CN111647619A - 一种幽门螺杆菌口服疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及幽门螺杆菌口服疫苗领域，具体涉及一种融合表达幽门螺杆菌抗原基因与Aga2基因的重组酿酒酵母。本发明借助酿酒酵母表面展示系统，展示幽门螺杆菌的UreB或VacA蛋白，构建一种全新的针对幽门螺杆菌的口服疫苗。该口服疫苗能有效提高机体对幽门螺杆菌的免疫预防作用，具有良好的应用价值。

Description

一种幽门螺杆菌口服疫苗
技术领域
本发明涉及幽门螺杆菌口服疫苗领域，尤其涉及一种幽门螺杆菌口服疫苗。
背景技术
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H.pylori)是一种新型的革兰氏阴性菌，在胃黏膜上皮细胞表面呈螺旋状或S形。其长2.5～4.0um,宽为0.5～1.0um。菌体一端有4～7根鞭毛，为H.pylori定植过程提供动力，且在定居过程中具有“锚定”作用，使之与胃黏膜紧密贴合，防止位移。H.pylori是一种专性微需氧菌，对生长环境的要求比较苛刻，生长于5％～8％的氧气环境中。被H.pylori感染后，其附着在胃上皮细胞上，在体内定植、繁殖，引起活动性胃炎的发生，改变胃的生理机能，引起胃酸分泌过多，导致慢性胃炎、急性胃炎、十二指肠溃疡和消化性溃疡。同时，它破坏分泌酸的黏膜，导致萎缩性胃炎、胃黏膜相关淋巴瘤和胃癌等疾病的风险，是消化系统疾病的主要病原菌。美国国立卫生研究院(NIH)证实了大多数再发性消化性溃疡因幽门螺杆菌感染所致，世界卫生组织(WHO)将其列于一类致癌物清单中。
目前，临床上主要采用三联疗法(质子泵抑制剂、克拉霉素+阿莫西林、奥美拉唑)治疗与H.pylori感染相关的疾病。抗生素在根除H.pylori中发挥了重要作用，但是随之而来的临床问题是，抗生素也杀伤肠道内其他益生菌，影响肠道菌群的稳定。此外，随着抗生素耐药性的急剧上升，临床治疗方案中抗生素的用量在不断增加，而且疗效也不尽如人意，细菌耐药性问题不断出现。值得注意的是，H.pylori容易反复感染，这就使得抗生素在临床治疗方案中出现了矛盾，即抗生素用量增加并没有增加临床治愈的效果。世界卫生组织(WHO)公布了对人类健康构成最大威胁的12种耐药性细菌和细菌家族清单，其中幽门螺杆菌(对克拉霉素耐药)排名第6位。再次，抗生素的使用存在过敏等诸多不良反应。令人触目惊心的是，每年全球直接或间接死于抗生素耐药的约有70万人，且数量逐年增长，因此造成的肌体损伤及不良反应更是无法估量。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae，S.cerevisiae)表面展示系统利用酿酒酵母的a-凝集素受体在细胞表面显示外来蛋白。凝集素受体由AGA1和AGA2基因编码的两个亚单位组成。Aga1蛋白(Aga1p,725个氨基酸)由细胞分泌后，共价连接到β-葡聚糖酵母细胞壁的细胞外基质。Aga2蛋白(Aga2p,69个氨基酸)通过两个二硫键与Aga1p结合，分泌后通过与Aga1p的接触与细胞保持附着。商业化的pYD1(美国Invitrogen公司)是一个5.0kb的酿酒酵母配套表达质粒，该载体可以使目标基因与AGA2融合。Aga2p的N端部分需要与Aga1p连接，而目标蛋白可以融合到C端，呈现在酿酒酵母细胞表面。酿酒酵母能够展示高分子量的蛋白质，能对表达的外源真核生物蛋白质进行有效的折叠、糖基化和形成二硫键。Wei Q利用酿酒酵母表面展示系统展示金属调节蛋白MerR并证明其可用于环境汞污染物的生物吸附和生物修复。Karbanowicz T利用酿酒表面展示系统展示神经毒素作为一种生产重组毒素的技术，揭示了基于酿酒酵母表面展示系统在工业中的潜在应用。
其相比其他展示系统有较多优势。首先，酿酒酵母具有公认的安全性(GRAS)，并且在食品和医药工业中已经被大量使用。其次，酿酒酵母EBY100的细胞壁表面成分中含有佐剂β-1,3-D-葡聚糖和甘露聚糖，能够增强机体对抗原的免疫应答。再次，酿酒酵母分子显示系统具有典型的真核特异性、翻译后修饰机制，能够表达许多翻译后修饰所需的功能蛋白。再次，酿酒酵母的培养方法简单，成本低，生长周期短，能够大规模应用于工业生产。
目前已有使用酿酒酵母表面展示系统构建的一些病毒疫苗，比如申请号201510405035.8的专利公开了一种酵母展示草鱼出血病注射用疫苗及其制备方法，该疫苗通过糖基化基因敲除后的酿酒酵母细胞EBY100△Mnn9表面展示GCRV-VP7蛋白制备。但目前未见酵母表面展示系统构建的幽门螺杆菌口服疫苗的报道。
本发明首次应用酿酒酵母表面展示技术构建幽门螺杆菌口服疫苗，并通过构建幽门螺杆菌感染的动物模型，考察酿酒酵母表面展示平台作为幽门螺杆菌口服疫苗递送载体的免疫保护效率。进一步地，为研发基于酿酒酵母表面展示平台为基础的细菌口服疫苗提供可行的策略和方法。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种重组酿酒酵母及其应用。
本发明的技术方案包括：
一种重组质粒，所述重组质粒能够融合表达幽门螺杆菌抗原基因与Aga2基因，得到表达融合蛋白的重组质粒；
所述幽门螺杆菌抗原基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～2任一所示；
所述融合蛋白中幽门螺杆菌抗原基因表达得到的肽段位于Aga2基因表达得到肽段的C端。
如前述的重组质粒，所述重组质粒以Invitrogen生产的pYD1质粒为骨架质粒。
如前述的重组质粒，所述幽门螺杆菌抗原基因连接有终止密码子序列。
一种重组酿酒酵母，它是包含前述任一重组质粒的酿酒酵母。
如前述的重组酿酒酵母，所述酿酒酵母是S.cerevisiae EBY100。
前述的重组酿酒酵母在制备幽门螺杆菌疫苗中的用途。
如前述的用途，所述疫苗为口服疫苗。
一种幽门螺杆菌疫苗，它是以前述任一重组酿酒酵母为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。
如前述的疫苗，所述辅助性成分为肠溶性胶囊。
一种制备前述重组酿酒酵母的方法，包括如下步骤：
(1)构建能够融合表达幽门螺杆菌抗原基因与Aga2基因的重组质粒，得到表达融合蛋白的重组质粒；
(2)将所述重组质粒导入感受态酿酒酵母菌中，即可；
所述幽门螺杆菌抗原基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～2任一所示。
本发明能够有效预防幽门螺杆菌的感染，具有十分良好的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过具体实施方式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
注：Lane表示电泳泳道。
图1；培养的H.pylori菌株。
图2：UreB和VacA基因PCR电泳图
A.Lane 1:DNA marker(DL 2,000)；Lane 2:UreB基因为1710bp；
B.Lane 1:DNA marker(DL 2,000)；Lane 2:VacA基因为780bp。
图3：双酶切后的质粒pYD1，Lane 1:DNA marker(DL5,000)；Lane 2:双酶切后的质粒pYD1为5009bp。
图4：重组质粒pYD1-UreB和pYD1-VacA的双酶切鉴定图。
A.Lane 1:DNA marker(DL 5,000)；Lane 2:pYD1-UreB经Nhe I/EcoR I双酶切；
B.Lane 1:DNA marker(DL 5,000)；Lane 2:pYD1-VacA经Nhe I/EcoR I双酶切。
图5：重组酿酒酵母S.cerevisiae EBY100/pYD1、S.cerevisiae EBY100/pYD1-UreB和S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA的PCR鉴定电泳图
A.Lane 1:DNA marker(DL 2,000)；Lane 2:以S.cerevisiae EBY100/pYD1基因组DNA为模板，pYD1正反引物扩增的PCR结果。
B.Lane 1:DNA marker(DL 5,000)；Lane 2:以S.cerevisiae EBY100/pYD1-UreB基因组DNA为模板，pYD1正反引物扩增的PCR结果；Lane 3:以S.cerevisiae EBY100/pYD1-UreB基因组DNA为模板，UreB正反引物扩增的PCR结果；
C.Lane 1:DNA marker(DL 2,000)；Lane 2:以S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA基因组DNA为模板，pYD1正反引物扩增的PCR结果；Lane 3:以S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA基因组DNA为模板，VacA正反引物扩增的PCR结果。
图6：酿酒酵母表面展示构建幽门螺杆菌的模式图
A.展示UreB蛋白的酿酒酵母表面展示系统的模式图。
B.展示VacA蛋白的酿酒酵母表面展示系统的模式图。
图7：Western blot检测UreB和VacA蛋白的特异性表达
A.EBY100/pYD1-UreB的Western blot分析：Lane 1：蛋白质标准品；Lane 2:EBY100/pYD1裂解物；Lane 3：EBY100/pYD1-UreB裂解物；
B.EBY100/pYD1-VacA的Western blot分析。Lane 1：蛋白标准品；Lane 2：EBY100/pYD1裂解物；Lane 3：EBY100/pYD1-VacA裂解物。
图8：EBY100/pYD1-UreB的免疫荧光分析结果，A.阴性对照EBY100/pYD1；B.EBY100/pYD1-UreB。(放大倍数：400×)。
图9：EBY100/pYD1-VacA的免疫荧光分析结果，A.阴性对照EBY100/pYD1；B.EBY100/pYD1-VacA。(放大倍数：400×)。
图10：EBY100/pYD1-UreB的流式细胞仪分析结果，A.阴性对照EBY100/pYD1；B.EBY100/pYD1-UreB，(计数：10,000细胞)。
图11：EBY100/pYD1-VacA的流式细胞仪分析结果，A.阴性对照EBY100/pYD1；B.EBY100/pYD1-VacA，(计数：10,000细胞)。
图12：口服免疫安排。
图13：ELISA检测抗-UreB特异性血清IgG效价，与PBS组和EBY100/pYD1组相比较，EBY100/pYD1-UreB组和EBY100/pYD1-UreB+EBY100/pYD1-VacA组具有统计学意义(*表示p<0.05)。
图14：ELISA检测抗-VacA特异性血清IgG效价，与PBS组和EBY100/pYD1组相比较，EBY100/pYD1-VacA组和EBY100/pYD1-UreB+EBY100/pYD1-VacA组具有统计学意义(*表示p<0.05)。
图15：ELISA检测抗-UreB特异性分泌型IgA，与PBS组和EBY100/pYD1组相比较，EBY100/pYD1-UreB组和EBY100/pYD1-UreB+EBY100/pYD1-VacA组具有统计学意义(*表示p<0.05)。
图16：ELISA检测抗-VacA特异性分泌型IgA，与PBS组和EBY100/pYD1组相比较，EBY100/pYD1-VacA组和EBY100/pYD1-UreB+EBY100/pYD1-VacA组具有统计学意义(*表示p<0.05)。
图17：H.pylori SS1在小鼠胃内的定植数量分析，与PBS组和EBY100/pYD1组相比较，EBY100/pYD1-UreB组、EBY100/pYD1-VacA组组和EBY100/pYD1-UreB+EBY100/pYD1-VacA组具有统计学意义(*表示p<0.05)。
图18：尿素酶测定结果，与PBS组和EBY100/pYD1组相比较，EBY100/pYD1-UreB组、EBY100/pYD1-VacA组和EBY100/pYD1-UreB+EBY100/pYD1-VacA组具有统计学意义(*表示p<0.05)。
具体实施方式
实施例1获得DNA片段UreB、VacA以及质粒pYD1
1.引物设计及合成：对照pYD1载体的酶切位点特性，在UreB，VacA基因(序列如SEQID NO：1～2所示)上游引物中引入Nhe Ⅰ酶切位点，下游引物中引入EcoR Ⅰ酶切位点并包含终止子密码子(TAA)。在上游引物与下游引物中添加保护碱基。PCR引物由上海生物工程技术服务有限公司合成，引物序列设计如下(下划线为酶切位点):
Figure BDA0002548870540000061
2.H.pylori基因组的获取：确定选择老鼠适应的H.pylori SS1菌株。培养基为含8％脱纤维羊血的选择性哥伦比亚琼脂，内含幽门螺杆菌培养基添加剂(抗生素)。取冷冻保存的菌株立即放入37℃水浴30s，然后接种于哥伦比亚固体培养基，每板80uL，涂布棒涂匀，放入2.5L的密封罐，内含微需氧袋(85％N2，10％CO2，5％O2)，37℃培养3～5天，培养的菌落形态如图1所示，菌落呈针尖样，透明，直径1～2mm。收集后用细菌基因组抽提试剂盒提取H.pylori基因组DNA。
3.PCR扩增获得目的片段：以H.pylori基因组DNA为模板，分别用UreB正反引物、VacA正反引物进行PCR扩增。UreB基因的PCR扩增结果如图2A所示，Lane 2中的UreB片段(约1,710bp)与预期相符。VacA基因的PCR扩增结果如图2B所示，Lane 2中VacA基因长度约为762bp。结果证明成功获得了UreB基因和VacA基因。最后参照DNA凝胶回收试剂盒(TaKaRa)回收获得目的基因片段UreB和VacA。
UreB和VacA是H.pylori最重要的两个毒力因子，已经成为研发H.pylori疫苗最重要的靶点。然而，UreB和VacA基因有很多抗原表位，选择不同的基因片段，就会产生不同的免疫效果。为了充分获得UreB和VacA蛋白的免疫原性，我们对UreB和VacA蛋白的理化性质、亲水性、疏水性、免疫原性等方面进行综合分析，并使用在线免疫表位预测工具对T细胞及B细胞表位进行预测，最终选择UreB抗原和VacA抗原性较强的表位区作为本发明的幽门螺杆菌抗原基因。
4.获得pYD1质粒：从-80℃超低温冰箱中取出含pYD1质粒的E.coli DH5α，在含100μg/ml氨苄青霉素抗性的LB固体培养基中进行划线过夜培养。从平板上挑选单菌落，接种至含100μg/ml氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中，37℃、250rpm振荡过夜培养。利用质粒DNA小量纯化试剂盒(TaKaRa)按照说明书步骤对pYD1质粒进行抽提纯化。1％琼脂糖凝胶电泳分析。参照DNA凝胶回收试剂盒(Takara)回收后获得pYD1质粒。
实施例2重组质粒pYD1-UreB和pYD1-VacA的分子构建
1.对PCR扩增获得的UreB和VacA片段分别进行双酶切：反应混合物包括2μL 10×Buffer，6μL UreB,1μL EcoR Ⅰ,1μL Nhe Ⅰ,10μL蒸馏水。混匀后置于恒温水浴锅37℃反应2h。电泳回收后获得的产物为UreB(N/E)。按照以上方法获得VacA(N/E)。
2.pYD1质粒双酶切：反应混合物包括2μL10×Buffer，6μL pYD1,1μL EcoR Ⅰ,1μLNhe Ⅰ,10μL蒸馏水。混匀后置于恒温水浴锅37℃反应2h，后进行琼脂糖凝胶电泳(如图3所示)，双酶切后的pYD1质粒长度约为5009bp。电泳回收后获得的产物命名为pYD1(N/E)。
3.连接与转化：将获得的UreB(N/E)与pYD1(N/E)用T4 DNA连接酶连接，16℃反应30min，获得连接产物。取一管感受态E.coli DH5α，待其冰上融化后，取10μL连接产物与之轻微混合，42℃水浴45s后，冰浴5min,加入1mL不含氨苄青霉素的LB液体培养基(预先在37℃保温)，摇床200rpm培养45min后，离心去掉800μL上清，将剩余液体重悬，涂布于100μg/mL的氨苄青霉素的LB固体平板中，37℃过夜培养，获得E.coli DH5α/pYD1-UreB。用同样方法获得E.coliDH5α/pYD1-VacA。
4.重组质粒pYD1-UreB和pYD1-VacA的双酶切分析：利用TaKaRa MiniBESTPlasmid Purification Kit质粒抽提试剂盒，分别从E.coli DH5α/pYD1-UreB和E.coliDH5α/pYD1-VacA中提取重组质粒pYD1-UreB和pYD1-VacA。重组质粒pYD1-UreB经过NheⅠ/EcoR Ⅰ双酶切后，结果如图4A所示，出现了两个条带，分别是4,943bp和1,692bp，这与预期的pYD1质粒和UreB基因长度相符。同理，重组质粒pYD1-VacA的双酶切结果(如图4B所示)也与我们预期的一致。重组质粒pYD1-UreB和pYD1-VacA的双酶切鉴定说明UreB和VacA基因成功的克隆至表面展示质粒pYD1中。
表面展示质粒pYD1本身含有V5 epitope和6×His tag表达标签。在幽门螺杆菌口服疫苗的分子构建过程中，本发明巧妙地选择了Nhe Ⅰ和EcoR Ⅰ两个酶切位点，并在下游引物中加入终止子(TAA)。因此表达的目的蛋白不含V5 epitope和6×His tag标签，这就避免了后续实验动物产生针对表达标签的特异性抗体。换言之，这有利于在后续的动物实验中考察H.pylori口服疫苗的免疫原性。除此之外，E.coli DH5α作为中间宿主时，重组质粒pYD1-UreB和pYD1-VacA含有氨苄青霉素(Amp)表达标记。然而，当重组质粒pYD1-UreB或pYD1-VacA整合至S.cerevisiae EBY100基因组后，氨苄青霉素(Amp)表达标记被整合消失掉了，这为H.pylori口服疫苗的安全性奠定了坚实的基础。
实施例3重组酿酒酵母S.cerevisiae EBY100/pYD1-UreB和S.cerevisiaeEBY100/pYD1-VacA的分子构建、筛选以及PCR鉴定
1.重组质粒的电转化：取10uL的重组质粒pYD1-UreB，加入到50μL感受态酿酒酵母S.cerevisiae EBY100中，轻微混匀，转移至预冷的电转杯中，静置5min。轻擦电转杯周围，将其放置于电击槽中，按照电击参数2.5KV，25uF，200Ω进行电击。电击后加入1mL预冷的1mol/L山梨醇，轻轻吹吸混匀，转移至1mLEP管中，于30℃静置1小时。离心得菌体后，吸除800uL上清液，然后涂布于亮氨酸MD固体培养基平板，于30℃培养3天，通过营养缺陷型固体培养基筛选重组酿酒酵母S.cerevisiae EBY100/pYD1-UreB阳性克隆。按照同样方法获得重组酿酒酵母S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA阳性克隆。
2.阳性克隆的PCR鉴定：分别挑取亮氨酸MD固体培养基平板上的重组酿酒酵母S.cerevisiae EBY100/pYD1、重组酿酒酵母S.cerevisiae EBY100/pYD1-UreB以及S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA单菌落，于5mL含2％葡萄糖的YNB-CAA液体培养基中，30℃、200rpm振荡过夜培养。将所得菌液利用酵母基因组抽提试剂盒(上海生工)进行基因组DNA的提取。以S.cerevisiae EBY100/pYD1基因组DNA为模板，利用pYD1正反引物进行PCR扩增，结果如图5A所示，pYD1的特异性片段长度约为399bp。以S.cerevisiae EBY100/pYD1-UreB基因组DNA为模板，分别利用pYD1正反引物和UreB基因的特异性引物，PCR扩增UreB基因，当利用pYD1正反引物进行PCR时，DNA条带约为2,031bp，而利用UreB基因的特异性引物进行PCR，DNA条带约为1,710bp(如图5B所示)。二者相差正好是321bp，这说明重组质粒pYD1-UreB已经成功地整合至S.cerevisiae EBY100基因组中。
同理，以S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA基因组DNA为模板，分别利用pYD1正反引物和VacA基因的特异性引物，也获得了与预期一致的结果(如图5C所示)。
S.cerevisiae EBY100可以在含有色氨酸(Arp)和亮氨酸(Leu)的YPD通用营养型培养基上生长。表面展示质粒pYD1带有色氨酸(Arp)合成基因，能够合成色氨酸(Arp)。当pYD1空质粒、重组质粒pYD1-UreB以及pYD1-VacA分别转化至感受态S.cerevisiae EBY100后，可以在含有亮氨酸(Leu)而不含有色氨酸(Arp)的营养缺陷型培养基上生长。因此，通过色氨酸(Arp)合成缺陷型培养基以及PCR鉴定，最终获得阳性克隆。
所获得的阳性克隆即为展示UreB、VacA的酿酒酵母表面展示系统，其模式图分别如图6A和图6B所示。
本发明以H.pylori SS1(基因库编号：CP009259.1)基因组DNA为模板，利用特异性引物，PCR扩增获得UreB和VacA基因，以E.coli DH5α作为中间宿主构建重组质粒pYD1-UreB和pYD1-VacA。进一步地，重组质粒分别转化至感受态S.cerevisiae EBY100，通过色氨酸营养缺陷型培养基筛选阳性克隆S.cerevisiae EBY100/pYD1-UreB和S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA，并以S.cerevisiae EBY100/pYD1-UreB和S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA基因组DNA作为模板，通过pYD1正反引物、UreB基因或VacA基因特异性引物，经PCR检测UreB基因或VacA基因在S.cerevisiae EBY100基因组中的整合情况。
实施例4目标蛋白的表达分析
1.目标蛋白的诱导表达：将单个重组酿酒酵母S.cerevisiae EBY100/pYD1-UreB阳性克隆菌落于5mL含2％葡萄糖的YNB-CAA液体培养基中在30℃条件下过夜培养，使其OD600nm值至于2～5之间后。将所得菌体转移至含2％半乳糖的YNB-CAA液体培养基培养，使其OD600nm值调整为0.5～1，诱导培养48h。按照同样方法诱导S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA。同时诱导S.cerevisiae EBY100/pYD1的表达作为阴性对照。
2.Western blot分析：取2OD600nm诱导表达后的重组酿酒酵母S.cerevisiaeEBY100/pYD1-UreB，加入100μL5×SDS上样缓冲液，100℃煮沸10min，获得蛋白样品，阴性对照S.cerevisiae EBY100/pYD1做同样处理。配置10％的SDS-PAGE预制胶，将样品和阴性对照点样后150V进行电泳约1h。通过湿转法，150V约1h，将目标蛋白转移至0.45μm孔径的硝酸纤维素膜中。PBS-T含0.5％的脱脂奶粉作为封闭液，对转移膜常温封闭1小时，再用多克隆兔源抗-UreB抗体(作为一抗)4℃孵育过夜，PBS-T漂洗过后，用HRP-标记的山羊抗兔IgG(1:5,000稀释)孵育。与WestPico化学发光底物进行反应，通过凝胶成像系统进行分析，确定目的蛋白的特异性表达。按照同样方法，利用多克隆兔源抗-VacA抗体作为一抗，对S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA进行Western blot分析。
S.cerevisiae EBY100/pYD1-UreB诱导培养48h后，利用抗-UreB抗体作为一抗，通过Western blot检测UreB的特异性表达，结果如图7A所示。与阴性对照S.cerevisiaeEBY100/pYD1裂解物的Western blot结果(如图7A、Lane 1所示)相比较，S.cerevisiaeEBY100/pYD1-UreB裂解物在分子量约72kDa处出现特异性条带(如图7A、Lane2所示)，与预期的UreB蛋白条带相符。同理，S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA裂解物在分子量约37kDa处出现特异性条带(如图7B、Lane 2所示)。Western blot分析表明UreB蛋白和VacA蛋白可以稳定、特异地表达在酿酒酵母S.cerevisiae EBY100中。
3.免疫荧光显微镜分析：取2OD600nm诱导培养48h后的重组酿酒酵母S.cerevisiaeEBY100/pYD1-UreB,用500ul的无菌1×PBS洗涤细胞3次，4,000rmp、4℃，离心5min，弃上清。在菌体中加入1:500稀释的500uL多克隆兔源抗-UreB抗体，4℃孵育过夜。无菌1×PBS洗涤菌体三次后，加入500uL的1:5,000稀释的FITC-标记的山羊抗兔IgG,室温孵育30min。无菌1×PBS洗涤菌体三次后，将细胞悬浮于50uL无菌1×PBS中，点样5uL于载玻片，盖上盖玻片,通过激光共聚焦显微镜进行观察并拍照。同理，利用多克隆兔源抗-VacA抗体作为一抗，对S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA进行免疫荧光分析。按照同样方法处理S.cerevisiaeEBY100/pYD1，作为阴性对照。结果如图8-9所示。
利用多克隆兔源抗-UreB抗体分别直接标记S.cerevisiae EBY100/pYD1和S.cerevisiae EBY100/pYD1-UreB,通过激光共聚焦显微镜进行观察，阴性对照S.cerevisiae EBY100/pYD1未出现绿色荧光(如图8A所示)，而S.cerevisiae EBY100/pYD1-UreB显示出较高强度的绿色荧光(如图8B所示)。这清晰地表明S.cerevisiaeEBY100/pYD1-UreB表达的UreB蛋白位于酿酒酵母EBY100的表面。
同理，与S.cerevisiae EBY100/pYD1-UreB免疫荧光标记的方法类似，利用兔源多克隆抗-VacA作为一抗，FITC标记的羊抗兔IgG作为二抗体，对诱导培养48h后的S.cerevisiae EBY100/pYD1和S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA进行标记。通过激光共聚焦显微镜观察，阴性对照S.cerevisiae EBY100/pYD1没有观察到特异性的绿色荧光(如图9A所示)。而S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA出现特异性的绿色荧光(如图9B所示)，这表明VacA蛋白成功地表达于酿酒酵母EBY100表面。
4.流式细胞仪分析：与3中的处理方法一致，S.cerevisiae EBY100/pYD1和S.cerevisiae EBY100/pYD1-UreB分别经过诱导培养48h后，利用兔源多克隆抗-UreB抗体作为一抗、FITC标记的羊抗兔IgG作为二抗进行标记，通过流式细胞仪分析，结果如图10所示。S.cerevisiae EBY100/pYD1作为阴性对照(如图10A所示)，UreB蛋白在酿酒酵母EBY100表面的表达效率为55.07％(如图10B所示)。
与S.cerevisiae EBY100/pYD1-UreB的流式细胞仪分析的方法类似，以S.cerevisiae EBY100/pYD1作为阴性对照(如图11A所示)，VacA蛋白在酿酒酵母EBY100表面的表达效率为31.90％(如图11B所示)。
本发明通过Western blot、免疫荧光标记以及流式细胞仪分析，对S.cerevisiaeEBY100/pYD1-UreB和S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA进行体外表达分析。通过Westernblot分析，确定目标蛋白的特异性表达。进一步，通过免疫荧光分析和流式细胞仪分析，确定目标表达于酿酒酵母EBY100的表面。这些结果表明基于酿酒酵母表面展示技术构建的H.pylori口服疫苗可以获得稳定表达。
毋容置疑，Western blot可以检测目标蛋白的特异性表达，而通过一抗的直接标记，免疫荧光分析和流式细胞仪分析，可以确定目标蛋白的表达位置。因此，通过Westernblot、免疫荧光标记以及流式细胞仪，建立酿酒酵母表面展示系统表达抗原蛋白的定性和定向分析技术平台，这一通用检测技术平台可以应用于其它表面展示系统的表面蛋白的体外表达分析。
实施例5幽门螺杆菌口服疫苗的动物免疫实验
将重组酿酒酵母S.cerevisiae EBY100/pYD1-UreB和S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA分别置于60℃水浴处理40min，并将终浓度分别调整至0.5OD600nm/uL(1OD600nm≈107cells)。
以下用实验例的形式证明本发明的有益效果。实验例中检测效果的方法如下：
实验例1口服免疫方案
将25只6周龄SPF级BALB/c小鼠随机分为5组，每组5只(如表1所示)。实验组1经口灌胃150OD600nmS.cerevisiae EBY100/pYD1-UreB，实验组2经口灌胃150OD600nmS.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA，实验组3经口灌胃75OD600nmS.cerevisiaeEBY100/pYD1-UreB+75OD600nmS.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA，阴性对照组灌喂150OD600nmS.cerevisiae EBY100/pYD1，空白对照组经口服灌胃300μL 1×PBS。每周免疫一次，共连续口服免疫6次。于初次免疫后第14天、28天和42天，收集小鼠血清及粪便。ELISA分析检测口服免疫后小鼠特异性IgG及分泌型IgA效价。
表1小鼠分组及口服免疫剂量
Figure BDA0002548870540000131
实验例2 H.pylori感染实验
在最后一次口服疫苗后两周(即第49天)，每只小鼠禁水禁食12h后，灌胃500μLH.pylori SS1(1×109CFU/mL)，灌胃完毕3～4h后进食。每隔一天一次，共感染4次。H.pylori SS1攻毒完成两周后(第70天)，脱颈法处死小鼠。无菌取胃。沿幽门-贲门线从中间纵切将胃一分为二，除去胃内容物。一半进行细菌培养检查H.pylori的定植情况，一半进行尿素酶实验(口服免疫安排如图12所示)。
1.血清特异性IgG检测
在初次免疫后的第14天、28天和第42天，收集免疫后小鼠的血清。常温静置2h，3,000rmp离心10min，取上清，-20℃保存，备用。通过ELISA检测血清特异性IgG效价。
用抗原包被液稀释UreB蛋白浓度至2μg/mL，用300μL的排枪将100μL的2μg/mLUreB蛋白加于酶标板中，锡箔纸包裹，4℃孵育过夜；TBS-T漂洗液漂洗三次。在每个孔中加入200μL TBS封闭液，置于37℃培养箱中封闭2h。TBS-T漂洗液漂洗三次。取出空白对照组、阴性对照组、实验组1(S.cerevisiae EBY100/pYD1-UreB)及实验组3(S.cerevisiaeEBY100/pYD1-UreB+S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA)的小鼠血清，以2的倍数用TBS封闭液将血清进行备比稀释，37℃孵育2h。TBS-T漂洗液漂洗三次。用300μL的排枪将100μL生物素标记的羊抗鼠IgG(1:5,000)加入酶标板中。37℃孵育1h。TBS-T漂洗液漂洗三次。将100μLTBS封闭液稀释的碱性磷酸酶标记的链亲和素(1:1,000)加入酶标板中，37℃孵育1h。TBS-T漂洗液漂洗三次。按照EL-P-NPP显色试剂盒的说明书，将稀释成一倍的分析液与干粉混合于棕色瓶中，于阴暗处每孔加入100μL的混合物，避光显色25min。加入50μL终止液并测定OD405nm和OD630nm。OD450nm-OD630nm值后，大于或等于0.2即为阳性，小于0.2则为阴性。数据以平均值+标准方差(SD)表示。
参照上述的方法，用2μg/mL VacA蛋白包被96孔板，封闭液封闭后，取空白对照组、阴性对照组、实验组2(S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA)及实验组3(S.cerevisiaeEBY100/pYD1-UreB+S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA)的小鼠血清以2的倍数稀释于孔板中，孵育抗体并测量其抗VacA特异性IgG的含量。
以PBS和S.cerevisiae EBY100/pYD1作为对照组，S.cerevisiae EBY100/pYD1-UreB和S.cerevisiae EBY100/pYD1-UreB+S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA作为实验组，通过ELISA检测口服免疫后小鼠血清IgG效价，结果如图13所示。对照组(PBS和S.cerevisiae EBY100/pYD1)的血清IgG效价均低于24，而S.cerevisiae EBY100/pYD1-UreB组和S.cerevisiae EBY100/pYD1-UreB+S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA组的血清IgG效价随着免疫次数的增加而逐渐升高。在初次免疫后的第42天，S.cerevisiae EBY100/pYD1-UreB和S.cerevisiae EBY100/pYD1-UreB+S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA诱导的血清IgG效价分别为211.4±0.89和27.8±0.45。
同理，以PBS和S.cerevisiae EBY100/pYD1作为对照组，S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA组和S.cerevisiae EBY100/pYD1-UreB+S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA组的ELISA检测结果如图14所示。与图13结果相似，PBS组和S.cerevisiae EBY100/pYD1组的血清IgG效价并没有随着免疫次数的增加而升高。然而，小鼠口服免疫S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA或S.cerevisiae EBY100/pYD1-UreB+S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA后产生了有意义的血清IgG效价(p＜0.05)，其中在初次免疫后的第42天，S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA和S.cerevisiae EBY100/pYD1-UreB+S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA诱导的血清IgG效价分别为210.6±0.54和28±0.71。
综上所述，通过ELISA检测血清特异性IgG抗体的应答水平(如图13和图14所示)，表明S.cerevisiae EBY100/pYD1-UreB、S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA和S.cerevisiaeEBY100/pYD1-UreB+S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA都能诱导有意义的体液免疫应答。
2.分泌型特异性IgA检测
在初次免疫后的第14天、28天和第42天，收集免疫后小鼠的粪便。通过ELISA检测特异性分泌型IgA。
取收集的小鼠粪便50mg于1.5mLEp管中，加入300μL1×PBS，静置2h。用黄色枪头轻轻捣碎粪便，混匀后12,000rmp离心20min。收集上清，-20℃保存，备用。
将100μL的2μg/mL UreB蛋白加于96孔高吸附酶标板中，锡箔纸包裹，4℃孵育过夜；用1×PBS-T漂洗液漂洗3次，最后一次彻底拍干。加1×PBS封闭液200μL/孔，37℃封闭2h。1×PBS-T漂洗液漂洗3次，最后一次彻底拍干。取出空白对照组、阴性对照组、实验组1(S.cerevisiae EBY100/pYD1-UreB)及实验组3(S.cerevisiae EBY100/pYD1-UreB+S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA)的小鼠粪便上清液100μL加入酶标板，37℃孵育2h；1×PBS-T漂洗液漂洗3次，最后一次彻底拍干。每孔加入100μL HRP标记的多克隆羊抗鼠IgA(1:10,000)，37℃孵育1h；1×PBS-T漂洗液漂洗3次，最后一次彻底拍干。按TMB显色试剂盒说明书加入反应液，反应后加入终止液。酶标仪测定OD450nm处的吸光度。
参照上述的方法，用2μg/mL VacA蛋白包被96孔板，封闭液封闭后，取空白对照组、阴性对照组、实验组2(S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA)及实验组3(S.cerevisiaeEBY100/pYD1-UreB+S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA)的小鼠粪便溶解，100μL/孔。利用HRP标记的多克隆羊抗鼠IgA作为二抗，TMB溶液作为显色底物，测量抗-VacA特异性IgA的OD450nm吸收值。
与PBS和EBY100/pYD1相比较，EBY100/pYD1-UreB和EBY100/pYD1-UreB+EBY100/pYD1-VacA诱导的抗-UreB特异性分泌型IgA应答水平随着免疫次数的增加而升高(如图15所示)。在初次免疫后的第42天，EBY100/pYD1-UreB和EBY100/pYD1-UreB+EBY100/pYD1-VacA诱导的抗-UreB特异性分泌型IgA在OD450nm的吸收值分别为1.23±0.15和0.73±0.06。
与EBY100/pYD1-UreB和EBY100/pYD1-UreB+EBY100/pYD1-VacA诱导的抗-UreB特异性分泌型IgA应答水平相似，EBY100/pYD1-VacA和EBY100/pYD1-UreB+EBY100/pYD1-VacA也能诱导小鼠产生有意义的抗-VacA分泌型IgA抗体(如图16所示)。在初次免疫后的第42天，EBY100/pYD1-VacA和EBY100/pYD1-UreB+EBY100/pYD1-VacA诱导的特异性分泌型IgA抗体在OD450nm的吸收值分别为1.42±0.37和0.70±0.162。
综上所述，通过ELISA检测粪便中特异性分泌型IgA抗体的应答水平(如图15和图16所示)，表明S.cerevisiae EBY100/pYD1-UreB、S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA和S.cerevisiae EBY100/pYD1-UreB+S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA均能诱导有意义的黏膜免疫应答。
3.H.pylori定植数量分析
将二分之一的胃组织样本在1mL PBS中匀浆，并分别稀释10倍、100倍、1,000倍。将这些稀释过的均质散布在哥伦比亚选择性培养板上。经过3天的培养后，计算每个胃中的菌落形成单位(Colony-Forming Units，CFU)。
在初次免疫后的第70天，通过H.pylori SS1的感染实验分析S.cerevisiaeEBY100/pYD1-UreB、S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA和S.cerevisiae EBY100/pYD1-UreB+S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA的免疫保护效率，结果如图17所示。在对照组(PBS和S.cerevisiae EBY100/pYD1)中，H.pylori SS1的定植数量约为107CFU/mg，而S.cerevisiae EBY100/pYD1-UreB组、S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA组和S.cerevisiaeEBY100/pYD1-UreB+S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA组的H.pylori SS1的定植数量分别为105.58±0.09、105.61±0.08和105.00±0.19CFU/mg。与对照组相比较，S.cerevisiae EBY100/pYD1-UreB、S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA和S.cerevisiae EBY100/pYD1-UreB+S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA能够减少1～2个数量级小鼠胃内H.pylori的数量。
4.尿素酶活性的测定
进一步地，为了佐证H.pylori SS1在小鼠胃内的定植数量分析，取出H.pyloriSS1感染的小鼠的胃，利用尿素酶检测试剂盒处理后，测定OD550nm吸收值，结果如图18所示。与PBS组和S.cerevisiae EBY100/pYD1组相比较，S.cerevisiae EBY100/pYD1-UreB组、S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA组和S.cerevisiae EBY100/pYD1-UreB+S.cerevisiaeEBY100/pYD1-VacA组的OD550nm吸收值分别为0.14±0.02、0.15±0.01和0.1±0.02。
综上分析，通过H.pylori SS1的感染分析，S.cerevisiae EBY100/pYD1-UreB、S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA和S.cerevisiae EBY100/pYD1-UreB+S.cerevisiaeEBY100/pYD1-VacA都能有效减少H.pylori SS1在小鼠胃部的定植(如图17和图18所示)，其中S.cerevisiae EBY100/pYD1-UreB+S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA联合口服免疫的保护效果更好，具有潜在的临床应用价值。
H.pylori SS1的定植数量是个核心指标，可以直观反映幽门螺杆菌口服疫苗的免疫保护效率。通过H.pylori SS1感染后的细菌培养可以检测S.cerevisiae EBY100/pYD1-UreB、S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA或S.cerevisiae EBY100/pYD1-UreB+S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA口服免疫后小鼠胃部的H.pylori定植数量；进一步地，尿素酶检测可以客观反映H.pylori SS1的定植水平。因此，H.pylori SS1感染实验可以有效分析幽门螺杆菌口服疫苗的免疫保护效率。
本发明在S.cerevisiae EBY100/pYD1-UreB、S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA或S.cerevisiae EBY100/pYD1-UreB+S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA口服免疫后的第42天，通过ELISA就可以检测到特异性血清IgG效价和分泌型IgA抗体应答。值得注意的是，在检测150OD600nmS.cerevisiae EBY100/pYD1-UreB、150OD600nmS.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA和75OD600nmS.cerevisiae EBY100/pYD1-UreB+75OD600nmS.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA诱导的血清IgG抗体应答时，利用UreB或VacA蛋白作为ELISA包被抗原，因此150OD600nmS.cerevisiae EBY100/pYD1-UreB或150OD600nmS.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA诱导的抗-UreB或抗-VacA血清IgG的效价要高于75OD600nmS.cerevisiae EBY100/pYD1-UreB+75OD600nmS.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA(如图15和图16所示)。同样的趋势也反映在分泌型IgA的检测上。事实上，S.cerevisiae EBY100/pYD1-UreB+S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA联合口服的优势在H.pylori SS1感染实验中体现出来了(如图17和图18所示)。这也带来积极的提示，S.cerevisiae EBY100/pYD1-UreB+S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA联合口服给药后的免疫效果更佳，也为开发安全、有效的H.pylori多价候选疫苗奠定了坚实的基础。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 西南交通大学
<120> 一种幽门螺杆菌口服疫苗
<150> 201910546216.0
<151> 2019-06-21
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1692
<212> DNA
<213> 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)
<400> 1
aaagaatatg tttctatgta tggccctact acaggtgata aagtgagatt gggcgataca 60
gacttgatcg ctgaagtaga acatgactac accatttatg gcgaagagct taaattcggt 120
ggcggtaaaa ccctaagaga aggcatgagc caatctaaca accctagcaa agaagaactg 180
gatctaatca tcactaacgc tttaatcgtg gattacaccg gtatttataa agcggatatt 240
ggtattaaag atggcaaaat cgctggcatt ggtaaaggcg gtaacaaaga catgcaagat 300
ggcgttaaaa acaatcttag cgtgggtcct gctactgaag ccttagccgg tgaaggtttg 360
atcgtaactg ctggtggtat tgacacacac atccacttca tttcacccca acaaatccct 420
acagcttttg caagcggtgt aacaaccatg attggtggcg gaactggtcc tgctgatggc 480
actaacgcga ctactatcac tccaggtaga agaaatttaa aatggatgct cagagcggct 540
gaagaatatt ctatgaactt aggtttctta gctaaaggta acgcttctaa cgatgcgagc 600
ttagccgatc aaattgaagc tggtgcgatt ggctttaaaa tccacgaaga ctggggaaca 660
actccttctg caatcaatca tgcactagat gttgcggaca aatacgatgt acaagtcgct 720
atccacacag acactttgaa tgaagctggt tgtgtagaag acactatggc agctattgct 780
gggcgcacta tgcacacttt ccacactgaa ggcgctggcg gcggacacgc tcctgatatt 840
attaaagtgg ccggcgaaca caacattctt cccgcttcca ctaaccccac tatccctttc 900
actgtgaata ctgaagcaga acacatggac atgcttatgg tgtgccacca cttggataaa 960
agcattaaag aagatgttca gttcgctgat tcaaggatcc gccctcaaac cattgcggct 1020
gaagacactt tgcatgacat ggggattttc tcaatcacta gttctgactc tcaagctatg 1080
ggccgtgtgg gtgaagttat cactagaact tggcaaacag ctgacaaaaa caaaaaagaa 1140
tttggccgct tgaaagaaga aaaaggcgat aacgacaact tcaggatcaa acgctacttg 1200
tctaaataca ccattaaccc agcgatcgct catgggatta gcgagtatgt cggttctgta 1260
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atccctaccc ctcaaccggt ttattacaga gaaatgttcg ctcatcatgg taaagctaaa 1440
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<210> 2
<211> 762
<212> DNA
<213> 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)
<400> 2
gaaatacaac aaacacaccg caaaatcaat cgccctatta tctctctcgc tctagtgggg 60
gtgttaatgg gcaccgaact aggggctaat acgccaaacg atcccataca cagcgagagt 120
cgtgcttttt tcacaaccgt gatcattcca gccattgttg gaggtatcgc tacaggcgct 180
gctgtaggaa cggtctcagg gcttcttagc tgggggctca aacaagccga acaagccaat 240
aaagccccgg ataaacccga taaagtttgg cgcattcaag caggcagagg ttttgataat 300
ttcccccaca agcaatacga cttatacaaa tccctactat ctagtaagat tgatggaggt 360
tgggactggg ggaatgccgc taggcattat tgggtcaaag acgggcaatg gaacaagctt 420
gaagtggata tgcaaaacgc tgtagggact tataaccttt caggccttat caactttact 480
ggtggggatt tagacgtcaa tatgcaaaaa gccactttac gtttgggcca attcaatggc 540
aattctttca caagctttaa agatgcggct aaccgcacca cgagggtgaa ttttgacgct 600
aaaaatatct taattgataa ttttgtagaa atcaacaatc gtgtgggttc tggagccggg 660
aggaaagcca gctctacggt tttgaccttg caagcttcag aaaaaattac aagccgtgaa 720
aacgcggaaa tttctcttta tgatggcgcc acgcttaatt aa 762
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctagctagca aagaatatgt ttctat 26
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccggaattct tagaaaatgc taaagagtt 29
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctagctagca attttaatca tctcact 27
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccggaattct tatttaatgt cattgagat 29

Claims (10)

1.一种重组质粒，其特征在于：所述重组质粒能够融合表达幽门螺杆菌抗原基因与Aga2基因，得到表达融合蛋白的重组质粒；
所述幽门螺杆菌抗原基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～2任一所示；
所述融合蛋白中幽门螺杆菌抗原基因表达得到的肽段位于Aga2基因表达得到肽段的C端。
2.如权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒以Invitrogen生产的pYD1质粒为骨架质粒。
3.如权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述幽门螺杆菌抗原基因连接有终止密码子序列。
4.一种重组酿酒酵母，其特征在于：它是包含权利要求1～2任一所述重组质粒的酿酒酵母。
5.如权利要求4所述的重组酿酒酵母，其特征在于，所述酿酒酵母是S.cerevisiaeEBY100。
6.权利要求4或5所述的重组酿酒酵母在制备幽门螺杆菌疫苗中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述疫苗为口服疫苗。
8.一种幽门螺杆菌疫苗，其特征在于：它是以权利要求4或5所述重组酿酒酵母为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。
9.如权利要求8所述的疫苗，其特征在于：所述辅助性成分为肠溶性胶囊。
10.一种制备权利要求4或5所述重组酿酒酵母的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)构建能够融合表达幽门螺杆菌抗原基因与Aga2基因的重组质粒，得到表达融合蛋白的重组质粒；
(2)将所述重组质粒导入感受态酿酒酵母菌中，即可；
所述幽门螺杆菌抗原基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～2任一所示。
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