻干。这种纯蛋白制品(约4mg/ml)被置于2％蔗糖中透析，再将透析过的溶液移入冻干用小瓶。小瓶中的溶液可以(1)在液氮中冷冻，再置入冻千机内，或(2)冷至4℃，再放入冻干机，在其中被冻至-40℃或更低温度。冻干按标准方法进行。冻千制品可用水重配。对病人用药的方式

重组幽门螺杆菌尿素酶被施用至病人粘膜表面，以刺激粘膜免疫应答，从而对随后的螺杆菌攻击提供有效的保护作用，和/或有效地促进对已有螺杆菌感染的清除。优选给予重组尿素酶以激发粘膜免疫应答，该应答与抗尿素酶抗体的产生和/或淋巴细胞对胃粘膜的浸润相关。重组尿素酶可被用于病人的任一种粘膜表面。优选的粘膜表面有鼻内、口腔和直肠粘膜(如用肛门栓剂)。除了用于单一粘膜表面外，本发明的疫苗还可应用于粘膜表面的组合(如，口腔加直肠、口腔加鼻内、或直肠加鼻内)。口腔用药时，优选用药方式为将疫苗吞服，但疫苗也可以漱口剂形式给予，从而刺激口腔粘膜表面免疫应答，而无需将疫苗吞服。另一方面，以诸如滴眼液或眼内植入的形式将疫苗用于眼的粘膜表面可产生全身性粘膜免疫应答。

施用给病人作预防性治疗或抗菌治疗的重组幽门螺杆菌尿素酶所用剂量可以由本领域的技术人员确定。一般来说，剂量为约10μg到1000mg重组幽门螺杆菌尿素酶，例如10mg到500mg，30mg到120mg，40mg到70mg，或60mg。

用于病人的重组幽门螺杆菌尿素酶不少于一剂，例如用至少两剂、至少四剂或高达六剂甚至更多的总剂量。在末次免疫后间隔一周或两周给予加强剂量的重组尿素酶较为理想，通常一个加强免疫剂量含有少于或等于初次给予的重组幽门螺杆菌尿素酶剂量。例如疫苗方案可以是分4剂使用，每次间隔一周。初始剂量和加强剂量可用在相同或不同的粘膜表面。就不同粘膜表面来说，例如口腔初始剂接下来可以是鼻内或直肠的加强剂，鼻内初始剂接下来可以是口腔或直肠的加强剂，或直肠初始剂接下来可以是口腔或鼻内加强剂。

重组幽门螺杆菌尿素酶可与一种粘膜佐剂一同给药。该粘膜佐剂可以是本领域已知适用于人的任一种佐剂。如，粘膜佐剂可以是霍乱毒素(CT)，肠产毒性大肠杆菌不耐热毒素(LT)，或CT或LT的保留有佐剂活性的一种衍生物、亚单位或片段。与重组幽门螺杆菌尿素酶一同使用的粘膜佐剂其量足以引发或增强粘膜免疫应答，尤其是体液和/或粘膜免疫应答。佐剂与重组尿素酶之比由本领域的技术人员用标准方法确定。例如，佐剂比例可以是1份佐剂比10份重组尿素酶。

在用重组幽门螺杆菌尿素酶之前可以用一种缓冲剂中和胃酸或提高胃酸的pH值。任何能有效提高胃酸pH并适合人用的缓冲剂都可以使用。例如，可用碳酸氢钠缓冲剂、碳酸氢钾缓冲剂和磷酸钠缓冲剂。至于口腔给药方式，疫苗可不含缓冲剂，即在给病人接种重组尿素酶疫苗之前或同时，不使用能有效影响胃酸pH的pH提升用缓冲剂化合物。

含有重组尿素酶的疫苗制剂可含有多种其他组分，包括稳定剂、调味剂(加糖)，或当疫苗用于抗菌治疗时，包括其它能有效促进感染性细菌的清除和/或消化的化合物。

用于预防性治疗时，含有重组幽门螺杆菌尿素酶的疫苗可在接触螺杆菌或该菌的感染建立之前任一时间使用。因该疫苗也可作抗菌治疗，故若有临界迹象或怀疑已存在螺杆菌感染(如无症状感染)时，也可毫无顾虑地使用该疫苗。

用疫苗作抗菌治疗时，可在症状出现之前、期间或之后的任一时间给予重组幽门螺杆菌尿素酶，上述症状与螺杆菌感染或胃炎、消化性溃疡或其它胃肠道紊乱有关。开始治疗前可通过下述方法确证螺杆菌感染的诊断，但这并非是必需的，确证方法如¹³C呼吸检验、血清学、胃镜、活检或其它本领域已知的螺杆菌检测法。免疫病人的进程可用常规医疗评价方法监测，即通过血清学、¹³C呼吸检验和/或胃镜检查筛选幽门螺杆菌感染。对人类使用重组幽门螺杆菌尿素酶的实施例

一种疫苗组成如下：在总体积15ml的水(内含2％重量/体积比的蔗糖，pH 7.5)中含60mg重组幽门螺杆菌尿素酶，将该疫苗经口腔给予病人。疫苗每周使用一次，一共4次。每天由病人记录症状。为检查副作用，医生在使用疫苗期间每周一次，并在末次免疫的一周和1个月后进行探访。在血清和唾液中测量抗尿素酶抗体，末次免疫后第7天采集外周血监测抗体分泌型细胞。序列表(1)一般资料：

(i)申请人：OraVax，Inc.

(ii)发明名称：多体、重组尿素酶疫苗

(iii)序列数：7

(iv)通讯地址：

  (A)联系人：Fish & Richardson P.C

  (B)街道：225 Franklin Street

  (C)城市：Boston

  (D)州：MA

  (E)国家：USA

  (F)邮编：02110-2804

(v)计算机可读形式：

  (A)介质类型：软盘

  (B)计算机：IBM PC兼容

  (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

  (D)软件：PatentIn Release#1.0，版本#1.25

(vi)当前申请数据：

  (A)申请号：PCT/US96/---

  (B)申请日：1996.4.23

  (C)类别：

(vii)在先申请数据：

  (A)申请号：08/431,04 1

  (B)申请日：1995.4.28

  (C)分类：

(vii)在先申请数据：

  (A)申请号：08/568,122

  (B)申请日：1995.12.6

  (C)分类：

(viii)代理人/代理机构资料：

  (A)姓名：Clark，Paul T

  (B)登记号：30,162

  (C)参考/备案号：06132/020001

(ix)电信资料：

  (A)电话：(617)542-5070

  (B)电传：(617)542-8906(2)SEQ ID NO：1资料：

(i)序列特征：

  (A)长度：2735碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：双链

  (D)拓扑构型：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列表述：SEQ ID NO：1：TAATACGACT CACTATAGGG GAATTGTGAG CGGATAACAA TTCATCCACC TTGATTGCGT      60TATGTCTTCA AGGAAAAACA CTTTAAGAAT AGGAGAATGA GATGAAACTC ACCCCAAAAG      120AGTTAGATAA GTTGATGCTC CACTACGCTG GAGAATTGGC TAAAAAACGC AAAGAAAAAG      180GCATTAAGCT TAACTATGTA GAAGCAGTAG CTTTGATTAG TGCCCATATT ATGGAAGAAG      240CGAGAGCTGG TAAAAAGACT GCGGCTGAAT TGATGCAAGA AGGGCGCACT CTTTTAAAAC      300CAGATGATGT GATGGATGGC GTGGCAAGCA TGATCCATGA AGTGGGTATT GAAGCGATGT      360TTCCTGATGG GACTAAACTC GTAACCGTGC ATACCCCTAT TGAGGCCAAT GGTAAATTAG      420TTCCTGGTGA GTTGTTCTTA AAAAATGAAG ACATCACTAT CAACGAAGGC AAAAAAGCCG      480TTAGCGTGAA AGTTAAAAAT GTTGGCGACA GACCGGTTCA AATCGGCTCA CACTTCCATT      540TCTTTGAAGT GAATAGATGC CTAGACTTTG ACAGAGAAAA AACTTTCGGT AAACGCTTAG      600ACATTGCGAG CGGGACAGCG GTAAGATTTG AGCCTGGCGA AGAAAAATCC GTAGAATTGA      660TTGACATTGG CGGTAACAGA AGAATCTTTG GATTTAACGC ATTGGTTGAT AGACAAGCAG      720ACAACGAAAG CAAAAAAATT GCTTTACACA GAGCTAAAGA GCGTGGTTTT CATGGCGCTA      780AAAGCGATGA CAACTATGTA AAAACAATTA AGGAGTAAGA AATGAAAAAG ATTAGCAGAA      840AAGAATATGT TTCTATGTAT GGTCCTACTA CAGGCGATAA AGTGAGATTG GGCGATACAG      900ACTTGATCGC TGAAGTAGAA CATGACTACA CCATTTATGG CGAAGAGCTT AAATTCGGTG      960GCGGTAAAAC CCTAAGAGAA GGCATGAGCC AATCTAACAA CCCTAGCAAA GAAGAGTTGG      1020ATTTAATTAT CACTAACGCT TTAATCGTGG ATTACACCGG TATTTATAAA GCGGATATTG      1080GTATTAAAGA TGGCAAAATC GCTGGCATTG GTAAAGGCGG TAACAAAGAC ATGCAAGATG      1140GCGTTAAAAA CAATCTTAGC GTAGGTCCTG CTACTGAAGC CTTAGCCGGT GAAGGTTTGA      1200TCGTAACGGC TGGTGGTATT GACACACACA TCCACTTCAT TTCACCCCAA CAAATCCCTA      1260CAGCTTTTGC AAGCGGTGTA ACAACCATGA TTGGTGGTGG AACCGGTCCT GCTGATGGCA      1320CTAATGCGAC TACTATCACT CCAGGCAGAA GAAATTTAAA ATGGATGCTC AGAGCGGCTG      1380AAGAATATTC TATGAATTTA GGTTTCTTGG CTAAAGGTAA CGCTTCTAAC GATGCGAGCT      1440TAGCCGATCA AATTGAAGCC GGTGCGATTG GCTTTAAAAT TCACGAAGAC TGGGGCACCA      1500CTCCTTCTGC AATCAATCAT GCGTTAGATG TTGCGGACAA ATACGATGTG CAAGTCGCTA      1560TCCACACAGA CACTTTGAAT GAAGCCGGTT GTGTAGAAGA CACTATGGCT GCTATTGCTG      1620GACGCACTAT GCACACTTTC CACACTGAAG GCGCTGGCGG CGGACACGCT CCTGATATTA      1680TTAAAGTAGC CGGTGAACAC AACATTCTTC CCGCTTCCAC TAACCCCACC ATCCCTTTCA      1740CCGTGAATAC AGAAGCAGAG CACATGGACA TGCTTATGGT GTGCCACCAC TTGGATAAAA      1800GCATTAAAGA AGATGTTCAG TTCGCTGATT CAAGGATCCG CCCTCAAACC ATTGCGGCTG      1860AAGACACTTT GCATGACATG GGGATTTTCT CAATCACCAG TTCTGACTCT CAAGCGATGG      1920GCCGTGTGGG TGAAGTTATC ACTAGAACTT GGCAAACAGC TGACAAAAAC AAGAAAGAAT      1980TTGGCCGCTT GAAAGAAGAA AAAGGCGATA ACGACAACTT CAGGATCAAA CGCTACTTGT      2040CTAAATACAC CATTAACCCA GCGATCGCTC ATGGGATTAG CGAGTATGTA GGTTCAGTAG      2100AAGTGGGCAA AGTGGCTGAC TTGGTATTGT GGAGTCCAGC ATTCTTTGGC GTGAAACCCA      2160ACATGATCAT CAAAGGCGGA TTCATTGCGT TAAGCCAAAT GGGCGATGCG AACGCTTCTA      2220TCCCTACCCC ACAACCGGTT TATTACAGAG AAATGTTCGC TCATCATGGT AAAGCTAAAT      2280ACGATGCAAA CATCACTTTT GTGTCTCAAG CGGCTTATGA CAAAGGCATT AAAGAAGAAT      2340TAGGACTTGA AAGACAAGTG TTGCCGGTAA AAAATTGCAG AAATATCACT AAAAAAGACA      2400TGCAATTCAA CGACACTACT GCTCACATTG AAGTCAATCC TGAAACTTAC CATGTGTTCG      2460TGGATGGCAA AGAAGTAACT TCTAAACCAG CCAATAAAGT GAGCTTGGCG CAACTCTTTA      2520GCATTTTCTA GGATTTTTTA GGAGCAACGC TTCCTTAAAT CCTGAATTCG AGCTCCGTCG      2580ACAAGCTTGC GGCCGCACTC GAGCACCACC ACCACCACCA CTGAGATCCG GCTGCTAACA      2640AAGCCCGAAA GGAAGCTGAG TTGGCTGCTG CCACCGCTGA GCAATAACTA GCATAACCCC      2700TTGGGGCCTC TAAACGGGTC TTGAGGGGTT TTTTG                                 2735(2)SEQ ID NO：2资料：

(i)序列特征：

  (A)长度：238氨基酸

  (B)类型：氨基酸

  (D)拓扑构型：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列表述：SEQ ID NO：2：Met Lys Leu Thr Pro Lys Glu Leu Asp Lys Leu Met Leu His Tyr Ala1               5                   10                  15Gly Glu Leu Ala Lys Lys Arg Lys Glu Lys Gly Ile Lys Leu Asn Tyr

        20                  25                  30Val Glu Ala Val Ala Leu Ile Ser Ala His Ile Met Glu Glu Ala Arg

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        100                 105                 110Leu Lys Asn Glu Asp Ile Thr Ile Asn Glu Gly Lys Lys Ala Val Ser

    115                 120                 125Val Lys Val Lys Asn Val Gly Asp Arg Pro Val Gln Ile Gly Ser His

130                 135                 140Phe His Phe Phe Glu Val Asn Arg Cys Leu Asp Phe Asp Arg Glu Lys145                 150                 155                 160Thr Phe Gly Lys Arg Leu Asp Ile Ala Ser Gly Thr Ala Val Arg Phe

            165                 170                 175Glu Pro Gly Glu Glu Lys Ser Val Glu Leu Ile Asp Ile Gly Gly Asn

        180                 185                 190Arg Arg Ile Phe Gly Phe Asn Ala Leu Val Asp Arg Gln Ala Asp Asn

    195                 200                 205Glu Ser Lys Lys Ile Ala Leu His Arg Ala Lys Glu Arg Gly Phe His

210                 215                 220Gly Ala Lys Ser Asp Asp Asn Tyr Val Lys Thr Ile Lys Glu225                 230                 235(2)SEQ ID NO：3资料：

(i)序列特征：

  (A)长度：566氨基酸

  (B)类型：氨基酸

  (D)拓扑构型：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列表述：SEQ ID NO：3：Met Lys Lys Ile Ser Arg Lys Glu Tyr Val Ser Met Tyr Gly Pro Thr1               5                   10                  15Thr Gly Asp Lys Val Arg Leu Gly Asp Thr Asp Leu Ile Ala Glu Val

        20                  25                  30Glu His Asp Tyr Thr Ile Tyr Gly Glu Glu Leu Lys Phe Gly Gly Gly

    35                  40                  45Lys Thr Leu Arg Glu Gly Met Ser Gln Ser Asn Asn Pro Ser Lys Glu

50                  55                  60Glu Leu Asp Leu Ile Ile Thr Asn Ala Leu Ile Val Asp Tyr Thr Gly65                  70                  75                  80Ile Tyr Lys Ala Asp Ile Gly Ile Lys Asp Gly Lys Ile Ala Gly Ile

            85                  90                  95Gly Lys Gly Gly Asn Lys Asp Met Gln Asp Gly Val Lys Asn Asn Leu

        100                 105                 110Ser Val Gly Pro Ala Thr Glu Ala Leu Ala Gly Glu Gly Leu Ile Val

    115                 120                 125Thr Ala Gly Gly Ile Asp Thr His Ile His Phe Ile Ser Pro Gln Gln

130                 135                 140Ile Pro Thr Ala Phe Ala Ser Gly Val Thr Thr Met Ile Gly Gly Gly145                 150                 155                 160Thr Gly Pro Ala Asp Gly Thr Asn Ala Thr Thr Ile Thr Pro Gly Arg

            165                 170                 175Arg Asn Leu Lys Trp Met Leu Arg Ala Ala Glu Glu Tyr Ser Met Asn

        180                 185                 190Leu Gly Phe Leu Ala Lys Gly Asn Ala Ser Asn Asp Ala Ser Leu Ala

    195                 200                 205Asp Gln Ile Glu Ala Gly Ala Ile Gly Phe Lys Ile His Glu Asp Trp

210                 215                 220Gly Thr Thr Pro Ser Ala Ile Asn His Ala Leu Asp Val Ala Asp Lys225                 230                 235                 240Tyr Asp Val Gln Val Ala Ile His Thr Asp Thr Leu Asn Glu Ala Gly

            245                 250                 255Cys Val Glu Asp Thr Met Ala Ala Ile Ala Gly Arg Thr Met His Thr

        260                 265                 270Phe His Thr Glu Gly Ala Gly Gly Gly His Ala Pro Asp Ile Ile Lys

    275                 280                 285Val Ala Gly Glu His Asn Ile Leu Pro Ala Ser Thr Asn Pro Thr Ile

290                 295                 300Pro Phe Thr Val Asn Thr Glu Ala Glu His Met Asp Met Leu Met Val305                 310                 315                 320Cys His His Leu Asp Lys Ser Ile Lys Glu Asp Val Gln Phe Ala Asp

            325                 330                 335Ser Arg Ile Arg Pro Gln Thr Ile Ala Ala Glu Asp Thr Leu His Asp

        340                 345                 350Met Gly Ile Phe Ser Ile Thr Ser Ser Asp Ser Gln Ala Met Gly Arg

    355                 360                 365Val Gly Glu Val Ile Thr Arg Thr Trp Gln Thr Ala Asp Lys Asn Lys

370                 375                 380Lys Glu Phe Gly Arg Leu Lys Glu Glu Lys Gly Asp Asn Asp Asn Phe385                 390                 395                 400Arg Ile Lys Arg Tyr Leu Ser Lys Tyr Thr Ile Asn Pro Ala Ile Ala

            405                 410                 415His Gly Ile Ser Glu Tyr Val Gly Ser Val Glu Val Gly Lys Val Ala

        420                 425                 430Asp Leu Val Leu Trp Ser Pro Ala Phe Phe Gly Val Lys Pro Asn Met

    435                 440                 445Ile Ile Lys Gly Gly Phe Ile Ala Leu Ser Gln Met Gly Asp Ala Asn

450                 455                 460Ala Ser Ile Pro Thr Pro Gln Pro Val Tyr Tyr Arg Glu Met Phe Ala465                 470                 475                 480His His Gly Lys Ala Lys Tyr Asp Ala Asn Ile Thr Phe Val Ser Gln

            485                 490                 495Ala Ala Tyr Asp Lys Gly Ile Lys Glu Glu Leu Gly Leu Glu Arg Gln

        500                 505                 510Val Leu Pro Val Lys Asn Cys Arg Asn Ile Thr Lys Lys Asp Met Gln

    515                 520                 525Phe Asn Asp Thr Thr Ala His Ile Glu Val Asn Pro Glu Thr Tyr His

530                 535                 540Val Phe Val Asp Gly Lys Glu Val Thr Ser Lys Pro Ala Asn Lys Val545                 550                 555                 560Ser Leu Ala Gln Leu Phe

            565(2)SEQ ID NO：4资料：

(i)序列特征：

  (A)长度：28碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：二者

  (D)拓扑构型：二者

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列表述：SEQ ID NO：4：CGGGATCCAC CTTGATTGCG TTATGTCT                                      28(2)SEQ ID NO：5资料：

(i)序列特征：

  (A)长度：27碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：二者

  (D)拓扑构型：二者

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列表述：SEQ ID NO：5：

CGGAATTCAG GATTTAAGGA AGCGTTG                            27(2)SEQ ID NO：6资料：

(i)序列特征：

  (A)长度：1557碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：二者

  (D)拓引构型：二者

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列表述：SEQ ID NO：6：ATGATAAAAA AGAATAGAAC GCTGTTTCTT AGTCTAGCCC TTTGCGCTAG CATAAGTTAT   60GCCGAAGATG ATGGAGGGTT TTTCACCGTC GGTTATCAGC TCGGGCAAGT CATGCAAGAT   120GTCCAAAACC CAGGCGGCGC TAAAAGCGAC GAACTCGCCA GAGAGCTTAA CGCTGATGTA   180ACGAACAACA TTTTAAACAA CAACACCGGA GGCAACATCG CAGGGGCGTT GAGTAACGCT   240TTCTCCCAAT ACCTTTATTC GCTTTTAGGG GCTTACCCCA CAAAACTCAA TGGTAGCGAT   300GTGTCTGCGA ACGCTCTTTT AAGTGGTGCG GTAGGCTCTG GGACTTGTGC GGCTGCAGGG   360ACGGCTGGTG GCACTTCTCT TAACACTCAA AGCACTTGCA CCGTTGCGGG CTATTACTGG   420CTCCCTAGCT TGACTGACAG GATTTTAAGC ACGATCGGCA GCCAGACTAA CTACGGCACG   480AACACCAATT TCCCCAACAT GCAACAACAG CTCACCTACT TGAATGCGGG GAATGTGTTT   540TTTAATGCGA TGAATAAGGC TTTAGAGAAT AAGAATGGAA CTAGTAGTGC TAGTGGAACT   600AGTGGTGCGA CTGGTTCAGA TGGTCAAACT TACTCCACAC AAGCTATCCA ATACCTTCAA   660GGCCAACAAA ATATCTTAAA TAACGCAGCG AACTTGCTCA AGCAAGATGA ATTGCTCTTA   720GAAGCTTTCA ACTCTGCCGT AGCCGCCAAC ATTGGGAATA AGGAATTCAA TTCAGCCGCT   780TTTACAGGTT TGGTGCAAGG CATTATTGAT CAATCTCAAG CGGTTTATAA CGAGCTCACT      840AAAAACACCA TTAGCGGGAG TGCGGTTATT AGCGCTGGGA TAAACTCCAA CCAAGCTAAC      900GCTGTGCAAG GGCGCGCTAG TCAGCTCCCT AACGCTCTTT ATAACGCGCA AGTAACTTTG      960GATAAAATCA ATGCGCTCAA TAATCAAGTG AGAAGCATGC CTTACTTGCC CCAATTCAGA      1020GCCGGGAACA GCCGTTCAAC GAATATTTTA AACGGGTTTT ACACCAAAAT AGGCTATAAG      1080CAATTCTTCG GGAAGAAAAG GAATATCGGT TTGCGCTATT ATGGTTTCTT TTCTTATAAC      1140GGAGCGAGCG TGGGCTTTAG ATCCACTCAA AATAATGTAG GGTTATACAC TTATGGGGTG      1200GGGACTGATG TGTTGTATAA CATCTTTAGC CGCTCCTATC AAAACCGCTC TGTGGATATG      1260GGCTTTTTTA GCGGTATCCA ATTAGCCGGT GAGACCTTCC AATCCACGCT CAGAGATGAC      1320CCCAATGTGA AATTGCATGG GAAAATCAAT AACACGCACT TCCAGTTCCT CTTTGACTTC      1380GGTATGAGGA TGAACTTCGG TAAGTTGGAC GGGAAATCCA ACCGCCACAA CCAGCACACG      1440GTGGAATTTG GCGTAGTGGT GCCTACGATT TATAACACTT ATTACAAATC AGCAGGGACT      1500ACCGTGAAGT ATTTCCGTCC TTATAGCGTT TATTGGTCTT ATGGGTATTC ATTCTAA         1557(2)SEQ ID NO：7资料：

(i)序列特征：

  (A)长度：518氨基酸

  (B)类型：氨基酸

  (D)拓扑构型：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列表述：SEQ ID NO：7：Met Ile Lys Lys Asn Arg Thr Leu Phe Leu Ser Leu Ala Leu Cys Ala1               5                  10                  15Ser Ile Ser Tyr Ala Glu Asp Asp Gly Gly Phe Phe Thr Val Gly Tyr

         20                  25                  30Gln Leu Gly Gln Val Met Gln Asp Val Gln Asn Pro Gly Gly Ala Lys

     35                  40                  45Ser Asp Glu Leu Ala Arg Glu Leu Asn Ala Asp Val Thr Asn Asn Ile

 50                  55                  60Leu Asn Asn Asn Thr Gly Gly Asn Ile Ala Gly Ala Leu Ser Asn Ala65                  70                  75                  80Phe Ser Gln Tyr Leu Tyr Ser Leu Leu Gly Ala Tyr Pro Thr Lys Leu

             85                  90                  95Asn Gly Ser Asp Val Ser Ala Asn Ala Leu Leu Ser Gly Ala Val Gly

        100                 105                 110Ser Gly Thr Cys Ala Ala Ala Gly Thr Ala Gly Gly Thr Ser Leu Asn

    115                 120                 125Thr Gln Ser Thr Cys Thr Val Ala Gly Tyr Tyr Trp Leu Pro Ser Leu

130                 135                 140Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Ile Gly Ser Gln Thr Asn Tyr Gly Thr145                 150                 155                 160Asn Thr Asn Phe Pro Asn Met Gln Gln Gln Leu Thr Tyr Leu Asn Ala

            165                 170                 175Gly Asn Val Phe Phe Asn Ala Met Asn Lys Ala Leu Glu Asn Lys Asn

        180                 185                 190Gly Thr Ser Ser Ala Ser Gly Thr Ser Gly Ala Thr Gly Ser Asp Gly

    195                 200                 205Gln Thr Tyr Ser Thr Gln Ala Ile Gln Tyr Leu Gln Gly Gln Gln Asn

210                 215                 220Ile Leu Asn Asn Ala Ala Asn Leu Leu Lys Gln Asp Glu Leu Leu Leu225                 230                 235                 240Glu Ala Phe Asn Ser Ala Val Ala Ala Asn Ile Gly Asn Lys Glu Phe

            245                 250                 255Asn Ser Ala Ala Phe Thr Gly Leu Val Gln Gly Ile Ile Asp Gln Ser

        260                 265                 270Gln Ala Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Asn Thr Ile Ser Gly Ser Ala

    275                 280                 285Val Ile Ser Ala Gly Ile Asn Ser Asn Gln Ala Asn Ala Val Gln Gly

290                 295                 300Arg Ala Ser Gln Leu Pro Asn Ala Leu Tyr Asn Ala Gln Val Thr Leu305                 310                 315                 320Asp Lys Ile Asn Ala Leu Asn Asn Gln Val Arg Ser Met Pro Tyr Leu

            325                 330                 335Pro Gln Phe Arg Ala Gly Asn Ser Arg Ser Thr Asn Ile Leu Asn Gly

        340                 345                 350Phe Tyr Thr Lys Ile Gly Tyr Lys Gln Phe Phe Gly Lys Lys Arg Asn

    355                 360                 365Ile Gly Leu Arg Tyr Tyr Gly Phe Phe Ser Tyr Asn Gly Ala Ser Val

370                 375                 380Gly Phe Arg Ser Thr Gln Asn Asn Val Gly Leu Tyr Thr Tyr Gly Val385                 390                 395                 400Gly Thr Asp Val Leu Tyr Asn Ile Phe Ser Arg Ser Tyr Gln Asn Arg

            405                 410                 415Ser Val Asp Met Gly Phe Phe Ser Gly Ile Gln Leu Ala Gly Glu Thr

        420                 425                 430Phe Gln Ser Thr Leu Arg Asp Asp Pro Asn Val Lys Leu His Gly Lys

    435                 440                 445Ile Asn Asn Thr His Phe Gln Phe Leu Phe Asp Phe Gly Met Arg Met

450                 455                 460Asn Phe Gly Lys Leu Asp Gly Lys Ser Asn Arg His Asn Gln His Thr465                 470                 475                 480Val Glu Phe Gly Val Val Val Pro Thr Ile Tyr Asn Thr Tyr Tyr Lys

            485                 490                 495Ser Ala Gly Thr Thr Val Lys Tyr Phe Arg Pro Tyr Ser Val Tyr Trp

        500                 505                 510Ser Tyr Gly Tyr Ser Phe

    515

Claims (33)

1.一种用于在病人体内诱导对螺杆菌的粘膜免疫应答的疫苗，该疫苗包括：

a)重组、无酶活性的螺杆菌尿素酶多体复合物；及

b)一种药用载剂或稀释剂。

2.权利要求1的疫苗，包括一种含8个尿素酶A亚单位和8个尿素酶B亚单位的多体复合物，一种含6个尿素酶A亚单位和6个尿素酶B亚单位的多体复合物及一种含4个尿素酶A亚单位和4个尿素酶B亚单位的多体复合物，或它们的混合物。

3.权利要求1的疫苗，包括一种含8个尿素酶A亚单位和8个尿素酶B亚单位的多体复合物，一种含6个尿素酶A亚单位和6个尿素酶B亚单位的多体复合物及一种含4个尿素酶A亚单位和4个尿素酶B亚单位的多体复合物。

4.权利要求1的疫苗，其中还包括一种粘膜佐剂。

5.权利要求1的疫苗，其中粘膜佐剂是肠产毒性大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、艰难杆菌毒素、它们的缺乏毒性但仍有佐剂活性的亚单位或衍生物，或它们的混合物。

6.权利要求4的疫苗，其中粘膜佐剂是肠产毒性大肠杆菌不耐热肠毒素或它的失去毒性但保留佐剂活性的一种亚单位或衍生物。

7.权利要求4的疫苗，其中粘膜佐剂是霍乱毒素或它的丧失毒性但保留佐剂活性的一种亚单位或衍生物。

8.权利要求4的疫苗，其中粘膜佐剂是艰难杆菌毒素，或它的失去毒性但保留佐剂活性的一种亚单位或衍生物。

9.权利要求8的疫苗，其中粘膜佐剂包括艰难杆菌毒素A的糖结合区。

10.权利要求1的疫苗，其中重组、无酶活性螺杆菌尿素酶的多体复合物已经冻干。

11.权利要求1的疫苗，其中螺杆菌尿素酶是幽门螺杆菌尿素酶。

12.一种用于治疗病人的胃十二指肠感染的组合物，该组合物包括(a)来自胃十二指肠病原菌的一种抗原，及(b)一种抗生素、一种抗分泌剂、一种铋盐，或它们的组合形式。

13.权利要求12的组合物，其中胃十二指肠病原菌是螺杆菌。

14.权利要求13的组合物，其中螺杆菌是幽门螺杆菌。

15.权利要求13的组合物，其中抗原是一种尿素酶。

16.权利要求13的组合物，其中抗原包括重组、无酶活性螺杆菌尿素酶的多体复合物。

17.权利要求13的组合物，包括一种含8个尿素酶A亚单位和8个尿素酶B亚单位的多体复合物，一种含6个尿素酶A亚单位和6个尿素酶B亚单位的多体复合物及一种含4个尿素酶A亚单位和4个尿素酶B亚单位的多体复合物，或它们的混合物。

18.权利要求13的组合物，包括一种含8个尿素酶A亚单位和8个尿素酶B亚单位的多体复合物，一种含6个尿素酶A亚单位和6个尿素酶B亚单位的多体复合物及一种含4个尿素酶A亚单位和4个尿素酶B亚单位的多体复合物。

19.权利要求12的组合物，其中螺杆菌感染是幽门螺杆菌感染。

20.权利要求12的组合物，其中包括一种粘膜佐剂。

21.权利要求20的组合物，其中粘膜佐剂是肠产毒性大肠杆菌的不耐热肠毒素、霍乱毒素、艰难杆菌毒素，或它们的失去毒性但仍有佐剂活性的亚单位或衍生物，或它们的混合物。

22.权利要求20的组合物，其中粘膜佐剂是肠产毒性大肠杆菌的不耐热肠毒素，或它的失去毒性但仍有佐剂活性的一种亚单位或衍生物。

23.权利要求20的组合物，其中粘膜佐剂是霍乱毒素，或其失去毒性但仍有佐剂活性的一种亚单位或衍生物。

24.权利要求20的组合物，其中粘膜佐剂是艰难杆菌毒素，或其失去毒性但仍有佐剂活性的衍生物。

25.权利要求24的组合物，其中粘膜佐剂包括艰难杆菌毒素A的糖结合区。

26.权利要求12的组合物，其中抗生素选自羟氨苄青霉素、甲基红霉素、四环素、灭滴灵和红霉素。

27.权利要求12的组合物，其中铋盐选自次柠檬酸铋和次水杨酸铋。

28.权利要求12的组合物，其中抗分泌剂是一种质子泵抑制剂。

29.权利要求28的组合物，其中质子泵抑制剂选自奥美拉唑、兰索拉唑和邦托拉唑。

30.权利要求12的组合物，其中抗分泌剂是一种H₂受体拮抗剂。

31.权利要求30的组合物，其中H₂受体拮抗剂选自雷尼替丁、西咪替丁、法莫替丁、尼扎替丁和罗沙替丁。

32.权利要求12的组合物，其中抗分泌剂是一种前列腺素类似物。

33.权利要求32的组合物，其中前列腺素类似物是米索前列腺素或恩前列腺素。

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