CN112501139B - 一株重组新城疫病毒毒株及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株重组新城疫病毒毒株及其制备方法和应用，属于基因工程领域。本发明公开的一株重组新城疫病毒毒株，为将VP2蛋白的编码基因和鸡IgG的Fc通过GS linker连接插入到鸡新城疫病毒毒株Clone30基因组的F和HN基因之间得到的重组病毒株。本发明通过在现有新城疫活疫苗基因组中引入鸡传染性法氏囊超强毒株的VP2‑Fc基因片段，在有效保护鸡群免受新城疫的入侵的同时，可以产生较高的鸡传染性法氏囊病的抗体，可以达到有效免疫效果和保护作用；本发明对于鸡传染性法氏囊病和新城疫的防治具有重大价值。

Description

一株重组新城疫病毒毒株及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，更具体的说是涉及一株重组新城疫病毒毒株及其制备方法和应用。
背景技术
传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)和新城疫(NewcastleDisease,ND)为禽类2种重大疫病。自上世纪80年代以来，欧洲及我国相继出现IBDV超强毒株的流行，该病能够引起鸡免疫机能障碍，对其他疾病的易感性增加；新城疫具有很高的发病率和病死率，也给养禽业造成重大经济损失。因此，预防和控制这两种烈性传染病对养禽业的发展有重要意义。
IBD疫苗接种后对鸡的法氏囊产生一定的破坏作用，从而影响其它疫苗的免疫效果。因此使用法氏囊卵黄抗体进行被动免疫已经成为预防和治疗IBDV感染的常规手段。然而，法氏囊卵黄抗体除了成本高外，还存在严重的垂直和水平传播疾病的风险。此外，用动物材料生产生物制品给质量控制带来无法克服的困难。
按照传统方法进行单苗免疫，既费时又费力。随着反向遗传操作技术的成熟，表达外源保护性抗原基因的重组NDV二联或载体疫苗取得了一定的进展。在实践免疫过程中，表达的外源保护性抗原的免疫效果不理想，其原因主要是外源基因在脱离病原体后半衰期变短，少则几分钟，多不过数小时，所以抗原浓度很难达到引起足够的抗体反应的程度。
传染性法氏囊病是一种由鸡传染性法氏囊病病毒引起的危害3-12周龄青年鸡的急性、高度接触性传染病。IBDV属于双RNA病毒科的禽双RNA病毒属，其基因组由A和B两个节段组成。研究表明，VP2蛋白具有血清型特异性位点，VP2能诱导产生具有保护性的中和抗体，并能诱导产生抗病毒的血清中和抗体，是该病毒的主要抗原。
免疫球蛋白IgG在体内的半衰期为20d，其稳定性是由于IgG的Fc片段与新生Fc受体(FcRn)结合，避免IgG进入溶酶体中被降解。因此，IgG的Fc片段被用来与活性蛋白连接构成融合蛋白，以提高活性蛋白的体内半衰期，达到长效的目的。NDV作为一种活病毒载体具有独特的优势，其安全性和有效性均已被充分证明，而且目前新城疫病毒的反向遗传操作系统现已成熟。
因此，提供一株重组新城疫病毒毒株用于预防鸡新城疫和鸡传染性法氏囊病是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一株重组新城疫病毒毒株及其制备方法和应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一株重组新城疫病毒毒株rClone30-VP2-Fc，为将VP2蛋白的编码基因和鸡IgG的Fc通过GS linker连接插入到鸡新城疫病毒毒株Clone30基因组的F和HN基因之间得到的重组病毒株；所述rClone30-VP2-Fc病毒的基因组序列为SEQ ID NO.2自5’末端第2703-20322位核苷酸序列。
进一步，一株重组新城疫病毒毒株rClone30-VP2-Fc的制备方法，具体步骤如下：
(1)合成VP2-Fc的双链DNA分子，如SEQ ID NO.1所示；
(2)分别采用限制性内切酶Hpa I和Mlu I双酶切步骤(1)的双链DNA分子和pClone30质粒，回收，连接，得到重组质粒pClone30-VP2-Fc；
(3)将重组质粒pClone30-VP2-Fc以及相应的辅助质粒pBL-N、pBL-P和pBL-L共转染BHK-21细胞，置于5％CO2、37℃条件中静置培养72h；
(4)取步骤(3)得到的转染细胞，于-80℃反复冻融3次，离心收取细胞上清液，然后接种于9-11日龄SPF鸡胚，37℃培养72h，收集鸡胚尿囊液；
(5)取步骤(4)得到的鸡胚尿囊液，接种于新的9-11日龄SPF鸡胚，37℃培养72h，收集鸡胚尿囊液；
(6)取步骤(5)得到的鸡胚尿囊液，接种于新的9-11日龄SPF鸡胚，37℃培养72h，收集鸡胚尿囊液；
(7)将步骤(5)和步骤(6)得到的鸡胚尿囊液混合，得到混合液，为rClone30-VP2-Fc病毒液。
进一步，重组新城疫病毒毒株rClone30-VP2-Fc在制备鸡传染性法氏囊病疫苗中的应用。
本发明提供的一株重组新城疫病毒毒株，命名为rClone30-VP2-Fc，毒株rClone30-VP2-Fc。所述毒株rClone30-VP2-Fc是将VP2蛋白的编码基因和鸡IgG的Fc通过GSlinker连接插入到鸡新城疫病毒毒株Clone30(简称毒株Clone30，弱毒株，为现有的新城疫病活疫苗)的基因组的F和HN基因之间得到的重组病毒株。病毒株rClone30-VP2-Fc免疫鸡群后，可以表达VP2-Fc融合蛋白，延长VP2的半衰期，能在较长时间激发鸡体内产生保护性抗体，同时达到有效预防新城疫和传染性法氏囊。
本发明构建的重组新城疫病毒可视为基因工程改造后的弱毒疫苗株，可制备为任何常规制剂，如冻干粉针制剂、液体疫苗制剂等。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一株重组新城疫病毒毒株及其制备方法和应用，本发明通过在现有新城疫活疫苗基因组中引入鸡传染性法氏囊超强毒株的VP2-Fc基因片段，在有效保护鸡群免受新城疫入侵的同时，可以产生较高的鸡传染性法氏囊病的抗体，可以达到有效免疫效果和保护作用；本发明对于鸡传染性法氏囊病和新城疫的防治具有重大价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明重组质粒pClone30-VP2-Fc的元件示意图；
图2附图为本发明实施例1中的PCR鉴定电泳图；
其中，M，marker；1，模板为水的阴性对照；2，重组病毒rClone30的VP2-Fc片段的RT-PCR结果；3，重组病毒rClone30-VP2-Fc中VP2-Fc片段的RT-PCR结果；
图3附图为本发明实施例1中的HA试验结果；
图4附图为本发明实施例1中的HI试验结果；
图5附图为本发明实施例2重组病毒中VP2-Fc基因片段的mRNA表达水平；
图6附图为本发明实施例3中重组病毒的细胞增殖稳定性的测定；
图7附图为本发明实施例4中重组病毒毒株免疫后抗NDV的抗体水平检测结果；
图8附图为本发明实施例4中重组病毒毒株免疫后抗IBDV的抗体水平检测结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
pClone30质粒来源参见“何金娇,刘雪莹,吴云舟,郭茉,韩晓辉,尹杰超,安莹,任桂萍,李德山.基于内部核糖体进入位点提高重组NDV表达IBDV VP2基因的研究[J].中国预防兽医学报,2013,6:485-489.”。该质粒中具有新城疫病毒的NP基因、P基因、M基因、F基因、HN基因和L基因，其中F基因和HN基因之间具有HpaI和MluI酶切识别位点。将pClone30质粒以及相应的辅助质粒pBL-N、pBL-P和pBL-L共转染哺乳动物细胞BHK-21并培养，得到毒株Clone30。
BHK-21细胞：ATCC编号为CRL-13001。
DF-1细胞：ATCC编号为CRL-12203。
SPF级白色来航鸡：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。
实施例中所用的新城疫强毒株为F48E9株，提及该毒株的文献：NDV强毒株F48E9：秦智峰，刘建利，卢体康，林庆燕，吕建强，曹琛福等.基于锁核酸探针的双重荧光实时RT-PCR检测方法鉴别新城疫中强毒株与弱毒株.中国预防兽医学报.2012,34(9):719-723。
实施例中所用的IBDV超强毒株为HLJ0504株，提及该毒株的文献：高立，祁小乐，高玉龙，高宏雷，秦立廷，邓小芸，宇文延青，王笑梅.传染性法氏囊病病毒超强毒株HLJ0504全基因组克隆及其新特征分析.中国预防兽医学报.2010,32(5):401-404。
完全培养基即为含有10％胎牛血清的DMEM培养基。
实施例1rClone30-VP2-Fc病毒液的制备
(一)重组质粒pClone30-VP2-Fc的构建
(1)合成SEQ ID NO.1所示的双链DNA分子
SEQ ID NO.1中，自5’末端第1至6位核苷酸为限制性内切酶Hpa I的识别序列，第7-12位核苷酸为Kozac序列，第13至1338位核苷酸为VP2蛋白的编码基因，第1339至1383位核苷酸为GS linker的识别序列，第1384至1396位核苷酸为限制性内切核酸酶Sfi I的识别序列，第1397至2364位核苷酸为鸡IgG Fc片段的序列，第2365至2370位核苷酸为限制性核酸内切酶Mlu I的识别序列。
(2)采用限制性内切酶Hpa I和Mlu I双酶切步骤(1)得到的双链DNA片段，回收酶切产物中的目的片段。
(3)采用限制性内切酶Hpa I和Mlu I双酶切pClone30质粒，回收约16000bp的载体片段。
(4)将步骤(2)的酶切产物片段和步骤(3)的载体片段进行连接，得到重组质粒pClone30-VP2-Fc。重组质粒pClone30-VP2-Fc的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示(SEQ IDNO.2中，自5’末端第2703-20322位核苷酸为rClone30-VP2-Fc病毒的基因组)。重组质粒pClone30-VP2-Fc的元件示意图见图1。
(二)重组病毒的制备
(1)将重组质粒pClone30-VP2-Fc以及相应的辅助质粒pBL-N、pBL-P和pBL-L共转染BHK-21细胞(每1×106个细胞约转染1μg重组质粒pClone30-VP2-Fc、0.5μg pBL-N质粒、0.25μg pBL-P质粒和0.1μg pBL-L质粒)，置于5％CO2、37℃条件中静置培养72h。
(2)取步骤(1)得到的转染细胞，于-80℃反复冻融3次，离心收取细胞上清液，然后接种于9-11日龄SPF鸡胚，37℃培养72h，收集鸡胚尿囊液。
(3)取步骤(2)得到的鸡胚尿囊液，接种于新的9-11日龄SPF鸡胚，37℃培养72h，收集鸡胚尿囊液。
(4)取步骤(3)得到的鸡胚尿囊液，接种于新的9-11日龄SPF鸡胚，37℃培养72h，收集鸡胚尿囊液。
(5)将步骤(3)和步骤(4)得到的鸡胚尿囊液混合，得到混合液。
对照病毒液的制备：用pClone30质粒代替重组质粒pClone30-VP2-Fc进行步骤(1)-步骤(5)，得到的混合液命名为rClone30病毒液。
(6)分别取上述步骤得到的两种病毒混合液，提取总RNA并反转录为cDNA，采用F1和R1组成的引物对进行PCR鉴定，F1和R1的引物序列如下：
F1：5’-ATGACAAACCTGCAAGAT-3’；SEQ ID NO.3；
R1：5’-TTATTTACCAGCCTGTTTCTGCAG-3’；SEQ ID NO.4。
结果见图2，PCR扩增片段大小约为2370bp，与预期大小相符。结果表明，本发明成功制备了具备感染性的表达VP2-Fc融合蛋白的NDV病毒，将步骤(5)得到的混合液命名为rClone30-VP2-Fc病毒液。
鸡血红细胞凝集(HA)试验的具体方法如下：①在血凝板第一排的1-12孔各加入25μL生理盐水；②在第1孔中加入25μL待测病毒液，混匀后吸25μL到第2孔，如此倍比稀释直到第10孔，第10孔混匀后弃除25μL；③在1-12孔中各加入25μL 1％鸡血红细胞；④震荡后室温静置20-30min，观察结果。
鸡血红细胞凝集抑制(HI)试验的具体方法如下：①在血凝板的1-12孔各加入25μL生理盐水；②第1孔加入待检血清25μL，混匀后吸25μL至第2孔，倍比稀释直至第10孔，第10孔混匀后弃除25μL；③在1-12孔中各加入25μL待测病毒液(4个血凝单位)，室温静置30min；④在1-12孔中各加入25μL 1％鸡血红细胞；⑤震荡后室温静置30-40min，观察结果。
结果表明，rClone30-VP2-Fc病毒液的HA效价为210，HI效价为211，见图3-图4。
实施例2检测病毒液中VP2-Fc基因片段的mRNA水平
将病毒分别按0.1MOI感染接种于六孔板内的DF-1细胞。分别收获经NDVrClone30-VP2-Fc处理48h的DF-1细胞，提取细胞总RNA，反转录成cDNA后，使用Real-timePCR技术检测重组病毒VP2-Fc mRNA的相对变化情况，以新城疫病毒核衣壳蛋白(NP)的表达量作为内参，引物由Invitrogen公司合成。
具体引物序列如下：
NP-F：5’-ATGCGTTTGTATCGGATGAA-3’；SEQ ID NO.5；
NP-R：5’-TAGGACTGATGCCATACCCA-3’；SEQ ID NO.6；
VP2-Fc-F:5’-GATGCCAACAACCGGACC-3’；SEQ ID NO.7；
VP2-Fc-R:5’-TCCCATTGCTCTGCAGTG-3’；SEQ ID NO.8。
结果见图5。rClone30-VP2-Fc中VP2-Fc基因的表达量显著高于rClone30(**p<0.01)，证明VP2-Fc基因片段可以有效表达。
实施例3rClone30-VP2-Fc病毒与rClone30病毒在宿主细胞中的动力生长曲线
(1)将对数生长期的DF-1细胞接种于六孔板，以0.1MOI的剂量将实施例1制备的rClone30-VP2-Fc病毒液(rClone30-VP2-Fc病毒液用完全培养基稀释)接种于单层细胞，采用含1μg/mL胰蛋白酶的完全培养基，置于5％CO2、37℃条件下静置培养96h，每隔24h取上清液并测定TCID50。
(2)使用实施例1制备的rClone30病毒液代替rClone30-VP2-Fc病毒液，其它同步骤(1)。
结果见图6。rClone30-VP2-Fc病毒与rClone30病毒保持着一致的繁殖滴度。结果表明，VP2蛋白的编码基因的插入并不影响rClone30病毒的增殖能力。
实施例4rClone30-VP2-Fc病毒或rClone30病毒免疫SPF鸡后的抗体水平检测
取1日龄白色来航鸡，随机分为3组，每组10只。分别处理如下(均为单次免疫)：
第一组：每只鸡采用滴鼻点眼的方式免疫200μL实施例1制备的rClone30-VP2-Fc病毒液(rClone30-VP2-Fc病毒液用完全培养基稀释，用于免疫的病毒液的浓度为105TCID50/0.1ml)；
第二组：每只鸡采用滴鼻点眼的方式免疫200μL实施例1制备的rClone30病毒液(rClone30病毒液用完全培养基稀释，用于免疫的病毒液的浓度为105TCID50/0.1ml)；
第三组：每只鸡采用滴鼻点眼的方式免疫200μL 0.9％生理盐水。
于免疫前和免疫后7d翅静脉采血分离血清，采用HI方法检测NDV抗体效价，结果见图7；采用ELISA方法检测IBDV抗体效价，结果见图8。
结果表明，与PBS对照组相比，rClone30重组病毒免疫鸡后，产生的NDV抗体水平显著升高(**p<0.01)，而产生的IBDV抗体水平无明显变化；rClone30-VP2-Fc重组病毒免疫鸡后，不仅产生NDV抗体水平显著升高(**p<0.01)，而且产生的IBDV(**p<0.01)的抗体水平显著升高。
实施例5rClone30-VP2-Fc重组疫苗对鸡的免疫保护试验
取1日龄的SPF级白色来航鸡，随机分为3组，每组20只，分别处理如下：
第一组(rClone30-VP2-Fc组)：试验第1天、第7天和第21天，每只鸡采用滴鼻点眼的方式免疫200μl实施例1制备rClone30-VP2-Fc病毒液(rClone30-VP2-Fc病毒液用完全培养基稀释，用于免疫的病毒液的浓度为107TCID50/0.1ml)。
第二组(rClone30组)：试验第1天、第7天和第21天，每只鸡采用滴鼻点眼的方式免疫200μl实施例1制备rClone30病毒液(rClone30病毒液用完全培养基稀释，用于免疫的病毒液的浓度为107TCID50/0.1ml)。
第三组(PBS组)：试验第1天、第7天和第21天，每只鸡采用滴鼻点眼的方式免疫相等体积的PBS。
试验第22天：每组取10只，采用新城疫强毒株F48E9株进行攻毒(每只鸡采用104ELD50的剂量经肌肉注射途径攻毒，攻毒体积为0.1ml)；每组取另外10只，采用IBDV超强毒株HLJ0504株进行攻毒(每只鸡采用104ELD50的剂量经肌肉注射途径攻毒，攻毒体积为0.1ml)；试验第25天，观察各组鸡的死亡率。结果见表1。
表1
Figure BDA0002830724310000091
表1结果表明，分别使用NDV和IBDV超强毒株攻毒时，rClone30-VP2-Fc组的发病率和死亡率低于rClone30对照组，对鸡产生有效的免疫保护。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 新乡学院
<120> 一株重组新城疫病毒毒株及其制备方法和应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2370
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gttaacgcca ccatgacaaa cctgcaagat caaacccaac agattgttcc gttcatacgg 60
agccttctga tgccaacaac cggaccggcg tccattccgg acgacaccct agagaagcac 120
actctcaggt cagagacctc gacctacaat ttgactgtgg gggacacagg gtcagggcta 180
attgtctttt tccctggttt ccctggctca attgtgggtg ctcactacac actgcagagc 240
aatgggaact acaagttcga tcagatgctc ctgactgccc agaacctacc ggccagctac 300
aactactgca ggctagtgag tcggagtctc acagtgaggt caagcacact ccctggtggc 360
gtttatgcat taaacggaac cataaacgcc gtgaccttcc aaggaagcct gagtgaactg 420
acagatgtta gctacaatgg gttgatgtct gcgacggcca acatcaacga caaaatcggg 480
aacgtcctag taggggaagg ggtaactgtc ctcagcttac ccacatcata tgatctgggg 540
tatgtgagac tcggtgaccc cattcccgct atagggcttg acccaaagat ggtagcaaca 600
tgtgacagca gtgataggcc cagagtctac accataactg cagccaatga ctaccaattc 660
tcatcacagt accaagcagg tggagtgaca atcacactgt tctcagcaaa catcgatgcc 720
atcacaagcc tcagcatcgg gggagaactt gtgtttcaaa caagcgtcca aggccttata 780
ctgggcgcta ccatctacct tataggcttc gatgggactg cggtaatcac cagagctgtg 840
gccgcagaca atgggctaac ggccggcact gacaacctta tgccattcaa tattgtgatt 900
ccaaccagcg agataaccca gccaatcaca tccatcaaac tggagatagt tacctccaaa 960
agtggtggtc aggcggggga tcagatgtca tggtcagcaa gtgggagcct agcagtgacg 1020
atccacggtg gcaactatcc aggggccctc cgtcccgtca cactagtagc ctacgaaaga 1080
gtggctacag gatctgtcgt tacggtcgcc ggggtgagca acttcgagct gatcccaaat 1140
cctgaactag caaagaacct gatcacagaa tacggccgat ttgacccagg ggccatgaac 1200
tacacaaaac tgatactgag tgagagggac cgtcttggca tcaagaccgt gtggccaaca 1260
agggagtaca ccgactttcg cgagtacttt atggaggtgg ccgacctcaa ctctcccctg 1320
aagattgcag gagcataagg tggtggtggt tctggtggtg gtggttctgg tggtggtgga 1380
tccggcctga gaggcccacg cctcctcctg caccccgagc caatcggaat cggtggagct 1440
gttgtgtttg gtgacggggt tctccccggc gtcggcggag gtcgaatggt tggtggacgg 1500
agtgggggga cttttggtgg cctcccaaag cccggcggtc cgcagcggat ccacctacag 1560
cctgagcagc cgcgtcaacg tcagcggcac cgattggagg gaagggaaga gttacagctg 1620
tagggtgagg caccccgcaa ccaacaccgt ggtggaggat cacgtcaagg gatgcccgga 1680
cggcgctcag agctgcagcc ccatccagct gtacgccatc ccacccagcc cgggcgagct 1740
gtacatcagc ttagacgcca aactgaggtg cctggtggtc aacctgccca gcgattccag 1800
cctcagcgtc acctggacca gggagaagag tgggaacctc cggcccgacc cgatggtcct 1860
ccaagaacac ttcaacggca cctacagcgc cagcagcgcc gtccccgcca gcacccagga 1920
ttggttatcc ggggagaggt tcacctgcac cgtgcagcac gaggagctgc ccctgccgct 1980
cagcaagagc gtctacagga acacgggacc caccacccca cctctgatct accccttcgc 2040
cccccacccg gaagagctgt ccctctcccg cgtcaccctg agctgcctgg tccgcggctt 2100
ccgcccacgt gacatcgaga tccggtggct ccgcgaccac cgcgccgttc ccgccaccga 2160
attcgtcacc accgccgtcc taccggaaga gagaaccgca aacggcgccg gcggtgacgg 2220
cgacaccttc ttcgtgtaca gtaagatgag cgtggagacc gccaagtgga acggcgggac 2280
ggtgttcgcc tgcatggcgg tgcacgaggc gctgcccatg cgcttcagcc agcgcacgct 2340
gcagaaacag gctggtaaat aacgacgcgt 2370
<210> 2
<211> 20737
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc gtagcctgaa 60
tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 120
cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 180
ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 240
gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 300
acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 360
ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 420
ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 480
acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 540
tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 600
tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat 660
gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt 720
ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg 780
agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga 840
agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg 900
tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt 960
tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg 1020
cagtgctgcc ataagcatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg 1080
aggaccgaag gagctaaccg ctttttttca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga 1140
tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc 1200
tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc 1260
ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc 1320
ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg 1380
cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac 1440
gacgggcagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc 1500
actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt 1560
aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac 1620
caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa 1680
aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc 1740
accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt 1800
aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg 1860
ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc 1920
agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt 1980
accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga 2040
gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag cattgagaaa gcgccacgct 2100
tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg 2160
cacgagggag cttccagggg ggaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca 2220
cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggccgagcc tatggaaaaa 2280
cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt 2340
ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 2400
taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 2460
gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 2520
cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttacct 2580
cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcctatgt tgtgtggaat 2640
tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg ccaagctcgg 2700
aagcggccgc taatacgact cactataggg accaaacaga gaatccgtaa gttacgataa 2760
aaggcgaagg agcaattgaa gtcgcacggg tagaaggtgt gaatctcgag tgcgagcccg 2820
aagcacaaac tcgagaaagc cttctgccaa catgtcttcc gtatttgatg agtacgaaca 2880
gctcctcgcg gctcagactc gccccaatgg agctcatgga gggggagaaa aagggagtac 2940
cttaaaagta gacgtcccgg tattcactct taacagtgat gacccagaag atagatggag 3000
ctttgtggta ttctgcctcc ggattgctgt tagcgaagat gccaacaaac cactcaggca 3060
aggtgctctc atatctcttt tatgctccca ctcacaggta atgaggaacc atgttgccct 3120
tgcagggaaa cagaatgaag ccacattggc cgtgcttgag attgatggct ttgccaacgg 3180
cacgccccag ttcaacaata ggagtggagt gtctgaagag agagcacaga gatttgcgat 3240
gatagcagga tctctccctc gggcatgcag caacggaacc ccgttcgtca cagccggggc 3300
cgaagatgat gcaccagaag acatcaccga taccctggag aggatcctct ctatccaggc 3360
tcaagtatgg gtcacagtag caaaagccat gactgcgtat gagactgcag atgagtcgga 3420
aacaaggcga atcaataagt atatgcagca aggcagggtc caaaagaaat acatcctcta 3480
ccccgtatgc aggagcacaa tccaactcac gatcagacag tctcttgcag tccgcatctt 3540
tttggttagc gagctcaaga gaggccgcaa cacggcaggt ggtacctcta cttattataa 3600
cctggtaggg gacgtagact catacatcag gaataccggg cttactgcat tcttcttgac 3660
actcaagtac ggaatcaaca ccaagacatc agcccttgca cttagtagcc tctcaggcga 3720
catccagaag atgaagcagc tcatgcgttt gtatcggatg aaaggagata atgcgccgta 3780
catgacatta cttggtgata gtgaccagat gagctttgcg cctgccgagt atgcacaact 3840
ttactccttt gccatgggta tggcatcagt cctagataaa ggtactggga aataccaatt 3900
tgccagggac tttatgagca catcattctg gagacttgga gtagagtacg ctcaggctca 3960
gggaagtagc attaacgagg atatggctgc cgagctaaag ctaaccccag cagcaaggag 4020
gggcctggca gctgctgccc aacgggtctc cgaggagacc agcagcatag acatgcctac 4080
tcaacaagtc ggagtcctca ctgggcttag cgaggggggg tcccaagctc tacaaggcgg 4140
atcgaataga tcgcaagggc aaccagaagc cggggatggg gagacccaat tcctggatct 4200
gatgagagcg gtagcaaata gcatgaggga ggcgccaaac tctgcacagg gcactcccca 4260
atcggggcct cccccaactc ctgggccatc ccaagataac gacaccgact gggggtattg 4320
atggacaaaa cccagcctgc ttccacaaaa acatcccaat gccctcaccc gtagtcgacc 4380
cctcgatttg cggctctata tgaccacacc ctcaaacaaa catccccctc tttcctccct 4440
ccccctgctg tacaactccg cacgccctag ataccacagg cacaatgcgg ctcactaaca 4500
atcaaaacag agccgaggga attagaaaaa agtacgggta gaagagggat attcagagat 4560
cagggcaagt ctcccgagtc tctgctctct cctctacctg atagaccagg acaaacatgg 4620
ccacctttac agatgcagag atcgacgagc tatttgagac aagtggaact gtcattgaca 4680
acataattac agcccagggt aaaccagcag agactgttgg aaggagtgca atcccacaag 4740
gcaagaccaa ggtgctgagc gcagcatggg agaagcatgg gagcatccag ccaccggcca 4800
gtcaagacaa ccccgatcga caggacagat ctgacaaaca accatccaca cccgagcaaa 4860
cgaccccgca tgacagcccg ccggccacat ccgccgacca gccccccacc caggccacag 4920
acgaagccgt cgacacacag ctcaggaccg gagcaagcaa ctctctgctg ttgatgcttg 4980
acaagctcag caataaatcg tccaatgcta aaaagggccc atggtcgagc ccccaagagg 5040
ggaatcacca acgtccgact caacagcagg ggagtcaacc cagtcgcgga aacagtcagg 5100
aaagaccgca gaaccaagtc aaggccgccc ctggaaacca gggcacagac gtgaacacag 5160
catatcatgg acaatgggag gagtcacaac tatcagctgg tgcaacccct catgctctcc 5220
gatcaaggca gagccaagac aatacccttg tatctgcgga tcatgtccag ccacctgtag 5280
actttgtgca agcgatgatg tctatgatgg aggcgatatc acagagagta agtaaggttg 5340
actatcagct agatcttgtc ttgaaacaga catcctccat ccctatgatg cggtccgaaa 5400
tccaacagct gaaaacatct gttgcagtca tggaagccaa cttgggaatg atgaagattc 5460
tggatcccgg ttgtgccaac atttcatctc tgagtgatct acgggcagtt gcccgatctc 5520
acccggtttt agtttcaggc cctggagacc cctctcccta tgtgacacaa ggaggcgaaa 5580
tggcacttaa taaactttcg caaccagtgc cacatccatc tgaattgatt aaacccgcca 5640
ctgcatgcgg gcctgatata ggagtggaaa aggacactgt ccgtgcattg atcatgtcac 5700
gcccaatgca cccgagttct tcagccaagc tcctaagcaa gttagatgca gccgggtcga 5760
tcgaggaaat caggaaaatc aagcgccttg ctctaaatgg ctaattacta ctgccacacg 5820
tagcgggtcc ctgtccactc ggcatcacac ggaatctgca ccgagttccc ccccgcagac 5880
ccaaggtcca actctccaag cggcaatcct ctctcgcttc ctcagcccca ctgaatgatc 5940
gcgtaaccgt aattaatcta gctacattta agattaagaa aaaatacggg tagaattgga 6000
gtgccccaat tgtgccaaga tggactcatc taggacaatt gggctgtact ttgattctgc 6060
ccattcttct agcaacctgt tagcatttcc gatcgtccta caagacacag gagatgggaa 6120
gaagcaaatc gccccgcaat ataggatcca gcgccttgac ttgtggactg atagtaagga 6180
ggactcagta ttcatcacca cctatggatt catctttcaa gttgggaatg aagaagccac 6240
tgtcggcatg atcgatgata aacccaagcg cgagttactt tccgctgcga tgctctgcct 6300
aggaagcgtc ccaaataccg gagaccttat tgagctggca agggcctgtc tcactatgat 6360
agtcacatgc aagaagagtg caactaatac tgagagaatg gttttctcag tagtgcaggc 6420
accccaagtg ctgcaaagct gtagggttgt ggcaaacaaa tactcatcag tgaatgcagt 6480
caagcacgtg aaagcgccag agaagattcc cgggagtgga accctagaat acaaggtgaa 6540
ctttgtctcc ttgactgtgg taccgaagaa ggatgtctac aagatcccag ctgcagtatt 6600
gaaggtttct ggctcgagtc tgtacaatct tgcgctcaat gtcactatta atgtggaggt 6660
agacccgagg agtcctttgg ttaaatctct gtctaagtct gacagcggat actatgctaa 6720
cctcttcttg catattggac ttatgaccac cgtagatagg aaggggaaga aagtgacatt 6780
tgacaagctg gaaaagaaaa taaggagcct tgatctatct gtcgggctca gtgatgtgct 6840
cgggccttcc gtgttggtaa aagcaagagg tgcacggact aagcttttgg cacctttctt 6900
ctctagcagt gggacagcct gctatcccat agcaaatgct tctcctcagg tggccaagat 6960
actctggagt caaaccgcgt gcctgcggag cgttaaaatc attatccaag caggtaccca 7020
acgcgctgtc gcagtgaccg ccgaccacga ggttacctct actaagctgg agaaggggca 7080
cacccttgcc aaatacaatc cttttaagaa ataagctgcg tctctgagat tgcgctccgc 7140
ccactcaccc agatcatcat gacacaaaaa actaatctgt cttgattatt tacagttagt 7200
ttacctgtct atcaagttag aaaaaacacg ggtagaagat tctggatccc ggttggcgcc 7260
ctccaggtgc aagatgggct ccagaccttc taccaagaac ccagcaccta tgatgctgac 7320
tatccgggtt gcgctggtac tgagttgcat ctgtccggca aactccattg atggcaggcc 7380
tcttgcagct gcaggaattg tggttacagg agacaaagcc gtcaacatat acacctcatc 7440
ccagacagga tcaatcatag ttaagctcct cccgaatctg cccaaggata aggaggcatg 7500
tgcgaaagcc cccttggatg catacaacag gacattgacc actttgctca ccccccttgg 7560
tgactctatc cgtaggatac aagagtctgt gactacatct ggagggggga gacaggggcg 7620
ccttataggc gccattattg gcggtgtggc tcttggggtt gcaactgccg cacaaataac 7680
agcggccgca gctctgatac aagccaaaca aaatgctgcc aacatcctcc gacttaaaga 7740
gagcattgcc gcaaccaatg aggctgtgca tgaggtcact gacggattat cgcaactagc 7800
agtggcagtt gggaagatgc agcagtttgt taatgaccaa tttaataaaa cagctcagga 7860
attagactgc atcaaaattg cacagcaagt tggtgtagag ctcaacctgt acctaaccga 7920
attgactaca gtattcggac cacaaatcac ttcacctgct ttaaacaagc tgactattca 7980
ggcactttac aatctagctg gtggaaatat ggattactta ttgactaagt taggtgtagg 8040
gaacaatcaa ctcagctcat taatcggtag cggcttaatc accggtaacc ctattctata 8100
cgactcacag actcaactct tgggtataca ggtaactcta ccttcagtcg ggaacctaaa 8160
taatatgcgt gccacctact tggaaacctt atccgtaagc acaaccaggg gatttgcctc 8220
ggcacttgtc ccaaaagtgg tgacacaggt cggttctgtg atagaagaac ttgacacctc 8280
atactgtata gaaactgact tagatttata ttgtacaaga atagtaacgt tccctatgtc 8340
ccctggtatt tattcctgct tgagcggcaa tacgtcggcc tgtatgtact caaagaccga 8400
aggcgcactt actacaccat acatgactat caaaggttca gtcatcgcca actgcaagat 8460
gacaacatgt agatgtgtaa accccccggg tatcatatcg caaaactatg gagaagccgt 8520
gtctctaata gataaacaat catgcaatgt tttatcctta ggcgggataa ctttaaggct 8580
cagtggggaa ttcgatgtaa cttatcagaa gaatatctca atacaagatt ctcaagtaat 8640
aataacaggc aatcttgata tctcaactga gcttgggaat gtcaacaact cgatcagtaa 8700
tgctttgaat aagttagagg aaagcaacag aaaactagac aaagtcaatg tcaaactgac 8760
tagcacatct gctctcatta cctatatcgt tttgactatc atatctcttg tttttggtat 8820
acttagcctg attctagcat gctacctaat gtacaagcaa aaggcgcaac aaaagacctt 8880
attatggctt gggaataata ctctagatca gatgagagcc actacaaaaa tgtgaacaca 8940
gatgaggaac gaaggtttcc ctaatagtaa tttgtgtgaa agttctggta gtctgtcagt 9000
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acagattgtt ccgttcatac ggagccttct gatgccaaca accggaccgg cgtccattcc 9120
ggacgacacc ctagagaagc acactctcag gtcagagacc tcgacctaca atttgactgt 9180
gggggacaca gggtcagggc taattgtctt tttccctggt ttccctggct caattgtggg 9240
tgctcactac acactgcaga gcaatgggaa ctacaagttc gatcagatgc tcctgactgc 9300
ccagaaccta ccggccagct acaactactg caggctagtg agtcggagtc tcacagtgag 9360
gtcaagcaca ctccctggtg gcgtttatgc attaaacgga accataaacg ccgtgacctt 9420
ccaaggaagc ctgagtgaac tgacagatgt tagctacaat gggttgatgt ctgcgacggc 9480
caacatcaac gacaaaatcg ggaacgtcct agtaggggaa ggggtaactg tcctcagctt 9540
acccacatca tatgatctgg ggtatgtgag actcggtgac cccattcccg ctatagggct 9600
tgacccaaag atggtagcaa catgtgacag cagtgatagg cccagagtct acaccataac 9660
tgcagccaat gactaccaat tctcatcaca gtaccaagca ggtggagtga caatcacact 9720
gttctcagca aacatcgatg ccatcacaag cctcagcatc gggggagaac ttgtgtttca 9780
aacaagcgtc caaggcctta tactgggcgc taccatctac cttataggct tcgatgggac 9840
tgcggtaatc accagagctg tggccgcaga caatgggcta acggccggca ctgacaacct 9900
tatgccattc aatattgtga ttccaaccag cgagataacc cagccaatca catccatcaa 9960
actggagata gttacctcca aaagtggtgg tcaggcgggg gatcagatgt catggtcagc 10020
aagtgggagc ctagcagtga cgatccacgg tggcaactat ccaggggccc tccgtcccgt 10080
cacactagta gcctacgaaa gagtggctac aggatctgtc gttacggtcg ccggggtgag 10140
caacttcgag ctgatcccaa atcctgaact agcaaagaac ctgatcacag aatacggccg 10200
atttgaccca ggggccatga actacacaaa actgatactg agtgagaggg accgtcttgg 10260
catcaagacc gtgtggccaa caagggagta caccgacttt cgcgagtact ttatggaggt 10320
ggccgacctc aactctcccc tgaagattgc aggagcataa ggtggtggtg gttctggtgg 10380
tggtggttct ggtggtggtg gatccggcct gagaggccca cgcctcctcc tgcaccccga 10440
gccaatcgga atcggtggag ctgttgtgtt tggtgacggg gttctccccg gcgtcggcgg 10500
aggtcgaatg gttggtggac ggagtggggg gacttttggt ggcctcccaa agcccggcgg 10560
tccgcagcgg atccacctac agcctgagca gccgcgtcaa cgtcagcggc accgattgga 10620
gggaagggaa gagttacagc tgtagggtga ggcaccccgc aaccaacacc gtggtggagg 10680
atcacgtcaa gggatgcccg gacggcgctc agagctgcag ccccatccag ctgtacgcca 10740
tcccacccag cccgggcgag ctgtacatca gcttagacgc caaactgagg tgcctggtgg 10800
tcaacctgcc cagcgattcc agcctcagcg tcacctggac cagggagaag agtgggaacc 10860
tccggcccga cccgatggtc ctccaagaac acttcaacgg cacctacagc gccagcagcg 10920
ccgtccccgc cagcacccag gattggttat ccggggagag gttcacctgc accgtgcagc 10980
acgaggagct gcccctgccg ctcagcaaga gcgtctacag gaacacggga cccaccaccc 11040
cacctctgat ctaccccttc gccccccacc cggaagagct gtccctctcc cgcgtcaccc 11100
tgagctgcct ggtccgcggc ttccgcccac gtgacatcga gatccggtgg ctccgcgacc 11160
accgcgccgt tcccgccacc gaattcgtca ccaccgccgt cctaccggaa gagagaaccg 11220
caaacggcgc cggcggtgac ggcgacacct tcttcgtgta cagtaagatg agcgtggaga 11280
ccgccaagtg gaacggcggg acggtgttcg cctgcatggc ggtgcacgag gcgctgccca 11340
tgcgcttcag ccagcgcacg ctgcagaaac aggctggtaa ataacgacgc gtggcctgag 11400
aggccttcag agagttaaga aaaaactacc ggttgtagat gaccaaagga cgatatacgg 11460
gtagaacggt aagagaggcc gcccctcaat tgcgagccag gcttcacaac ctccgttcta 11520
ccgcttcacc gacaacagtc ctcaatcatg gaccgcgccg ttagccaagt tgcgttagag 11580
aatgatgaaa gagaggcaaa aaatacatgg cgcttgatat tccggattgc aatcttattc 11640
ttaacagtag tgaccttggc tatatctgta gcctcccttt tatatagcat gggggctagc 11700
acacctagcg atcttgtagg cataccgact aggatttcca gggcagaaga aaagattaca 11760
tctacacttg gttccaatca agatgtagta gataggatat ataagcaagt ggcccttgag 11820
tctccgttgg cattgttaaa tactgagacc acaattatga acgcaataac atctctctct 11880
tatcagatta atggagctgc aaacaacagt gggtgggggg cacctatcca tgacccagat 11940
tatatagggg ggataggcaa agaactcatt gtagatgatg ctagtgatgt cacatcattc 12000
tatccctctg catttcaaga acatctgaat tttatcccgg cgcctactac aggatcaggt 12060
tgcactcgaa taccctcatt tgacatgagt gctacccatt actgctacac ccataatgta 12120
atattgtctg gatgcagaga tcactcacat tcatatcagt atttagcact tggtgtgctc 12180
cggacatctg caacagggag ggtattcttt tctactctgc gttccatcaa cctggacgac 12240
acccaaaatc ggaagtcttg cagtgtgagt gcaactcccc tgggttgtga tatgctgtgc 12300
tcgaaagtca cggagacaga ggaagaagat tataactcag ctgtccctac gcggatggta 12360
catgggaggt tagggttcga cggccagtac cacgaaaagg acctagatgt cacaacatta 12420
ttcggggact gggtggccaa ctacccagga gtagggggtg gatcttttat tgacagccgc 12480
gtatggttct cagtctacgg agggttaaaa cccaattcac ccagtgacac tgtacaggaa 12540
gggaaatatg tgatatacaa gcgatacaat gacacatgcc cagatgagca agactaccag 12600
attcgaatgg ccaagtcttc gtataagcct ggacggtttg gtgggaaacg catacagcag 12660
gctatcttat ctatcaaggt gtcaacatcc ttaggcgaag acccggtact gactgtaccg 12720
cccaacacag tcacactcat gggggccgaa ggcagaattc tcacagtagg gacatctcat 12780
ttcttgtatc aacgagggtc atcatacttc tctcccgcgt tattatatcc tatgacagtc 12840
agcaacaaaa cagccactct tcatagtcct tatacattca atgccttcac tcggccaggt 12900
agtatccctt gccaggcttc agcaagatgc cccaactcgt gtgttactgg agtctataca 12960
gatccatatc ccctaatctt ctatagaaac cacaccttgc gaggggtatt cgggacaatg 13020
cttgatggtg tacaagcaag acttaaccct gcgtctgcag tattcgatag cacatcccgc 13080
agtcgcatta ctcgagtgag ttcaagcagt accaaagcag catacacaac atcaacttgt 13140
tttaaagtgg tcaagactaa taagacctat tgtctcagca ttgctgaaat atctaatact 13200
ctcttcggag aattcagaat cgtcccgtta ctagttgaga tcctcaaaga tgacggggtt 13260
agagaagcca ggtctggcta gttgagtcaa ttataaagga gttggaaaga tggcattgta 13320
tcacctatct tctgcgacat caagaatcaa accgaatgcc ggcgcgtgct cgaattccat 13380
gttgccagtt gaccacaatc agccagtgct catgcgatca gattaagcct tgtcaatagt 13440
ctcttgatta agaaaaaatg taagtggcaa tgagatacaa ggcaaaacag ctcatggtaa 13500
ataatacggg taggacatgg cgagctccgg tcctgaaagg gcagagcatc agattatcct 13560
accagagtca cacctgtctt caccattggt caagcacaaa ctactctatt actggaaatt 13620
aactgggcta ccgcttcctg atgaatgtga cttcgaccac ctcattctca gccgacaatg 13680
gaaaaaaata cttgaatcgg cctctcctga tactgagaga atgataaaac tcggaagggc 13740
agtacaccaa actcttaacc acaattccag aataaccgga gtgctccacc ccaggtgttt 13800
agaagaactg gctaatattg aggtcccaga ttcaaccaac aaatttcgga agattgagaa 13860
gaagatccaa attcacaaca cgagatatgg agaactgttc acaaggctgt gtacgcatat 13920
agagaagaaa ctgctggggt catcttggtc taacaatgtc ccccggtcag aggagttcag 13980
cagcattcgt acggatccgg cattctggtt tcactcaaaa tggtccacag ccaagtttgc 14040
atggctccat ataaaacaga tccagaggca tctgatggtg gcagctagga caaggtctgc 14100
ggccaacaaa ttggtgatgc taacccataa ggtaggccaa gtctttgtca ctcctgaact 14160
tgtcgttgtg acgcatacga atgagaacaa gttcacatgt cttacccagg aacttgtatt 14220
gatgtatgca gatatgatgg agggcagaga tatggtcaac ataatatcaa ccacggcggt 14280
gcatctcaga agcttatcag agaaaattga tgacattttg cggttaatag acgctctggc 14340
aaaagacttg ggtaatcaag tctacgatgt tgtatcacta atggagggat ttgcatacgg 14400
agctgtccag ctactcgagc cgtcaggtac atttgcagga gatttcttcg cattcaacct 14460
gcaggagctt aaagacattc taattggcct cctccccaat gatatagcag aatccgtgac 14520
tcatgcaatc gctactgtat tctctggttt agaacagaat caagcagctg agatgttgtg 14580
tctgttgcgt ctgtggggtc acccactgct tgagtcccgt attgcagcaa aggcagtcag 14640
gagccaaatg tgcgcaccga aaatggtaga ctttgatatg atccttcagg tactgtcttt 14700
cttcaaggga acaatcatca acgggtacag aaagaagaat gcaggtgtgt ggccgcgagt 14760
caaagtggat acaatatatg ggaaggtcat tgggcaacta catgcagatt cagcagagat 14820
ttcacacgat atcatgttga gagagtataa gagtttatct gcacttgaat ttgagccatg 14880
tatagaatat gaccctgtca ccaacctgag catgttccta aaagacaagg caatcgcaca 14940
ccccaacgat aattggcttg cctcgtttag gcggaacctt ctctccgaag accagaagaa 15000
acatgtaaaa gaagcaactt cgactaatcg cctcttgata gagtttttag agtcaaatga 15060
ttttgatcca tataaagaga tggaatatct gacgaccctt gagtacctta gagatgacaa 15120
tgtggcagta tcatactcgc tcaaggagaa ggaagtgaaa gttaatggac ggatcttcgc 15180
taagctgaca aagaagttaa ggaactgtca ggtgatggcg gaagggatcc tagccgatca 15240
gattgcacct ttctttcagg gaaatggagt cattcaggat agcatatcct tgaccaagag 15300
tatgctagcg atgagtcaac tgtcttttaa cagcaataag aaacgtatca ctgactgtaa 15360
agaaagagta tcttcaaacc gcaatcatga tccgaaaagc aagaaccgtc ggagagttgc 15420
aaccttcata acaactgacc tgcaaaagta ctgtcttaat tggagatatc agacaatcaa 15480
attgttcgct catgccatca atcagttgat gggcctacct cacttcttcg aatggattca 15540
cctaagactg atggacacta cgatgttcgt aggagaccct ttcaatcctc caagtgaccc 15600
tactgactgt gacctctcaa gagtccctaa tgatgacata tatattgtca gtgccagagg 15660
gggtatcgaa ggattatgcc agaagctatg gacaatgatc tcaattgctg caatccaact 15720
tgctgcagct agatcgcatt gtcgtgttgc ctgtatggta cagggtgata atcaagtaat 15780
agcagtaacg agagaggtaa gatcagacga ctctccggag atggtgttga cacagttgca 15840
tcaagccagt gataatttct tcaaggaatt aattcatgtc aatcatttga ttggccataa 15900
tttgaaggat cgtgaaacca tcaggtcaga cacattcttc atatacagca aacgaatctt 15960
caaagatgga gcaatcctca gtcaagtcct caaaaattca tctaaattag tgctagtgtc 16020
aggtgatctc agtgaaaaca ccgtaatgtc ctgtgccaac attgcctcta ctgtagcacg 16080
gctatgcgag aacgggcttc ccaaagactt ctgttactat ttaaactata taatgagttg 16140
tgtgcagaca tactttgact ctgagttctc catcaccaac aattcgcacc ccgatcttaa 16200
tcagtcgtgg attgaggaca tctcttttgt gcactcatat gttctgactc ctgcccaatt 16260
agggggactg agtaaccttc aatactcaag gctctacact agaaatatcg gtgacccggg 16320
gactactgct tttgcagaga tcaagcgact agaagcagtg ggattactga gtcctaacat 16380
tatgactaat atcttaacta ggccgcctgg gaatggagat tgggccagtc tgtgcaacga 16440
cccatactct ttcaattttg agactgttgc aagcccaaat attgttctta agaaacatac 16500
gcaaagagtc ctatttgaaa cttgttcaaa tcccttattg tctggagtgc acacagagga 16560
taatgaggca gaagagaagg cattggctga attcttgctt aatcaagagg tgattcatcc 16620
ccgcgttgcg catgccatca tggaggcaag ctctgtaggt aggagaaagc aaattcaagg 16680
gcttgttgac acaacaaaca ccgtaattaa gattgcgctt actaggaggc cattaggcat 16740
caagaggctg atgcggatag tcaattattc tagcatgcat gcaatgctgt ttagagacga 16800
tgttttttcc tccagtagat ccaaccaccc cttagtctct tctaatatgt gttctctgac 16860
actggcagac tatgcacgga atagaagctg gtcacctttg acgggaggca ggaaaatact 16920
gggtgtatct aatcctgata cgatagaact cgtagagggt gagattctta gtgtaagcgg 16980
agggtgtaca agatgtgaca gcggagatga acaatttact tggttccatc ttccaagcaa 17040
tatagaattg accgatgaca ccagcaagaa tcctccgatg agggtaccat atctcgggtc 17100
aaagacacag gagaggagag ctgcctcact tgcaaaaata gctcatatgt cgccacatgt 17160
aaaggctgcc ctaagggcat catccgtgtt gatctgggct tatggggata atgaagtaaa 17220
ttggactgct gctcttacga ttgcaaaatc tcggtgtaat gtaaacttag agtatcttcg 17280
gttactgtcc cctttaccca cggctgggaa tcttcaacat agactagatg atggtataac 17340
tcagatgaca ttcacccctg catctctcta cagggtgtca ccttacattc acatatccaa 17400
tgattctcaa aggctgttca ctgaagaagg agtcaaagag gggaatgtgg tttaccaaca 17460
gatcatgctc ttgggtttat ctctaatcga atcgatcttt ccaataacaa caaccaggac 17520
atatgatgag atcacactgc acctacatag taaatttagt tgctgtatca gagaagcacc 17580
tgttgcggtt cctttcgagc tacttggggt ggtaccggaa ctgaggacag tgacctcaaa 17640
taagtttatg tatgatccta gccctgtatc ggagggagac tttgcgagac ttgacttagc 17700
tactttcaag agttatgagc ttaatctgga gtcatatccc acgatagagc taatgaacat 17760
tctttcaata tccagcggga agttgattgg ccagtctgtg gtttcttatg atgaagatac 17820
ctccataaag aatgacgcca taatagtgta tgacaatacc cgaaattgga tcagtgaagc 17880
tcagaattca gatgtggtcc gcctatttga atatgcagca cttgaagtgc tcctcgactg 17940
ttcttaccaa ctctattacc tgagagtaag aggcctagac aatattgtct tatatatggg 18000
tgatttatac aagaatatgc caggaattct actttccaac attgcagcta caatatctca 18060
tcccgtcatt cattcaaggt tacatgcagt gggcctggtc aaccatgacg gatcacacca 18120
acttgcagat acggatttta tcgaaatgtc tgcaaaacta ttagtatctt gcacccgacg 18180
tgtgatctcc ggcttatatt caggaaataa gtatgatctg ctgttcccat ctgtcttaga 18240
tgataacctg aatgagaaga tgcttcagct gatatcccgg ttatgctgtc tgtacacggt 18300
actctttgct acaacaagag aaatcccgaa aataagaggc ttaactgcag aagagaaatg 18360
ttcaatactc actgagtatt tactgtcgga tgctgtgaaa ccattactta gtcccgatca 18420
agtgagctct atcatgtctc ctaacataat tacattccca gctaatctgt actacatgtc 18480
tcggaagagc ctcaatttga tcagggaaag ggaggacagg gatactatcc tggcgttgtt 18540
gttcccccaa gagccattat tagagttccc ttctgtgcaa gatattggtg ctcgagtgaa 18600
agatccattc acccgacaac ctgcggcatt tttgcaagag ttagatttga gtgctccagc 18660
aaggtatgac gcattcacac ttagtcagat tcatcctgaa ctcacatctc caaatccgga 18720
ggaagactac ttagtacgat acttgttcag agggataggg actgcatctt cctcttggta 18780
taaggcatct catctccttt ctgtacccga ggtaagatgt gcaagacacg ggaactcctt 18840
atacttagct gaagggagcg gagccatcat gagtcttctc gaactgcatg taccacatga 18900
aactatctat tacaatacgc tcttttcaaa tgagatgaac cccccgcaac gacatttcgg 18960
gccgacccca actcagtttt tgaattcggt tgtttatagg aatctacagg cggaggtaac 19020
atgcaaagat ggatttgtcc aagagttccg tccattatgg agagaaaata cagaggaaag 19080
tgacctgacc tcagataaag tagtggggta tattacatct gcagtgccct acagatctgt 19140
atcattgctg cattgtgaca ttgaaattcc tccagggtcc aatcaaagct tactagatca 19200
actagctatc aatttatctc tgattgccat gcattctgta agggagggcg gggtagtaat 19260
catcaaagtg ttgtatgcaa tgggatacta ctttcatcta ctcatgaact tgtttgctcc 19320
gtgttccaca aaaggatata ttctctctaa tggttatgca tgtcgaggag atatggagtg 19380
ttacctggta tttgtcatgg gttacctggg cgggcctaca tttgtacatg aggtggtgag 19440
gatggcgaaa actctggtgc agcggcacgg tacgcttttg tctaaatcag atgagatcac 19500
actgaccagg ttattcacct cacagcggca gcgtgtgaca gacatcctat ccagtccttt 19560
accaagatta ataaagtact tgaggaagaa tattgacact gcgctgattg aagccggggg 19620
acagcccgtc cgtccattct gtgcggagag tctggtgagc acgctagcga acataactca 19680
gataacccag atcatcgcta gtcacattga cacagttatc cggtctgtga tatatatgga 19740
agctgagggt gatctcgctg acacagtatt tctatttacc ccttacaatc tctctactga 19800
cgggaaaaag aggacatcac ttaaacagtg cacgagacag atcctagagg ttacaatact 19860
aggtcttaga gtcgaaaatc tcaataaaat aggcgatata atcagcctag tgcttaaagg 19920
catgatctcc atggaggacc ttatcccact aaggacatac ttgaagcata gtacctgccc 19980
taaatatttg aaggctgtcc taggtattac caaactcaaa gaaatgttta cagacacttc 20040
tgtactgtac ttgactcgtg ctcaacaaaa attctacatg aaaactatag gcaatgcagt 20100
caaaggatat tacagtaact gtgactctta acgaaaatca catattaata ggctcctttt 20160
ttggccaatt gtattcttgt tgatttaatc atattatgtt agaaaaaagt tgaaccctga 20220
ctccttagga ctcgaattcg aactcaaata aatgtcttaa aaaaaggttg cgcacaatta 20280
ttcttgagtg tagtctcgtc attcaccaaa tctttgtttg gtttggtggc cggcatggtc 20340
ccagcctcct cgctggcgcc ggctgggcaa cattccgagg ggaccgtccc ctcggtaatg 20400
gcgaatggga cgcggccgat ccggctgcta acaaagcccg aaaggaagct gagttggctg 20460
ctgccaccgc tgagcaataa ctagcataac cccttggggc ctctaaacgg gtcttgaggg 20520
gttttttgct gaaaggagga actatatccg gatcggccga tccggctgct aacaaagccc 20580
gaaaggaagc tgagttggct gctgccaccg ctgagcaata actagcataa ccccttgggg 20640
cctctaaacg ggtcttgagg ggttttttgc tgaaaggagg aactatatcc ggatggccgc 20700
caccggtggg ccttgcagca catcccccct tcgccag 20737
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
atgacaaacc tgcaagat 18
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
ttatttacca gcctgtttct gcag 24
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
atgcgtttgt atcggatgaa 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
taggactgat gccataccca 20
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
gatgccaaca accggacc 18
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
tcccattgct ctgcagtg 18

Claims (3)

1.一株重组新城疫病毒毒株rClone30-VP2-Fc，其特征在于，为将VP2蛋白的编码基因和鸡IgG的Fc通过GS linker连接插入到鸡新城疫病毒毒株Clone30基因组的F和HN基因之间得到的重组病毒株；所述rClone30-VP2-Fc病毒的基因组序列为SEQ ID NO.2自5’末端第2703-20322位核苷酸序列。
2.权利要求1所述的一株重组新城疫病毒毒株rClone30-VP2-Fc的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)合成VP2-Fc的双链DNA分子，如SEQ ID NO.1所示；
(2)分别采用限制性内切酶Hpa I和Mlu I双酶切步骤(1)的双链DNA分子和pClone30质粒，回收，连接，得到重组质粒pClone30-VP2-Fc；所述重组质粒pClone30-VP2-Fc的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(3)将重组质粒pClone30-VP2-Fc以及相应的辅助质粒pBL-N、pBL-P和pBL-L共转染BHK-21细胞，置于5％CO2、37℃条件中静置培养72h；
(4)取步骤(3)得到的转染细胞，于-80℃反复冻融3次，离心收取细胞上清液，然后接种于9-11日龄SPF鸡胚，37℃培养72h，收集鸡胚尿囊液；
(5)取步骤(4)得到的鸡胚尿囊液，接种于新的9-11日龄SPF鸡胚，37℃培养72h，收集鸡胚尿囊液；
(6)取步骤(5)得到的鸡胚尿囊液，接种于新的9-11日龄SPF鸡胚，37℃培养72h，收集鸡胚尿囊液；
(7)将步骤(5)和步骤(6)得到的鸡胚尿囊液混合，得到混合液，为rClone30-VP2-Fc病毒液。
3.权利要求1或2所述的一株重组新城疫病毒毒株rClone30-VP2-Fc在制备鸡传染性法氏囊病疫苗中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN109929815A (zh) * 2019-03-20 2019-06-25 中国动物卫生与流行病学中心 人造的禽副黏病毒

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102973930A (zh) * 2012-12-03 2013-03-20 青岛康地恩药业股份有限公司 一种鸡亚单位二联疫苗及其制备和应用
CN107002097A (zh) * 2014-12-24 2017-08-01 英特维特国际股份有限公司 改进的hvt作为载体的nd‑ibd疫苗

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2768529A1 (en) * 2011-10-21 2014-08-27 Intervet International B.V. Recombinant nonpathogenic mdv vector providing multivalent immunity

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102973930A (zh) * 2012-12-03 2013-03-20 青岛康地恩药业股份有限公司 一种鸡亚单位二联疫苗及其制备和应用
CN107002097A (zh) * 2014-12-24 2017-08-01 英特维特国际股份有限公司 改进的hvt作为载体的nd‑ibd疫苗

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A Recombinant Newcastle Disease Virus (NDV) Expressing VP2 Protein of Infectious Bursal Disease Virus (IBDV) Protects against NDV and IBDV;Zhuhui Huang et al.;《JOURNAL OF VIROLOGY》;20040930;第78卷(第18期);第10054-10063页 *
Fused IgY Fc and Polysaccharide Adjuvant Enhanced the Immune Effect of the Recombinant VP2 and VP5 Subunits-A Prospect for Improvement of Infectious Bursal Disease Virus Subunit Vaccine;Huining Wang et al.;《frontiers in microbiology》;20171114;第8卷;第2页左栏第3段，第6页右栏倒数第1段 *
Newcastle disease virus cDNA to complete genomic RNA, clone 30 GenBank: Y18898.1;Romer-Oberdorfer,A. et al.;《genbank》;20050418;第1-6页 *
基于内部核糖体进入位点提高重组NDV表达IBDV VP2基因的研究;何金娇等;《中国预防兽医学报》;20130630;第35卷(第6期);第486页右栏第3段，图1A，第488页左栏第1-2段，右栏第1段 *
蛋鸡传染性法氏囊病的流行病学、病理变化与防控;崔玉英;《现代畜牧科技》;20191231(第11期);第100-101页 *

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