CN109609538A - 一种预防h7n9病毒感染的口服疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种预防H7N9病毒感染的口服疫苗及其制备方法。具体地，本发明公开了一种重组质粒，还公开了包含前述重组质粒的重组酵母菌，以及它在制备预防H7N9病毒感染的疫苗中的用途。本发明已经成功建立了包含H7N9病毒部分基因片段的重组酵母EBY100/pYD1‑HA，而且证实了HA可以在酵母中有效表达，并且进一步证明了重组酵母对H7N9病毒具有良好的免疫保护性，可以制备成为口服疫苗，应用前景优良。

Description

一种预防H7N9病毒感染的口服疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种预防H7N9病毒感染的口服疫苗及其制备方法。

背景技术

2013年3月，中国疾病控制中心证实，一种全新的禽流感病毒H7N9亚型出现在中国大陆。截止至2016年2月25日，中国内地共有人感染H7N9禽流感病毒1295例，其中249例死亡，致死率达20％。H7N9亚型如其它A型禽流感病毒一样，其基因组由8 股负链的单链RNA片段组成，共编码10个病毒蛋白，其中主要表面抗原成份是血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuramidinase,NA)。尽管H7N9病毒尚不具备人际传播的能力，但是由于其能够特异性地结合人上呼吸道的α2-6唾液酸受体，所以在H7N9 病毒不断发生突变的情况下发生，具备人传人的潜能。因此，我国对H7N9病毒的防控必须时刻保持清醒，并采取有效的措施予以应对。毋容置疑，接种疫苗是预防H7N9病毒感染的最有效的措施之一。

目前，人用H7N9禽流感疫苗的研发，与其它人用流感疫苗一样，主要采用灭活或裂解工艺生产。然而，无论是传统的灭活疫苗、减毒疫苗还是通过哺乳动物细胞制备的H7N9流感疫苗都需要对活病毒进行操作，并且需要严格的生物安全三级实验室(BSL-3)的设施。

疫苗的核心是安全性、有效性和时效性。如何在三者之间找寻一个平衡点，是科研工作者需要直面的一个的挑战。目前已经报到的人用H7N9禽流感疫苗的安全性均较差，而安全性较好的有效性和时效性往往又较差。需要研发能够兼顾安全性、有效性和时效性的H7N9疫苗。

发明内容

本申请基于高效、稳定以及安全的酿酒酵母(S.cerevisiae EBY100)表面展示系统，以A/Anhui/1/2013(AH-H7N9)的HA、NP和M2蛋白作为主要研究对象，通过pYD1构建酿酒酵母C-末端表面展示系统(EBY100/pYD1-HA，EBY100/pYD1-NP，EBY100/pYD1-M2。同理，通过pYD5构建酿酒酵母N-末端展示系统(EBY100/pYD5-HA，EBY100/pYD5-NP， EBY100/pYD5-M2)。以雪貂(ferret)作为动物模型，在不使用佐剂的情况下，通过肠溶胶囊包裹经冷冻干燥后的不同组分、不同比例的酿酒酵母表面展示系统进行口服免疫。检测机体的体液免疫应答水平、细胞免疫应答水平和黏膜免疫水平。通过不同亚型的H7N9 病毒或异型的H5N1和H1N1进行攻击分析，检测酿酒酵母表面展示系统作为H7N9流感疫苗递送载体的交叉免疫保护效率。与此同时，考察并比较酿酒酵母C末端表面展示系统和N末端表面展示系统的免疫保护效果，最终研发出以酿酒酵母表面展示系统为基础的临床前期人用H7N9流感疫苗，并建立可以实际应用的流感疫苗口服递送技术平台。为我国防控H7N9及其它流感病毒(如H5N1、H1N1等)提供可行的免疫参考和技术储备。

具体地，本发明提供了一种重组质粒，它含有A/Anhui/1/2013(AH-H7N9)具有交叉反应性的HA茎结构域(基因库编号：CY187618)、核蛋白(NP)(基因库编号：CY187621，基因长度：1497bp)或离子通道蛋白(M2)(基因库编号：CY187619.1，基因长度：291bp) 所述核苷酸序列的重组pYD1质粒或者重组pYD5质粒。

所述SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或者SEQ ID NO：3所述核苷酸序列位于pYD1 质粒的C端，或者位于pYD5质粒的N端；优选地，所述重组质粒的序列如SEQ ID NO： 4～6任意一项所示。

本发明还提供了一种重组酵母菌，它是含有前述重组质粒的酵母菌。优选地，所述酵母菌是S.cerevisiae EBY 100。

本发明还提供了前述重组酵母菌在制备预防H7N9流感病毒感染的疫苗中的用途。其中，所述疫苗为口服疫苗。

本发明还提供了一种预防H7N9流感病毒感染的疫苗，它是以前述的重组酵母菌为活性成分，加上药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。

其中，所述制剂是口服制剂。优选地，所述辅助性成分为肠溶性胶囊。

本发明还提供了一种制备预防H7N9流感病毒感染的重组酵母菌的方法，步骤如下：

(1)H7N9流感病毒的基因或者基因片段，与pYD1质粒或者pYD5质粒连接；

(2)导入感受态酵母菌中，即可。

步骤(1)中，所述H7N9流感病毒的基因片段的核苷酸序列如HA、NP和M2(SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2或者SEQ ID NO：3所示。)

步骤(2)中，所述酵母菌为S.cerevisiae EBY 100。

本发明已经成功建立了包含H7N9流感病毒部分基因片段的重组酵母 EBY100/pYD1-HA，而且证实了HA作为研究对象可以在酵母中有效表达，并且进一步证明了重组酵母对H7N9流感病毒具有良好的免疫保护性，可以制备成为口服疫苗，应用前景优良。

本发明的优势：

(1)安全性。pYD1和pYD5作为大肠杆菌-酿酒酵母的穿梭质粒，含有的氨苄青霉素抗性标记只在中间宿主E.coli DH5α中发挥作用，当带有目标基因pYD1和pYD5整合到EBY100的基因组时，抗性标记随即丢失。因此，通过pYD1和pYD5构建的酿酒酵母表面展示系统是食品级的，这为口服H7N9流感疫苗的安全性奠定了坚实的物质基础。

(2)有效性。本申请巧妙地选择了AH-H7N9具有交叉反应性的HA、NP和M2作为研究对象，利用稳定、成熟的酿酒酵母表面展示技术，构建C末端表面展示展示系统和N末端表面展示展示系统。全面而深入地比较这两种表面展示系统免疫应答和交叉免疫保护效率。最终研发出能用于临床试验的人用H7N9流感疫苗。作为传统流感疫苗制备技术的一个有效补充，酿酒酵母表面展示技术既可以解决目前人用H7N9流感疫苗制备的面临的挑战和技术瓶颈，又可以为其它亚型(如H5N1、H1N1等)的流感疫苗的研发提供新的研究策略。

(3)酿酒酵母EBY100是一种直径约10μm的圆球形真核细胞，通过免疫荧光标记和流式细胞仪可以分析目标蛋白在EBY100表面的展示效率。而且被展示的目标蛋白是一种糖基化修饰的蛋白，更接近于病毒蛋白本身的特性，具有很强的免疫原性。

(4)酿酒酵母EBY100的细胞壁表面成分β-1,3-D-葡聚糖和甘露聚糖具有很强的佐剂功能。因此，本申请不需要使用黏膜免疫佐剂。与此同时，肠溶胶囊可以有效地将包裹的H7N9疫苗靶向输送到小肠部位，最大限度地发挥疫苗的免疫效果，在将来的临床应用上具有独特的意义。

(5)时效性。酿酒酵母表面展示技术可以应用于快速、大规模地制备流感疫苗。从载体构建到酵母的大规模培养，只需要约15天就可完成，这为预防流感大爆发提供了可靠的战略保障。而且整个操作过程不要特殊的实验条件，在生物安全二级实验室就可完成。与此同时，酿酒酵母表面展示系统作为一种通用的技术平台，为研究其它细菌或病毒疫苗提供可行的参考。

(7)雪貂是学术界公认流感疫苗进入临床试验前最为理想的动物模型，本申请通过雪貂动物实验有效验证了本发明重组酵母的有效性。

因此，利用酿酒酵母表面展示技术表达禽流感病毒的蛋白时，既可以保持禽流感病毒蛋白的高级结构，又可以充分利用酿酒酵母自身特有的优点，通过口服免疫，最终刺激机体产生保护性免疫应答。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1以酿酒酵母C末端表面展示系统为基础的H7N9流感疫苗模式图。

A/Anhui/1/2013(AH-H7N9)的HA、NP和M2蛋白通过表达质粒pYD1展示在S.cerevisiae EBY100表面，HA、NP和M2蛋白的C末端处于游离状

图2以酿酒酵母N末端表面展示系统为基础的H7N9流感疫苗模式图。

A/Anhui/1/2013(AH-H7N9)的HA、NP和M2蛋白通过表达质粒pYD5展示在S.cerevisiae EBY100表面，HA、NP和M2蛋白的N末端处于游离状态。A:EBY100/p YD5-HA；B:EBY100/p YD5-NP；C:EBY100/p YD5-M2。

图3EBY100/pYD1-H7N9 HA诱导48小时的表达分析。A：Western blot分析。Lane 1：Western blot marker(Precision Plus ProteinTM，Bio-rad)；Lane 2：EBY100/pYD5-H7N9HA； Lane 3：去糖基化酶PNGase F处理过的EBY100/pYD5-H7N9 HA。B：免疫荧光分析。阴性对照EBY100/pYD5(左)，EBY100/pYD5-H7N9 HA(右)。放大倍数：400×。C：流式细胞仪分析。阴性对照EBY100/pYD5(左)，EBY100/pYD5-H7N9 HA(右)。10,000细胞被计数。

图4口服免疫计划。在初次免疫后的第13天和第28天，收集血样。在初次免疫后的第40天，对免疫后的小鼠进行病毒攻击实验。

图5血清IgG效价和病毒攻击分析。A：通过ELISA检测HA特异性血清IgG。B：经regime 1免疫后小鼠的存活率。C：经regime 2免疫后小鼠的存活率。D：经regime 3 免疫后小鼠的存活率。以PBS和EBY100/pYD1作为阴性对照，灭活的H5N1疫苗作为阳性对照。血清IgG效价用平均值±标准方差表示，*(p＜0.05)表示与对照组相比较，具有统计学意义。(10只/组)。

图6肠溶胶囊包裹荧光素Cy5.5标记的EBY100/pYD5-H7N9 HA在小鼠体内的动态崩解过程。A：口服40分钟后的图像。B：口服60分钟后的图像。C：口服80分钟后的图像。D：荧光强度指示带。

具体实施方式

本发明具体实施方式中使用的试剂均为已知产品，通过购买市售产品获得。

实施例1本发明H7N9口服疫苗的制备及其效果验证

一、方法

本申请以酿酒酵母的a-凝集素表面展示系统为基础，根据AH-H7N9具有交叉反应性的HA(基因库编号：CY187618)(特别说明：HA包含部分HA1片段(C277-C346)和整个HA2片段，基因总长度：867bp)、核蛋白(NP)(基因库编号：CY187621，基因长度：1497bp)或离子通道蛋白(M2)(基因库编号：CY187619.1，基因长度：291bp)的末端(C末端或N末端)处于不同游离状态时产生不同免疫效率的特性，通过pYD1将 AH-H7N9蛋白展示在酿酒酵母EBY100的表面，此时AH-H7N9蛋白C末端处于游离状态，以此构建以酿酒酵母C末端表面展示系统为基础的H7N9流感疫苗(如图1所示)。同理，通过pYD5将AH-H7N9蛋白展示在酿酒酵母EBY100的表面，此时AH-H7N9蛋白N末端处于游离状态，以此构建以酿酒酵母N末端表面展示系统为基础的H7N9流感疫苗(如图2所示)。在不使用黏膜免疫佐剂的情况下，图1或图2中各种构建经冷冻干燥后，通过肠溶胶囊包裹其中一种，或不同组分的不同比例的组合，经口服免疫Specific pathogen free(SPF)级雪貂(ferret)，通过系统地检测以酿酒酵母表面展示系统作为H7N9 流感疫苗递送载体的免疫活性，最终研发出安全、有效并具有交叉免疫保护作用的H7N9 流感疫苗，为人用H7N9流感疫苗的临床应用提供可信的实验数据。

以图1的EBY100/pYD1-HA为例，简述构建过程。该系统包括：A/Anhui/1/2013的 HA基因包含部分HA1片段(C277-C346)和整个HA2片段，基因总长度：867bp)、适用于目标蛋白C末端展示的表达质粒pYD1、中间宿主菌E.coli DH5α、最终宿主 S.cerevisiae EBY100。首先，通过PCR获得特异性pGEM-HA基因片段。其次，通过特异性酶切位点(Nhe I/EcoR I)，构建重组表达质粒pYD1-HA，并转化至感受态E.coli DH5α，筛选阳性克隆。然后，将鉴定好的重组表达质粒pYD1-HA电转至感受态S.cerevisiae EBY100，重组表达质粒pYD1-HA最终整合至S.cerevisiae EBY100基因组中，pYD1-HA 本身携带的氨苄青霉素标记丢失。最后，通过氨基酸营养缺陷筛选出阳性 EBY100/pYD1-HA，提取基因组DNA，对阳性克隆进行PCR鉴定。

需要说明的是，pYD1作为酿酒酵母(S.cerevisiae)表面展示型表达质粒之一，是一个长度为5.0kb、含有GAL1启动子、可以在大肠杆菌-酵母中穿梭的诱导型质粒，含有来源于酿酒酵母的AGA2基因，可以编码a-凝集素的一个结合受体Aga2，其功能是将目标蛋白的N末端与Aga2的C末端融合。宿主S.cerevisiae EBY100编码Aga1蛋白，Aga1 与Aga2通过二硫键连接，最终将目标蛋白的C末端展示在EBY100的表面(如图1所示)。值得一提的是，在本申请中，我们将在进行引物设计时，巧妙地利用pYD1上的多克隆酶切位点，规避pYD1质粒上固有的Xpress、V5 epitope以及His tag的表达标签，从而重点考察目标蛋白的展示效率。

与酿酒酵母C末端表面展示系统构建的方法相似，通过pYD5构建酿酒酵母N末端表面展示系统(如图2所示)。需要说明的是，pYD5(由Neville DM Jr博士提供)是从商业化的pYD1改造而来，适用于目标蛋白的N末端展示。

与此同时，构建EBY100/pYD1和EBY100/pYD5，作为平行实验中的阴性对照。

需要强调的是，在构建重组表达质粒时，目标蛋白(HA、NP或M2)和Aga2之间的(G₄S)₃linker(甘氨酸-丝氨酸柔性肽)是表达质粒pYD1和pYD5本身固有的。因此，本申请不需要再对pYD1和pYD5进行改造，只需要设计特异性的PCR引物，将目标基因克隆至相应的位点即可。

二、具体操作方法

(1)酿酒酵母C末端表面展示系统和N末端表面展示系统的构建

利用常规的分子生物学方法构建酿酒酵母C末端表面展示系统(EBY100/pYD1-HA、EBY100/pYD1-NP、EBY100/pYD1-M2)和N末端表面展示系统(EBY100/pYD5-HA、EBY100/pYD5-NP、EBY100/pYD5-M2)。以图1A的EBY100/pYD1-HA为例，商业化的pYD1(美国Invitrogen公司)作为酿酒酵母EBY100的表达质粒，适用于目标蛋白的 C末端展示。其主要构建过程如下：第一步：以pGEM-HA(基因库编号：CY187618) 为模板，在上游引物中设计Nhe I酶切位点，下游引物设计EcoR I并含终止密码子(TAA) (引物序列：F-1：CTAGCTAGCGTTTTAGCAGCTGGTGACAAAATCTGCC； R-1:CCGGAATTCTATACAAATAGT)，通过PCR反应、Nhe I/EcoR I双酶切、割胶回收获得HA基因片段(核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)。与此同时，对表面展示型表达质粒pYD1进行Nhe I/EcoR I双酶切、割胶回收。第二步：将pYD1与HA基因进行连接，转化至感受态E.coli DH5α，并涂布于LB固体培养基，通过氨苄青霉素筛选阳性克隆。第三步：将鉴定为阳性克隆的质粒进行双酶切和测序分析，确定目标基因序列的完整性。第四步：将该阳性重组质粒电转至感受态S.cerevisiae EBY 100，并涂布于酵母筛选固体培养基(0.67％yeast nitrogen base without amino acids(YNB),2％glucose,0.01％leucine,2％agar,和1M sorbitol)。第五步：筛选Trp⁺阳性克隆，提取基因组DNA，对阳性克隆进行 PCR鉴定。最终获得EBY100/pYD1-HA。用同样的方法可以获得EBY100/pYD1-NP和 EBY100/pYD1-M2。

同理，利用同样的双酶切位点(Nhe I/EcoR I)，参照酿酒酵母C末端表面展示系统的构建过程，可以成功地构建N末端表面展示系统(EBY100/pYD5-HA、EBY100/pYD5-NP 和EBY100/pYD5-M2)。

图1和图2中目标蛋白(HA、NP或M2)和Aga2之间的(G₄S)₃linker(甘氨酸-丝氨酸柔性肽)是表达质粒pYD1和pYD5本身固有的。

(2)目标蛋白的定性与定位分析

以图1中的EBY100/pYD1-HA为例，阐述体外诱导培养及表达分析。与此同时，以EBY100/ pYD1作为阴性对照。

诱导培养：EBY100/pYD1-HA单克隆接种于含有2％(m/v)葡萄糖的YNB-CAA(0.67％yeast nitrogen base without amino acids(YNB),2％glucose,13.61g/L Na₂HPO₄,7.48g/L NaH₂PO₄和5g/L casamino acids)培养液中，30℃、250rpm培养18小时。通过紫外分光光度计测定OD₆₀₀nm值，并将该数值调整为1.0后，加入新鲜的YNB-CAA培养液(注意：2％(m/v)葡萄糖被2％(m/v)半乳糖替代)，调整OD₆₀₀nm＝0.75，20℃、250rpm 培养。诱导表达后，收集不同时间点(0h、24h、36h、48h、72h)的EBY100/pYD1-HA 上清和沉淀。

Western blot分析：对1OD_600nm(1OD_600nm≈10⁷cells)的EBY100/pYD1-HA进行Western blot分析。首先，利用4-15％的SDS-PAGE预制胶进行电泳(200伏，45分钟)。然后，通过湿转法(150伏，1小时)，将目标蛋白转移至0.45μm孔径的硝酸纤维素膜。接着，PBS-T含0.5％的脱脂奶粉作为封闭液，对转移膜常温封闭1小时，再用单克隆雪貂抗HA血清(1:500 稀释)4℃孵育过夜，PBS-T漂洗过后，用HRP标记的羊抗雪貂IgG(1:5,000稀释)孵育。最后，与West Pico化学发光底物进行反应，通过凝胶成像系统(ChemiDoc XRS System， Bio-Rad)进行分析。通过成像图片，可以清晰地知晓目标蛋白的表达是否具有特异性。与此同时，与Western blot标准蛋白Marker比较，就可以大致知道目标蛋白的分子量。

(4)肠溶胶囊包裹表面展示型酿酒酵母后口服递送

胶囊信息：本申请将使用3#肠溶胶囊(规格：帽：8.1mm±0.4mm，单壁厚度： 0.090～0.115mm±0.015mm；体：13.6mm±0.4mm，单壁厚度：0.090～0.110mm±0.015mm；购买于广东强基药业有限公司)，每次包裹实验前，都要随机抽取10粒空心肠溶胶囊进行体外耐酸和崩解实验，确保100％合格。每个肠溶胶囊最大装载量为300μl；

样品处理:将EBY100/pYD1-HA置于60℃水浴锅中，处理40分钟，并将最终浓度调整至0.5OD₆₀₀nm/μl(1OD₆₀₀≈10⁷cells)。经冷冻干燥后，参照表1进行包裹。以表1 中的编号1为例，体积为3ml的EBY100/pYD1-HA经过冷冻干燥后，称重并分装于10 个肠溶胶囊，每个肠溶胶囊相当于包裹了300μl＝150OD₆₀₀nm的EBY100/pYD1-HA。

表1.每个肠溶胶囊包裹酿酒酵母表面展示系统的干粉量^＊

Table 1.Each enteric capsule coating power content of S.cerevisiaesurface display system*

^＊表示以EBY100/pYD1-HA(浓度：0.5OD₆₀₀nm/μl)为例，总体积为5.5ml。

胶囊递送：通过灌胃针将包裹酿酒酵母表面展示系统的肠溶胶囊轻轻推至雪貂的胃部。

免疫计划：每只雪貂每天口服1粒，连续两天。初次免疫后的第14天和第15天以同样的剂量和方式进行加强免疫。如表1所示，本申请将重点考察三个剂量(150OD₆₀₀nm，75OD₆₀₀nm，50OD₆₀₀nm)的免疫效率。

免疫调整：以EBY100/pYD1-HA作为免疫实验的先锋，通过雪貂血清IgG的分析，适时地对免疫剂量和免疫次数做出合理的调整，以期达到最佳的免疫效果。

鉴于此，在EBY100/pYD1-HA获得最佳免疫效果后，其它C末端展示系统 (EBY100/pYD1-NP和EBY100/pYD1-M2)和N末端表面展示系统(EBY100/pYD5-HA、 EBY100/pYD5-NP和EBY100/pYD5-M2)都可以参照EBY100/pYD1-HA的免疫程序进行正规的动物免疫实验。

(5)体液免疫应答

在最优免疫条件下，对SPF级雪貂(10只/组)进行不同剂量的免疫，通过眼眶收集血液样品，室温静置2小时后，2,000rpm离心10分钟，收集上清，保存于-20℃冰箱，待用。通过ELISA(生物素－链亲和素系统)检测特异性的抗-HA、抗-NP或抗M2血清 Ig G抗体。进一步地，对特异性的血清分型IgG1和IgG2a进行检测。

以检测特异性的抗-NP血清IgG为例，简述ELISA过程。首先，2μg/ml的重组NP 蛋白作为抗原包被于96孔高吸附性的ELISA板中，将血清以2的倍数用封闭液进行稀释，加入ELISA板中。其次，用生物素化的羊抗雪貂IgG和碱性磷酸酶标记的链亲和素 (AP-Streptavidin)分别进行标记。然后，pNPP作为底物显色液。最后，双波长检测： 405nm作为检测波长，630nm作为参比波长。数据以平均值±标准方差(SD)表示。具体步骤参见Virology 2010，407：319-324.

(6)黏膜免疫应答

分别收集免疫后雪貂的鼻洗液、小肠洗液、粪便和尿液，通过上述ELISA方法检测特异性的分泌型Ig A抗体。

基于生物素－链亲和素系统建立的ELISA分析平台适用于所有流感疫苗诱发的体液免疫应答和黏膜免疫应答的检测。

(7)细胞免疫应答

在初次免疫后的第10天和第24天，分离雪貂的脾脏和肠系膜淋巴结，加入红细胞裂解液，分离得到白细胞。最后用含有10％胎牛血清和双抗的RPMI-1640培养液重悬白细胞。

T淋巴细胞增殖检测：在96孔细胞培养板中，每孔加入100μl(含有2×10⁵细胞) 的培养液，同时加入1～10μg/ml特异性多肽进行刺激，培养48小时候，每孔加入10μl 的CCK-8试剂(日本同仁化学研究所)，继续培养4小时，通过酶标仪检测OD₄₅₀nm吸收值。

抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxict lymphocyte，CTL)活性检测：采用CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay试剂盒(美国Promega公司)，根据靶细胞被特异性CTL裂解后释放乳酸脱氢酶，设计酶化学反应，最终产生Formazan为红色化合物，其颜色深浅与乳酸脱氢酶量成正比，通过比色测定OD₄₉₀nm吸收值，获得被裂解靶细胞数量，代表特异性CTL裂解靶细胞能力。以百分裂解率表示CTL裂解靶细胞能力。

细胞因子的检测：利用IFN-γ/IL-4Dual-Color ELISpot Kit(美国R&D Systems公司) 检测免疫后雪貂的CD4⁺T细胞分泌INF-γ和IL-4的水平，从而明确I型辅助T细胞(Th1) 和II型辅助T细胞(Th2)的作用。主要分析过程为：首先，在96孔板(PVDF膜)上加入100μl(10⁶/孔)细胞，在37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养24小时。其次，每孔加入1～10μg/ml的特异性多肽。然后，加入检测抗体(生物素化羊抗雪貂IgG)和碱性磷酸酶标记的链亲和素。接着，加入显色液BCIP/NBT。最后，通过Immunospot分析仪(美国Cellular技术公司)进行计数。结果用加入每孔的细胞数中所含有的斑点形成细胞(SFC) 的数量来表示。

炎症因子的检测：同理，利用包被有TNF-α和IL-8的ELISpot试剂盒检测免疫后雪貂的炎症因子TNF-α和IL-8的分泌水平。

(8)血清学检测

血凝抑制(Hemagglutinin Inhibition,HI)实验：首先，雪貂的血清用受体破坏酶(Receptor destroying enzyme，RDE)处理后，去除非特异性抑制因子和凝血因子，调整血清的初始浓度为1:10。然后，确定4HAU的病毒液，再将RDE处理后的血清进行倍比稀释，每个稀释度的体积为25μl。接着，在每孔中加入25μl含4HAU的病毒液，混匀，室温静置1 小时。最后，加入50μl的红血球(0.5％鸡红细胞悬液)，室温静置30～45分钟后观察结果。血凝被完全抑制的最大稀释度的倒数为血凝抑制试验的终点。

微量中和(Microneutralization,MN)实验：首先，待MDCK细胞在96孔板中生长密度达到75～90％后，弃去培养基，PBS洗2次。其次，加入100μl维持液(MEM含双抗和0.5μg/mlTPCK-Trypsin)，放置37℃待用，用维持液倍比稀释血凝抑制阳性血清 (1≥20)，每个稀释度为50μl体积。然受，加入50μl病毒液(含100×TCID50)，混匀后室温孵育1小时。接着，将100μl抗体与病毒混合液转入细胞培养板中。最后，培养 48～72小时，取50μl培养液进行血凝测试，计算抑制效价。以能保护50％细胞孔不被感染的最高稀释度的倒数作为中和终点。

(9)H7N9疫苗的交叉保护效率分析

在初次免疫后第40天，雪貂经乙醚轻度麻醉后，用50μl 10×LD₅₀雪貂适应病毒株A/Anhui/1/2013(AH-H7N9)、A/Shanghai/1/2013(SH-H7N9)A/Vietnam/1203/2004(H5N1)和A/California/2009(H1N1)分别进行攻击实验。在病毒攻击后的14天内，统计体重丢失百分数和存活率。需要强调的是，攻毒实验必须在生物安全三级实验室(P3)中进行。

肺部、脑部和肝脏的病毒滴度检测：在攻毒后第3天，分离肺、脑和肝脏，以10的倍数对肺、脑和肝脏洗液进行稀释(从1:10开始)，接种至MDCK细胞中，3天后观察细胞病变情况。病毒效价表示为50％的组织培养感染剂量(TCID50)，数值用每毫升病毒效价(TCID50)的平均值±标准方差(SD)表示。

体温变化：病毒攻击后，每天测量雪貂的体温，计算体温变化百分数(％)。

体重丢失百分数：病毒攻击后，每天称量雪貂的体重，计算体重丢失百分数(％)。当雪貂体重丢失≥25％时，需要执行安乐死。

存活率统计：每天统计雪貂的存活数量，计算存活率(％)。

(10)H7N9疫苗的长效保护分析

为了考察酿酒酵母表面展示系统的长效保护效率，在初次免疫后的第180天，进行上述免疫活性分析以及病毒攻击实验。

需要强调的是，在整个免疫实验以及免疫分析中，需要以相同剂量的无菌PBS，EBY100，EBY100/pYD1或EBY100/pYD5作为阴性对照。以相同剂量的AH-H7N9标准抗原在作为阳性对照。

三、实验结果

(1)HA蛋白C末端通过pYD1成功地展示在EBY100表面

在前期预实验中，我们成功地构建了EBY100/pYD5-H7N9 HA，并在 EBY100/pYD5-H7N9 HA诱导48小时后对目标蛋白HA的定位表达做了分析。

通过Western blot分析，检测到了目标蛋白HA的特异性表达，其分子量约为65kDa(如图3A Lane 2所示)。与此同时，通过去N-连接的糖基化酶PNGase F处理，发现目标蛋白HA条带的分子量变小(如图3A Lane 3所示)，这说明EEBY100/pYD5-H7N9 HA 具有糖基化的翻译后修饰过程。糖基化修饰有助于增强病毒抗原蛋白的免疫原性。需要说明的是，由于是预实验，在进行Western blot分析时，没有设置阴性对照EBY100/pYD5。进一步地，EBY100/pYD5-H7N9 HA的表面直接用抗HA血清(一抗)对 EBY100/pYD5-H7N9 HA表面进行直接标记，FITC标记的羊抗鼠IgG作为二抗。通过免疫荧光显微镜和流式细胞仪分析，EBY100/pYD5-H7N9 HA表面的特异性荧光信号非常强 (如图3B、C右图所示)，而且目标蛋白HA的展示效率为72.5％(如图3C右图所示)。这说明目标蛋白HA高效、稳定地展示在酿酒酵母EBY100表面。

(2)EBY100/pYD1-HA的口服免疫效率分析

申请比较了EBY100/pYD1-HA经两种不同给药方式(肌肉注射和腹腔注射)的免疫效率，肌肉注射方式获得了100％的免疫保护，而腹腔注射方式对小鼠没有保护作用。虽然取得了令人振奋的实验结果，但是在实际的操作过程中，由于EBY100/pYD1-HA的直径约 10μm，疫苗在小鼠的肌肉注射处很难快速地扩散，这既影响了疫苗的吸收，也非常容易引发炎症。

结合酿酒酵母表面展示系统的特有的优点(直径大、目标蛋白展示效率高、酵母细胞壁具有佐剂功能等)，口服免疫或许可以破解肌肉注射面临的科学问题。为了证实这一科学设想，以EBY100/pYD1-HA为例，将其浓度调整至0.5OD₆₀₀nm/μl，设计了三种相同口服剂量，不同口服次数的实验方式，即50OD₆₀₀nm＝100μl，75OD₆₀₀nm＝150μl，150 OD₆₀₀nm＝300μl(如图4所示)。在初次免疫后的第13天和第28天，收集血样，通过 ELISA检测HA特异性的血清IgG。在初次免疫后的第40天，用同型A/Vietnam/1203/2004 (H5N1)病毒对免疫后的小鼠进行病毒攻击实验。以相同剂量的PBS和EBY100/pYD1 作为阴性对照，灭活的H5N1疫苗作为阳性对照。

口服免疫后，小鼠血清IgG效价的分析结果如图5A所示，EBY100/pYD1-HA在regime1、2和3中检测到较高的HA特异性的血清IgG抗体效价，其中regime 2和regime 3诱发的IgG效价在2¹⁴左右。而灭活的H5N1疫苗(阳性对照)在口服免疫后并没有诱发有意义的IgG应答。通过同型H5N1病毒的攻击实验，EBY100/pYD1-HA在regime 1具有 60％的保护效率(如图5B所示)，regime 2和regime 3均能提供100％的保护(如图5C、 D所示)。阴性对照组(PBS和EBY100/pYD1)和阳性对照组(灭活的H5N1疫苗)都没有保护作用(如图B、C和D所示)。

可以看出，EBY100/pYD1-HA通过regime 2和regime 3口服免疫方式，可以使小鼠获得非常理想的保护效果，并且小鼠经口服免疫EBY100/pYD1-HA后，没有任何不适症状发生。因此，基于酿酒酵母表面展示系统开发的病毒疫苗，通过口服免疫方式可以有效地解决注射给药带来的科学问题。

(3)肠溶胶囊包裹EBY100/pYD5-H7N9 HA在小鼠体内的释放过程

为了分析肠溶胶囊包裹EBY100/pYD5-H7N9 HA的靶向性，利用荧光素Cy5.5对EBY100/pYD5-H7N9 HA进行标记，经肠溶胶囊包裹后，通过灌胃针输送至BALB/c小鼠的胃部。最后，通过小动物活体光学成像仪适时观察荧光素标记的EBY100/pYD1-H5N1 HA在小鼠体内的释放过程。

肠溶胶囊包裹的EBY100/pYD5-H7N9 HA在口服40分钟后到达小肠，但是此时的肠溶胶囊并未崩解，所以荧光强度最高(如图6A所示)。随着肠溶胶囊的逐渐崩解并释放内容物，荧光强度逐渐减弱(如图6B、C所示)。这说明肠溶胶囊包裹的 EBY100/pYD5-H7N9 HA能够逃避胃酸的降解，并在口服40分钟后到达小肠部位并逐渐崩解、释放包裹物。因此，肠溶胶囊包裹的高致病性禽流感疫苗可以有效地靶向输送小肠部位。

综上所述，本发明重组菌EBY100/pYD1-HA通过肠溶胶囊包裹制成的口服疫苗，可以有效免疫，免疫保护率高，具有很大的临床应用价值。

本实施例的基因片段和重组质粒序列如下所示：

附件1

HA基因序列(SEQ ID NO：1)

ATGGACAAAATCTGCCTCGGACATCATGCCGTGTCAAACGGAACCAAAGTAAACACATTAACTGAAAGAGGAGTG GAAGTCGTCAATGCAACTGAAACAGTGGAACGAACAAACATCCCCAGGATCTGCTCAAAAGGGAAAAGGACAGT TGACCTCGGTCAATGTGGACTCCTGGGGACAATCACTGGACCACCTCAATGTGACCAATTCCTAGAATTTTCAGCC GATTTAATTATTGAGAGGCGAGAAGGAAGTGATGTCTGTTATCCTGGGAAATTCGTGAATGAAGAAGCTCTGAGGC AAATTCTCAGAGAATCAGGCGGAATTGACAAGGAAGCAATGGGATTCACATACAGTGGAATAAGAACTAATGGAG CAACCAGTGCATGTAGGAGATCAGGATCTTCATTCTATGCAGAAATGAAATGGCTCCTGTCAAACACAGATGATGC TGCATTCCCGCAGATGACTAAGTCATATAAAAATACAAGAAAAAGCCCAGCTCTAATAGTATGGGGGATCCATCATT CCGTATCAACTGCAGAGCAAACCAAGCTATATGGGAGTGGAAACAAACTGGTGACAGTTGGGAGTTCTAATTATCA ACAATCTTTTGTACCGAGTCCAGGAGCGAGACCACAAGTTAATGGTCTATCTGGAAGAATTGACTTTCATTGGCTA ATGCTAAATCCCAATGATACAGTCACTTTCAGTTTCAATGGGGCTTTCATAGCTCCAGACCGTGCAAGCTTCCTGAG AGGAAAATCTATGGGAATCCAGAGTGGAGTACAGGTTGATGCCAATTGTGAAGGGGACTGCTATCATAGTGGAGG GACAATAATAAGTAACTTGCCATTTCAGAACATAGATAGCAGGGCAGTTGGAAAATGTCCGAGATATGTTAAGCAA AGGAGTCTGCTGCTAGCAACAGGGATGAAGAATGTTCCTGAGATTCCAAAGGGAAGAGGCCTATTTGGTGCTATA GCGGGTTTCATTGAAAATGGATGGGAAGGCCTAATTGATGGTTGGTATGGTTTCAGACACCAGAATGCACAGGGAG AGGGAACTGCTGCAGATTACAAAAGCACTCAATCGGCAATTGATCAAATAACAGGAAAATTAAACCGGCTTATAGA AAAAACCAACCAACAATTTGAGTTGATAGACAATGAATTTAATGAGGTAGAGAAGCAAATCGGTAATGTGATAAAT TGGACCAGAGATTCTATAACAGAAGTGTGGTCATACAATGCTGAACTCTTGGTAGCAATGGAGAACCAGCATACAA TTGATCTGGCTGATTCAGAAATGGACAAACTGTACGAACGAGTGAAAAGACAGCTGAGAGAGAATGCTGAAGAA GATGGCACTGGTTGCTTTGAAATATTTCACAAGTGTGATGATGACTGTATGGCCAGTATTAGAAATAACACCTATGA TCACAGCAAATACAGGGAAGAGGCAATGCAAAATAGAATACAGATTGACCCAGTCAAACTAAGCAGCGGCTACAA AGATGTGATACTTTGGTTTAGCTTCGGGGCATCATGTTTCATACTTCTAGCCATTGTAATGGGCCTTGTCTTCATATGT GTAAAGAATGGAAACATGCGGTGCACTATTTGTATATAA

氨基酸序列：

MDKICLGHHAVSNGTKVNTLTERGVEVVNATETVERTNIPRICSKGKRTVDLGQCGLLGTITGPPQCDQFLEFSADLIIE RREGSDVCYPGKFVNEEALRQILRESGGIDKEAMGFTYSGIRTNGATSACRRSGSSFYAEMKWLLSNTDDAAFPQMTK SYKNTRKSPALIVWGIHHSVSTAEQTKLYGSGNKLVTVGSSNYQQSFVPSPGARPQVNGLSGRIDFHWLMLNPNDTVT FSFNGAFIAPDRASFLRGKSMGIQSGVQVDANCEGDCYHSGGTIISNLPFQNIDSRAVGKCPRYVKQRSLLLATGMKNV PEIPKGRGLFGAIAGFIENGWEGLIDGWYGFRHQNAQGEGTAADYKSTQSAIDQITGKLNRLIEKTNQQFELIDNEFNE VEKQIGNVINWTRDSITEVWSYNAELLVAMENQHTIDLADSEMDKLYERVKRQLRENAEEDGTGCFEIFHKCDDDCM ASIRNNTYDHSKYREEAMQNRIQIDPVKLSSGYKDVILWFSFGASCFILLAIVMGLVFICVKNGNMRCTICI

附件2：

NP基因序列(SEQ ID NO：2)；

ATGGCGTCTCAAGGCACCAAACGATCCTATGAACAGATGGAAACTGGTGGGGAACGCCAGAATGCTACTGAGATC AGGGCATCTGTTGGAAGAATGGTTAGCGGCATTGGGAGATTCTACATACAGATGTGTACAGAACTCAAACTCAGTG ACAATGAAGGGAGGCTGATTCAGAACAGTATAACAATAGAGAGAATGGTACTCTCTGCATTTGATGAAAGAAGGA ACAGATACCTGGAAGAGCACCCCAGTGCAGGAAAGGACCCTAAGAAAACTGGAGGTCCAATTTACAGGAGAAGA GACGGAAAATGGGTGAGAGAGCTGATCCTGTATGACAAAGAGGAAATCAGGAGAATTTGGCGACAAGCGAACAA TGGAGAGGATGCAACTGCTGGTCTTACCCATCTGATGATATGGCATTCCAACCTGAATGATGCTACCTATCAGAGAA CGAGAGCTCTCGTGCGTACTGGAATGGATCCCCGGATGTGCTCTCTGATGCAAGGATCAACTCTCCCGAGGAGATC TGGAGCTGCAGGTGCAGCAGTGAAGGGGATAGGGACAATGGTGATGGAACTGATTCGGATGATAAAACGAGGGAT CAACGACCGGAATTTCTGGAGAGGCGAAAATGGAAGAAGGACAAGAATTGCATATGAGAGAATGTGCAACATCCT CAAAGGGAAATTCCAAACAGCAGCACAAAGGGCAATGATGGATCAAGTGCGAGAGAGCAGAAATCCTGGGAATG CTGAAATAGAAGATCTCATTTTTCTGGCAAGGTCTGCACTCATCCTGAGAGGATCAGTGGCTCATAAATCCTGCTTG CCTGCTTGTGTGTACGGACTTGCAGTGGCTAGTGGATATGACTTTGAGAGAGAAGGGTACTCCTTGGTTGGAATAG ATCCTTTCCGTCTGCTTCAAAACAGCCAGGTCTTTAGTCTCATTAGACCAAATGAGAACCCAGCACATAAGAGCCA ACTAGTGTGGATGGCATGCCACTCTGCAGCGTTTGAGGACCTTAGGGTCTCAAGTTTCATTAGAGGGACAAGAATG GTCCCAAGAGGACAGCTATCCACTAGAGGGGTTCAAATTGCTTCAAATGAGAACATGGAAGCAATGGACTCCAAT ACTCTTGAACTGAGAAGTAGATATTGGGCTATAAGAACCAGAAGCGGAGGGAACACCAACCAACAGAGGGCATCT GCAGGACAGGTCAGCGTTCAACCCACTTTCTCAGTACAGAGAAACCTTCCTTTCGAAAGAGCAACCATTATGGCA GCATTTACAGGAAATACTGAGGGTAGAACGTCTGACATGAGGACTGAAATCATAAGAATGATGGAAAGTGCCAGA CCAGAAGATGTGTCATTCCAGGGGCGGGGAGTCTTCGAGCTCTCGGACGAAAAGGCAACGAACCCGATCGTGCCT TCCTTTGACATGAATAATGAAGGATCTTATTTCTTCGGAGACAATGCAGAGGAGTATGACAATTAA

氨基酸序列：

MASQGTKRSYEQMETGGERQNATEIRASVGRMVSGIGRFYIQMCTELKLSDNEGRLIQNSITIERMVLSAFDERRNRYL EEHPSAGKDPKKTGGPIYRRRDGKWVRELILYDKEEIRRIWRQANNGEDATAGLTHLMIWHSNLNDATYQRTRALVRT GMDPRMCSLMQGSTLPRRSGAAGAAVKGIGTMVMELIRMIKRGINDRNFWRGENGRRTRIAYERMCNILKGKFQTAA QRAMMDQVRESRNPGNAEIEDLIFLARSALILRGSVAHKSCLPACVYGLAVASGYDFEREGYSLVGIDPFRLLQNSQVF SLIRPNENPAHKSQLVWMACHSAAFEDLRVSSFIRGTRMVPRGQLSTRGVQIASNENMEAMDSNTLELRSRYWAIRTR SGGNTNQQRASAGQVSVQPTFSVQRNLPFERATIMAAFTGNTEGRTSDMRTEIIRMMESARPEDVSFQGRGVFELSDE KATNPIVPSFDMNNEGSYFFGDNAEEYDN

附件3:

M2基因序列(SEQ ID NO：3)；

ATGAGTCTTCTAACCGAGGTCGAAACGCCTACCAGAACCGGATGGGAGTGCAACTGCAGCGGTTCAAGTGAGCCT CTAGTCGTTGCAGCTAACATTATTGGGATATTGCACTTGATATTGTGGATTCTTGATCGTCTTTTCTTCAAATGCATTT ATCGTCGTTTTAAATACGGTTTGAAAAGAGGGCCTTCTACGGAAGGAATGCCTGAGTCTATGAGGGAAGAATATCG GCAGGAACAGCAGAATGCTGTGGATGTTGACGATGGTCATTTTGTCAACATAGAGCTGAAGTAA

氨基酸序列：

MSLLTEVETPTRTGWECNCSGSSEPLVVAANIIGILHLILWILDRLFFKCIYRRFKYGLKRGPSTEGMPESMREEYRQEQ QNAVDVDDGHFVNIELK

附件4:

pYD1-HA基因序列(SEQ ID NO：4)

ACGGATTAGAAGCCGCCGAGCGGGTGACAGCCCTCCGAAGGAAGACTCTCCTCCGTGCGTCCTCGTCTTCACCGG TCGCGTTCCTGAAACGCAGATGTGCCTCGCGCCGCACTGCTCCGAACAATAAAGATTCTACAATACTAGCTTTTATG GTTATGAAGAGGAAAAATTGGCAGTAACCTGGCCCCACAAACCTTCAAATGAACGAATCAAATTAACAACCATAG GATGATAATGCGATTAGTTTTTTAGCCTTATTTCTGGGGTAATTAATCAGCGAAGCGATGATTTTTGATCTATTAACAG ATATATAAATGCAAAAACTGCATAACCACTTTAACTAATACTTTCAACATTTTCGGTTTGTATTACTTCTTATTCAAAT GTAATAAAAGTATCAACAAAAAATTGTTAATATACCTCTATACTTTAACGTCAAGGAGAAAAAACCCCGGATCGGAC TACTAGCAGCTGTAATACGACTCACTATAGGGAATATTAAGCTAATTCTACTTCATACATTTTCAATTAAGATGCAGTT ACTTCGCTGTTTTTCAATATTTTCTGTTATTGCTTCAGTTTTAGCACAGGAACTGACAACTATATGCGAGCAAATCCC CTCACCAACTTTAGAATCGACGCCGTACTCTTTGTCAACGACTACTATTTTGGCCAACGGGAAGGCAATGCAAGGA GTTTTTGAATATTACAAATCAGTAACGTTTGTCAGTAATTGCGGTTCTCACCCCTCAACAACTAGCAAAGGCAGCCC CATAAACACACAGTATGTTTTTAAGCTTCTGCAGGCTAGTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGT GGTGGTTCTGCTAGCGACAAAATCTGCCTCGGACATCATGCCGTGTCAAACGGAACCAAAGTAAACACATTAACT GAAAGAGGAGTGGAAGTCGTCAATGCAACTGAAACAGTGGAACGAACAAACATCCCCAGGATCTGCTCAAAAGG GAAAAGGACAGTTGACCTCGGTCAATGTGGACTCCTGGGGACAATCACTGGACCACCTCAATGTGACCAATTCCT AGAATTTTCAGCCGATTTAATTATTGAGAGGCGAGAAGGAAGTGATGTCTGTTATCCTGGGAAATTCGTGAATGAA GAAGCTCTGAGGCAAATTCTCAGAGAATCAGGCGGAATTGACAAGGAAGCAATGGGATTCACATACAGTGGAATA AGAACTAATGGAGCAACCAGTGCATGTAGGAGATCAGGATCTTCATTCTATGCAGAAATGAAATGGCTCCTGTCAA ACACAGATGATGCTGCATTCCCGCAGATGACTAAGTCATATAAAAATACAAGAAAAAGCCCAGCTCTAATAGTATG GGGGATCCATCATTCCGTATCAACTGCAGAGCAAACCAAGCTATATGGGAGTGGAAACAAACTGGTGACAGTTGG GAGTTCTAATTATCAACAATCTTTTGTACCGAGTCCAGGAGCGAGACCACAAGTTAATGGTCTATCTGGAAGAATTG ACTTTCATTGGCTAATGCTAAATCCCAATGATACAGTCACTTTCAGTTTCAATGGGGCTTTCATAGCTCCAGACCGT GCAAGCTTCCTGAGAGGAAAATCTATGGGAATCCAGAGTGGAGTACAGGTTGATGCCAATTGTGAAGGGGACTGC TATCATAGTGGAGGGACAATAATAAGTAACTTGCCATTTCAGAACATAGATAGCAGGGCAGTTGGAAAATGTCCGA GATATGTTAAGCAAAGGAGTCTGCTGCTAGCGCGTCTCAAGGCACCAAACGATCCTATGAACAGATGGAAACTGG TGGGGAACGCCAGAATGCTACTGACAAAATCTGCCTCGGACATCATGCCGTGTCAAACGGAACCAAAGTAAACAC ATTAACTGAAAGAGGAGTGGAAGTCGTCAATGCAACTGAAACAGTGGAACGAACAAACATCCCCAGGATCTGCTC AAAAGGGAAAAGGACAGTTGACCTCGGTCAATGTGGACTCCTGGGGACAATCACTGGACCACCTCAATGTGACC AATTCCTAGAATTTTCAGCCGATTTAATTATTGAGAGGCGAGAAGGAAGTGATGTCTGTTATCCTGGGAAATTCGTG AATGAAGAAGCTCTGAGGCAAATTCTCAGAGAATCAGGCGGAATTGACAAGGAAGCAATGGGATTCACATACAGT GGAATAAGAACTAATGGAGCAACCAGTGCATGTAGGAGATCAGGATCTTCATTCTATGCAGAAATGAAATGGCTCC TGTCAAACACAGATGATGCTGCATTCCCGCAGATGACTAAGTCATATAAAAATACAAGAAAAAGCCCAGCTCTAAT AGTATGGGGGATCCATCATTCCGTATCAACTGCAGAGCAAACCAAGCTATATGGGAGTGGAAACAAACTGGTGACA GTTGGGAGTTCTAATTATCAACAATCTTTTGTACCGAGTCCAGGAGCGAGACCACAAGTTAATGGTCTATCTGGAA GAATTGACTTTCATTGGCTAATGCTAAATCCCAATGATACAGTCACTTTCAGTTTCAATGGGGCTTTCATAGCTCCAG ACCGTGCAAGCTTCCTGAGAGGAAAATCTATGGGAATCCAGAGTGGAGTACAGGTTGATGCCAATTGTGAAGGGG ACTGCTATCATAGTGGAGGGACAATAATAAGTAACTTGCCATTTCAGAACATAGATAGCAGGGCAGTTGGAAAATG TCCGAGATATGTTAAGCAAAGGAGTCTGCTGCTAGCAACAGGGATGAAGAATGTTCCTGAGATTCCAAAGGGAAG AGGCCTATTTGGTGCTATAGCGGGTTTCATTGAAAATGGATGGGAAGGCCTAATTGATGGTTGGTATGGTTTCAGAC ACCAGAATGCACAGGGAGAGGGAACTGCTGCAGATTACAAAAGCACTCAATCGGCAATTGATCAAATAACAGGAA AATTAAACCGGCTTATAGAAAAAACCAACCAACAATTTGAGTTGATAGACAATGAATTTAATGAGGTAGAGAAGCA AATCGGTAATGTGATAAATTGGACCAGAGATTCTATAACAGAAGTGTGGTCATACAATGCTGAACTCTTGGTAGCAA TGGAGAACCAGCATACAATTGATCTGGCTGATTCAGAAATGGACAAACTGTACGAACGAGTGAAAAGACAGCTGA GAGAGAATGCTGAAGAAGATGGCACTGGTTGCTTTGAAATATTTCACAAGTGTGATGATGACTGTATGGCCAGTAT TAGAAATAACACCTATGATCACAGCAAATACAGGGAAGAGGCAATGCAAAATAGAATACAGATTGACCCAGTCAA ACTAAGCAGCGGCTACAAAGATGTGATACTTTGGTTTAGCTTCGGGGCATCATGTTTCATACTTCTAGCCATTGTAAT GGGCCTTGTCTTCATATGTGTAAAGAATGGAAACATGCGGTGCACTATTTGTATATAAGAATTCTGCAGATATCCAGC ACAGTGGCGGCCGCTCGAGTCTAGAGGGCCCTTCGAAGGTAAGCCTATCCCTAACCCTCTCCTCGGTCTCGATTCT ACGCGTACCGGTCATCATCACCATCACCATTGAGTTTAAACCCGCTGATCTGATAACAACAGTGTAGATGTAACAAA ATCGACTTTGTTCCCACTGTACTTTTAGCTCGTACAAAATACAATATACTTTTCATTTCTCCGTAAACAACATGTTTTC CCATGTAATATCCTTTTCTATTTTTCGTTCCGTTACCAACTTTACACATACTTTATATAGCTATTCACTTCTATACACTA AAAAACTAAGACAATTTTAATTTTGCTGCCTGCCATATTTCAATTTGTTATAAATTCCTATAATTTATCCTATTAGTAGCTAAAAAAAGATGAATGTGAATCGAATCCTAAGAGAATTGGGCAAGTGCACAAACAATACTTAAATAAATACTACTCAGTAATAACCTATTTCTTAGCATTTTTGACGAAATTTGCTATTTTGTTAGAGTCTTTTACACCATTTGTCTCCACACCT CCGCTTACATCAACACCAATAACGCCATTTAATCTAAGCGCATCACCAACATTTTCTGGCGTCAGTCCACCAGCTAA CATAAAATGTAAGCTCTCGGGGCTCTCTTGCCTTCCAACCCAGTCAGAAATCGAGTTCCAATCCAAAAGTTCACCT GTCCCACCTGCTTCTGAATCAAACAAGGGAATAAACGAATGAGGTTTCTGTGAAGCTGCACTGAGTAGTATGTTGC AGTCTTTTGGAAATACGAGTCTTTTAATAACTGGCAAACCGAGGAACTCTTGGTATTCTTGCCACGACTCATCTCCG TGCAGTTGGACGATATCAATGCCGTAATCATTGACCAGAGCCAAAACATCCTCCTTAGGTTGATTACGAAACACGC CAACCAAGTATTTCGGAGTGCCTGAACTATTTTTATATGCTTTTACAAGACTTGAAATTTTCCTTGCAATAACCGGGT CAATTGTTCTCTTTCTATTGGGCACACATATAATACCCAGCAAGTCAGCATCGGAATCTAGAGCACATTCTGCGGCC TCTGTGCTCTGCAAGCCGCAAACTTTCACCAATGGACCAGAACTACCTGTGAAATTAATAACAGACATACTCCAAG CTGCCTTTGTGTGCTTAATCACGTATACTCACGTGCTCAATAGTCACCAATGCCCTCCCTCTTGGCCCTCTCCTTTTC TTTTTTCGACCGAATTTCTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAAT GGTTTCTTAGGACGGATCGCTTGCCTGTAACTTACACGCGCCTCGTATCTTTTAATGATGGAATAATTTGGGAATTTA CTCTGTGTTTATTTATTTTTATGTTTTGTATTTGGATTTTAGAAAGTAAATAAAGAAGGTAGAAGAGTTACGGAATGA AGAAAAAAAAATAAACAAAGGTTTAAAAAATTTCAACAAAAAGCGTACTTTACATATATATTTATTAGACAAGAAA AGCAGATTAAATAGATATACATTCGATTAACGATAAGTAAAATGTAAAATCACAGGATTTTCGTGTGTGGTCTTCTAC ACAGACAAGATGAAACAATTCGGCATTAATACCTGAGAGCAGGAAGAGCAAGATAAAAGGTAGTATTTGTTGGCG ATCCCCCTAGAGTCTTTTACATCTTCGGAAAACAAAAACTATTTTTTCTTTAATTTCTTTTTTTACTTTCTATTTTTAAT TTATATATTTATATTAAAAAATTTAAATTATAATTATTTTTATAGCACGTGATGAAAAGGACCCAGGTGGCACTTTTCG GGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACC CTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTT TGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGT GCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTC CAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGG TCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATG ACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCG GAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGG AGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAAC TATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGG ACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGC GGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGCAGTCAGGCAA CTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGT TTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAAT CTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTT CTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTT GCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTT CTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTT ACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCG CAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATA CCTACAGCGTGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCA GGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGGAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTC GCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCCGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACG CGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGG ATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGA GCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGC ACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTACCTCACTCATTAGGCAC CCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCCTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAAC AGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTCGGAATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGCTAGT

附件5:

pYD1-NP基因序列(SEQ ID NO：5)

ACGGATTAGAAGCCGCCGAGCGGGTGACAGCCCTCCGAAGGAAGACTCTCCTCCGTGCGTCCTCGTCTTCACCGG TCGCGTTCCTGAAACGCAGATGTGCCTCGCGCCGCACTGCTCCGAACAATAAAGATTCTACAATACTAGCTTTTATG GTTATGAAGAGGAAAAATTGGCAGTAACCTGGCCCCACAAACCTTCAAATGAACGAATCAAATTAACAACCATAG GATGATAATGCGATTAGTTTTTTAGCCTTATTTCTGGGGTAATTAATCAGCGAAGCGATGATTTTTGATCTATTAACAG ATATATAAATGCAAAAACTGCATAACCACTTTAACTAATACTTTCAACATTTTCGGTTTGTATTACTTCTTATTCAAAT GTAATAAAAGTATCAACAAAAAATTGTTAATATACCTCTATACTTTAACGTCAAGGAGAAAAAACCCCGGATCGGAC TACTAGCAGCTGTAATACGACTCACTATAGGGAATATTAAGCTAATTCTACTTCATACATTTTCAATTAAGATGCAGTT ACTTCGCTGTTTTTCAATATTTTCTGTTATTGCTTCAGTTTTAGCACAGGAACTGACAACTATATGCGAGCAAATCCC CTCACCAACTTTAGAATCGACGCCGTACTCTTTGTCAACGACTACTATTTTGGCCAACGGGAAGGCAATGCAAGGA GTTTTTGAATATTACAAATCAGTAACGTTTGTCAGTAATTGCGGTTCTCACCCCTCAACAACTAGCAAAGGCAGCCC CATAAACACACAGTATGTTTTTAAGCTTCTGCAGGCTAGTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGT GGTGGTTCTGCTAGCGACAAAATCTGCCTCGGACATCATGCCGTGTCAAACGGAACCAAAGTAAACACATTAACT GAAAGAGGAGTGGAAGTCGTCAATGCAACTGAAACAGTGGAACGAACAAACATCCCCAGGATCTGCTCAAAAGG GAAAAGGACAGTTGACCTCGGTCAATGTGGACTCCTGGGGACAATCACTGGACCACCTCAATGTGACCAATTCCT AGAATTTTCAGCCGATTTAATTATTGAGAGGCGAGAAGGAAGTGATGTCTGTTATCCTGGGAAATTCGTGAATGAA GAAGCTCTGAGGCAAATTCTCAGAGAATCAGGCGGAATTGACAAGGAAGCAATGGGATTCACATACAGTGGAATA AGAACTAATGGAGCAACCAGTGCATGTAGGAGATCAGGATCTTCATTCTATGCAGAAATGAAATGGCTCCTGTCAA ACACAGATGATGCTGCATTCCCGCAGATGACTAAGTCATATAAAAATACAAGAAAAAGCCCAGCTCTAATAGTATG GGGGATCCATCATTCCGTATCAACTGCAGAGCAAACCAAGCTATATGGGAGTGGAAACAAACTGGTGACAGTTGG GAGTTCTAATTATCAACAATCTTTTGTACCGAGTCCAGGAGCGAGACCACAAGTTAATGGTCTATCTGGAAGAATTG ACTTTCATTGGCTAATGCTAAATCCCAATGATACAGTCACTTTCAGTTTCAATGGGGCTTTCATAGCTCCAGACCGT GCAAGCTTCCTGAGAGGAAAATCTATGGGAATCCAGAGTGGAGTACAGGTTGATGCCAATTGTGAAGGGGACTGC TATCATAGTGGAGGGACAATAATAAGTAACTTGCCATTTCAGAACATAGATAGCAGGGCAGTTGGAAAATGTCCGA GATATGTTAAGCAAAGGAGTCTGCTGCTAGCGCGTCTCAAGGCACCAAACGATCCTATGAACAGATGGAAACTGG TGGGGAACGCCAGAATGCTACTGAGATCAGGGCATCTGTTGGAAGAATGGTTAGCGGCATTGGGAGATTCTACATA CAGATGTGTACAGAACTCAAACTCAGTGACAATGAAGGGAGGCTGATTCAGAACAGTATAACAATAGAGAGAATG GTACTCTCTGCATTTGATGAAAGAAGGAACAGATACCTGGAAGAGCACCCCAGTGCAGGAAAGGACCCTAAGAA AACTGGAGGTCCAATTTACAGGAGAAGAGACGGAAAATGGGTGAGAGAGCTGATCCTGTATGACAAAGAGGAAA TCAGGAGAATTTGGCGACAAGCGAACAATGGAGAGGATGCAACTGCTGGTCTTACCCATCTGATGATATGGCATTC CAACCTGAATGATGCTACCTATCAGAGAACGAGAGCTCTCGTGCGTACTGGAATGGATCCCCGGATGTGCTCTCTG ATGCAAGGATCAACTCTCCCGAGGAGATCTGGAGCTGCAGGTGCAGCAGTGAAGGGGATAGGGACAATGGTGATG GAACTGATTCGGATGATAAAACGAGGGATCAACGACCGGAATTTCTGGAGAGGCGAAAATGGAAGAAGGACAAG AATTGCATATGAGAGAATGTGCAACATCCTCAAAGGGAAATTCCAAACAGCAGCACAAAGGGCAATGATGGATCA AGTGCGAGAGAGCAGAAATCCTGGGAATGCTGAAATAGAAGATCTCATTTTTCTGGCAAGGTCTGCACTCATCCTG AGAGGATCAGTGGCTCATAAATCCTGCTTGCCTGCTTGTGTGTACGGACTTGCAGTGGCTAGTGGATATGACTTTGA GAGAGAAGGGTACTCCTTGGTTGGAATAGATCCTTTCCGTCTGCTTCAAAACAGCCAGGTCTTTAGTCTCATTAGA CCAAATGAGAACCCAGCACATAAGAGCCAACTAGTGTGGATGGCATGCCACTCTGCAGCGTTTGAGGACCTTAGG GTCTCAAGTTTCATTAGAGGGACAAGAATGGTCCCAAGAGGACAGCTATCCACTAGAGGGGTTCAAATTGCTTCA AATGAGAACATGGAAGCAATGGACTCCAATACTCTTGAACTGAGAAGTAGATATTGGGCTATAAGAACCAGAAGC GGAGGGAACACCAACCAACAGAGGGCATCTGCAGGACAGGTCAGCGTTCAACCCACTTTCTCAGTACAGAGAAA CCTTCCTTTCGAAAGAGCAACCATTATGGCAGCATTTACAGGAAATACTGAGGGTAGAACGTCTGACATGAGGACT GAAATCATAAGAATGATGGAAAGTGCCAGACCAGAAGATGTGTCATTCCAGGGGCGGGGAGTCTTCGAGCTCTCG GACGAAAAGGCAACGAACCCGATCGTGCCTTCCTTTGACATGAATAATGAAGGATCTTATTTCTTCGGAGACAATG CAGAGGAGTATGACAATTAAGAATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGGCGGCCGCTCGAGTCTAGAGGGCCCTTCG AAGGTAAGCCTATCCCTAACCCTCTCCTCGGTCTCGATTCTACGCGTACCGGTCATCATCACCATCACCATTGAGTTT AAACCCGCTGATCTGATAACAACAGTGTAGATGTAACAAAATCGACTTTGTTCCCACTGTACTTTTAGCTCGTACAA AATACAATATACTTTTCATTTCTCCGTAAACAACATGTTTTCCCATGTAATATCCTTTTCTATTTTTCGTTCCGTTACCA ACTTTACACATACTTTATATAGCTATTCACTTCTATACACTAAAAAACTAAGACAATTTTAATTTTGCTGCCTGCCATA TTTCAATTTGTTATAAATTCCTATAATTTATCCTATTAGTAGCTAAAAAAAGATGAATGTGAATCGAATCCTAAGAGAA TTGGGCAAGTGCACAAACAATACTTAAATAAATACTACTCAGTAATAACCTATTTCTTAGCATTTTTGACGAAATTTG CTATTTTGTTAGAGTCTTTTACACCATTTGTCTCCACACCTCCGCTTACATCAACACCAATAACGCCATTTAATCTAA GCGCATCACCAACATTTTCTGGCGTCAGTCCACCAGCTAACATAAAATGTAAGCTCTCGGGGCTCTCTTGCCTTCCA ACCCAGTCAGAAATCGAGTTCCAATCCAAAAGTTCACCTGTCCCACCTGCTTCTGAATCAAACAAGGGAATAAAC GAATGAGGTTTCTGTGAAGCTGCACTGAGTAGTATGTTGCAGTCTTTTGGAAATACGAGTCTTTTAATAACTGGCAA ACCGAGGAACTCTTGGTATTCTTGCCACGACTCATCTCCGTGCAGTTGGACGATATCAATGCCGTAATCATTGACCA GAGCCAAAACATCCTCCTTAGGTTGATTACGAAACACGCCAACCAAGTATTTCGGAGTGCCTGAACTATTTTTATAT GCTTTTACAAGACTTGAAATTTTCCTTGCAATAACCGGGTCAATTGTTCTCTTTCTATTGGGCACACATATAATACCCAGCAAGTCAGCATCGGAATCTAGAGCACATTCTGCGGCCTCTGTGCTCTGCAAGCCGCAAACTTTCACCAATGGACCAGAACTACCTGTGAAATTAATAACAGACATACTCCAAGCTGCCTTTGTGTGCTTAATCACGTATACTCACGTGCTCAATAGTCACCAATGCCCTCCCTCTTGGCCCTCTCCTTTTCTTTTTTCGACCGAATTTCTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGGACGGATCGCTTGCCTGTAACTTACACG CGCCTCGTATCTTTTAATGATGGAATAATTTGGGAATTTACTCTGTGTTTATTTATTTTTATGTTTTGTATTTGGATTTT AGAAAGTAAATAAAGAAGGTAGAAGAGTTACGGAATGAAGAAAAAAAAATAAACAAAGGTTTAAAAAATTTCAA CAAAAAGCGTACTTTACATATATATTTATTAGACAAGAAAAGCAGATTAAATAGATATACATTCGATTAACGATAAGT AAAATGTAAAATCACAGGATTTTCGTGTGTGGTCTTCTACACAGACAAGATGAAACAATTCGGCATTAATACCTGA GAGCAGGAAGAGCAAGATAAAAGGTAGTATTTGTTGGCGATCCCCCTAGAGTCTTTTACATCTTCGGAAAACAAAA ACTATTTTTTCTTTAATTTCTTTTTTTACTTTCTATTTTTAATTTATATATTTATATTAAAAAATTTAAATTATAATTATTTT TATAGCACGTGATGAAAAGGACCCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCT AAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGT ATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAA ACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGC GGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCG CGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGA GTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATG AGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAAC ATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGAC ACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGC AACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTT TATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCC TCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGCAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAG GTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATT TTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCC ACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTG CAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTA ACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACT CTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTT ACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACA GCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTCC CGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCA GGGGGGAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTC GTCAGGGGGGCCGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTT GCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCT CGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGC CTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGC GCAACGCAATTAATGTGAGTTACCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCCTATGTTGT GTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTCGGAATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGCTAGT

附件6:

pYD1-M2基因序列(SEQ ID NO：6)

ACGGATTAGAAGCCGCCGAGCGGGTGACAGCCCTCCGAAGGAAGACTCTCCTCCGTGCGTCCTCGTCTTCACCGG TCGCGTTCCTGAAACGCAGATGTGCCTCGCGCCGCACTGCTCCGAACAATAAAGATTCTACAATACTAGCTTTTATG GTTATGAAGAGGAAAAATTGGCAGTAACCTGGCCCCACAAACCTTCAAATGAACGAATCAAATTAACAACCATAG GATGATAATGCGATTAGTTTTTTAGCCTTATTTCTGGGGTAATTAATCAGCGAAGCGATGATTTTTGATCTATTAACAG ATATATAAATGCAAAAACTGCATAACCACTTTAACTAATACTTTCAACATTTTCGGTTTGTATTACTTCTTATTCAAAT GTAATAAAAGTATCAACAAAAAATTGTTAATATACCTCTATACTTTAACGTCAAGGAGAAAAAACCCCGGATCGGAC TACTAGCAGCTGTAATACGACTCACTATAGGGAATATTAAGCTAATTCTACTTCATACATTTTCAATTAAGATGCAGTT ACTTCGCTGTTTTTCAATATTTTCTGTTATTGCTTCAGTTTTAGCACAGGAACTGACAACTATATGCGAGCAAATCCC CTCACCAACTTTAGAATCGACGCCGTACTCTTTGTCAACGACTACTATTTTGGCCAACGGGAAGGCAATGCAAGGA GTTTTTGAATATTACAAATCAGTAACGTTTGTCAGTAATTGCGGTTCTCACCCCTCAACAACTAGCAAAGGCAGCCC CATAAACACACAGTATGTTTTTAAGCTTCTGCAGGCTAGTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGT GGTGGTTCTGCTAGCGACAAAATCTGCCTCGGACATCATGCCGTGTCAAACGGAACCAAAGTAAACACATTAACT GAAAGAGGAGTGGAAGTCGTCAATGCAACTGAAACAGTGGAACGAACAAACATCCCCAGGATCTGCTCAAAAGG GAAAAGGACAGTTGACCTCGGTCAATGTGGACTCCTGGGGACAATCACTGGACCACCTCAATGTGACCAATTCCT AGAATTTTCAGCCGATTTAATTATTGAGAGGCGAGAAGGAAGTGATGTCTGTTATCCTGGGAAATTCGTGAATGAA GAAGCTCTGAGGCAAATTCTCAGAGAATCAGGCGGAATTGACAAGGAAGCAATGGGATTCACATACAGTGGAATA AGAACTAATGGAGCAACCAGTGCATGTAGGAGATCAGGATCTTCATTCTATGCAGAAATGAAATGGCTCCTGTCAA ACACAGATGATGCTGCATTCCCGCAGATGACTAAGTCATATAAAAATACAAGAAAAAGCCCAGCTCTAATAGTATG GGGGATCCATCATTCCGTATCAACTGCAGAGCAAACCAAGCTATATGGGAGTGGAAACAAACTGGTGACAGTTGG GAGTTCTAATTATCAACAATCTTTTGTACCGAGTCCAGGAGCGAGACCACAAGTTAATGGTCTATCTGGAAGAATTG ACTTTCATTGGCTAATGCTAAATCCCAATGATACAGTCACTTTCAGTTTCAATGGGGCTTTCATAGCTCCAGACCGT GCAAGCTTCCTGAGAGGAAAATCTATGGGAATCCAGAGTGGAGTACAGGTTGATGCCAATTGTGAAGGGGACTGC TATCATAGTGGAGGGACAATAATAAGTAACTTGCCATTTCAGAACATAGATAGCAGGGCAGTTGGAAAATGTCCGA GATATGTTAAGCAAAGGAGTCTGCTGCTAGCGCGTCTCAAGGCACCAAACGATCCTATGAACAGATGGAAACTGG TGGGGAACGCCAGAATGCTACTAGTCTTCTAACCGAGGTCGAAACGCCTACCAGAACCGGATGGGAGTGCAACTG CAGCGGTTCAAGTGAGCCTCTAGTCGTTGCAGCTAACATTATTGGGATATTGCACTTGATATTGTGGATTCTTGATCG TCTTTTCTTCAAATGCATTTATCGTCGTTTTAAATACGGTTTGAAAAGAGGGCCTTCTACGGAAGGAATGCCTGAGT CTATGAGGGAAGAATATCGGCAGGAACAGCAGAATGCTGTGGATGTTGACGATGGTCATTTTGTCAACATAGAGCT GAAGTAAGAATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGGCGGCCGCTCGAGTCTAGAGGGCCCTTCGAAGGTAAGCCTATC CCTAACCCTCTCCTCGGTCTCGATTCTACGCGTACCGGTCATCATCACCATCACCATTGAGTTTAAACCCGCTGATCT GATAACAACAGTGTAGATGTAACAAAATCGACTTTGTTCCCACTGTACTTTTAGCTCGTACAAAATACAATATACTTT TCATTTCTCCGTAAACAACATGTTTTCCCATGTAATATCCTTTTCTATTTTTCGTTCCGTTACCAACTTTACACATACT TTATATAGCTATTCACTTCTATACACTAAAAAACTAAGACAATTTTAATTTTGCTGCCTGCCATATTTCAATTTGTTATA AATTCCTATAATTTATCCTATTAGTAGCTAAAAAAAGATGAATGTGAATCGAATCCTAAGAGAATTGGGCAAGTGCA CAAACAATACTTAAATAAATACTACTCAGTAATAACCTATTTCTTAGCATTTTTGACGAAATTTGCTATTTTGTTAGAG TCTTTTACACCATTTGTCTCCACACCTCCGCTTACATCAACACCAATAACGCCATTTAATCTAAGCGCATCACCAACA TTTTCTGGCGTCAGTCCACCAGCTAACATAAAATGTAAGCTCTCGGGGCTCTCTTGCCTTCCAACCCAGTCAGAAA TCGAGTTCCAATCCAAAAGTTCACCTGTCCCACCTGCTTCTGAATCAAACAAGGGAATAAACGAATGAGGTTTCTG TGAAGCTGCACTGAGTAGTATGTTGCAGTCTTTTGGAAATACGAGTCTTTTAATAACTGGCAAACCGAGGAACTCT TGGTATTCTTGCCACGACTCATCTCCGTGCAGTTGGACGATATCAATGCCGTAATCATTGACCAGAGCCAAAACATC CTCCTTAGGTTGATTACGAAACACGCCAACCAAGTATTTCGGAGTGCCTGAACTATTTTTATATGCTTTTACAAGACTTGAAATTTTCCTTGCAATAACCGGGTCAATTGTTCTCTTTCTATTGGGCACACATATAATACCCAGCAAGTCAGCAT CGGAATCTAGAGCACATTCTGCGGCCTCTGTGCTCTGCAAGCCGCAAACTTTCACCAATGGACCAGAACTACCTGT GAAATTAATAACAGACATACTCCAAGCTGCCTTTGTGTGCTTAATCACGTATACTCACGTGCTCAATAGTCACCAAT GCCCTCCCTCTTGGCCCTCTCCTTTTCTTTTTTCGACCGAATTTCTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTAT TTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGGACGGATCGCTTGCCTGTAACTTACACGCGCCTCGTATCTT TTAATGATGGAATAATTTGGGAATTTACTCTGTGTTTATTTATTTTTATGTTTTGTATTTGGATTTTAGAAAGTAAATAA AGAAGGTAGAAGAGTTACGGAATGAAGAAAAAAAAATAAACAAAGGTTTAAAAAATTTCAACAAAAAGCGTACT TTACATATATATTTATTAGACAAGAAAAGCAGATTAAATAGATATACATTCGATTAACGATAAGTAAAATGTAAAATCA CAGGATTTTCGTGTGTGGTCTTCTACACAGACAAGATGAAACAATTCGGCATTAATACCTGAGAGCAGGAAGAGCA AGATAAAAGGTAGTATTTGTTGGCGATCCCCCTAGAGTCTTTTACATCTTCGGAAAACAAAAACTATTTTTTCTTTAA TTTCTTTTTTTACTTTCTATTTTTAATTTATATATTTATATTAAAAAATTTAAATTATAATTATTTTTATAGCACGTGATGA AAAGGACCCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATA TGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACAT TTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGT AAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGA GAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTG TTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCAC AGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCG GCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAA CTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAG CAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTG GATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCT GGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTA TCTACACGACGGGCAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAA GCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATC TAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCC CGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCA CCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAG CGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACA TACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAA GACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGA ACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGC GGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGGAACGCCTGGT ATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCCGAGC CTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCC TGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGA CCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGG CCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTG AGTTACCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCCTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGG ATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTCGGAATTAACCCTCACTAAAGGGAACAA AAGCTGGCTAGT。

序列表

<110> 西南交通大学

<120> 一种预防H7N9病毒感染的口服疫苗及其制备方法

<130> GY138-18P1298

<150> 201710461660.3

<151> 2017-06-16

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1632

<212> DNA

<213> HA基因序列(H7N9avian influenza)

<400> 1

atggacaaaa tctgcctcgg acatcatgcc gtgtcaaacg gaaccaaagt aaacacatta 60

actgaaagag gagtggaagt cgtcaatgca actgaaacag tggaacgaac aaacatcccc 120

aggatctgct caaaagggaa aaggacagtt gacctcggtc aatgtggact cctggggaca 180

atcactggac cacctcaatg tgaccaattc ctagaatttt cagccgattt aattattgag 240

aggcgagaag gaagtgatgt ctgttatcct gggaaattcg tgaatgaaga agctctgagg 300

caaattctca gagaatcagg cggaattgac aaggaagcaa tgggattcac atacagtgga 360

ataagaacta atggagcaac cagtgcatgt aggagatcag gatcttcatt ctatgcagaa 420

atgaaatggc tcctgtcaaa cacagatgat gctgcattcc cgcagatgac taagtcatat 480

aaaaatacaa gaaaaagccc agctctaata gtatggggga tccatcattc cgtatcaact 540

gcagagcaaa ccaagctata tgggagtgga aacaaactgg tgacagttgg gagttctaat 600

tatcaacaat cttttgtacc gagtccagga gcgagaccac aagttaatgg tctatctgga 660

agaattgact ttcattggct aatgctaaat cccaatgata cagtcacttt cagtttcaat 720

ggggctttca tagctccaga ccgtgcaagc ttcctgagag gaaaatctat gggaatccag 780

agtggagtac aggttgatgc caattgtgaa ggggactgct atcatagtgg agggacaata 840

ataagtaact tgccatttca gaacatagat agcagggcag ttggaaaatg tccgagatat 900

gttaagcaaa ggagtctgct gctagcaaca gggatgaaga atgttcctga gattccaaag 960

ggaagaggcc tatttggtgc tatagcgggt ttcattgaaa atggatggga aggcctaatt 1020

gatggttggt atggtttcag acaccagaat gcacagggag agggaactgc tgcagattac 1080

aaaagcactc aatcggcaat tgatcaaata acaggaaaat taaaccggct tatagaaaaa 1140

accaaccaac aatttgagtt gatagacaat gaatttaatg aggtagagaa gcaaatcggt 1200

aatgtgataa attggaccag agattctata acagaagtgt ggtcatacaa tgctgaactc 1260

ttggtagcaa tggagaacca gcatacaatt gatctggctg attcagaaat ggacaaactg 1320

tacgaacgag tgaaaagaca gctgagagag aatgctgaag aagatggcac tggttgcttt 1380

gaaatatttc acaagtgtga tgatgactgt atggccagta ttagaaataa cacctatgat 1440

cacagcaaat acagggaaga ggcaatgcaa aatagaatac agattgaccc agtcaaacta 1500

agcagcggct acaaagatgt gatactttgg tttagcttcg gggcatcatg tttcatactt 1560

ctagccattg taatgggcct tgtcttcata tgtgtaaaga atggaaacat gcggtgcact 1620

atttgtatat aa 1632

<210> 2

<211> 1497

<212> DNA

<213> NP基因序列 (H7N9avian influenza)

<400> 2

atggcgtctc aaggcaccaa acgatcctat gaacagatgg aaactggtgg ggaacgccag 60

aatgctactg agatcagggc atctgttgga agaatggtta gcggcattgg gagattctac 120

atacagatgt gtacagaact caaactcagt gacaatgaag ggaggctgat tcagaacagt 180

ataacaatag agagaatggt actctctgca tttgatgaaa gaaggaacag atacctggaa 240

gagcacccca gtgcaggaaa ggaccctaag aaaactggag gtccaattta caggagaaga 300

gacggaaaat gggtgagaga gctgatcctg tatgacaaag aggaaatcag gagaatttgg 360

cgacaagcga acaatggaga ggatgcaact gctggtctta cccatctgat gatatggcat 420

tccaacctga atgatgctac ctatcagaga acgagagctc tcgtgcgtac tggaatggat 480

ccccggatgt gctctctgat gcaaggatca actctcccga ggagatctgg agctgcaggt 540

gcagcagtga aggggatagg gacaatggtg atggaactga ttcggatgat aaaacgaggg 600

atcaacgacc ggaatttctg gagaggcgaa aatggaagaa ggacaagaat tgcatatgag 660

agaatgtgca acatcctcaa agggaaattc caaacagcag cacaaagggc aatgatggat 720

caagtgcgag agagcagaaa tcctgggaat gctgaaatag aagatctcat ttttctggca 780

aggtctgcac tcatcctgag aggatcagtg gctcataaat cctgcttgcc tgcttgtgtg 840

tacggacttg cagtggctag tggatatgac tttgagagag aagggtactc cttggttgga 900

atagatcctt tccgtctgct tcaaaacagc caggtcttta gtctcattag accaaatgag 960

aacccagcac ataagagcca actagtgtgg atggcatgcc actctgcagc gtttgaggac 1020

cttagggtct caagtttcat tagagggaca agaatggtcc caagaggaca gctatccact 1080

agaggggttc aaattgcttc aaatgagaac atggaagcaa tggactccaa tactcttgaa 1140

ctgagaagta gatattgggc tataagaacc agaagcggag ggaacaccaa ccaacagagg 1200

gcatctgcag gacaggtcag cgttcaaccc actttctcag tacagagaaa ccttcctttc 1260

gaaagagcaa ccattatggc agcatttaca ggaaatactg agggtagaac gtctgacatg 1320

aggactgaaa tcataagaat gatggaaagt gccagaccag aagatgtgtc attccagggg 1380

cggggagtct tcgagctctc ggacgaaaag gcaacgaacc cgatcgtgcc ttcctttgac 1440

atgaataatg aaggatctta tttcttcgga gacaatgcag aggagtatga caattaa 1497

<210> 3

<211> 294

<212> DNA

<213> M2基因序列(H7N9avian influenza)

<400> 3

atgagtcttc taaccgaggt cgaaacgcct accagaaccg gatgggagtg caactgcagc 60

ggttcaagtg agcctctagt cgttgcagct aacattattg ggatattgca cttgatattg 120

tggattcttg atcgtctttt cttcaaatgc atttatcgtc gttttaaata cggtttgaaa 180

agagggcctt ctacggaagg aatgcctgag tctatgaggg aagaatatcg gcaggaacag 240

cagaatgctg tggatgttga cgatggtcat tttgtcaaca tagagctgaa gtaa 294

<210> 4

<211> 7555

<212> DNA

<213> pYD1-HA基因序列(artificial)

<400> 4

acggattaga agccgccgag cgggtgacag ccctccgaag gaagactctc ctccgtgcgt 60

cctcgtcttc accggtcgcg ttcctgaaac gcagatgtgc ctcgcgccgc actgctccga 120

acaataaaga ttctacaata ctagctttta tggttatgaa gaggaaaaat tggcagtaac 180

ctggccccac aaaccttcaa atgaacgaat caaattaaca accataggat gataatgcga 240

ttagtttttt agccttattt ctggggtaat taatcagcga agcgatgatt tttgatctat 300

taacagatat ataaatgcaa aaactgcata accactttaa ctaatacttt caacattttc 360

ggtttgtatt acttcttatt caaatgtaat aaaagtatca acaaaaaatt gttaatatac 420

ctctatactt taacgtcaag gagaaaaaac cccggatcgg actactagca gctgtaatac 480

gactcactat agggaatatt aagctaattc tacttcatac attttcaatt aagatgcagt 540

tacttcgctg tttttcaata ttttctgtta ttgcttcagt tttagcacag gaactgacaa 600

ctatatgcga gcaaatcccc tcaccaactt tagaatcgac gccgtactct ttgtcaacga 660

ctactatttt ggccaacggg aaggcaatgc aaggagtttt tgaatattac aaatcagtaa 720

cgtttgtcag taattgcggt tctcacccct caacaactag caaaggcagc cccataaaca 780

cacagtatgt ttttaagctt ctgcaggcta gtggtggtgg tggttctggt ggtggtggtt 840

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cagccgattt aattattgag aggcgagaag gaagtgatgt ctgttatcct gggaaattcg 1140

tgaatgaaga agctctgagg caaattctca gagaatcagg cggaattgac aaggaagcaa 1200

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ttggaaaatg tccgagatat gttaagcaaa ggagtctgct gctagcgcgt ctcaaggcac 1800

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caagctatat gggagtggaa acaaactggt gacagttggg agttctaatt atcaacaatc 2460

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gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac 7200

cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt 7260

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aattaatgtg agttacctca ctcattaggc accccaggct ttacacttta tgcttccggc 7440

tcctatgttg tgtggaattg tgagcggata acaatttcac acaggaaaca gctatgacca 7500

tgattacgcc aagctcggaa ttaaccctca ctaaagggaa caaaagctgg ctagt 7555

<210> 5

<211> 7354

<212> DNA

<213> pYD1-NP基因序列(artificial)

<400> 5

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cctcgtcttc accggtcgcg ttcctgaaac gcagatgtgc ctcgcgccgc actgctccga 120

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ttagtttttt agccttattt ctggggtaat taatcagcga agcgatgatt tttgatctat 300

taacagatat ataaatgcaa aaactgcata accactttaa ctaatacttt caacattttc 360

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ctctatactt taacgtcaag gagaaaaaac cccggatcgg actactagca gctgtaatac 480

gactcactat agggaatatt aagctaattc tacttcatac attttcaatt aagatgcagt 540

tacttcgctg tttttcaata ttttctgtta ttgcttcagt tttagcacag gaactgacaa 600

ctatatgcga gcaaatcccc tcaccaactt tagaatcgac gccgtactct ttgtcaacga 660

ctactatttt ggccaacggg aaggcaatgc aaggagtttt tgaatattac aaatcagtaa 720

cgtttgtcag taattgcggt tctcacccct caacaactag caaaggcagc cccataaaca 780

cacagtatgt ttttaagctt ctgcaggcta gtggtggtgg tggttctggt ggtggtggtt 840

ctggtggtgg tggttctgct agcgacaaaa tctgcctcgg acatcatgcc gtgtcaaacg 900

gaaccaaagt aaacacatta actgaaagag gagtggaagt cgtcaatgca actgaaacag 960

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aatgtggact cctggggaca atcactggac cacctcaatg tgaccaattc ctagaatttt 1080

cagccgattt aattattgag aggcgagaag gaagtgatgt ctgttatcct gggaaattcg 1140

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gatcttcatt ctatgcagaa atgaaatggc tcctgtcaaa cacagatgat gctgcattcc 1320

cgcagatgac taagtcatat aaaaatacaa gaaaaagccc agctctaata gtatggggga 1380

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tatccttttc tatttttcgt tccgttacca actttacaca tactttatat agctattcac 3600

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cccaatacgc aaaccgcctc tccccgcgcg ttggccgatt cattaatgca gctggcacga 7140

caggtttccc gactggaaag cgggcagtga gcgcaacgca attaatgtga gttacctcac 7200

tcattaggca ccccaggctt tacactttat gcttccggct cctatgttgt gtggaattgt 7260

gagcggataa caatttcaca caggaaacag ctatgaccat gattacgcca agctcggaat 7320

taaccctcac taaagggaac aaaagctggc tagt 7354

<210> 6

<211> 6217

<212> DNA

<213> pYD1-M2基因序列(artificial)

<400> 6

acggattaga agccgccgag cgggtgacag ccctccgaag gaagactctc ctccgtgcgt 60

cctcgtcttc accggtcgcg ttcctgaaac gcagatgtgc ctcgcgccgc actgctccga 120

acaataaaga ttctacaata ctagctttta tggttatgaa gaggaaaaat tggcagtaac 180

ctggccccac aaaccttcaa atgaacgaat caaattaaca accataggat gataatgcga 240

ttagtttttt agccttattt ctggggtaat taatcagcga agcgatgatt tttgatctat 300

taacagatat ataaatgcaa aaactgcata accactttaa ctaatacttt caacattttc 360

ggtttgtatt acttcttatt caaatgtaat aaaagtatca acaaaaaatt gttaatatac 420

ctctatactt taacgtcaag gagaaaaaac cccggatcgg actactagca gctgtaatac 480

gactcactat agggaatatt aagctaattc tacttcatac attttcaatt aagatgcagt 540

tacttcgctg tttttcaata ttttctgtta ttgcttcagt tttagcacag gaactgacaa 600

ctatatgcga gcaaatcccc tcaccaactt tagaatcgac gccgtactct ttgtcaacga 660

ctactatttt ggccaacggg aaggcaatgc aaggagtttt tgaatattac aaatcagtaa 720

cgtttgtcag taattgcggt tctcacccct caacaactag caaaggcagc cccataaaca 780

cacagtatgt ttttaagctt ctgcaggcta gtggtggtgg tggttctggt ggtggtggtt 840

ctggtggtgg tggttctgct agcgacaaaa tctgcctcgg acatcatgcc gtgtcaaacg 900

gaaccaaagt aaacacatta actgaaagag gagtggaagt cgtcaatgca actgaaacag 960

tggaacgaac aaacatcccc aggatctgct caaaagggaa aaggacagtt gacctcggtc 1020

aatgtggact cctggggaca atcactggac cacctcaatg tgaccaattc ctagaatttt 1080

cagccgattt aattattgag aggcgagaag gaagtgatgt ctgttatcct gggaaattcg 1140

tgaatgaaga agctctgagg caaattctca gagaatcagg cggaattgac aaggaagcaa 1200

tgggattcac atacagtgga ataagaacta atggagcaac cagtgcatgt aggagatcag 1260

gatcttcatt ctatgcagaa atgaaatggc tcctgtcaaa cacagatgat gctgcattcc 1320

cgcagatgac taagtcatat aaaaatacaa gaaaaagccc agctctaata gtatggggga 1380

tccatcattc cgtatcaact gcagagcaaa ccaagctata tgggagtgga aacaaactgg 1440

tgacagttgg gagttctaat tatcaacaat cttttgtacc gagtccagga gcgagaccac 1500

aagttaatgg tctatctgga agaattgact ttcattggct aatgctaaat cccaatgata 1560

cagtcacttt cagtttcaat ggggctttca tagctccaga ccgtgcaagc ttcctgagag 1620

gaaaatctat gggaatccag agtggagtac aggttgatgc caattgtgaa ggggactgct 1680

atcatagtgg agggacaata ataagtaact tgccatttca gaacatagat agcagggcag 1740

ttggaaaatg tccgagatat gttaagcaaa ggagtctgct gctagcgcgt ctcaaggcac 1800

caaacgatcc tatgaacaga tggaaactgg tggggaacgc cagaatgcta ctagtcttct 1860

aaccgaggtc gaaacgccta ccagaaccgg atgggagtgc aactgcagcg gttcaagtga 1920

gcctctagtc gttgcagcta acattattgg gatattgcac ttgatattgt ggattcttga 1980

tcgtcttttc ttcaaatgca tttatcgtcg ttttaaatac ggtttgaaaa gagggccttc 2040

tacggaagga atgcctgagt ctatgaggga agaatatcgg caggaacagc agaatgctgt 2100

ggatgttgac gatggtcatt ttgtcaacat agagctgaag taagaattct gcagatatcc 2160

agcacagtgg cggccgctcg agtctagagg gcccttcgaa ggtaagccta tccctaaccc 2220

tctcctcggt ctcgattcta cgcgtaccgg tcatcatcac catcaccatt gagtttaaac 2280

ccgctgatct gataacaaca gtgtagatgt aacaaaatcg actttgttcc cactgtactt 2340

ttagctcgta caaaatacaa tatacttttc atttctccgt aaacaacatg ttttcccatg 2400

taatatcctt ttctattttt cgttccgtta ccaactttac acatacttta tatagctatt 2460

cacttctata cactaaaaaa ctaagacaat tttaattttg ctgcctgcca tatttcaatt 2520

tgttataaat tcctataatt tatcctatta gtagctaaaa aaagatgaat gtgaatcgaa 2580

tcctaagaga attgggcaag tgcacaaaca atacttaaat aaatactact cagtaataac 2640

ctatttctta gcatttttga cgaaatttgc tattttgtta gagtctttta caccatttgt 2700

ctccacacct ccgcttacat caacaccaat aacgccattt aatctaagcg catcaccaac 2760

attttctggc gtcagtccac cagctaacat aaaatgtaag ctctcggggc tctcttgcct 2820

tccaacccag tcagaaatcg agttccaatc caaaagttca cctgtcccac ctgcttctga 2880

atcaaacaag ggaataaacg aatgaggttt ctgtgaagct gcactgagta gtatgttgca 2940

gtcttttgga aatacgagtc ttttaataac tggcaaaccg aggaactctt ggtattcttg 3000

ccacgactca tctccgtgca gttggacgat atcaatgccg taatcattga ccagagccaa 3060

aacatcctcc ttaggttgat tacgaaacac gccaaccaag tatttcggag tgcctgaact 3120

atttttatat gcttttacaa gacttgaaat tttccttgca ataaccgggt caattgttct 3180

ctttctattg ggcacacata taatacccag caagtcagca tcggaatcta gagcacattc 3240

tgcggcctct gtgctctgca agccgcaaac tttcaccaat ggaccagaac tacctgtgaa 3300

attaataaca gacatactcc aagctgcctt tgtgtgctta atcacgtata ctcacgtgct 3360

caatagtcac caatgccctc cctcttggcc ctctcctttt cttttttcga ccgaatttct 3420

tgaagacgaa agggcctcgt gatacgccta tttttatagg ttaatgtcat gataataatg 3480

gtttcttagg acggatcgct tgcctgtaac ttacacgcgc ctcgtatctt ttaatgatgg 3540

aataatttgg gaatttactc tgtgtttatt tatttttatg ttttgtattt ggattttaga 3600

aagtaaataa agaaggtaga agagttacgg aatgaagaaa aaaaaataaa caaaggttta 3660

aaaaatttca acaaaaagcg tactttacat atatatttat tagacaagaa aagcagatta 3720

aatagatata cattcgatta acgataagta aaatgtaaaa tcacaggatt ttcgtgtgtg 3780

gtcttctaca cagacaagat gaaacaattc ggcattaata cctgagagca ggaagagcaa 3840

gataaaaggt agtatttgtt ggcgatcccc ctagagtctt ttacatcttc ggaaaacaaa 3900

aactattttt tctttaattt ctttttttac tttctatttt taatttatat atttatatta 3960

aaaaatttaa attataatta tttttatagc acgtgatgaa aaggacccag gtggcacttt 4020

tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 4080

tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat 4140

gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt 4200

ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg 4260

agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga 4320

agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg 4380

tgttgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt 4440

tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg 4500

cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg 4560

aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga 4620

tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc 4680

tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc 4740

ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc 4800

ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg 4860

cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac 4920

gacgggcagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc 4980

actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt 5040

aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac 5100

caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa 5160

aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc 5220

accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt 5280

aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg 5340

ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc 5400

agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt 5460

accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga 5520

gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag cattgagaaa gcgccacgct 5580

tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg 5640

cacgagggag cttccagggg ggaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca 5700

cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggccgagcc tatggaaaaa 5760

cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt 5820

ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 5880

taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 5940

gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 6000

cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttacct 6060

cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcctatgt tgtgtggaat 6120

tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg ccaagctcgg 6180

aattaaccct cactaaaggg aacaaaagct ggctagt 6217

<210> 7

<211> 543

<212> PRT

<213> HA基因编码的氨基酸序列(H7N9avian influenza)

<400> 7

Met Asp Lys Ile Cys Leu Gly His His Ala Val Ser Asn Gly Thr Lys

1 5 10 15

Val Asn Thr Leu Thr Glu Arg Gly Val Glu Val Val Asn Ala Thr Glu

20 25 30

Thr Val Glu Arg Thr Asn Ile Pro Arg Ile Cys Ser Lys Gly Lys Arg

35 40 45

Thr Val Asp Leu Gly Gln Cys Gly Leu Leu Gly Thr Ile Thr Gly Pro

50 55 60

Pro Gln Cys Asp Gln Phe Leu Glu Phe Ser Ala Asp Leu Ile Ile Glu

65 70 75 80

Arg Arg Glu Gly Ser Asp Val Cys Tyr Pro Gly Lys Phe Val Asn Glu

85 90 95

Glu Ala Leu Arg Gln Ile Leu Arg Glu Ser Gly Gly Ile Asp Lys Glu

100 105 110

Ala Met Gly Phe Thr Tyr Ser Gly Ile Arg Thr Asn Gly Ala Thr Ser

115 120 125

Ala Cys Arg Arg Ser Gly Ser Ser Phe Tyr Ala Glu Met Lys Trp Leu

130 135 140

Leu Ser Asn Thr Asp Asp Ala Ala Phe Pro Gln Met Thr Lys Ser Tyr

145 150 155 160

Lys Asn Thr Arg Lys Ser Pro Ala Leu Ile Val Trp Gly Ile His His

165 170 175

Ser Val Ser Thr Ala Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gly Ser Gly Asn Lys

180 185 190

Leu Val Thr Val Gly Ser Ser Asn Tyr Gln Gln Ser Phe Val Pro Ser

195 200 205

Pro Gly Ala Arg Pro Gln Val Asn Gly Leu Ser Gly Arg Ile Asp Phe

210 215 220

His Trp Leu Met Leu Asn Pro Asn Asp Thr Val Thr Phe Ser Phe Asn

225 230 235 240

Gly Ala Phe Ile Ala Pro Asp Arg Ala Ser Phe Leu Arg Gly Lys Ser

245 250 255

Met Gly Ile Gln Ser Gly Val Gln Val Asp Ala Asn Cys Glu Gly Asp

260 265 270

Cys Tyr His Ser Gly Gly Thr Ile Ile Ser Asn Leu Pro Phe Gln Asn

275 280 285

Ile Asp Ser Arg Ala Val Gly Lys Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gln Arg

290 295 300

Ser Leu Leu Leu Ala Thr Gly Met Lys Asn Val Pro Glu Ile Pro Lys

305 310 315 320

Gly Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp

325 330 335

Glu Gly Leu Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ala Gln

340 345 350

Gly Glu Gly Thr Ala Ala Asp Tyr Lys Ser Thr Gln Ser Ala Ile Asp

355 360 365

Gln Ile Thr Gly Lys Leu Asn Arg Leu Ile Glu Lys Thr Asn Gln Gln

370 375 380

Phe Glu Leu Ile Asp Asn Glu Phe Asn Glu Val Glu Lys Gln Ile Gly

385 390 395 400

Asn Val Ile Asn Trp Thr Arg Asp Ser Ile Thr Glu Val Trp Ser Tyr

405 410 415

Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Met Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu

420 425 430

Ala Asp Ser Glu Met Asp Lys Leu Tyr Glu Arg Val Lys Arg Gln Leu

435 440 445

Arg Glu Asn Ala Glu Glu Asp Gly Thr Gly Cys Phe Glu Ile Phe His

450 455 460

Lys Cys Asp Asp Asp Cys Met Ala Ser Ile Arg Asn Asn Thr Tyr Asp

465 470 475 480

His Ser Lys Tyr Arg Glu Glu Ala Met Gln Asn Arg Ile Gln Ile Asp

485 490 495

Pro Val Lys Leu Ser Ser Gly Tyr Lys Asp Val Ile Leu Trp Phe Ser

500 505 510

Phe Gly Ala Ser Cys Phe Ile Leu Leu Ala Ile Val Met Gly Leu Val

515 520 525

Phe Ile Cys Val Lys Asn Gly Asn Met Arg Cys Thr Ile Cys Ile

530 535 540

<210> 8

<211> 498

<212> PRT

<213> NP基因编码的氨基酸序列(H7N9avian influenza)

<400> 8

Met Ala Ser Gln Gly Thr Lys Arg Ser Tyr Glu Gln Met Glu Thr Gly

1 5 10 15

Gly Glu Arg Gln Asn Ala Thr Glu Ile Arg Ala Ser Val Gly Arg Met

20 25 30

Val Ser Gly Ile Gly Arg Phe Tyr Ile Gln Met Cys Thr Glu Leu Lys

35 40 45

Leu Ser Asp Asn Glu Gly Arg Leu Ile Gln Asn Ser Ile Thr Ile Glu

50 55 60

Arg Met Val Leu Ser Ala Phe Asp Glu Arg Arg Asn Arg Tyr Leu Glu

65 70 75 80

Glu His Pro Ser Ala Gly Lys Asp Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Ile

85 90 95

Tyr Arg Arg Arg Asp Gly Lys Trp Val Arg Glu Leu Ile Leu Tyr Asp

100 105 110

Lys Glu Glu Ile Arg Arg Ile Trp Arg Gln Ala Asn Asn Gly Glu Asp

115 120 125

Ala Thr Ala Gly Leu Thr His Leu Met Ile Trp His Ser Asn Leu Asn

130 135 140

Asp Ala Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Thr Gly Met Asp

145 150 155 160

Pro Arg Met Cys Ser Leu Met Gln Gly Ser Thr Leu Pro Arg Arg Ser

165 170 175

Gly Ala Ala Gly Ala Ala Val Lys Gly Ile Gly Thr Met Val Met Glu

180 185 190

Leu Ile Arg Met Ile Lys Arg Gly Ile Asn Asp Arg Asn Phe Trp Arg

195 200 205

Gly Glu Asn Gly Arg Arg Thr Arg Ile Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn

210 215 220

Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Thr Ala Ala Gln Arg Ala Met Met Asp

225 230 235 240

Gln Val Arg Glu Ser Arg Asn Pro Gly Asn Ala Glu Ile Glu Asp Leu

245 250 255

Ile Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Ile Leu Arg Gly Ser Val Ala His

260 265 270

Lys Ser Cys Leu Pro Ala Cys Val Tyr Gly Leu Ala Val Ala Ser Gly

275 280 285

Tyr Asp Phe Glu Arg Glu Gly Tyr Ser Leu Val Gly Ile Asp Pro Phe

290 295 300

Arg Leu Leu Gln Asn Ser Gln Val Phe Ser Leu Ile Arg Pro Asn Glu

305 310 315 320

Asn Pro Ala His Lys Ser Gln Leu Val Trp Met Ala Cys His Ser Ala

325 330 335

Ala Phe Glu Asp Leu Arg Val Ser Ser Phe Ile Arg Gly Thr Arg Met

340 345 350

Val Pro Arg Gly Gln Leu Ser Thr Arg Gly Val Gln Ile Ala Ser Asn

355 360 365

Glu Asn Met Glu Ala Met Asp Ser Asn Thr Leu Glu Leu Arg Ser Arg

370 375 380

Tyr Trp Ala Ile Arg Thr Arg Ser Gly Gly Asn Thr Asn Gln Gln Arg

385 390 395 400

Ala Ser Ala Gly Gln Val Ser Val Gln Pro Thr Phe Ser Val Gln Arg

405 410 415

Asn Leu Pro Phe Glu Arg Ala Thr Ile Met Ala Ala Phe Thr Gly Asn

420 425 430

Thr Glu Gly Arg Thr Ser Asp Met Arg Thr Glu Ile Ile Arg Met Met

435 440 445

Glu Ser Ala Arg Pro Glu Asp Val Ser Phe Gln Gly Arg Gly Val Phe

450 455 460

Glu Leu Ser Asp Glu Lys Ala Thr Asn Pro Ile Val Pro Ser Phe Asp

465 470 475 480

Met Asn Asn Glu Gly Ser Tyr Phe Phe Gly Asp Asn Ala Glu Glu Tyr

485 490 495

Asp Asn

<210> 9

<211> 97

<212> PRT

<213> M2基因编码的氨基酸序列(H7N9avian influenza)

<400> 9

Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Thr Gly Trp Glu

1 5 10 15

Cys Asn Cys Ser Gly Ser Ser Glu Pro Leu Val Val Ala Ala Asn Ile

20 25 30

Ile Gly Ile Leu His Leu Ile Leu Trp Ile Leu Asp Arg Leu Phe Phe

35 40 45

Lys Cys Ile Tyr Arg Arg Phe Lys Tyr Gly Leu Lys Arg Gly Pro Ser

50 55 60

Thr Glu Gly Met Pro Glu Ser Met Arg Glu Glu Tyr Arg Gln Glu Gln

65 70 75 80

Gln Asn Ala Val Asp Val Asp Asp Gly His Phe Val Asn Ile Glu Leu

85 90 95

Lys

<210> 10

<211> 37

<212> DNA

<213> F-1（artificial）

<400> 10

ctagctagcg ttttagcagc tggtgacaaa atctgcc 37

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> R-1（artificial）

<400> 11

ccggaattct atacaaatag t 21

Claims (10)

1.一种重组质粒，其特征在于：它是含有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或者SEQ ID NO：3所述核苷酸序列的重组pYD1质粒或者重组pYD5质粒。

2.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于：所述SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或者SEQ ID NO：3所述核苷酸序列位于pYD1质粒的C端，或者位于pYD5质粒的N端；优选地，所述重组质粒的序列如SEQ ID NO：4～6任意一项所示。

3.一种重组酵母菌，其特征在于：它是含有权利要求1或2所述的重组质粒的酵母菌。

4.根据权利要求3所述的重组酵母菌，其特征在于：所述酵母菌是S.cerevisiae EBY100。

5.权利要求3或4所述的重组酵母菌在制备预防H7N9病毒感染的疫苗中的用途。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述疫苗为口服疫苗。

7.一种预防H7N9病毒感染的疫苗，其特征在于：它是以权利要求3或4所述的重组酵母菌为活性成分，加上药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。

8.根据权利要求7所述的疫苗，其特征在于：所述制剂是口服制剂。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述辅助性成分为肠溶性胶囊。

10.一种制备预防H7N9病毒感染的重组酵母菌的方法，其特征在于：步骤如下：

(1)取H7N9病毒的基因或者基因片段，与pYD1质粒或者pYD5质粒连接；

(2)导入感受态酵母菌中，即可。