CN102719471B - 整合质粒pOPHI及无抗性筛选标记的自主发光分枝杆菌 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种整合质粒pOPHI及无抗性筛选标记的自主发光分枝杆菌，所述整合质粒pOPHI包括启动子，发光所需酶基因（LuxCDABE），整合酶基因（Int）和抗性筛选基因的融合基因，位于融合基因两端的同向重复序列DifR和DifL，以及噬菌体整合位点(attP)和复制子。整合质粒pOPHI转入分枝杆菌后，经过传代培养筛选出抗性基因和整合酶基因均丢失的发光菌即为无抗性筛选标记的自主发光分枝杆菌。构建得到的无抗性筛选标记的自主发光分枝杆菌可通过细菌的发光与否来判断其死活，可用于多种实验检测，能快速得到可信的实验数据。

Description

整合质粒 pOPHI 及无抗性筛选标记的自主发光分枝杆菌

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种整合质粒pOPHI，以及一种无抗性筛选标记的自主发光分枝杆菌。

背景技术

分枝杆菌属(Mycobacterium)是一类细长略弯曲的微生物，有时有分枝或出现丝状体。目前在分类学上已将分枝杆菌属归纳于放线菌中。对人致病的放线菌可分含和不含分枝菌酸两类。分枝杆菌属于含分枝菌酸类。

本属细菌的主要特点是细胞壁含有大量脂质，主要是分枝菌酸。这和其染色性、生长特性、致病性、抵抗力等密切相关。一般不易着色，若经加温或延长染色时间而着色后能抵抗强脱色剂盐酸乙醇的脱色，故又称抗酸杆菌(acid-fast bacilli)。该菌属无鞭毛、无芽胞、一般不产生内、外毒素，其致病性和菌体成分有关。引起的疾病都呈慢性，并伴有肉芽肿。分枝杆菌种类较多，主要可分为结核分枝杆菌复合群、非结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌三类。

结核分枝杆菌可发生形态、菌落、毒力、免疫原性和耐药性等变异。卡介苗（BCG）就是Calmette和Guerin 2人(1908)将牛结核分枝杆菌在含甘油、胆汁、马铃薯的培养基中经13年230次传代而获得的减毒活疫苗株，现广泛用于预防接种。

根据菌落色素与生长速度可将非结核分枝杆菌分为4组。第Ⅳ组：迅速生长菌。在25～45℃生长。生长快，培养5～7 d即可见到菌落，菌落粗糙，有的并能产色。耻垢分枝杆菌(M ． smegmatis)即是其中一种。

结核分枝杆菌（Mtb）是引起结核病的病原菌，可侵犯全身各器官，但以肺结核为最多见。结核病至今仍为重要的传染病，全世界现在每年因结核病死亡约200万人。

结核分枝杆菌生长缓慢，难于对其进行遗传操作，需要昂贵的带负压的3级生物安全实验室，长时间培养不仅占用空间而且容易污染等等使结核分枝杆菌的研究耗时耗财耗力。

以抗Mtb药物的研发为例，抗Mtb药物的研发昂贵且周期长。近半个世纪以来尚无一种新作用机制的药物用于临床治疗。研究抗Mtb药物最核心的难题之一就是缺乏有效，快速和廉价的模型，特别是体内模型。

目前最常见的抗Mtb药物体外筛选是利用表达荧光素酶^[1]或绿色荧光蛋白（GFP: Green fluorescent protein）^[2]的重组菌或利用染料阿尔玛蓝(alamar blue)可以区分活菌与死菌的特性^[3]进行筛选。

其中，表达细菌荧光素酶操纵子的重组菌因为不需要加入底物或进行诱导，自身即可实现发光，故称之为自主发光菌。

之前构建的自主发光的Mtb并发现利用该菌可简单，快速，经济地进行大规模抗Mtb药物体外筛选和连续检测药物/疫苗在活体小鼠的效果。该发明可极大减少体外对药物筛选、评价及对药物和疫苗体内效果评价中所需的时间，精力，动物，花费等，特别是对抗Mtb药物的研发可能具有变革意义。

现有技术构建的自主发光的Mtb是通过电转化人工构建的质粒，然后将自主发光元件框整合到Mtb基因组中从而使之发光。现有技术方案的实现方式：现有技术方案主要是利用整合质粒pTYOK^[4]。该质粒含有荧光素酶操纵子基因luxCDABE、卡那霉素抗性基因、整合酶基因Int。LuxCDABE : 荧光素酶操纵子，该系列基因的表达使得宿主菌可以自主发光。整合酶基因Int，可以表达出整合酶，将质粒整合进分枝杆菌的基因组中。将此质粒电转化入Mtb菌中，使用卡那抗性筛选出阳性克隆，并检测到发光，即获得目标菌株。但该菌株由于含有卡那霉素抗性基因，在药物筛选/评价中，可能存在交叉抗性。由于对分枝杆菌进行遗传操作，仅有卡那霉素抗性基因和潮霉素抗性基因比较有效。因此，利用可自主发光分枝杆菌进行研究时，如果所用菌株具有抗性基因，这会对以后的遗传操作带来不便。例如，基因敲除/遗传互补一般至少需2种抗性基因；重组工程技术也需要至少2种抗性基因等。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种整合质粒pOPHI。

本发明的另一个目的是提供一种无抗性筛选标记的自主发光分枝杆菌。

本发明所采用的技术方案是：

整合质粒pOPHI，其包括：启动子，发光所需酶基因（LuxCDABE），整合酶基因（Int）和抗性筛选基因的融合基因，位于融合基因两端的同向重复序列DifR和DifL，以及噬菌体整合位点(attP)和复制子。

所述启动子为Hsp60启动子。

所述抗性筛选基因为潮霉素抗性基因（Hyg），其序列如SEQ ID NO:9所示。

所述DifR和DifL的序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。

所述复制子为大肠杆菌复制子（rep ）。

整合质粒pOPHI，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

整合质粒pOPHI的构建方法，包括如下步骤：

1）构建质粒pP：起始质粒pblueInt用限制性内切酶PstI 消化后，回收3.6 kb片段，加入连接酶使其自身环化，得到3.6 kb的质粒pP；

2）构建质粒pOP： 用限制性内切酶KpnI和XhoI消化质粒pP，得到3.6 kb功能片段；用限制性内切酶KpnI和XhoI消化质粒pluxOK；回收6.3kb 的功能片段KpnI-Hsp60-luxCDABE-XhoI；将上述2种功能片段进行连接，得到9.9 kb的质粒pOP；

3）构建质粒pUCDis： 用限制性内切酶KpnI和HindIII消化质粒pUC19，回收2.6 kb的功能片段，将其与DifL（SEQ ID NO:2）、DifR（SEQ ID NO:3）进行三片段连接，得到2.7 kb的质粒pUCDis；

4）构建质粒pUCDI：将质粒pUCDis用XbaI和ClaI消化，得到2.7kb的功能片段A；以质粒pblueInt为模板，用引物 Int-f（SEQ ID NO:4）与引物Int-r1（SEQ ID NO:5）扩增出1.3kb的Int片段(SEQ ID NO:6)，片段Int经酶切（XbaI和ClaI切）后与功能片段 A进行连接，得到4.0 kb的质粒pUCDI；

5）构建质粒pUCDIH：质粒 pUCDI 用XbaI消化，连入XbaI消化的 Hyg片段（SEQ ID NO:9），得到5.1 kb的质粒pUCDIH；

6）构建质粒pOPHI： 用限制性内切酶XhoI消化质粒pOP，回收9.8 kb的功能片段，用限制性内切酶XhoI消化质粒pUCDIH，得到2.5 kb的功能片段dif-Int-Hyg-dif，将上述2个功能片段进行连接，得到12.3 kb的质粒pOPHI。

一种无抗性筛选标记的自主发光分枝杆菌，由以下方法制备得到：

1）电转化法将权利要求1～6任一项所述的整合质粒pOPHI转入分枝杆菌中，获得自主发光分枝杆菌；

2）将获得的自主发光分枝杆菌传代培养筛选出抗性基因和整合酶基因均丢失的发光菌即为无抗性筛选标记的自主发光分枝杆菌。

所述分枝杆菌包括耻垢分枝杆菌(Mycobacterium. smegmatis)，结核分枝杆菌（Mycobacterium. tuberculosis），卡介苗(Mycobacterium. bovis BCG)，海分枝杆菌（Mycobacterium. marinum），或布鲁丽坏死分枝杆菌（Mycobacterium. ulcerans）等。

步骤2）的具体操作为：将步骤1）得到的发光菌挑取少量菌落到无抗性的7H9培育基中，摇床培养，培养物稀释后铺板37℃培养，挑取多个单菌落同时划线到无抗生素的7H11板和含潮霉素（Hyg）的7H11板上，37℃培养，挑取在Hyg板上未长出，而在相应的无抗板上长出的克隆到7H9培养基中培养，再取培养物铺于Hyg板上培养，若平板上无单克隆长出，则筛选所得相应克隆是正确的丢失Hyg抗性的克隆。

本发明的有益效果在于：

1）本发明制备得到的质粒pOPHI可转入各种分枝杆菌中，从而得到可自主发光的分枝杆菌，可通过细菌的发光与否来判断其死活，可用于多种实验检测，能快速得到可信的实验数据；

2）本发明的无抗性筛选标记自主发光分枝杆菌可用于体外药物活性检测，不需要任何底物，可连续检测同一样品，1-3 天便可以看出抑菌和杀菌活性，灵敏度高，重复性强。利用本发明的自主发光分枝杆菌，可以连续对感染的小鼠进行活体、动态、无创体内药物检测和评价，不仅利用动物少，而且更具有统计学意义。该方法还具有简便易行可以进行大规模体内筛选等优点，检测一只小鼠仅需3 秒时间，一个人一天可以麻醉并检测500 只以上的小鼠。如果对所用检测仪进行改进，甚至无需麻醉小鼠即可进行活体检测。我们用该菌株对作用机制不同的7 种抗Mtb药进行体内活性检测，发现：给药后1 到2 天即可判断其有无体内药物活性，3 到4 天即可以判断该药是具有抑菌还是杀菌活性。所需化合物量少；

3）相对于现有的具有抗性标记的自主发光分枝杆菌，本发明的自主发光分枝杆菌因为没有抗性基因，所以更加更加适用于大规模操作（抗性基因的表达可能对菌的生长，对药物的敏感性等有一定的影响）。

附图说明

图1质粒pP、pOP的构建流程图；

图2 质粒pUCDIH 构建流程图；

图3 质粒pOPHI 构建流程图；

图4质粒pNBV1酶切图谱；

图5 质粒pOPHI的酶切图谱；

图6 发光菌形态图；

图7将转化后所获得的发光菌进行传代的示意图；

图8将传代后的发光菌分别涂布含Hyg平板和无抗生素平板示意图；

图9进一步验证筛选获得的发光菌株抗性已丢失。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括PCR扩增、质粒提取、质粒转化、DNA片段连接、酶切、凝胶电泳等都采用常规的方法，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版) (Sambrook J, Russell DW，Janssen K, Argentine J.黄培堂等译，2002，北京：科学出版社)。

以下实施例中PCR反应所用的pfu酶、dNTP以及相关试剂均购买自上海生工生物有限公司；抗生素潮霉素购自罗氏公司；大肠杆菌感受态DH5a购买于广州东盛生物科技有限公司，货号为C1042；DNA连接反应均采用Takara 宝生物公司的 T4 DNA连接试剂盒，型号：D6020A；质粒DNA提取试剂盒（BSC01M1）、DNA回收试剂盒（BSC02M1）、PCR纯化试剂盒（BSC03M1）购自博日生物公司。

实施例 1

构建整合质粒pOPHI，构建流程见图1～3，质粒pOPHI的图谱见图5。如图5所示，质粒pOPHI含有分枝杆菌强启动子（Hsp60），发光所需酶基因（LuxCDABE），整合酶基因（Int）和潮霉素抗性基因（Hyg）的融合基因，位于融合基因两端的同向重复序列DifR和DifL，噬菌体整合位点(attP)，以及氨苄青霉素抗性基因（Ampr）和复制子（Rep）。各元件的功能如下：

Hsp60：一种分枝杆菌强启动子，可以启动后续基因的强表达。

LuxCDABE：发光所需酶基因，该基因的表达使得宿主菌可以自主发光 ^[5] 。

整合酶基因（Int）：可以表达出整合酶，将质粒整合进分枝杆菌的基因组中。整合酶的作用是可逆的，即它既可以将含有attP 的序列的质粒整合到基因组attB位点，也可以再将其解离下来。因此，在最终的目标菌中如不含有该基因，不会起到解离作用，则构建的菌株可能更稳定。

潮霉素抗性基因（Hyg）： 潮霉素抗性基因（Hyg）是一种选择标记，用于筛选获得目的菌株。潮霉素抗性基因（Hyg）在分枝杆菌和大肠杆菌中表达后，可使宿主获得对潮霉素（hygromycin，缩写为Hyg）的抗性，即可在含有Hyg的培养基中生长。潮霉素是一种常用的抗性筛选药物，用于分枝杆菌的Hyg浓度为50ug/mL，用于大肠杆菌的Hyg浓度为200ug/mL。

同向重复序列dif：该序列可以被分枝杆菌自身的一种解离酶识别，并高效切除，因而可以在后续操作中去掉潮霉素抗性基因和整合酶基因。

噬菌体整合位点(attP)：整合酶获得表达后，可通过结合此位点将整个质粒整合进分枝杆菌的基因组中的attB 位点。即此位点的主要作用是被整合酶结合，起整合到基因组的作用。

氨苄青霉素抗性基因（Ampr）：是一种筛选标记，但只在大肠杆菌等细菌中起作用,在分枝杆菌中无作用，因为分枝杆菌对氨苄青霉素天然耐药。

复制子（Rep）：负责质粒在大肠杆菌中复制的元件。

质粒pOPHI的具体构建方法如下：

1、质粒pP的构建

起始质粒pblueInt（由美国约翰霍普金斯大学，Eric Nuermberger教授惠赠，其质粒图谱见图1，具体构建方法见参考文献4 ）用限制性内切酶PstI 消化后，去掉功能片段Int，使之成为残存的无功能的Int ’，回收3.6 kb的片段，加入连接酶使其自身环化，得到3.6 kb的质粒pP（见图1），转化大肠杆菌感受态DH5α，利用含氨苄青霉素抗性的LB固体平板筛选出阳性克隆，挑取单克隆到LB液体培养基中培养后，提取质粒，用限制性内切酶PstI酶切鉴定质粒pP，正确的质粒 pP可切下3.6 kb左右的单一条带。

2、质粒pOP的构建

用限制性内切酶KpnI和XhoI消化质粒pP，凝胶回收试剂盒回收3.6kb的功能片段；用限制性内切酶KpnI和XhoI消化质粒pluxOK（由美国约翰霍普金斯大学，Eric Nuermberger教授惠赠，其质粒图谱见图1，具体构建方法见参考文献4 ），回收6.3 kb 的功能片段KpnI-Hsp60-luxCDABE-XhoI；将上述2种功能片段进行连接，得到9.9 kb的质粒pOP（见图1）， 转化大肠杆菌感受态DH5α，利用含氨苄青霉素抗性的LB固体平板筛选出阳性克隆，挑取单克隆到LB液体培养基中培养后，提取质粒，用限制性内切酶KpnI和 XhoI酶切鉴定质粒pOP，正确的质粒 pOP可切下3.6kb 和6.3 kb 两个条带。

3、质粒pUCDis的构建

1）用限制性内切酶KpnI和HindIII消化质粒pUC19，回收2.6kb的功能片段；

2）由上海捷瑞生物工程有限公司合成DifL（SEQ ID NO:2）和DifR（SEQ ID NO:3）片段，合成的Dif-L两端带有HindIII和XbaI酶切位点，DifR两端带有XbaI和KpnI酶切位点；

3）将pUC19酶切后的2.6kb功能片段和DifL、DifR片段进行三片段连接，得到2.7kb的质粒pUCDis（见图2），然后转化大肠杆菌感受态DH5α，利用含氨苄青霉素抗性的LB固体平板筛选出阳性克隆，用限制性内切酶EcoRI酶切鉴定质粒pUCDis，正确的质粒可切下2.7kb左右的单一条带。

4、构建质粒pUCDI

1）将质粒pUCDis用XbaI和ClaI消化，得到2.7kb的功能片段；

2）以质粒pblueInt为模板，用引物 Int-f（SEQ ID NO:4）与引物Int-r1（SEQ ID NO:5）扩增出1.3kb的Int(SEQ ID NO:6)片段；

3）片段Int经XbaI和ClaI酶切后与pUCDis酶切后得到的2.7kb功能片段进行连接反应，得到4.0kb的质粒pUCDI（见图2）。转化大肠杆菌感受态DH5α，利用含氨苄青霉素抗性的LB固体平板筛选出阳性克隆，用限制性内切酶XbaI和ClaI酶切鉴定质粒pUCDI，正确的质粒pUCDI可切下2.7kb 和1.3kb 两个条带。

5、构建质粒pUCDIH

1）以质粒pNBV1（由美国约翰霍普金斯大学William Bishai实验室惠赠，质粒图谱见图4，具体构建方法见参考文献6）为模板，以引物hyg-f(SEQ ID NO:7)和hyg-r(SEQ ID NO:8)扩增获得Hyg片段，将该Hyg片段送上海捷瑞生物工程有限公司进行突变，将片段中仅有的一个KpnI酶切位点 (GGTACC)突变为GGTACA ；将片段中仅有的1个EcoRI酶切位点 (GAATTC)突变为GAATTA，从而去掉了内部的KpnI和EcoRI位点，最后序列见SEQ ID NO:9，序列首尾均为XbaI酶切位点。

2）质粒 pUCDI 用XbaI消化，回收约4.0 kb的片段， hyg片段（SEQ ID NO:9）用XbaI消化，回收约1.1 kb的片段，将上述两个片段进行连接，得到5.1kb的质粒pUCDIH（见图2），转化大肠杆菌感受态DH5α，利用含Hyg抗性的LB固体平板筛选出阳性克隆，扩大培养，提取质粒，用限制性内切酶XbaI酶切鉴定质粒pUCDIH，正确的质粒pUCDIH可切下4.0kb 和1.1kb 两个条带。

6、质粒pOPHI的构建

1）用限制性内切酶XhoI消化质粒pOP，回收约9.8 kb的载体片段；

2）用限制性内切酶XhoI消化质粒pUCDIH，回收2.5 kb的片段 DifL-Int-Hyg-DifR；

3）将上述两个片段进行连接，得到12.3kb的质粒pOPHI（见图3），转化大肠杆菌感受态DH5α，利用含Hyg抗性的LB固体平板筛选出阳性克隆，挑取单克隆到LB液体培养基中培养后，提取质粒，酶切鉴定出正确的克隆即为质粒pOPHI。用限制性内切酶XhoI酶切鉴定质粒pOPHI，正确的质粒pOPHI可切下9.8 kb 和2.5kb 两个条带。

实施例 2

一种无抗性筛选标记的自主发光分枝杆菌的制备方法

本实施例涉及的7H9培养基、7H11培养基、吐温80均购自广州华奇盛生物公司。

Biorad 电转化仪（Biorad GenePulser Xcell）以及电转杯购自Biorad公司。

1. 需要准备的材料：

1）耻垢分枝杆菌（Mycobacterium. smegmatis），可从中国普通微生物菌种保藏管理中心获得，编号为1.2621。

2) 10% 甘油+0.05% Tween 80 [20ml 甘油+180毫升水+100ul Tween 80，并用0.2µm滤器过滤。要求新鲜配制，不得超过1周。

3）灭菌的玻璃珠，50ml离心管，Biorad 的0.2cm的电转杯，25 ml移液管。

4）50ml长好的对数期的菌液[菌液的OD值，达到0.6-1.3]。带滤芯的1ml枪尖。

2. 电转化：

1) 将待转菌（耻垢分枝杆菌，Mycobacterium. smegmatis）接种至含有50 mL 7H9(含0.1% tween 80)的液体培养基的锥形瓶中，37℃摇菌扩增。

冻存甘油菌需要先加到含有5ml培养基的50ml 离心管复壮，待长起之后，需取>2ml，接种到含有50 mL 7H9(含0.1% tween 80)的液体培养基的锥形瓶中；

菌落需刮取上百个菌落加入含有50 mL 7H9(含0.1% tween 80)的液体培养基的锥形瓶中，同时锥形瓶中需加入10颗左右的玻璃珠；

普通生长的或在4℃保存的菌，接种时可以取1至5ml加入含有50 mL 7H9(含0.1% tween 80)的液体培养基的锥形瓶中。

2) 检测菌液的OD值，若达到0.6-1.3，则可进行电转化。

3) 将40ml菌液转至50 mL离心管中，加入10~13颗玻璃珠后，于涡旋器中充分涡旋5分钟后[目的是将菌团块打散]，于4℃离心机中6000 rpm离心8分钟。

4) 加入40mL 10%甘油，于涡旋器中充分洗涤细菌后，于4℃离心机中6000 rpm离心8分钟。

5) 重复步骤4）2次后，留约1 mL上清，用带滤芯的枪尖，吹吸充分混匀后于冰上放置。

6) 于标记好的0.2cm的电转杯中，分别加入10 µL 浓缩后的质粒pOPHI和200 µL分枝杆菌感受态细胞。轻柔吹吸充分混匀后于冰上放置10分钟，加入电转仪前擦尽电转杯上的水分。

7) 用Biorad 电转化仪进行电转化，以电压2.5KV、电阻1000 Ω、电容25µF脉冲波进行电转化。未加DNA的细菌阴性对照的脉冲时间应于19~21秒间，该时间范围显示待转细菌处于良好状态。若感受态细胞洗得不干净或质粒含盐较多，会发生爆炸。

8）迅速用带滤芯的枪尖于电转液中加入2 mL 7H9(含吐温80)培养基(先用1 mL转移电转液，再用1 mL洗涤电转杯)，转移至50mL离心管中。

9）于37度孵箱中孵育4～12小时，充分复活细菌并使其抗性表达。

10）用带滤芯的枪尖吹吸混匀后，1ml/1.5ml tube 分装，10000 rpm离心1分钟沉淀转化菌，弃上清，用0.6 mL 7H9培养基重悬后，以500 µL/板铺于含抗生素[50ug/ml Hyg]的7H11培养板中。同时稀释一百倍后，500 µL/板铺Hyg板。

11) 避光于37℃孵箱培养。

备注：待转菌为耻垢分枝杆菌时，所用到的试剂及耗材均需于4℃预冷，电转全过程需冰浴中完成。培养耻垢分枝杆菌 的7H9 /7H11可以加: 放线菌酮，羧苄青霉素，浓度均为50ug/mL。

上述操作中的待转菌除了可用耻垢分枝杆菌(Mycobacterium. smegmatis)外，还可选用其它的分枝杆菌如：结核分枝杆菌（Mycobacterium. tuberculosis），卡介苗(Mycobacterium. bovis BCG)，海分枝杆菌（Mycobacterium. marinum），布鲁丽坏死分枝杆菌（Mycobacterium. ulcerans）等等。

3、检测平板上生长出的单克隆菌落发光值的大小

1）将Hyg板上生长的单个菌，挑取到含有100uL 7H9培养基的1.5mL 离心管中，混匀后，将离心管放入发光检测仪器（普洛麦格公司的GLOMAX2020），检测发光值大小。根据经验，一般发光值在100以下的可认定为不发光，发光值在10⁵或更高的可认定为发光很强。

2）对于发光很强的单个菌落，在暗室中，凭肉眼可以看到明显的蓝色荧光（见图6）。

4、选取发光值在10⁵或更高的单克隆进行传代，筛选出抗性基因和整合酶基因均丢失的发光菌即为目标菌株。

具体筛选方法如下（图7～9）：

1）连续传代摇菌培养

从平板上，挑取发光值在10⁵或更高的单克隆接种到5mL7H9培养基中，摇床振荡培养约2天。将培养所得的菌液适当稀释后，进行铺板，以每个平板上长出5～50个菌落为宜。

平板37℃培养3天后观察，挑取100-200个单菌落同时划线到无抗生素的7H11板和含50ug/mL Hyg的7H11板，并对应编号；

放置37℃培养箱培养3天左右，可观察在Hyg板上是否有未长出的克隆，而在相应的无抗板上长出，挑取相应的克隆到5mL 7H9培养基中培养约2天，取500微升培养物铺于Hyg板（50ug/mL），培养2 ~3 天，若平板上无单克长出，则筛选所得相应克隆是正确的丢失Hyg抗性的克隆，即丢失潮霉素抗性基因（Hyg）和整合酶基因的克隆（图8、图9）。

利用上述制备得到的菌株进行体外药物活性检测，不需要任何底物，可连续检测同一样品，1-3 天便可以看出抑菌和杀菌活性，灵敏度高，重复性强。利用自主发光分枝杆菌，可以连续对感染的小鼠进行活体、动态、无创体内药物检测和评价，不仅利用动物少，而且更具有统计学意义。该方法还具有简便易行可以进行大规模体内筛选等优点，检测一只小鼠仅需3 秒时间，一个人一天可以麻醉并检测500 只以上的小鼠。如果对所用检测仪进行改进，甚至无需麻醉小鼠即可进行活体检测。我们用该菌株对作用机制不同的7 种抗Mtb药进行体内活性检测，发现：给药后1 到2 天即可判断其有无体内药物活性，3 到4 天即可以判断该药是具有抑菌还是杀菌活性。所需化合物量少。

参考文献：

[1]Zhang TY, Bishai WR, Grosset JH, Nuermberger EL. Rapid assessment of antibacterial activity against mycobacterium ulcerans by using recombinant luminescent strains. Antimicrob Agents Chemother 2010;54:2806-2813.

[2] Hakkila K, Maksimow M, Karp M, Virta M. Reporter genes lucff, luxcdabe, gfp, and dsred have different characteristics in whole-cell bacterial sensors. Anal Biochem 2002;301:235-242.

[3] Collins LA, Franzblau SG. Microplate alamar blue assay versus bactec 460 system for high-throughput screening of compounds against Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium. Antimicrob Agents Chemother 1997;41:1004-1009.

[4] Zhang T, Li SY, Nuermberger EL. Autoluminescent Mycobacterium tuberculosis for Rapid, Real-Time, Non-Invasive Assessment of Drug and Vaccine Efficacy. PLoS ONE. (2012), 7(1): e29774.

[5] Hakkila K, Maksimow M, Karp M, Virta M (2002) Reporter genes lucFF, luxCDABE, gfp, and dsred have different characteristics in whole-cell bacterial sensors. Anal Biochem 301: 235-242.

[6] Howard NS, Gomez JE, Ko C, Bishai WR. Color selection with a hygromycin-resistance-based escherichia coli-mycobacterial shuttle vector. Gene 1995;166:181-182。

<110> 中国科学院广州生物医药与健康研究院

<120> 整合质粒pOPHI及无抗性筛选标记的自主发光分枝杆菌

<130>

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 12330

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt 60

caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa 120

ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt 180

gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt 240

tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt 300

ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg 360

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atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa 480

gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga 540

caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa 600

ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca 660

ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta 720

ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac 780

ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc 840

gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag 900

ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga 960

taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt 1020

agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata 1080

atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag 1140

aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa 1200

caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt 1260

ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc 1320

cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa 1380

tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa 1440

gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc 1500

ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa 1560

gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa 1620

caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg 1680

ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc 1740

tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg 1800

ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg 1860

agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg 1920

aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat 1980

gcagctggca cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg 2040

tgagttagct cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt 2100

tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg 2160

ccaagcgcgc aattaaccct cactaaaggg aacaaaagct gggtacctct agaggataga 2220

atggcgccgg gcctttcttt atgtttttgg cgtcttccat ggagcctcct cgattcctcc 2280

ggatcgggga tgaaacgggg gtcaccgggt gacggcaacc ccgctactta cgctggccgg 2340

gcgcagtgcc cgcgacggac ggctcaagtt gtcctcgctg ccactcgctg cgacgacggg 2400

cctggcctca ccgtcccgac ctagcactca ccggtcgcga gtgccaacgt tattcttagc 2460

actcgcctat gccgagtgca agaagccccg caccgggtca tgcccctcgt tcgaccttgt 2520

cctcggccct ccgatccggg tgagtatgtt cggcccatga ccgccaacga caacaagacc 2580

cgtaaatggt cggccgcaga cgtccccgat caaagcgggc gcgtcgttgt ggtcaccgga 2640

tcccccgggt ctagaattca ggcttggagg atacgtatga ctaaaaaaat ttcattcatt 2700

attaacggcc aggttgaaat ctttcccgaa agtgatgatt tagtgcaatc cattaatttt 2760

ggtgataata gtgtttacct gccaatattg aatgactctc atgtaaaaaa cattattgat 2820

tgtaatggaa ataacgaatt acggttgcat aacattgtca attttctcta tacggtaggg 2880

caaagatgga aaaatgaaga atactcaaga cgcaggacat acattcgtga cttaaaaaaa 2940

tatatgggat attcagaaga aatggctaag ctagaggcca attggatatc tatgatttta 3000

tgttctaaag gcggccttta tgatgttgta gaaaatgaac ttggttctcg ccatatcatg 3060

gatgaatggc tacctcagga tgaaagttat gttcgggctt ttccgaaagg taaatctgta 3120

catctgttgg caggtaatgt tccattatct gggatcatgt ctatattacg cgcaatttta 3180

actaagaatc agtgtattat aaaaacatcg tcaaccgatc cttttaccgc taatgcatta 3240

gcgttaagtt ttattgatgt agaccctaat catccgataa cgcgctcttt atctgttata 3300

tattggcccc accaaggtga tacatcactc gcaaaagaaa ttatgcgaca tgcggatgtt 3360

attgtcgctt ggggagggcc agatgcgatt aattgggcgg tagagcatgc gccatcttat 3420

gctgatgtga ttaaatttgg ttctaaaaag agtctttgca ttatcgataa tcctgttgat 3480

ttgacgtccg cagcgacagg tgcggctcat gatgtttgtt tttacgatca gcgagcttgt 3540

ttttctgccc aaaacatata ttacatggga aatcattatg aggaatttaa gttagcgttg 3600

atagaaaaac ttaatctata tgcgcatata ttaccgaatg ccaaaaaaga ttttgatgaa 3660

aaggcggcct attctttagt tcaaaaagaa agcttgtttg ctggattaaa agtagaggtg 3720

gatattcatc aacgttggat gattattgag tcaaatgcag gtgtggaatt taatcaacca 3780

cttggcagat gtgtgtacct tcatcacgtc gataatattg agcaaatatt gccttatgtt 3840

caaaaaaata agacgcaaac catatctatt tttccttggg agtcatcatt taaatatcga 3900

gatgcgttag cattaaaagg tgcggaaagg attgtagaag caggaatgaa taacatattt 3960

cgagttggtg gatctcatga cggaatgaga ccgttgcaac gattagtgac atatatttct 4020

catgaaaggc catctaacta tacggctaag gatgttgcgg ttgaaataga acagactcga 4080

ttcctggaag aagataagtt ccttgtattt gtcccataat aggtaaaagt atggaaaatg 4140

aatcaaaata taaaaccatc gaccacgtta tttgtgttga aggaaataaa aaaattcatg 4200

tttgggaaac gctgccagaa gaaaacagcc caaagagaaa gaatgccatt attattgcgt 4260

ctggttttgc ccgcaggatg gatcattttg ctggtctggc ggaatattta tcgcggaatg 4320

gatttcatgt gatccgctat gattcgcttc accacgttgg attgagttca gggacaattg 4380

atgaatttac aatgtctata ggaaagcaga gcttgttagc agtggttgat tggttaacta 4440

cacgaaaaat aaataacttc ggtatgttgg cttcaagctt atctgcgcgg atagcttatg 4500

caagcctatc tgaaatcaat gcttcgtttt taatcaccgc agtcggtgtt gttaacttaa 4560

gatattctct tgaaagagct ttagggtttg attatctcag tctacccatt aatgaattgc 4620

cggataatct agattttgaa ggccataaat tgggtgctga agtctttgcg agagattgtc 4680

ttgattttgg ttgggaagat ttagcttcta caattaataa catgatgtat cttgatatac 4740

cgtttattgc ttttactgca aataacgata attgggtcaa gcaagatgaa gttatcacat 4800

tgttatcaaa tattcgtagt aatcgatgca agatatattc tttgttagga agttcgcatg 4860

acttgagtga aaatttagtg gtcctgcgca atttttatca atcggttacg aaagccgcta 4920

tcgcgatgga taatgatcat ctggatattg atgttgatat tactgaaccg tcatttgaac 4980

atttaactat tgcgacagtc aatgaacgcc gaatgagaat tgagattgaa aatcaagcaa 5040

tttctctgtc ttaaaatcta ttgagatatt ctatcactca aatagcaata taaggactct 5100

ctatgaaatt tggaaacttt ttgcttacat accaacctcc ccaattttct caaacagagg 5160

taatgaaacg tttggttaaa ttaggtcgca tctctgagga gtgtggtttt gataccgtat 5220

ggttactgga gcatcatttc acggagtttg gtttgcttgg taacccttat gtcgctgctg 5280

catatttact tggcgcgact aaaaaattga atgtaggaac tgccgctatt gttcttccca 5340

cagcccatcc agtacgccaa cttgaagatg tgaatttatt ggatcaaatg tcaaaaggac 5400

gatttcggtt tggtatttgc cgagggcttt acaacaagga ctttcgcgta ttcggcacag 5460

atatgaataa cagtcgcgcc ttagcggaat gctggtacgg gctgataaag aatggcatga 5520

cagagggata tatggaagct gataatgaac atatcaagtt ccataaggta aaagtaaacc 5580

ccgcggcgta tagcagaggt ggcgcaccgg tttatgtggt ggctgaatca gcttcgacga 5640

ctgagtgggc tgctcaattt ggcctaccga tgatattaag ttggattata aatactaacg 5700

aaaagaaagc acaacttgag ctttataatg aagtggctca agaatatggg cacgatattc 5760

ataatatcga ccattgctta tcatatataa catctgtaga tcatgactca attaaagcga 5820

aagagatttg ccggaaattt ctggggcatt ggtatgattc ttatgtgaat gctacgacta 5880

tttttgatga ttcagaccaa acaagaggtt atgatttcaa taaagggcag tggcgtgact 5940

ttgtattaaa aggacataaa gatactaatc gccgtattga ttacagttac gaaatcaatc 6000

ccgtgggaac gccgcaggaa tgtattgaca taattcaaaa agacattgat gctacaggaa 6060

tatcaaatat ttgttgtgga tttgaagcta atggaacagt agacgaaatt attgcttcca 6120

tgaagctctt ccagtctgat gtcatgccat ttcttaaaga aaaacaacgt tcgctattat 6180

attagctaag gagaaagaaa tgaaatttgg attgttcttc cttaacttca tcaattcaac 6240

aactgttcaa gaacaaagta tagttcgcat gcaggaaata acggagtatg ttgataagtt 6300

gaattttgaa cagattttag tgtatgaaaa tcatttttca gataatggtg ttgtcggcgc 6360

tcctctgact gtttctggtt ttctgctcgg tttaacagag aaaattaaaa ttggttcatt 6420

aaatcacatc attacaactc atcatcctgt cgccatagcg gaggaagctt gcttattgga 6480

tcagttaagt gaagggagat ttattttagg gtttagtgat tgcgaaaaaa aagatgaaat 6540

gcattttttt aatcgcccgg ttgaatatca acagcaacta tttgaagagt gttatgaaat 6600

cattaacgat gctttaacaa caggctattg taatccagat aacgattttt atagcttccc 6660

taaaatatct gtaaatcccc atgcttatac gccaggcgga cctcggaaat atgtaacagc 6720

aaccagtcat catattgttg agtgggcggc caaaaaaggt attcctctca tctttaagtg 6780

ggatgattct aatgatgtta gatatgaata tgctgaaaga tataaagccg ttgcggataa 6840

atatgacgtt gacctatcag agatagacca tcagttaatg atattagtta actataacga 6900

agatagtaat aaagctaaac aagagacgcg tgcatttatt agtgattatg ttcttgaaat 6960

gcaccctaat gaaaatttcg aaaataaact tgaagaaata attgcagaaa acgctgtcgg 7020

aaattatacg gagtgtataa ctgcggctaa gttggcaatt gaaaagtgtg gtgcgaaaag 7080

tgtattgctg tcctttgaac caatgaatga tttgatgagc caaaaaaatg taatcaatat 7140

tgttgatgat aatattaaga agtaccacat ggaatatacc taatagattt cgagttgcag 7200

cgaggcggca agtgaacgaa tccccaggag catagataac tatgtgactg gggtgagtga 7260

aagcagccaa caaagcagca gcttgaaaga tgaagggtat aaaagagtat gacagcagtg 7320

ctgccatact ttctaatatt atcttgagga gtaaaacagg tatgacttca tatgttgata 7380

aacaagaaat tacagcaagc tcagaaattg atgatttgat tttttcgagc gatccattag 7440

tgtggtctta cgacgagcag gaaaaaatca gaaagaaact tgtgcttgat gcatttcgta 7500

atcattataa acattgtcga gaatatcgtc actactgtca ggcacacaaa gtagatgaca 7560

atattacgga aattgatgac atacctgtat tcccaacatc ggtttttaag tttactcgct 7620

tattaacttc tcaggaaaac gagattgaaa gttggtttac cagtagcggc acgaatggtt 7680

taaaaagtca ggtggcgcgt gacagattaa gtattgagag actcttaggc tctgtgagtt 7740

atggcatgaa atatgttggt agttggtttg atcatcaaat agaattagtc aatttgggac 7800

cagatagatt taatgctcat aatatttggt ttaaatatgt tatgagtttg gtggaattgt 7860

tatatcctac gacatttacc gtaacagaag aacgaataga ttttgttaaa acattgaata 7920

gtcttgaacg aataaaaaat caagggaaag atctttgtct tattggttcg ccatacttta 7980

tttatttact ctgccattat atgaaagata aaaaaatctc attttctgga gataaaagcc 8040

tttatatcat aaccggaggc ggctggaaaa gttacgaaaa agaatctctg aaacgtgatg 8100

atttcaatca tcttttattt gatactttca atctcagtga tattagtcag atccgagata 8160

tatttaatca agttgaactc aacacttgtt tctttgagga tgaaatgcag cgtaaacatg 8220

ttccgccgtg ggtatatgcg cgagcgcttg atcctgaaac gttgaaacct gtacctgatg 8280

gaacgccggg gttgatgagt tatatggatg cgtcagcaac cagttatcca gcatttattg 8340

ttaccgatga tgtcgggata attagcagag aatatggtaa gtatcccggc gtgctcgttg 8400

aaattttacg tcgcgtcaat acgaggacgc agaaagggtg tgctttaagc ttaaccgaag 8460

cgtttgatag ttgactcgag acttgacata atgtcgctta tcggcttaat cgatctcagt 8520

gtccttggga ggggggcttt ttgcgtttca ggaggtcttg gccagcttgg acatcgcctc 8580

agcgatagcc tcgtcgcggg cctcagacgc catctggtac ttcatcgcca tcctaggagt 8640

cgtgtgaccg agacgggcca tcagctcctt ggtcgtcgca cctgcctgag cggcgaacgt 8700

agcgccgaca gcgcggaggt cgtggatgcg gagttccggc cgaccgatct tggcgtagcc 8760

acgcttcagc gacttggtga acgcggactt cgacagccgg ttgccctgcg tcgtggtcac 8820

caggaatgcc tcggggccct tgttcatctt cgtacggtcc ttcatgtgcg ctcggatcat 8880

ctccgcgacg tgaggcggaa ccgtcacagg acgcttcgac cggacggtct tggcgttgcc 8940

aacgacgatc ttgttcccca cgcgggaagc gccacggcgc acccggagct tcatcgtcat 9000

gccgtcgtcc acgatgtcct tgcggcgaag ctcgatcagc tctccgaacc ggaggctcgt 9060

ccacgccagg atgtatgccg cgatccggta gtgctcgaag atctcagcgg cgacgatgtc 9120

cagctcctca ggcgtcagcg cctctacgtc gcgctcatcg gctgccttct gctcgatccg 9180

gcacgggttc tctgcgatca gcttgtcctc gaccgctgtg ttcatcaccg cccggaggac 9240

gttgtaggca tgccggcggg cagtcgggtg cttcctaccc atcccggccc accacgcacg 9300

caccagagct ggcgtcatct ctgtgaccgc cacttcacct agcaccgggt agatgcggcg 9360

ctccgcgtgc ccgctgtaca gatccctggt gccgtctgcg aggtcgcgct ccacgagcca 9420

cttccgggtg tactcctcca gcgtgatggc gctggcggct gccttcttcg cccggtcctg 9480

tggaggggtc caggtctcca tctcgatgag ccgcttctcg cccgcgagcc aggcttcggc 9540

gtccatcttg ttgtcgtagg tctgcagcgc gtagtacctc acaccgtcct gcgggttgac 9600

gtatgaggct tggatcctcc cgctgcgctg agtcttcagc gatccccatc cgcgacgtgc 9660

caactaggtc tcctctcgtc gtgaacaagg ctaccgggtt gcaactcctg tgcaactctc 9720

aggcttcaac gcgcttctac gacctgcaat ttctttccac ttagaggatg cagccgagag 9780

ggggtaaaaa cctatcttga ccggcccata tgtggtcggc agacacccat tcttccaaac 9840

tagtctagac cggccgtgcg gaattaagcc ggcccgtacc ctgtgaatag aggtccgctg 9900

tgacacaaga atccctgtta cttctcgacc gtattgattc ggatgattcc tacgcgagcc 9960

tgcggaacga ccaggagttc tgggagccgc tggcccgccg agccctggag gagctcgggc 10020

tgccggtgcc gccggtgctg cgggtgcccg gcgagagcac caaccccgta ctggtcggcg 10080

agcccggccc ggtgatcaag ctgttcggcg agcactggtg cggtccggag agcctcgcgt 10140

cggagtcgga ggcgtacgcg gtcctggcgg acgccccggt tccggtgccc cgcctcctcg 10200

gccgcggcga gctgcggccc ggcaccggag cctggccgtg gccctacctg gtgatgagcc 10260

ggatgaccgg caccacctgg cggtccgcga tggacggcac gaccgaccgg aacgcgctgc 10320

tcgccctggc ccgcgaactc ggccgggtgc tcggacggct gcacagggtg ccgctgaccg 10380

ggaacaccgt gctcaccccc cattccgagg tcttcccgga actgctgcgg gaacgccgcg 10440

cggcgaccgt cgaggaccac cgcgggtggg gctacctctc gccccggctg ctggaccgcc 10500

tggaggactg gctgccggac gtggacacgc tgctggccgg ccgcgaaccc cggttcgtcc 10560

acggcgacct gcacgggacc aacatcttcg tggacctggc cgcgaccgag gtcaccggga 10620

tcgtcgactt caccgacgtc tatgcgggag actcccgcta cagcctggtg caactgcatc 10680

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tgttcgagga gaccccgctg gatctctccg gcttcaccga tccggaggaa ctggcgcagt 10860

tcctctgggg gccgccggac accgcccccg gcgcctgaat ctagacccgg gacttgacat 10920

aatgtcgctt atcggcttac tcgaggtcgg ggatcctcta gagtcgacca ccaagggcac 10980

catctctgct tgggccaccc cgttggccgc agccagctcg ctgagagccg tgaacgacag 11040

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gtcccggtct attctcttca ctgcaccagc tccaatctgg tgtgaatgcc cctcgtctgt 11160

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gttgcaaccg cgtatgccca ggtcagaaga gtcgcacaag agttgcagac ccctggaaag 11280

aaaaatggcc agagggcgaa aacaccctct gaccagcgga gcgggcgacg ggaatcgaac 11340

ccgcgtagct agtttggaag aatgggtgtc tgccgaccac atatgggccg gtcaagatag 11400

gtttttaccc cctctcggct gcatcctcta agtggaaaga aattgcaggt cgtagaagcg 11460

cgttgaagcc tgagagttgc acaggagttg caacccggta gccttgttca cgacgagagg 11520

agacctagtt ggcacgtcgc ggatggggat cgctgaagac tcagcgcagc gggaggatcc 11580

aagcctcata cgtcaacccg caggacggtg tgaggtacta cgcgctgcag cccgggggat 11640

ccactagttc tagagcggcc gccaccgcgg tggagctcca attcgcccta tagtgagtcg 11700

tattacgcgc gctcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa ccctggcgtt 11760

acccaactta atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca gctggcgtaa tagcgaagag 11820

gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg ggacgcgccc 11880

tgtagcggcg cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac cgctacactt 11940

gccagcgccc tagcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc cacgttcgcc 12000

ggctttcccc gtcaagctct aaatcggggg ctccctttag ggttccgatt tagtgcttta 12060

cggcacctcg accccaaaaa acttgattag ggtgatggtt cacgtagtgg gccatcgccc 12120

tgatagacgg tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag tggactcttg 12180

ttccaaactg gaacaacact caaccctatc tcggtctatt cttttgattt ataagggatt 12240

ttgccgattt cggcctattg gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt taacgcgaat 12300

tttaacaaaa tattaacgct tacaatttag 12330

<210> 2

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agcttctcga gtaagccgat aagcgacatt atgtcaagtc ccgggtctag a 51

<210> 3

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atcgattaag ccgataagcg acattatgtc aagtctcgag aagcttggta c 51

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tctagactag tttggaagaa tgggtgtctg ccgaccacat atg 43

<210> 5

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atcgatctca gtgtccttgg gaggggggct ttttgcgttt ca 42

<210> 6

<211> 1329

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ctagtttgga agaatgggtg tctgccgacc acatatgggc cggtcaagat aggtttttac 60

cccctctcgg ctgcatcctc taagtggaaa gaaattgcag gtcgtagaag cgcgttgaag 120

cctgagagtt gcacaggagt tgcaacccgg tagccttgtt cacgacgaga ggagacctag 180

ttggcacgtc gcggatgggg atcgctgaag actcagcgca gcgggaggat ccaagcctca 240

tacgtcaacc cgcaggacgg tgtgaggtac tacgcgctgc agacctacga caacaagatg 300

gacgccgaag cctggctcgc gggcgagaag cggctcatcg agatggagac ctggacccct 360

ccacaggacc gggcgaagaa ggcagccgcc agcgccatca cgctggagga gtacacccgg 420

aagtggctcg tggagcgcga cctcgcagac ggcaccaggg atctgtacag cgggcacgcg 480

gagcgccgca tctacccggt gctaggtgaa gtggcggtca cagagatgac gccagctctg 540

gtgcgtgcgt ggtgggccgg gatgggtagg aagcacccga ctgcccgccg gcatgcctac 600

aacgtcctcc gggcggtgat gaacacagcg gtcgaggaca agctgatcgc agagaacccg 660

tgccggatcg agcagaaggc agccgatgag cgcgacgtag aggcgctgac gcctgaggag 720

ctggacatcg tcgccgctga gatcttcgag cactaccgga tcgcggcata catcctggcg 780

tggacgagcc tccggttcgg agagctgatc gagcttcgcc gcaaggacat cgtggacgac 840

ggcatgacga tgaagctccg ggtgcgccgt ggcgcttccc gcgtggggaa caagatcgtc 900

gttggcaacg ccaagaccgt ccggtcgaag cgtcctgtga cggttccgcc tcacgtcgcg 960

gagatgatcc gagcgcacat gaaggaccgt acgaagatga acaagggccc cgaggcattc 1020

ctggtgacca cgacgcaggg caaccggctg tcgaagtccg cgttcaccaa gtcgctgaag 1080

cgtggctacg ccaagatcgg tcggccggaa ctccgcatcc acgacctccg cgctgtcggc 1140

gctacgttcg ccgctcaggc aggtgcgacg accaaggagc tgatggcccg tctcggtcac 1200

acgactccta ggatggcgat gaagtaccag atggcgtctg aggcccgcga cgaggctatc 1260

gctgaggcga tgtccaagct ggccaagacc tcctgaaacg caaaaagccc ccctcccaag 1320

gacactgag 1329

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

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<211> 1062

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tctagattca ggcgccgggg gcggtgtccg gcggccccca gaggaactgc gccagttcct 60

ccggatcggt gaagccggag agatccagcg gggtctcctc gaacacctcg aagtcgtgca 120

ggaaggtgaa ggcgagcagt tcgcgggcga agtcctcggt ccgcttccac tgcgccccgt 180

cgagcagcgc ggccaggatc tcgcggtcgc cccggaaggc gttgagatgc agttgcacca 240

ggctgtagcg ggagtctccc gcatagacgt cggtgaagtc gacgatcccg gtgacctcgg 300

tcgcggccag gtccacgaag atgttggtcc cgtgcaggtc gccgtggacg aaccggggtt 360

cgcggccggc cagcagcgtg tccacgtccg gcagccagtc ctccaggcgg tccagcagcc 420

ggggcgagag gtagccccac ccgcggtggt cctcgacggt cgccgcgcgg cgttcccgca 480

gcagttccgg gaagacctcg gaatgggggg tgagcacggt gttcccggtc agcggcaccc 540

tgtgcagccg tccgagcacc cggccgagtt cgcgggccag ggcgagcagc gcgttccggt 600

cggtcgtgcc gtccatcgcg gaccgccagg tggtgccggt catccggctc atcaccaggt 660

agggccacgg ccaggctccg gtgccgggcc gcagctcgcc gcggccgagg aggcggggca 720

ccggaaccgg ggcgtccgcc aggaccgcgt acgcctccga ctccgacgcg aggctctccg 780

gaccgcacca gtgctcgccg aacagcttga tcaccgggcc gggctcgccg accagtacgg 840

ggttggtgct ctcgccgggc acccgcagca ccggcggcac cggcagcccg agctcctcca 900

gggctcggcg ggccagcggc tcccagaact cctggtcgtt ccgcaggctc gcgtaggaat 960

catccgaatc aatacggtcg agaagtaaca gggattcttg tgtcacagcg gacctctatt 1020

cacagggtac gggccggctt aattccgcac ggccggtcta ga 1062

Claims (9)

1.整合质粒pOPHI，其包括：启动子，发光所需酶基因LuxCDABE，整合酶基因Int和抗性筛选基因的融合基因，位于融合基因两端的同向重复序列DifR和DifL，以及噬菌体整合位点attP和复制子；

所述表达质粒中各元件的排序顺序为：以启动子为起点，按顺时针方向依次含有发光所需酶基因LuxCDABE、整合酶基因Int和抗性筛选基因的融合基因，位于融合基因两端的同向重复序列DifR和DifL，以及噬菌体整合位点attP和复制子；

所述DifR和DifL的序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。

2.根据权利要求1所述的整合质粒pOPHI，其特征在于，所述启动子为Hsp60启动子。

3.根据权利要求1所述的整合质粒pOPHI，其特征在于，所述抗性筛选基因为潮霉素抗性基因Hyg，其序列如SEQ ID NO:9所示。

4.根据权利要求1所述的整合质粒pOPHI，其特征在于，所述复制子为大肠杆菌复制子rep。

5.根据权利要求1所述的整合质粒pOPHI，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

6.整合质粒pOPHI的构建方法，包括如下步骤：

1）构建质粒pP： 起始质粒pblueInt用限制性内切酶Pst I 消化后，回收3.6 kb片段，加入连接酶使其自身环化，得到3.6 kb的质粒pP；

2）构建质粒pOP： 用限制性内切酶KpnI和XhoI消化质粒pP，得到3.6 kb功能片段；用限制性内切酶KpnI和XhoI消化质粒pluxOK；回收6.3kb 的功能片段KpnI-Hsp60-luxCDABE-XhoI；将上述2种功能片段进行连接，得到9.9 kb的质粒pOP；

3）构建质粒pUCDis： 用限制性内切酶KpnI和HindIII消化质粒pUC19，回收2.6 kb的功能片段，将其与DifL、DifR进行三片段连接，得到2.7 kb的质粒pUCDis，所述DifL如SEQ ID NO:2所示，DifR如SEQ ID NO:3所示；

4）构建质粒pUCDI：将质粒pUCDis用XbaI和ClaI消化，得到2.7kb的功能片段A；以质粒pblueInt为模板，用引物 Int-f与引物Int-r1扩增出1.3kb的Int片段，如SEQ ID NO:6所示，片段Int经XbaI和ClaI酶切后与功能片段 A进行连接，得到4.0 kb的质粒pUCDI，所述Int-f如SEQ ID NO:4所示，Int-r1如SEQ ID NO:5所示；

5）构建质粒pUCDIH：质粒 pUCDI 用XbaI消化，连入XbaI消化的Hyg片段，如SEQ ID NO:9所示，得到5.1 kb的质粒pUCDIH；

6）构建质粒pOPHI： 用限制性内切酶Xho I消化质粒pOP，回收9.8 kb的功能片段，用限制性内切酶Xho I消化质粒pUCDIH，得到2.5 kb的功能片段dif-Int-Hyg-dif，将上述2个功能片段进行连接，得到12.3 kb的质粒pOPHI。

7.一种无抗性筛选标记的自主发光分枝杆菌，由以下方法制备得到：

1）电转化法将权利要求1～6任一项所述的整合质粒pOPHI转入分枝杆菌中，获得自主发光分枝杆菌；

2）将获得的自主发光分枝杆菌传代培养筛选出抗性基因和整合酶基因均丢失的发光菌即为无抗性筛选标记的自主发光分枝杆菌。

8.根据权利要求7的制备方法，其特征在于，所述分枝杆菌包括耻垢分枝杆菌(Mycobacterium. smegmatis)，结核分枝杆菌（Mycobacterium. tuberculosis），卡介苗(Mycobacterium. bovis BCG)，海分枝杆菌（Mycobacterium. marinum），或布鲁丽坏死分枝杆菌（Mycobacterium. ulcerans）。

9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤2）的具体操作为：将步骤1）得到的发光菌挑取少量菌落到无抗性的7H9培育基中，摇床培养，培养物稀释后铺板37℃培养，挑取多个单菌落同时划线到无抗生素的7H11板和含潮霉素Hyg的7H11板上，37℃培养，挑取在Hyg板上未长出，而在相应的无抗板上长出的克隆到7H9培养基中培养，再取培养物铺于Hyg板上培养，若平板上无单克隆长出，则筛选所得相应克隆是正确的丢失Hyg抗性的克隆。

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