CN114085863B - 一种可在产甘油假丝酵母中游离表达的双ars载体及其应用 - Google Patents

一种可在产甘油假丝酵母中游离表达的双ars载体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可在产甘油假丝酵母中游离表达的双ARS载体及其应用，属于酵母基因工程领域。本发明的表达载体采用双ARS大幅度提高了质粒自我复制性能；该游离表达载体的开放阅读框可采用产甘油假丝酵母中的内源启动子和可提高质粒性能的内源AOX1终止子；该游离表达载体的筛选标记为产甘油假丝酵母的URA5基因；该游离表达载体属穿梭质粒，还含有来自克隆载体的氨苄青霉素抗性基因以及原核生物复制原点；该表达载体首次实现了在产甘油假丝酵母中进行游离自主复制，并可应用于各种基因的游离表达。

Description

一种可在产甘油假丝酵母中游离表达的双ARS载体及其应用
技术领域
本发明涉及一种可在产甘油假丝酵母中游离表达的双ARS载体及其应用，属于酵母基因工程领域。
背景技术
产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)是从自然界中筛选分离出来的一株能够在超高渗透压(55％葡萄糖，W/V)下进行快速生长的可高产甘油的工业生产的安全菌株，与模式菌株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)相比，产甘油假丝酵母生长能力极强并且具备更高的酸胁迫，高温，高渗透压，高氧化压力等耐受性，除此外，其对许多物质等耐受性在酵母中也是出类拔萃(如10％乙醇、8％乳酸、4.5g/L苯乙醇和＞200g/L柠檬酸)，显而易见其拥有相当重要的研究价值。
游离表达的载体是表达异源基因很好的选择，其已广泛用于基础研究和合成生物学应用。酵母质粒又分为整合质粒，附加体质粒，复制质粒以及稳定质粒。对于整合质粒，其无法在菌体内进行自我复制，只能通过整合到菌体细胞基因组上借助染色体的复制机制才能进行稳定的表达；对于附加体质粒，含有酿酒酵母天然2μ质粒部分片段(复制起始部位和rep基因)或全部片段，并可在酿酒酵母中持续存在；对于复制质粒，其含有酵母DNA的自主复制序列(autonomously replicating sequence,ARS)，而ARS序列是在DNA复制中的每个细胞周期的S期仅启动一次的基因组位点，从而使其能在真核细胞中独立于染色体外进行自主的复制；对于稳定质粒，在复制质粒基础之上再向插入酵母着丝粒的一个DNA片段，使其具有两个特征序列：自主复制序列(ARS)和着丝粒序列(centromere DNA sequence,CEN)，CEN序列使其能够均分到子细胞中。
不论是作为模式菌株的酿酒酵母还是其他非常规酵母，绝大部分都已经含有可在自身进行游离表达的载体，然而，因为在产甘油假丝酵母中也并未发现天然的游离质粒，也未找到合适的游离表达载体，所以在产甘油假丝酵母中对目的基因的表达还仅限于操作十分复杂并且低拷贝的整合载体进行表达的方式，这种缺陷严重的限制了对其的分子改造、育种和研究，为了弥补产甘油假丝酵母在分子生物学改造、育种和研究技术上的短板，研发一种能在产甘油假丝酵母中游离表达的载体迫在眉睫。
发明内容
本发明提供了一种可在产甘油假丝酵母中游离表达各种基因的双ARS载体，该游离表达质粒可在无天然游离质粒的工业生产安全菌株产甘油假丝酵母中进行自主复制并用于各种目的基因的表达。
本发明提供了一种游离型表达载体，所述表达载体包括：
pMD19-T Vector骨架、目的基因表达盒、乳酸克鲁维的自主复制序列PanARS、筛选标记基因表达盒、毕赤酵母的自主复制序列PPARS2；
所述乳酸克鲁维酵母的自主复制序列PanARS的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；所述毕赤酵母的自主复制序列PPARS2的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。
在本发明的一种实施方式中，所述目的基因表达盒自上游至下游依次包括启动子、目的基因插入酶切位点、转录终止子；所述启动子包括是渗透压诱导的GAP启动子、GPD启动子、STL3启动子、酸诱导的GMT启动子和高温诱导的CWP1启动子中的任一种。
在本发明的一种实施方式中，所述TRP1终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述GAP启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述GPD启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述STL3启动子的核苷酸序列如SEQ IDNO.10所示；所述GMT启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；所述CWP1启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
在本发明的一种实施方式中，所述筛选标记基因为产甘油假丝酵母的URA5基因，所述筛选标记基因表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，所述目的基因插入酶切位点为：多克隆酶切位点(MCS)。
本发明还提供了上述游离表达载体的构建方法，该方法包含以下步骤：
S1.以产甘油假丝酵母基因已知的几种内源诱导启动子(GAP,GPD,STL3,GMT,CWP1)序列，URA5基因序列和AOX1终止子序列设计扩增引物，并且在引物上下游5’端附加25bp的质粒上下游同源重叠序列，AOX1t基因上游引物包含多克隆酶切位点(MCS)，AOX1t基因下游引物包含XhoI酶切位点，URA5基因下游引物包含KpnI酶切位点；
S2.以产甘油假丝酵母基因组DNA为模板，利用上述步骤S1所得引物，运用PCR扩增技术获得各个启动子片段，URA5基因片段和AOX1终止子片段；
S3.通过Gibson组装方法分别将步骤S1，S2和S3获得的不同启动子片段与目的基因片段，终止子片段和URA5基因片段连接起来获得5’-GAP/GPD/STL3/GMT/CWP1-目的基因-AOX1t-URA5-3’片段；
即：制备得到以下片段：
5’-GAP-目的基因-AOX1t-URA5-3’片段；
5’-GPD-目的基因-AOX1t-URA5-3’片段；
5’-STL3-目的基因-AOX1t-URA5-3’片段；
5’-GMT-目的基因-AOX1t-URA5-3’片段；
5’-CWP1-目的基因-AOX1t-URA5-3’片段。
S4.通过TA克隆方法将分别步骤S3所获得的片段连接至载体pMD19-T上，从而获得一系列载体(pTGAP/GPD/STL3/GMT/CWP1-AOX1t-URA5)；
S5.以乳酸克鲁维酵母NRRL Y-1140的panARS序列以及毕赤酵母GS115的PPARS2序列设计扩增引物，并且在引物上下游5’端附加25bp的质粒上下游同源重叠序列；
S6.以乳酸克鲁维酵母NRRL Y-1140的基因组DNA以及毕赤酵母GS115的基因组DNA为模板，利用上述步骤S5所得引物，运用PCR扩增技术获得panARS片段和PPARS2片段；
S7.以S4步骤中获得的片段为模板，通过XhoI和KpnI限制性内切酶进行双酶切，然后通过Gibson组装方法将其与步骤S6所获得的片段进行连接并转化大肠杆菌JM109，即可得到一系列产甘油假丝酵母游离表达双ARS载体(pTGAP/GPD/STL3/GMT/CWP1-AOX1t-panARS-URA5-PPARS2)。
在本发明的一种实施方式中，本发明的表达载体为：pTGAP-GFP-AOX1t-panARS-URA5-PPARS2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明化提供了携带上述表达载体的重组细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞以产甘油假丝酵母为表达宿主。
本发明还提供了一种利用产甘油假丝酵母制备目的蛋白的方法，所述方法为，将目的蛋白的基因插入上述表达载体的目的基因插入酶切位点，得到重组载体，将重组载体转化至产甘油假丝酵母中进行表达制备得到目的蛋白。
在本发明的一种实施方式中，所述目的蛋白包括但不限于，绿色荧光蛋白，4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶、NADPH-黄素氧化还原酶、酪氨酸氨裂合酶。
在本发明的一种实施方式中，所述绿色荧光蛋白基因的Gene bank登录号为：KU763376.1；编码所述4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；编码所述NADPH-黄素氧化还原酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；编码所述酪氨酸氨裂合酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明还提供了一种重组产甘油假丝酵母，含有上述表达载体，表达了4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶、NADPH-黄素氧化还原酶、酪氨酸氨裂合酶。
在本发明的一种实施方式中，所述绿色荧光蛋白基因的Gene bank登录号为：KU763376.1；编码所述4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；编码所述NADPH-黄素氧化还原酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；编码所述酪氨酸氨裂合酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明还提供了上述表达载体在产甘油假丝酵母表达外源蛋白中的应用。
本发明所提供的产甘油假丝酵母质粒表达载体可以在产甘油假丝酵母中进行自我复制并且可应用于各种目的基因的表达。
有益效果
本发明成功在产甘油假丝酵母中构建游离表达载体，实现了从无到有的跨越，使用本发明的表达载体对产甘油假丝酵母的基因改造提供了巨大的便利，克服了原先整合载体所具有的一系列弊端，如原件构造耗时耗材，基因改造困难，整合效率低，几乎为单拷贝，表达强度低、能力弱，或者整合于重复串联基因座，但其遗传不稳定，本发明大大促进产甘油假丝酵母的基础研究和合成生物学应用。
附图说明
图1：不同ARS对质粒转化子数的影响；
图2：不同ARS对荧光强度的影响；
图3：不同ARS对质粒拷贝数的影响；
图4：panARS分别与各个ARS组合对转化子数的影响；
图5：panARS分别与各个ARS组合对荧光强度的影响；
图6：panARS分别与各个ARS组合对拷贝数的影响；
图7：pTGAP-GFP-AOX1t-panARS-URA5-PPARS2质粒图谱；
图8：野生型菌体与含质粒pTGAP-GFP-AOX1t-panARS-URA5-PPARS2的菌体的第五、第十、第十五代的生长曲线；
图9：不同启动子在SD培养基中对荧光强度的影响；
图10：不同启动子在最适培养基中对荧光强度的影响；
图11：咖啡酸产量；
图12：表达绿色荧光蛋白GFP时的产甘油假丝酵母明场与荧光图像。
具体实施方式
下述实施例中所涉及的培养基如下：
LB培养基：10g/L NaCl，5g/L酵母粉、10g/L胰蛋白胨。
SD培养基：20g/L葡萄糖，0.67g/L YNB。
YPD培养基：20g/L葡萄糖，20g/L胰蛋白胨，10g/L酵母粉。
固体培养基另加20g/L琼脂粉。
下述实施例中所涉及的检测方法如下：
咖啡酸产量的检测：
将发酵液经10000rpm离心15min，取1mL上清液经0.22μm水系微孔滤膜处理，利用HPLC法检测发酵液中咖啡酸的浓度；其中，色谱柱为C18反相色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相为水：乙腈：乙酸＝849:150:1，柱温为30℃，流速为0.4mL·min-1，进样体积为5μL。
下述实施例中所涉及的引物序列如表1所示：
表1：引物序列
GAP-F:caccacagcagcaccaacagttacaac
GAP-R:gctagcatcgatagatctgactagt ggatcctttttgtaattgtgtttgtttgtgtg
URA5-F:ctcgaaaacggcgacggtattagacg
URA5-R：ggtacc tgaacaccattgtaccaatgcactc
本发明的游离表达载体适合于所有的产甘油假丝酵母，本发明仅以产甘油假丝酵母URA5缺陷菌株为代表，进行效果的验证。
产甘油假丝酵母URA5缺陷菌株的制备：以野生型菌株产甘油假丝酵母CCTCC：M93018(在中国专利CN1070235C中公开)为出发菌株，利用CRISPR/Cas9基因编辑系统对出发菌株URA5基因进行敲除，从而获得产甘油假丝酵母URA5缺陷菌株：产甘油假丝酵母CCTCC：M93018ΔURA5。
实施例1：pTGAP-AOX1t-URA5表达载体的构建
本发明的游离表达载体上的外源基因表达盒中的启动子包括但不限于GAP,GPD,STL3,GMT,CWP1，由于均能启动目的基因，只是诱导条件不同，因此，本实施例当中仅以GAP为例描述本发明的游离型表达载体的构建及相应的效果。
具体步骤如下：
(1)以产甘油假丝酵母基因的内源诱导启动子GAP序列(核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示)，URA5基因(筛选标记基因表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)；AOX1终止子序列设计扩增引物(引物序列如表1所示)，并且在引物上下游5’端附加25bp的质粒上下游同源重叠序列(如表1所示)，GAP下游引物包含BamHI酶切位点，AOX1t上游引物包含多克隆酶切位点(MCS)而下游引物包含XhoI酶切位点，URA5基因下游引物包含KpnI酶切位点；
(2)以产甘油假丝酵母野生型菌株的基因组为模板，利用步骤(1)所得引物，运用PCR扩增技术获得启动子GAP片段，URA5基因片段和AOX1终止子片段；
(3)通过Gibson组装方法将获得启动子GAP片段，AOX1终止子片段和URA5基因片段连接起来，获得5’-GAP-AOX1t-URA5-3’片段；
(4)通过TA克隆方法将步骤(3)所获得的5’-GAP-AOX1t-URA5-3’片段连接至载体pMD19-T载体上，从而获得表达载体pTGAP-AOX1t-URA5。
实施例2：不同来源ARS的筛选
具体步骤如下：
(1)化学合成来源于商业质粒pCAMBIA1302的GFP基因片段(Gene bank登录号为：KU763376.1)；
(2)以实施例1制备得到的表达载体pTGAP-AOX1t-URA5为模板，以BamHI限制性内切酶进行单酶切，获得的片段通过Gibson组装方法与步骤(1)GFP基因片段进行组装，转化大肠杆菌JM109，获得质粒pTGAP-GFP-AOX1t-URA5；
(3)不同自主复制序列(ARS片段)的制备
以产甘油假丝酵母野生型菌株基因组DNA获得CgARS片段(核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示)；以乳酸克鲁维酵母基因组DNA获得panARS片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示)；以东方伊萨酵母基因组DNA获得IOARS片段(公开于Exploiting Issatchenkiaorientalis SD108 for succinic acid production论文当中)；以毕赤酵母基因组DNA获得PPARS1片段(公开于Pichia pastoris as a Host System for Transformations论文中)；以毕赤酵母基因组DNA获得PPARS2片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示)，以酿酒酵母商业质粒载体pRS414与pYX212分别获得414ARS片段与212ARS片段，以树干毕赤酵母基因组DNA获得PSARS2片段(公开于High-Efficiency Transformation of Pichia stipitisBased on ItsURA3 Gene and a Homologous Autonomous Replication Sequence)，以马克思克鲁维酵母基因组DNA获得KMARS片段(公开于Kluyveromyces marxianus Small DNAFragments Contain Both Autonomous Replicative and Centromeric Elements thatalso Function in Kluyveromyces lactis)，以粟酒裂殖酵母基因组DNA获得SPARS片段(公开于pDblet,a stable autonomously replicating shuttle vector forSchizosaccharomyces pomb)；此外我们还通过高通量筛选选择了大量来自于酿酒酵母染色体的已经确定的有活性的ARS以及解脂耶氏酵母、汉逊酵母和假丝酵母等多种非常规酵母的报道有作用的ARS，但在实验过程中并未获得转化子(数据未列出)。
分别制备得到自主复制序列(ARS片段)：CgARS片段、panARS片段、IOARS片段、PPARS1片段、PPARS2片段、414ARS片段、212ARS片段、PSARS2片段、KMARS片段、SPARS片段。
(4)以步骤(2)制备得到的载体pTGAP-GFP-AOX1t-URA5为模板，以XhoI限制性内切酶进行单酶切，获得的片段通过Gibson组装方法分别与步骤(3)各个ARS片段进行组装，然后转化大肠杆菌JM109后，经测序验证之后，分别获得一系列含不同ARS的质粒：
pTGAP-GFP-AOX1t-CgARS-URA5、pTGAP-GFP-AOX1t-panARS-URA5、pTGAP-GFP-AOX1t-IOARS-URA5、pTGAP-GFP-AOX1t-414ARS-URA5、pTGAP-GFP-AOX1t-212ARS-URA5、pTGAP-GFP-TRP1t-PPARS1-URA5、pTGAP-GFP-AOX1t-PPARS2-URA5、pTGAP-GFP-AOX1t-PSARS2-URA5、pTGAP-GFP-AOX1t-KMARS-URA5、pTGAP-GFP-AOX1t-SPARS-URA5。
(5)通过PEG/LiAC转化法将步骤(4)所构建的一系列含不同ARS质粒载体转化产甘油假丝酵母URA5缺陷菌株：产甘油假丝酵母CCTCC：M93018ΔURA5中，在SD培养基上培养并计数阳性克隆转化子(结果如图1所示)，结果显示，表达载体pTGAP-GFP-AOX1t-panARS-URA5在产甘油假丝酵母中转化子数最多，达到了108CFU，其次便是PPARS1、PPARS2、212ARS和IOARS，其菌落数分别为21CFU、68CFU、25CFU和22，其余各个ARS所构建载体转化子数均不超过5CFU；
为了更直观判断表达载体游离表达情况以及其上的筛选标记基因的表达情况，对筛选平板上所生长的克隆子的大小(小：＜0.5mm，中：0.5-1.5mm，大：＞1.5mm)，生长时间(慢：＞3d，快:＜3d)进行简单的分类，结果如表2所示。
表2：各个ARS转化子菌落大小与生长速度
ARS 菌落大小(小：＜0.5mm，中：0.5-1.5mm，大：＞1.5mm) 生长速度(慢：＞3d，快:＜3d)
CgARS 小 慢
panARS 小 慢
IOARS 中 慢
PPARS1 大 慢
PPARS2 大 快
414ARS 小 慢
212ARS 中 快
PSARS 小 慢
KMARS 小 慢
SPARS 小 慢
结果显示，含PPARS1、PPARS2的转化子为大型菌落，212ARS、IOARS转化子为中型菌落，而剩余的其余ARS转化子为小型菌落；而对于生长速度，仅有PPARS2转化子生长快速，而其余转化子均生长缓慢，其中CgARS转化子菌落最小(只能形成白色小点，且生长几乎停滞，初步判断该序列可能无法维持质粒在菌体内的游离表达，或该序列可能包含两个着丝粒序列，从而导致质粒在增殖分裂时破碎)；
分别挑选阳性克隆转化子转接SD培养基培养24h(其中CgARS在摇瓶中几乎无发生长)，通过多功能酶标仪检测其荧光强度(如图2)，结果显示利用panARS构建的表达载体(pTGAP-GFP-AOX1t-panARS-URA5)在产甘油假丝酵母中荧光强度(为：265)明显高于其他ARS所构建的表达载体，其次便是PPARS2、PPARS1、212ARS与IOARS，最后剩余的各个ARS所构建的表达载体在产甘油假丝酵母中所表达的荧光强度微乎其微；
将培养24h后的菌体进行基因组DNA的提取，通过qPCR检测其拷贝数情况(如图3)，结果显示利用panARS构建的表达载体在产甘油假丝酵母中拷贝数最高，达到5左右，其次是PPARS2、212ARS、IOARS拷贝数均约为2，PPARS1拷贝数约为1，而剩余的ARS其拷贝数均为0；
由于我们所构建的表达载体最主要目的是为了目的基因的表达，选择荧光强度最强，拷贝数最多的含pTGAP-GFP-AOX1t-panARS-URA5质粒载体的克隆子通过荧光显微镜进行观察，结果也是能明显的荧光，如图12，这也表明成功筛选出了首次能在产甘油假丝酵母中进行游离表达的载体。
实施例3：不同ARS组合的双ARS载体
为了进一步提高表达载体的拷贝数和生长情况，本发明通过构建双ARS载体进一步对其能力进行提升，所以，以pTGAP-GFP-AOX1t-panARS-URA5质粒为模板，在其基础之上进行改造；具体步骤如下：
(1)按照实施例2步骤(3)的方法，分别制备得到自主复制序列(ARS片段)：CgARS片段、panARS片段、IOARS片段、PPARS1片段、PPARS2片段、414ARS片段、212ARS片段、PSARS2片段、KMARS片段、SPARS片段。
(2)以实施例2制备得到的表达载体pTGAP-GFP-AOX1t-panARS-URA5为模板，使用KpnI限制性内切酶进行对其进行单酶切后的片段，通过Gibson组装方法分别与步骤(1)所获得的各个ARS片段进行连接，然后转化大肠杆菌JM109，经测序验证之后，获得一系列双ARS质粒(pTGAP-GFP-AOX1t-panARS-URA5-/panARS/IOARS/414ARS/212ARS/PPARS1/PPARS2/PSARS2/KMARS/SPARS)。分别获得一系列含不同ARS的质粒：pTGAP-GFP-AOX1t-panARS-URA5-panARS、pTGAP-GFP-AOX1t-panARS-URA5-IOARS、pTGAP-GFP-AOX1t-panARS-URA5-414ARS、pTGAP-GFP-AOX1t-panARS-URA5-212ARS、pTGAP-GFP-AOX1t-panARS-URA5-PPARS1、pTGAP-GFP-AOX1t-panARS-URA5-PPARS2、pTGAP-GFP-AOX1t-panARS-URA5-PSARS2、pTGAP-GFP-AOX1t-panARS-URA5-KMARS、pTGAP-GFP-AOX1t-panARS-URA5-SPARS。
(3)通过PEG/LiAC转化法将步骤(2)所构建的一系列含不同双ARS质粒载体转化产甘油假丝酵母URA5缺陷菌株产甘油假丝酵母CCTCC：M93018ΔURA5中，在SD培养基中培养并计数阳性克隆转化子(结果如图4所示)，结果显示，利用与PPARS2连用所构建的表达载体在产甘油假丝酵母中转化子数最多，达到了193CFU，与panARS连用其转化子达到83CFU，而与其余各个ARS连用所构建载体转化子数均不足50CFU，其中只有与PPARS2连用的载体，其转化子数提高最多，提高79％，而其余连用的载体与单独使用相比并无明显提升，反而出现不同程度的降低；
对筛选平板上所生长的克隆子的大小，生长时间进行简单的分类，如表3所示。
表3：panARS分别与各个ARS连用转化子菌落大小与生长速度
ARS 菌落大小(小：＜0.5mm，中：0.5-1.5mm，大：＞1.5mm) 生长速度(慢：＞3d，快:＜3d)
CgARS 小 慢
panARS 小 慢
IOARS 中 慢
PPARS1 大 慢
PPARS2 大 快
414ARS 小 慢
212ARS 中 快
PSARS 小 慢
KMARS 小 慢
SPARS 小 慢
结果显示，含与PPARS1和PPARS2连用的转化子为大型菌落，与IOARS连用转化子为中型菌落，而剩余的分别与其余ARS连用转化子为小型菌落，而对于生长速度，只有与PPARS2连用转化子生长快速，而其余转化子均生长缓慢，总的来说与PPARS2连用的载体其对菌体的生长表现出了明显的增益，使得其从单独使用的又小又慢的菌落变成了又快又大的菌落，从而对后续的菌种验证以及发酵罐放大培养均有不小的益处；
分别挑选阳性克隆转化子转接SD培养基培养24h，通过多功能酶标仪检测其荧光强度(如图5)，结果显示与PPARS2连用构建的表达载体(pTGAP-GFP-AOX1t-panARS-URA5-PPARS2)在产甘油假丝酵母中荧光强度(为：411)较改造之前(Control：pTGAP-GFP-AOX1t-panARS-URA5质粒，荧光强度为265)有提升，提升了约55％，而与panARS连用时几乎无变化，其余与各个ARS连用的载体均较改造之前有不同程度的降低；
将培养24h后的菌体进行基因组DNA的提取，通过qPCR检测其拷贝数情况(如图6)，结果显示与PPARS2连用构建的表达载体(pTGAP-GFP-AOX1t-panARS-URA5-PPARS2)在产甘油假丝酵母中拷贝数最高，达到7.0左右，而与剩余的ARS连用其拷贝数最高为5，其中，与PPARS2连用的载体拷贝数得到了极大的提升，提高了约40％，而其余均表现出相对平庸的成绩，与实验组相比甚至出现不同程度的降低；
经过对转化子数、荧光强度、拷贝数、转化子生长快慢、克隆子菌落大小等方面综合考虑，发现含有双ARS的质粒pTGAP-GFP-AOX1t-panARS-URA5-PPARS2(如图7)与仅含有单ARS的质粒pTGAP-GFP-AOX1t-panARS-URA5(Control)相比，其在各个方面均得到明显提升，转化子数提高了约79％，荧光强度提高了约55％，拷贝数提高了约40％，转化子生长变快，克隆子菌落也变大，这也表明所构建的该表达载体在产甘油假丝酵母中能够进行有效的游离表达，并且其上所携带的目的基因以及筛选标记能够得到充分表达，从而能检测到明显荧光以及获得足够的抗性促使其在筛选平板上恣意生长。
实施例4：稳定性探究
对于表达载体，除了对目的基因的表达强度的研究是重点外，其稳定性也是相当重要，所以对质粒pTGAP-GFP-AOX1t-panARS-URA5-PPARS2的稳定性进行研究；具体步骤如下：
(1)通过PEG/LiAC转化法将pTGAP-GFP-AOX1t-panARS-URA5-PPARS2转化产甘油假丝酵母URA5缺陷菌株：产甘油假丝酵母CCTCC：M93018ΔURA5中，制备得到重组菌株，挑取重组菌株单菌落转接于10mL YPD培养基中，在SD培养基中，培养12h，制备得到种子液。
按照上述方法制备得到产甘油假丝酵母CCTCC：M93018ΔURA5野生型菌株种子液。
(2)将制备得到的种子液以初始OD600＝0.1将步骤(1)制备得到的重组菌株菌体种子液与野生型(WT)产甘油假丝酵母种子液分别转接10mL YPD培养基中，在30℃，200rpm条件下，培养24h为一代；
然后分别以初始OD600＝0.1转接新鲜YPD培养基，重复此步骤继续在10mL YPD培养基中做传代实验；
分别选择第四代，第九代和第十四代的培养24h的菌体，以初始OD600＝0.1转接100mL SD培养基，每6h测量菌体量(OD600)，结果如图8所示。
结果显示含质粒pTGAP-GFP-AOX1t-panARS-URA5-PPARS2的菌体表现出较好的稳定性，其在第五代几乎没有发生质粒丢失的情况，在第十代和十五代丢失率分别约4％和9％，结果显示，质粒pTGAP-GFP-AOX1t-panARS-URA5-PPARS2的稳定性相当好。
实施例5：构建含有不同内源启动子的表达载体
为了拓宽我们所构建的该游离表达载体在产甘油假丝酵母中的实际应用范围，同时也探究多种启动子在该游离表达载体上的适用性，我们对多种内源启动子进行综合比较分析，具体步骤如下：
(1)按照实施例1～3的方法，分别采用不同的启动子替换GAP启动子，制备得到不同的表达载体：
所述启动子为：GPD启动子(核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示)；STL3启动子(核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示)；GMT启动子(核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示)；CWP1启动子(核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示)。
制备得到含有不同内源启动子的质粒：pTGPD-GFP-AOX1t-panARS-URA5-PPARS2，pTSTL3-GFP-AOX1t-panARS-URA5-PPARS2；pTGMT-GFP-AOX1t-panARS-URA5-PPARS2；pTCWP1-GFP-AOX1t-panARS-URA5-PPARS2。
(2)通过PEG/LiAC转化法将步骤(1)所构建的一系列含不同启动子的质粒载体转化产甘油假丝酵母URA5缺陷菌株WL2002-5ΔURA5，分别挑选阳性克隆转化子转接SD培养基中，在30℃，200rpm条件下培养24h，通过多功能酶标仪检测其荧光强度(如图9)，结果显示，GAP启动子能力最强，荧光强度最高，GPD、STL3、GMT、CWP1启动子所表达的荧光强度分别是GAP启动子表达荧光强度的50％、43％、20％、15％；
其次，分别转接至各个启动子最适条件的培养基中(其中GAP、GPD、STL3、GMT、CWP1启动子最适条件分别为：30％葡萄糖、20％葡萄糖、30％葡萄糖、pH＝2.0、42℃)培养24h，通过多功能酶标仪检测其荧光强度(如图10)，
结果显示，依然是GAP启动子能力最强，荧光强度最高，而GPD、STL3、GMT、CWP1等启动子所表达的荧光强度分别是GAP启动子表达荧光强度的65％、51％、40％、45％。
但均能够实现荧光蛋白在产甘油假丝酵母中游离表达。
实施例6：本发明所构建得到的表达载体的应用
(1)为了验证所构建载体对外源基因使用的普适性，以实施例3构建得到的pTGAP-GFP-AOX1t-panARS-URA5-PPARS2为模板，以BamHI限制性内切酶进行单酶切，然后回收片段；
(2)通过天霖生物科技无锡有限公司合成基因片段5’-TAL-HpaB-HpaC-3'其中，编码所述4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；编码所述NADPH-黄素氧化还原酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；编码所述酪氨酸氨裂合酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
(3)通过Gibson组装方法将载体片段以及合成的基因片段进行组装，转化大肠杆菌JM109获得质粒pTGAP-TAL-HpaB-HpaC-AOX1t-panARS-URA5-PPARS2；
(4)通过PEG/LiAC转化法将步骤(3)所构建的质粒载体转化产甘油假丝酵母CCTCC：M93018ΔURA5，挑选阳性克隆转化子分别转接10mLSD培养基中，在30℃，200rpm条件下培养12h；分别制备得到种子液，然后分别将制备得到的种子液按照初始OD600＝0.1的接种量，转接至100mL SD培养基中，在30℃，200rpm条件下培养72h，得到发酵液1；
将YPD培养基替换SD培养基后，按照上述方法，制备得到发酵液2；
分别通过HPLC对发酵液1和2进行检测咖啡酸最终产量(如图11)，从结果我们得到，咖啡酸产量在SD培养基中达到7.5mg/L，在YPD中产量达到17mg/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种可在产甘油假丝酵母中游离表达的双ARS载体及其应用
<130> BAA211438A
<160> 14
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 390
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gtagattaac ttaaaaatat aaaaaaattg aatgattctt atagaaatac aaaatcagag 60
catacccgtg taacaacggg acctcagttt cccatagttt aagcagaacc agaaatgtag 120
aaccacttgt caacagactt atcaattggt gcaggtggca atgggtttgc tgcaggaact 180
tgaatggatg gttcgtaaga ggaagttcca gttaaggtag tgttggttaa aacaacgccc 240
ttgctatctg caacgttacc tgcaatcaat ttcttccaag attcgttaca ttcagcaatg 300
acttcttccg catactttct gttcttacat tcaccattaa atgcgaaaac attttctggc 360
ttaccatctg gaatcttgta aattctgaac 390
<210> 2
<211> 1611
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctcgaaaacg gcgacggtat tagacgtccc gattgtaatt gacttagtcc tcttaggttc 60
actatttgcc tcttgtggtt cttatcaaaa ttgttgccgg ttgtggcagc tggagtagtg 120
cttatagtac tgaatgatga tgacgatgac aatctcctct ttggcctgat tgactttggc 180
agtgaatgaa aatgctgtag tgatgattta ttggaccttt gagaagtaga tagccctgtt 240
attattggcg taactccatt tacttcataa ggtgagcctg gtggtgatat cgaaatctgc 300
tgtaatatat tcataatatt attagtggtc aatgatgtct cattatacac gttctcactt 360
gacataatgt aattgtgctt cctgccttgt tccttagagt atattctaaa ttactatagt 420
aaacaccttt aaatgtattc caaaatttgt caaaagtgat caaaccaatc agttgggcgg 480
ccaagttccc ctctgatttc tgtctttgtc gataagtagg gaataaccga tagagtggat 540
atttttattc gtgatgattt tttttttctc gccatttctc atttttgcta tgattcatga 600
gagaaaaaaa gtgtttttgt ctaatccaga aactatcttt aaaagttaat tttcatataa 660
ttgagtgtct tgaatcacct ggtcaagtca gatcattcag atcgcatata tttaattagc 720
atgccttcat acaaggaaac atttcttcaa gctgctttag atgctgaagc tcttaaattt 780
ggtactttca ctttaaagag tggaagaata tctccatatt tcttcaatat gggattattc 840
agcactgcaa agaccttgag tacattaggt gaatcttatg cacgtgccat cgttgagtcg 900
ggaattgaat ttgatatatt atttggtcca gcttataagg gtatcccact agcggcaatc 960
actgttacaa aattgtacga aatcggcggt gcaaaatatg ccaacattgg ctattctttc 1020
aacaggaagg aaaagaaaga ccatggtgaa ggaggttcta ttgtcggatg caatatgaag 1080
ggtaaaaaga ttctaatcat tgatgacgtt atgaccgcag gtactgccat caatgaagca 1140
tttggtatta tttctgcaga aggtggtaat gctgttggtt gcattattgc tttggataga 1200
atggaaacta ccaaggactc caatgactct gcaactaaca ttgttgcaaa aagatacggc 1260
gtccctgttt tctctatcgt ttgctttgat gacattattg aggtcttgaa agatcagctt 1320
tctgaagaac aaatggagaa aatcaacgaa tacaggaaac agtatgttcc agctaaatag 1380
agcacctcct tcttagtata cgtctcttat tatacagaaa tatttgctta gattttttac 1440
ttatcatata tataattcca attgttgact aacctctaat tctttggatt ttatgtttta 1500
tctttttggc ttcaacgggc ttctctgtct cagcggcaga tttcatataa gcacctgcag 1560
tttctgggtg tttcataatg aggaatgagt gcattggtac aatggtgttc a 1611
<210> 3
<211> 1560
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgaaaccag aagattttag agcttctgct accagaccat ttaccggtga ggagtacttg 60
gcttccctcc gcgacgatag agaaatttat atctatggtg atagagtgaa agacgtcacc 120
tctcatccag cttttagaaa tgctgctgct tctatggcta gattgtatga tgctttgcat 180
gatccacaat ctaaagaaaa attgtgttgg gaaaccgata ccggtaatgg tggttatacc 240
cataaatttt ttagatatgc tagatctgct gatgaattga gacaacaaag agatgctatt 300
gctgaatggt ctcgattgac ctatggctgg atgggtagaa ccccagatta taaagctgct 360
tttggttctg ctttgggtgc taatccaggt ttttatggta gatttgaaga taatgctaaa 420
acctggtata aaagaattca agaagcttgt ttgtatttga atcatgctat tgttaatcca 480
ccaattgata gagataaacc agttgatcaa gttaaagacg tgtttatttc tgttgatgaa 540
gaagttgatg gtggtattgt tgtttctggt gctaaagttg ttgctaccaa ttctgctttg 600
acccattata attttgttgg tcaaggttct gctcaattgt tgggtgataa taccgatttt 660
gctttgatgt ttattgctcc aatgaatacc ccaggtatga aattgatttg tagaccatct 720
tatgaattgg ttgctggtat tgctggttct ccatttgatt atccattgtc ttctagattt 780
gatgaaaatg atgcaattct cgttatggat aaagtattta ttccatggga gaatgtactg 840
atttatagag attttgaaag atgtaaacaa tggtttccac aaggtggttt tggtagattg 900
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gaggttgttg cctggagaaa tttgttttgg tctttgaccg atgctatgta tggtaatgct 1080
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ttgatttatt tgccatctgg tgttagagat cttcataatc cacaattgga taaatatttg 1260
tctacctatt gtagaggttc tggtggtatg ggtcatagag aaagaattaa aattttgaaa 1320
ttgttgtggg atgctatagg ttcggagttt ggtggtagac atgaattgta tgaaattaat 1380
tatgctggtt ctcaagatga aattagaatg caagctttga gacaagctat tggttctggt 1440
gctatgaaag gtatgttggg tatggttgaa caatgtatgg gtgattatga tgaaaatggt 1500
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<212> DNA
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<400> 4
atgcaagttg atgaacaaag attgagattt agagatgcta tggcttcttt ggctgctgct 60
gttaatattg ttaccaccgc tggtcatgct ggtagatgtg gtattaccgc taccgctgtt 120
tgttctgtta ccgatacccc accatctgtt atggtttgta ttaatgctaa ttctgctatg 180
aatccagttt ttcaaggaaa tggtagacta tgtataaacg tcctcaatca cgaacaagaa 240
ttgatggcta gacattttgc tggtatgacc ggtatggcta tggaagaaag atttcatcaa 300
ccatgttggc aaaatggtcc attgggtcaa ccagttttga atggtgcttt ggctggtttg 360
gaaggtgaaa tttctgaagt tcaaaccatc ggtacccatt tggtttacct tgttgctatt 420
aaaaacatta ttctttctca agacggtcat ggattgattt atttcaagag aagatttcat 480
ccagttagat tggaaatgga agctccagtt taa 513
<210> 5
<211> 1518
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atgaatacca tcaatgagta cttgtctttg gaagagttcg aagctattat atttgggaac 60
caaaaagtta ccatttctga tgtagttgtt aaccgggtta acgaaagttt caatttcctt 120
aaagaatttt cgggaaataa agttatttat ggtgttaata ccggttttgg tccaatggct 180
caatacagaa ttaaagagtc tgatcaaatt caattgcagt ataatttgat tagatctcat 240
tcttctggta ccggtaaacc attgtctcca gtttgtgcta aagctgctat tttggctaga 300
ttgaatacct tgtctttggg taattctgga gtgcatccat ccgtgatcaa cttgatgtct 360
gaattgatca ataaggatat taccccattg atttttgaac atggtggtgt tggtgcttct 420
ggtgatttgg ttcaattgtc tcatttggct ttggttttga ttggtgaagg tgaagttttt 480
tataaaggtg aaagaagacc aaccccagaa gtttttgaaa ttgaaggttt gaaaccaatt 540
caagttgaaa ttagagaagg tttggctttg attaatggta cctctgttat gaccggtatt 600
ggtgttgtta acgtttatca tgctaaaaaa ttgttggatt ggtctttgaa atcttcttgt 660
gctattaacg aattggttca agcttatgat gatcattttt ctgctgaatt gaatcaaacc 720
aaaagacata aaggtcaaca agaaattgct ttgaaaatga gacaaaattt gtctgattct 780
accttgatta gaaaaagaga agaccatttg tattctggcg aaaacaccga agagattttt 840
aaagaaaaag ttcaagaata ttattctttg agatgtgttc cacaaatttt gggtccagtt 900
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gagagacagc taaactattt actgaattct aagattaatg aattgttgcc accatttgtt 1140
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tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt 360
gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct 420
gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc 480
cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta 540
tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac 600
tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc 660
atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac 720
ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg 780
gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac 840
gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc 900
gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt 960
gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga 1020
gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc 1080
cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag 1140
atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca 1200
tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc 1260
ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca 1320
gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc 1380
tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta 1440
ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgttctt 1500
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gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg 1620
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gagcaatttg ccaccaggat agaattggat gagttataat tctactgtat ttattgtata 3420
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cgtatacatc atggccgaca agcaaaagaa cggcatcaaa gccaacttca agacccgcca 4020
caacatcgaa gacggcggcg tgcaactcgc tgatcattat caacaaaata ctccaattgg 4080
cgatggccct gtccttttac cagacaacca ttacctgtcc acacaatctg ccctttcgaa 4140
agatcccaac gaaaagagag accacatggt ccttcttgag tttgtaacag ctgctgggat 4200
tacacatggc atggatgaac tatacaaagc tagccaccac caccaccacc acgtgtgatt 4260
ctagcctagt ctagatcaag aggatgtcag aatgccattt gcctgagaga tgcaggcttc 4320
atttttgata cttttttatt tgtaacctat atagtatagg attttttttg tcattttgtt 4380
tcttctcgta cgagcttgct cctgatcagc ctatctcgca gctgatgaat atcttgtggt 4440
aggggtttgg gaaaatcatt cgagtttgat gtttttcttg gtatttccca ctcctcttca 4500
gagtacagaa gattaagtga gactcgcaac atctttggat aatatcagaa tgagaaagaa 4560
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gaggttaaga acaaaaaaac aaattagata tctgctaatc caatatagtt aaatcaatct 4860
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gacataatgt aattgtgctt cctgccttgt tccttagagt atattctaaa ttactatagt 5400
aaacaccttt aaatgtattc caaaatttgt caaaagtgat caaaccaatc agttgggcgg 5460
ccaagttccc ctctgatttc tgtctttgtc gataagtagg gaataaccga tagagtggat 5520
atttttattc gtgatgattt tttttttctc gccatttctc atttttgcta tgattcatga 5580
gagaaaaaaa gtgtttttgt ctaatccaga aactatcttt aaaagttaat tttcatataa 5640
ttgagtgtct tgaatcacct ggtcaagtca gatcattcag atcgcatata tttaattagc 5700
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gtccctgttt tctctatcgt ttgctttgat gacattattg aggtcttgaa agatcagctt 6300
tctgaagaac aaatggagaa aatcaacgaa tacaggaaac agtatgttcc agctaaatag 6360
agcacctcct tcttagtata cgtctcttat tatacagaaa tatttgctta gattttttac 6420
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ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg 7020
cga 7023
<210> 7
<211> 2570
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ctcctctaat tcattgcttg ggcttctaga catgtcgtat gagtctgagt agtgaaaaca 60
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ctacttttca ttaaattttt tttttccatt attgacaaat ctttttcttt gcacaaacag 300
ttccattttt aaagcatcag gagcaagaac tctttagccg ctgcttttca agaggctgca 360
ggaatttgtt agtgtccttg ttcaaatgaa gaatactaac ttcaaacgag gagacctagt 420
tcaaagaatt actattattg aaattgttca atatacatag cttttgccct ttatatcgta 480
ctgtacattt gcaaagtttt caaactagga agcagaccgt ctcttgactc tgtttacaaa 540
acccgaagct atctttttta attttccctt tatgcgtaat acaaaacctg gaaaaataac 600
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aaactttagc cagacaaaat tgtcctaaac ctttgggatt tgttaaaatc ccctttgaat 840
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<210> 8
<211> 1111
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
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cttcacagac ggcacgcccg gatggccaag gacggcaggg ggtcaagagg gacagagatg 120
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tctactgtat ttattgtata atttatttct ccttttgtat caaacacatt acaaaacaca 1080
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<210> 9
<211> 955
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ccagttcccg ttttccattt ccggaacaac aatgggactc cactgttttc tttcccccct 60
tcccttttcg gctcgcagtc tgtacatgca cgtttatccg acacctgtct tgtttggcgc 120
gtaattaata cagtttctcc ggagtccagg tctcggacgg gtaatttaca cgtcatcatt 180
catttctgtg tcaagagagg tagcgcaaaa agtagaaatg gtgaaccacg ggaatgactt 240
gctggaaatc gacgccagag tccatttgaa aacctacctc tacaagagag gaaacacact 300
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agcggaaagg ggaattggca aattgaggga gaaaaaaaaa aaggcaaaaa aaggaggcgg 660
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ttgtttcatg acgtagtggc gtttcttttc ctgcacttta gaaatctatc ttttccttat 780
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tgaattttga tatcgtttat tttaaattta ttttatgttt ctaatctcaa agagtttaca 900
ctttacaagg agtttctcaa atactatcaa gacattgaat agatcaaaca ttaaa 955
<210> 10
<211> 1243
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gcagttgaca atttggatca gtgggagatg gcgccgggga gtgtgttgcg agtgaaccat 60
gcgtactaca ggggctgtgt ggaggatgga caaatgggtg tatggcagcg ggccgttagg 120
gaggagctgc tagccaagga ctttgtccaa gaggaggatt gataggtggg tcagtaggtg 180
gtcaagtaga tgaattgata aatagtttgt gtatactagg taaatactct taaagcaaat 240
actcttaaag caaatactct taaagcaaat acactctaaa caaatagtct gtgtacacta 300
atcaaatctt ctactgcaaa aactactgca aaattcgcgc actgcaactt gcaaagtgca 360
aatttctcaa atactcacaa ccaacatact gtaccatact atactatacc ctgtatggta 420
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ctggagacaa tggctacagg ttcaaccaca tcaatgaaaa atgtctctat aacaactctc 540
gaatatcttc tcaatgagca ctgtgcccgt cacagtgagg ccgagcttca tgccttaggg 600
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cccccacaag gggacccccc agtactgcgc accccactcg agtgcgtcaa atttgtgtgt 720
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cgagttactc ttggagatat atgtgaatgt cttgtttgtt gtttgttgtt tgttgtttgt 1140
tgtttgttgt ttgttgtttg ttgtttacta tttaggttag ttgtttatct cttgggatca 1200
tataaatggc ctttacttta ccttcaacaa acattgggcg gaa 1243
<210> 11
<211> 1553
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (426)..(426)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 11
atactataca attgtaaaat acaatccaat acaccgcatc acgtgcgtgc gcacagggca 60
tggctgccca gacaaagccc caattgccgt tttgggcgcc aacgcgctcc ttccaaaaac 120
ggacggcaca gagggcacaa aaaatttcag gcggcgaaat gataatttgt gagggcaaga 180
aaagtttcag tgcggaaagg ggggaacttc agtggggagg aaaaaaaaaa aagcggcgga 240
gtacagagaa attggatggt tttccccccc atcagttgta aaattgacaa ttttttcgag 300
tgtctgtttc acttttgaag ttggtttatg aatcttgtct tgatataatt tgctttactt 360
aagtatattt tatttaactc tattttattt cagtttattt tagtttattt cagtttattt 420
tagtgnattt tatttaactc tattttattt tagtttattt tagtttattt tattttcttc 480
cttctccaac ttgaacgtcc catagagtaa ccatgtctgc agagaagaaa gatatcgagc 540
aaccacaaga tcttaacaag atcagaatca ccttcacctc caccaatgtc agagcattgg 600
aaaaggtttc tggcttagtc atcagaaacg ctagaagaga aggtatcaac aagaagggtc 660
ctgtcagaat gccaaccaag gcgctctcca ttgcaaccag aaagactcct aatggtgaag 720
gttccaagac ctgggaacat tatgaaatga gaatccacaa gagatacatt gacttggaag 780
ctccatccac cttgatcaag aagattactt ccttgaccat tgagccaggt gttgatgtcg 840
aagtcactgt ctctgtctaa ggacatggac aggtgtcgtt attttccttt tttttttctt 900
ttttttttct gttctggcat tgttgttgag tggttgattg cccaataatc ctctgacatc 960
acatatcgca gccgtactcc ggcgtgccgt gttgtgcaca ccctctaggc gtgccgtgta 1020
tgagacaagt ccagcttatc aagttcttca acaattttta gatggttatc tcgtatatga 1080
gacgttgcgg tagacagcta tcagcgtgtg tattccacgg cgcaatatgt atcttgttta 1140
gctttatagt gtcgttaatg ctcttcacac agtactacaa acagcaatat ccaatgtaga 1200
tatttaaaca tgttggtcct tgcctttgta ttgtttttag acttttaacc tatttgcgcc 1260
cgtgtcacgt gacacacatt atcgttagta tgcaagtcac gtgccacgca ccccctcccc 1320
ccaccgagac ttatatttac acactttaac gcggttttct atatttaacg agttcaggca 1380
cctgcatttt cttcacattt ggcctgttta aatgaaattt ctcgcgtttg cgtctctgga 1440
gcgtcgaatt tttcccattc tcataaaaga agctgcattt tccactagtt tggtgtttgt 1500
tactcctttg ttttcacttg tttgatccag ttgttcctat caacatacta gaa 1553
<210> 12
<211> 1621
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gatttccttg agcccatcaa tgtctatttg gtcgttttcg gttcgggtat tttgacattt 60
catttttcgc ctattgtgaa ccccgccaac gtcagacgta gagttcgtca gttgagggac 120
tatgtgaatg tgtcaccaga ctggctttgt tatgccatga ttgatgatat taccgatgga 180
tttgcgccaa taatccagtc cattgaatat gaagccgatt cgattgagga ttctgtattt 240
ttaagtacag acatggacat cggttctatg cttttgaaga ttggtgaaag tagacggaaa 300
gtcatgacat tgatgaggtt gttacaaggt aaggctgatg ttattaagat gtttgccaag 360
cggtgtcaag atgaaatggc aagattcaat ttaagcaatc agaacttaca agcacagcca 420
agagcggata ttgccctata tttaggtgat attcaagatc atattattac catgttccag 480
tcgttactat cctatgagaa gattttcagc aggtcccatt ccaattactt ggcacaacta 540
caggttgaat ccttttatag taacgttcaa gtcaccgata tgctctccaa agttaccctt 600
ctgggtacca tcctagtccc aatgaacttg atcacagggt tatttggtat gaatgttcgg 660
gtgcctggac aagatggttc caactatgga tggtttggag gaataattgg tgttattttt 720
gtgattatat ttgtcagttt actaggagca acccaataca tgaagtatgt ggaaaaacag 780
gctggtagaa atggattgag gagcggcata agcgtcaaga acttcaagtt tggacgcaag 840
aaacagacca atggcacaca acgccaagac gctgttagtt taccaactag gtttacgagg 900
tatggtgatt ggtaatgtta gctgagaact aaaaaaaata acaacaaaca aacaaacaaa 960
caaattctaa ggatgccaat cattttctcg tgtatgtttc tttttttaag ctttgtttgc 1020
gtctttttgt ttacattttt gtgtatctaa ttaacgcagt gtgtacattg catgtcgaat 1080
actggaaata gaaccgagta ctactctatc cgagattcca ataccaaacc ccggcgctct 1140
ctgcaacaac aacgccagga agctgaaaga ggagggaggg gacacaaagg agaatttgct 1200
aattcctaag ggtgaattgc cgaatgttga cctttcttgt aggagtgacg tgcatctgtc 1260
acctctgttt tgccagagtt gttaggtaag gtgagggcct ttccccttta agttgctatt 1320
ttcagataat atttctataa atacggcttt agctttaagc tttgtgatag tatagccctc 1380
tttttttcca gaggtttccg tctttgttta cctttggtta tttacgtgtg gagttaccat 1440
atttgtctct ccctctctct ttgtagccat gcagtattca tcaccactac taaggctagc 1500
atcgagaggt ctatataaac cagcatcccc accatcttat aggcatatgc tctcggagtt 1560
ttttacttgt tgattttctt tttataccat aacagtcact cgctaaaaca aaccatacat 1620
a 1621
<210> 13
<211> 451
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
caacatcttt ggataatatc agaatgagaa agaacagata cgcagtacgt tttttggtga 60
gctctttgca cttctttagt tctttccatc aatatcagtt gcttatgcac ttatgactaa 120
tattgatgtt taacttcaat atctttaaac ttttgttctt cccgacgttc attaagaata 180
ctaatacact ttaataatta gtttaatatt tgtttctata taatgacatt taattaaaaa 240
agataaaata taaaaacatc ataataactc accagaggtt aagaacaaaa aaacaaatta 300
gatatctgct aatccaatat agttaaatca atctttcctt ggtataatgg gtatattaca 360
tatatttcaa ggaccgacac tcctaccaaa tatctaaaat ttaccatatt aacataacat 420
gtatataaac gtcaaatcat aatcagcact a 451
<210> 14
<211> 111
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ccaatcaaac aaggtgactt gcgcgaagca atgatttgtg gatgggctgc ggtatggcag 60
cataacaatg caacgctatt tcagaaattg taaagtgtaa aggaaatatt c 111

Claims (10)

1.一种游离型表达载体，其特征在于，所述表达载体为：在pMD19-T Vector骨架上依次整合了目的基因表达盒、乳酸克鲁维酵母的自主复制序列PanARS、筛选标记基因表达盒、毕赤酵母的自主复制序列PPARS2；
所述乳酸克鲁维酵母的自主复制序列PanARS的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；所述毕赤酵母的自主复制序列PPARS2的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。
2.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述目的基因表达盒自上游至下游依次包括启动子、目的基因插入酶切位点、转录终止子；所述启动子为渗透压诱导的GAP启动子、GPD启动子、STL3启动子、酸诱导的GMT启动子和高温诱导的CWP1启动子中的任一种。
3.如权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述GAP启动子的核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示；所述GPD启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述STL3启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述GMT启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；所述CWP1启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
4.如权利要求1～3任一所述的表达载体，其特征在于，所述筛选标记基因为产甘油假丝酵母的URA5基因，所述筛选标记基因表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.携带权利要求1～4任一所述表达载体的重组细胞。
6.如权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞以产甘油假丝酵母为表达宿主。
7.一种利用产甘油假丝酵母制备目的蛋白的方法，其特征在于，所述方法为，将目的蛋白的基因插入权利要求1～4任一所述的表达载体的目的基因插入酶切位点，得到重组载体，将重组载体转化至产甘油假丝酵母中进行表达制备得到目的蛋白。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述目的蛋白为绿色荧光蛋白，4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶、NADPH-黄素氧化还原酶、酪氨酸氨裂合酶。
9.一种重组产甘油假丝酵母，其特征在于，含有权利要求1～4任一所述的表达载体，表达了4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶、NADPH-黄素氧化还原酶、酪氨酸氨裂合酶。
10.权利要求1～4任一所述的表达载体在产甘油假丝酵母表达外源蛋白中的应用。
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