CN110004163B - 多基因编辑提高水稻抗旱性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种多基因编辑提高水稻抗旱性的方法。该方法是以GSK1‑GSK4这四个同源基因为靶，同时编辑后多个组合的突变体抗旱性显著增强。相对于野生型(‘中花11’)，双突变体gsk1/2、三突变体gsk1/2/3和四突变体gsk1/2/3/4抗旱性显著增强，野生型干旱处理后存活率为10‑15％左右，双突、三突和四突存活率可达60‑80％。

Description

多基因编辑提高水稻抗旱性的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种多基因编辑提高水稻抗旱性的方法。

背景技术

目前，全世界有1/6人口、约10亿多人面临缺水问题，预计到2025年世界缺水人口将超过25亿。我国是一个干旱缺水严重的国家，人均水资源量只有2300立方米，仅为世界平均水平的1/4，是全球人均水资源最贫乏的国家之一。随着人口增长和经济增长，水资源短缺现象日趋严重，这也直接导致了干旱地区的扩大与干旱化程度的加重，干旱化趋势已成为全球关注的问题。水稻作为主要粮食作物，在种植过程中需要消耗大量的淡水资源，特别是在少雨天气，产量严重依赖水利灌溉，因此培养耐旱水稻具有重要意义。

高产稳产是作物育种追求的长久目标。粒重是产量的主要决定因素之一。稳产通常指作物对生物或非生物胁迫具有一定的抗性，在不利条件下仍然能保持一定的产量。非生物胁迫，包括盐、旱、冷、热、贫瘠等，是限制作物产量的主要因素。近来，科学家发现，水稻的耐旱能力往往与产量负相关，如旱稻虽然抗旱性强，但产量一般较低，对于高产旱稻的培育造成了困难。GSK2属于GSK3类激酶家族成员，在水稻中与GSK1、GSK3、GSK4共4个成员属于这一家族的同一分支，被认为参与油菜素甾醇信号的负调控。油菜素甾醇是一类固醇类植物激素，控制着植物的株型和粒型以及抗逆性。在作物如水稻中，虽然油菜素甾醇在控制株型和粒型的机制研究上进展迅速，但对于此激素如何调控非生物胁迫抗性，包括抗旱，还所知甚少。以往的研究通过过表达或干涉方式研究其功能，发现GSK2以及其同源蛋白通过抑制油菜素甾醇功能来调控水稻株型和粒型。将此基因特定位置的碱基进行定点突变后导致保守氨基酸变化(TREE中的T或第一个E)可增加所编码蛋白的稳定性或激酶活性，在水稻中过表达后会导致植株矮化紧凑，籽粒显著变小等表型。而将GSK2及其同源基因同时抑制后，会导致籽粒增大，叶夹角增大等表型。由于缺乏功能丧失突变体，目前对这一家族不同成员的具体功能，特别是抗逆性方面还很不清楚。

提高植物特别是水稻的抗旱性具有重要意义，但目前大多数报道是通过转基因方法将目的基因进行过表达获得耐旱植物。由于基因功能的冗余性，通过单基因敲除往往很难获得理想效果。而通过干涉虽然可以同时抑制多个基因的表达，但这一技术存在非特异性的问题。并且通过常规转基因方法获得的植物抗性依赖于外源载体序列的整合。

发明内容

本发明的目的是提供一种多基因编辑提高水稻抗旱性的方法。

本发明的另一目的是提供基因簇GSK1-GSK4在调控植物抗旱性中的应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供基因簇GSK1-GSK4在调控植物抗旱性中的应用，其中，所述基因簇GSK1-GSK4包括水稻GSK1、GSK2、GSK3和GSK4基因。

本发明中，所述植物包括水稻。

所述调控为负调控，且水稻GSK1和GSK2基因为发挥负调控作用的主效基因。

第二方面，本发明提供所述基因簇GSK1-GSK4在抗旱水稻育种中的应用。利用基因工程手段，对水稻GSK1、GSK2、GSK3和/或GSK4基因进行定点突变，使得该基因功能缺失，来实现对水稻抗旱性的遗传改良。

第三方面，本发明提供一种提高水稻抗旱性的方法，利用基因工程手段，对水稻GSK1、GSK2、GSK3和/或GSK4基因进行定点突变，使得该基因功能缺失，从而提高水稻的抗旱性。

第四方面，本发明提供一种基于CRISPR-Cas9系统的水稻多基因编辑载体，所述载体是基于CRISPR-Cas9系统的gRNA表达载体，所述载体靶向水稻GSK1、GSK2、GSK3、GSK4基因中的至少两个基因进行编辑，且所述载体至少靶向水稻GSK1和GSK2基因进行编辑。

优选地，所述载体靶向水稻GSK1和GSK2基因进行编辑。

优选地，所述载体靶向水稻GSK1、GSK2和GSK3基因进行编辑。

优选地，所述载体靶向水稻GSK1、GSK2、GSK3和GSK4基因进行编辑。

本发明中，gRNA作用位点的核酸序列如下(SEQ ID NO:1-8)：

GSK1-sgRNA1：5′-CCTGAGACACTCTACCGTGTGCT-3′

GSK1-sgRNA2：5′-ACTACAGCAATGCTAACCAGCGG-3′

GSK2-sgRNA1：5′-CCAATGTCATCTCCCTGAAGCAT-3′

GSK2-sgRNA2：5′-ACTACAGCAATGCCAACCACCGG-3′

GSK3-sgRNA1：5′-CCTGAGTCACTGTATCGTGTGTT-3′

GSK3-sgRNA2：5′-CCTGGAGTTTGCCACAGGGATGT-3′

GSK4-sgRNA1：5′-CCCTAAAGCATTGTTTCTTCTCT-3′

GSK4-sgRNA2：5′-CCTGGAGTTTGTCACCGAGATAT-3′

在本发明的一个具体实施方式中，所述基于CRISPR-Cas9系统的水稻多基因编辑载体为pC1300-Cas9-4GSK-8gRNA，序列如SEQ ID NO:23所示(图3B)。

第五方面，本发明提供包含上述载体的用于提高植物(包括水稻)抗旱性的CRISPR-Cas9多基因编辑系统。

第六方面，本发明提供所述多基因编辑载体的以下任一应用：

1)用于植物育种；

2)用于制备转基因植物；

3)用于提高植物抗旱性；

4)用于制备生物材料。

其中，所述植物包括但不限于水稻。所述生物材料包括但不限于转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、工程菌或非可再生的植物部分。

第七方面，本发明提供一种多基因编辑提高水稻抗旱性的方法，将所述多基因编辑载体导入水稻中，从转基因植株中筛选出抗旱性提高的水稻后代。

用于检测转基因植株的引物如下(SEQ ID NO:9-16)：

GSK1-F:5′-gcgatttctcatgcgatttt-3′

GSK1-R:5′-accagaacctttgcacttcc-3′

GSK2-F:5′-ggtgctcatttttggtggtt-3′

GSK2-R:5′-agggtggaaaaggccaatac-3′

GSK3-F:5′-gtgggaactggatcatttgg-3′

GSK3-R:5′-ccctcttgaaaaccagaaagaa-3′

GSK4-F:5′-ggacaaagaatgtcgcatga-3′

GSK4-R:5′-agtagcatccgccacaaatc-3′

第八方面，本发明提供按照上述方法制备得到的抗旱性提高的水稻材料。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(一)本发明提供一种通过快速编辑多个基因大幅提高植物抗旱性的方法。具体地，以GSK1-GSK4这四个同源基因为靶，同时编辑后多个组合的突变体抗旱性显著增强。

(二)本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑系统，通过导入8个分别靶向GSK1-GSK4四个同源基因的sgRNA后进行单次转基因，从而快速获得四个基因各种组合的功能丧失或功能缺陷的单/双/三/四突变体，其中多突变体gsk1/2、gsk1/2/3和gsk1/2/3/4抗旱性均有增强。

(三)相对于野生型背景(‘中花11’)，双突变体gsk1/2、三突变体gsk1/2/3和四突变体gsk1/2/3/4抗旱性显著增强，野生型干旱处理后存活率为10-15％左右，双突、三突和四突存活率可达60-80％。

附图说明

图1为本发明实施例1中sgRNA靶位点在基因编码区CDS上的位置示意图。

图2为本发明实施例1中用于构建所述多基因编辑载体的质粒图谱及主要表达盒位置结构示意图。其中，图2A为SK-gRNA的质粒图谱，图2B为pC1300-Cas9的质粒图谱，图2C为主要表达盒的位置结构示意图。

图3为本发明实施例1中载体构建过程示意图及最终质粒图谱。其中，图3A为多个sgRNA中间载体聚合过程示意图，图3B为pC1300-Cas9-4GSK-8gRNA的质粒图谱。

图4为本发明实施例1中部分水稻突变体表型数据。其中，A为多突变体整体植株表型，B为从水稻剑叶往下三片叶的角度比较，C为多突变体籽粒表型，D为多突变体粒长统计数据比较。

图5为本发明实施例1中部分水稻突变体对油菜素内酯的敏感性分析结果。其中，A为添加不同量油菜素内酯后不同植物材料幼苗第二叶的角度示意图，B为添加100ng油菜素内酯后不同植物材料的叶夹角测量数据比较。

图6为本发明实施例1中GSK1-4基因的表达模式及受旱模拟处理的调控情况。其中，A为GSK1-4基因在根、茎、叶和穗中的表达模式，B为GSK1-4在PEG2000处理不同时间后的表达情况。

图7为本发明实施例1中部分水稻突变体干旱处理结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J & Russell DW，Molecular Cloning:a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1GSK1-GSK4编辑载体的构建及转基因的制备

从公共水稻基因组注释网站上(http://rice.plantbiology.msu.edu)下载GSK1(LOC_Os01g10840)、GSK2(LOC_Os05g11730)、GSK3(LOC_Os02g14130)、GSK4(LOC_Os06g35530)序列，每个基因设计2个sgRNA，共8个sgRNA，在基因编码区上的位置如图1所示。GSK1、GSK2、GSK3、GSK4的CDS序列分别如SEQ ID NO:19-22所示。

sgRNA靶位点序列如下(SEQ ID NO:1-8)，下划线为PAM序列(若位于5’端则为识别反向互补序列)：

GSK1-sgRNA1：5′-CCTGAGACACTCTACCGTGTGCT-3′

GSK1-sgRNA2：5′-ACTACAGCAATGCTAACCAGCGG-3′

GSK2-sgRNA1：5′-CCAATGTCATCTCCCTGAAGCAT-3′

GSK2-sgRNA2：5′-ACTACAGCAATGCCAACCACCGG-3′

GSK3-sgRNA1：5′-CCTGAGTCACTGTATCGTGTGTT-3′

GSK3-sgRNA2：5′-CCTGGAGTTTGCCACAGGGATGT-3′

GSK4-sgRNA1：5′-CCCTAAAGCATTGTTTCTTCTCT-3′

GSK4-sgRNA2：5′-CCTGGAGTTTGTCACCGAGATAT-3′

针对每一个靶位点，设计两个互补DNA序列，分别在正向靶序列前(去除PAM序列)加GGCA，在反向互补靶序列前添加AAAC，合成的序列如下所示：

GSK1-sgRNA1-F：5′-GGCAAGCACACGGTAGAGTGTCTC-3′

GSK1-sgRNA1-R：5′-AAACGAGACACTCTACCGTGTGCT-3′

GSK1-sgRNA2-F：5′-GGCAACTACAGCAATGCTAACCAG-3′

GSK1-sgRNA2-R：5′-AAACCTGGTTAGCATTGCTGTAGT-3′

GSK2-sgRNA1-F：5′-GGCAATGCTTCAGGGAGATGACAT-3′

GSK2-sgRNA1-R：5′-AAACATGTCATCTCCCTGAAGCAT-3′

GSK2-sgRNA2-F：5′-GGCAACTACAGCAATGCCAACCAC-3′

GSK2-sgRNA2-R：5′-AAACGTGGTTGGCATTGCTGTAGT-3′

GSK3-sgRNA1-F：5′-GGCAAACACACGATACAGTGACTC-3′

GSK3-sgRNA1-R：5′-AAACGAGTCACTGTATCGTGTGTT-3′

GSK3-sgRNA2：5′-GGCAACATCCCTGTGGCAAACTCC-3′

GSK3-sgRNA2：5′-AAACGGAGTTTGCCACAGGGATGT-3′

GSK4-sgRNA1-F：5′-GGCAAGAGAAGAAACAATGCTTTA-3′

GSK4-sgRNA1-R：5′-AAACTAAAGCATTGTTTCTTCTCT-3′

GSK4-sgRNA2-F：5′-GGCAATATCTCGGTGACAAACTCC-3′

GSK4-sgRNA2-R：5′-AAACGGAGTTTGTCACCGAGATAT-3′

采用CRISPR/Cas9载体系统包括中间载体SK-gRNA和载体pC1300-Cas9，参见文献Chun Wang,Lan Shen,Yaping Fu,Changjie Yan，Kejian Wang，Journal of Genetics andGenomics 42(2015)703-706，A Simple CRISPR/Cas9 System for Multiplex GenomeEditing in Rice。用于构建多基因编辑载体的质粒图谱如图2所示。其中，图2A为SK-gRNA的质粒图谱(序列见SEQ ID NO:17)，图2B为pC1300-Cas9的质粒图谱(序列见SEQ ID NO:18)，图2C为主要表达盒的位置结构示意图。

将中间载体SK-gRNA进行AarI酶切，形成带有粘性末端的载体；将上述合成的互补引物成对混合后变性退火，形成带有粘性末端的片段；然后将载体和片段按照摩尔浓度约1:5混合进行连接，转化大肠杆菌DH5α得到连接质粒，利用公共引物T7进行测序，选取正确的质粒克隆共8个(SK-GSK1-gRNA1，SK-GSK1-gRNA2，SK-GSK2-gRNA1，SK-GSK2-gRNA2，SK-GSK3-gRNA1，SK-GSK3-gRNA2，SK-GSK4-gRNA1，SK-GSK4-gRNA2)进行下一步聚合连接。

利用BamHI和BglII为同尾酶的特点，将SK-GSK1-gRNA1使用KPNI和BamHI进行酶切作为载体，SK-GSK1-gRNA2使用KpnI和BglII进行酶切作为片段，连接后形成SK-GSK1-gRNA1-gRNA2；按照同样方法，利用SK-GSK2-gRNA1和SK-GSK2-gRNA2构建SK-GSK1-gRNA1-gRNA2；利用SK-GSK3-gRNA1和SK-GSK3-gRNA2构建SK-GSK3-gRNA1-gRNA2；利用SK-GSK4-gRNA1和SK-GSK4-gRNA2构建SK-GSK4-gRNA1-gRNA2。接着利用SK-GSK1-gRNA1-gRNA2和SK-GSK2-gRNA1-gRNA2构建SK-GSK1/2-sgRNA1/2，利用SK-GSK3-gRNA1-gRNA2和SK-GSK4-gRNA1-gRNA2构建SK-GSK3/4-sgRNA1/2。最后利用SK-GSK1/2-sgRNA1/2和SK-GSK3/4-sgRNA1/2构建形成SK-GSK1/2/3/4-sgRNA1/2，此载体将8个sgRNA表达盒聚合到一个中间载体上的质粒，简称为SK-4GSK-8gRNA。图3A示意4个sgRNA的聚合过程，8个sgRNA的聚合过程以此类推。

将CRISPR/Cas9载体pC1300-Cas9使用KPNI和BamHI进行酶切作为载体，SK-4GSK-8gRNA使用KpnI和BglII进行酶切后回收作为片段，载体片段连接后得到目的质粒pC1300-Cas9-4GSK-8gRNA(图3B，序列见SEQ ID NO:23)。

用所构建的多基因编辑载体转化野生型水稻‘中花11’(ZH11)愈伤。

2、转基因苗的分子检测

将获得的T0转基因苗与ZH11提取基因组DNA，直接在靶标位点两侧设计引物进行PCR后进行测序，检测引物如下(SEQ ID NO:9-16)：

GSK1-F:5′-gcgatttctcatgcgatttt-3′

GSK1-R:5′-accagaacctttgcacttcc-3′

GSK2-F:5′-ggtgctcatttttggtggtt-3′

GSK2-R:5′-agggtggaaaaggccaatac-3′

GSK3-F:5′-gtgggaactggatcatttgg-3′

GSK3-R:5′-ccctcttgaaaaccagaaagaa-3′

GSK4-F:5′-ggacaaagaatgtcgcatga-3′

GSK4-R:5′-agtagcatccgccacaaatc-3′

比较转基因苗序列与野生型序列，分析突变情况，发现除了GSK4-sgRNA1位置没有发现突变外，其它sgRNA处均能检测到突变，突变类型以单碱基插入(in)或缺失(del)居多。T0代转基因株系中51号为四突变体纯合子，在田间极端矮化并且不育，最终死亡。水稻突变体T0代检测结果见表1。

表1 水稻突变体T0代检测结果

3、各种转基因阴性突变体的获得

将其它含有突变的T0代转基因株系自花授粉繁殖两代，每一代均使用上述GSK1-GSK4检测引物检测突变情况，并同时利用引物对HPT-F(5’-TAGGAGGGCGTGGATATGTC-3’)和HPT-R(5’-TACACAGCCATCGGTCCAGA-3’)检测转基因载体。结果发现，对于转基因阳性株系，不同代数间对同一基因的编辑情况存在不稳定性。为此，最终筛选获得的转基因阴性植株用于后续分析，包括单突：gsk1，gsk2，gsk3w；双突：gsk1/2，gsk1/3；三突：gsk1/2/3，gsk1/2/4，gsk2/3w/4；四突：gsk1/2/3w/4(表2)。此处3w表示GSK3为弱等位(weak allele)，即非移码突变，其它未特别注明则均为移码突变。值得注意的是能获得的四突变体中gsk3均为12bp的缺失，不会导致移码，因此其功能仅部分丧失。尝试使用gsk1/2/3gsk4(+/-)(GSK3纯合移码敲除，GSK4为杂合)进行后代分离，仍然无法获得四个基因功能全部敲除(突变后移码)的纯合四突变体，表明纯合敲除四突变体是致死的。突变类型及位置如表2所示：

表2 水稻转基因后代检测分离获得不同基因型突变体结果

Genotype	GSK1	GSK2	GSK3	GSK4	HPT//
						gsk1	1bp del，437	WT	WT	WT
gsk2	WT	1bp in，347	WT	WT
						gsk3	WT	WT	12bp del，573-584	WT
gsk1/2	1bp in，436	1bp in，347	WT	WT
						gsk2/3	WT	5bp del，349-353	1bp in，581	WT
gsk1/2/3	1bp in，436	1bp in，347	1bp in，581	WT
						gsk1/2/4	1bp in，436	1bp in，347	WT	2bp del，574-575
gsk2/3/4	WT	1bp in，347	12bp del，573-584	2bp del，574-575
						gsk1/2/3/4	1bp in，436	1bp in，347	12bp del，573-584	2bp del，574-575

4、突变体的表型观察以及对油菜素内酯的敏感性检测

将突变体材料在田间种植，在收获前进行表型观察，发现单突和双突表型变化较弱或无明显变化，而三突和四突均有显著的表型变化。表型最显著的是gsk1/2/3，株高明显降低，叶夹角明显增大，籽粒也显著增大；gsk1/2/3w/4具有类似表型，但株高和籽粒相对变化均弱于gsk1/2/3(图4)。

将野生型和部分突变体种子萌发后培养约三天时间，在新生直立的第二叶顶部滴加1微升含有0、10、100、1000ng油菜素内酯(BL)的乙醇，继续培养三天后观察叶片角度，用于比较植物对BL的敏感性。结果发现，gsk3w单突变体对BL敏感性明显增强外，而其它突变体敏感性均有一定程度的降低或变化较小，表明GSK3在BR信号中起着关键的负调控子作用。与此一致的是，相对于gsk1/2双突，gsk1/2/3对BR的敏感性也有明显增加(图5)。

5、GSK1-4的表达模式及受PEG2000的调控

取不同组织的野生型水稻组织样品，提取RNA并反转录成cDNA，设计GSK1-4的定量PCR引物，使用Ubiquitin基因作为内参，定量PCR引物序列如下：

GSK1q-F:TCCGCAAGGACTCAGTACCAGA

GSK1q-R:AGGGCAATGCTAAGGATCACAAA

GSK2q-F:CTGGTTCTTTCGGTATCGTCT

GSK2q-R:ATATTGGGTTCACCTGGGAC

GSK3q-F:TTTTACTTTGCGAAGCCGATGC

GSK3q-R:CTGATCCCTTTCAATAGCTTAACAATAC

GSK4q-F:TCTGCCAAGAGGAGCCCGAATA

GSK4q-R:TTGAATGGATGCAGGTGCGGTA

UBQq-F:GAGCCTCTGTTCGTCAAGTA

UBQq-R:ACTCGATGGTCCATTAAACC

分析比较四个成员的表达模式。结果发现，四个成员均在穗部表达量最高，表达量总体上GSK3>GSK1>GSK4>GSK2，在其它组织如根中，GSK3表达量比其它成员高出10倍以上。将野生型水稻正常条件下培养一周，使用PEG2000模拟旱信号，处理不同时间取样提取RNA并反转录成cDNA，使用Ubiquitin基因作为内参，在每个时间点均使用未处理的样品作为对照，进行定量PCR分析。结果发现，GSK1-4全部都受到PEG2000的显著抑制，暗示其参与耐旱胁迫反应。定量PCR分析结果如图6所示。

6、突变体抗旱性检测

将野生型和部分突变体培养一周后，停止供水，直到叶片发卷呈干枯状后(约5-7天)复水，统计存活率。结果显示，与野生型相比，不同组合的突变体抗旱性各不相同，其中单突变体gsk1和gsk2无显著性差异，而gsk3耐旱性明显减弱；双突变体gsk1/2、三突变体gsk1/2/3和四突变体gsk1/2/3w/4存活率显著提高，相对而言双突变体gsk1/2最为明显。综合以上结果说明，GSK1和GSK2在调控水稻耐旱性过程中发挥着主要作用，并具有冗余功能。旱胁迫处理结果如图7所示。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 多基因编辑提高水稻抗旱性的方法

<130> KHP191110386.0

<160> 23

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cctgagacac tctaccgtgt gct 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

actacagcaa tgctaaccag cgg 23

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccaatgtcat ctccctgaag cat 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

actacagcaa tgccaaccac cgg 23

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cctgagtcac tgtatcgtgt gtt 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cctggagttt gccacaggga tgt 23

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccctaaagca ttgtttcttc tct 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cctggagttt gtcaccgaga tat 23

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gcgatttctc atgcgatttt 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

accagaacct ttgcacttcc 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggtgctcatt tttggtggtt 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

agggtggaaa aggccaatac 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gtgggaactg gatcatttgg 20

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ccctcttgaa aaccagaaag aa 22

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ggacaaagaa tgtcgcatga 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

agtagcatcc gccacaaatc 20

<210> 17

<211> 3428

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt 60

caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa 120

ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt 180

gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt 240

tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt 300

ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg 360

tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga 420

atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa 480

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

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tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca 10980

cgttaaggga ttttggtcat gcattctagg tactaaaaca attcatccag taaaatataa 11040

tattttattt tctcccaatc aggcttgatc cccagtaagt caaaaaatag ctcgacatac 11100

tgttcttccc cgatatcctc cctgatcgac cggacgcaga aggcaatgtc ataccacttg 11160

tccgccctgc cgcttctccc aagatcaata aagccactta ctttgccatc tttcacaaag 11220

atgttgctgt ctcccaggtc gccgtgggaa aagacaagtt cctcttcggg cttttccgtc 11280

tttaaaaaat catacagctc gcgcggatct ttaaatggag tgtcttcttc ccagttttcg 11340

caatccacat cggccagatc gttattcagt aagtaatcca attcggctaa gcggctgtct 11400

aagctattcg tatagggaca atccgatatg tcgatggagt gaaagagcct gatgcactcc 11460

gcatacagct cgataatctt ttcagggctt tgttcatctt catactcttc cgagcaaagg 11520

acgccatcgg cctcactcat gagcagattg ctccagccat catgccgttc aaagtgcagg 11580

acctttggaa caggcagctt tccttccagc catagcatca tgtccttttc ccgttccaca 11640

tcataggtgg tccctttata ccggctgtcc gtcattttta aatataggtt ttcattttct 11700

cccaccagct tatatacctt agcaggagac attccttccg tatcttttac gcagcggtat 11760

ttttcgatca gttttttcaa ttccggtgat attctcattt tagccattta ttatttcctt 11820

cctcttttct acagtattta aagatacccc aagaagctaa ttataacaag acgaactcca 11880

attcactgtt ccttgcattc taaaacctta aataccagaa aacagctttt tcaaagttgt 11940

tttcaaagtt ggcgtataac atagtatcga cggagccgat tttgaaaccg cggtgatcac 12000

aggcagcaac gctctgtcat cgttacaatc aacatgctac cctccgcgag atcatccgtg 12060

tttcaaaccc ggcagcttag ttgccgttct tccgaatagc atcggtaaca tgagcaaagt 12120

ctgccgcctt acaacggctc tcccgctgac gccgtcccgg actgatgggc tgcctgtatc 12180

gagtggtgat tttgtgccga gctgccggtc ggggagctgt tggctggctg gtggcaggat 12240

atattgtggt gtaaacaaat tgacgcttag acaacttaat aacacattgc ggacgttttt 12300

aatgtactga attaacgccg aattaattcg ggggatctgg attttagtac tggattttgg 12360

ttttaggaat tagaaatttt attgatagaa gtattttaca aatacaaata catactaagg 12420

gtttcttata tgctcaacac atgagcgaaa ccctatagga accctaattc ccttatctgg 12480

gaactactca cacattatta tggagaaact cgagcttgtc gatcgacaga tccggtcggc 12540

atctactcta tttctttgcc ctcggacgag tgctggggcg tcggtttcca ctatcggcga 12600

gtacttctac acagccatcg gtccagacgg ccgcgcttct gcgggcgatt tgtgtacgcc 12660

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catcgaaatt gccgtcaacc aagctctgat agagttggtc aagaccaatg cggagcatat 12780

acgcccggag tcgtggcgat cctgcaagct ccggatgcct ccgctcgaag tagcgcgtct 12840

gctgctccat acaagccaac cacggcctcc agaagaagat gttggcgacc tcgtattggg 12900

aatccccgaa catcgcctcg ctccagtcaa tgaccgctgt tatgcggcca ttgtccgtca 12960

ggacattgtt ggagccgaaa tccgcgtgca cgaggtgccg gacttcgggg cagtcctcgg 13020

cccaaagcat cagctcatcg agagcctgcg cgacggacgc actgacggtg tcgtccatca 13080

cagtttgcca gtgatacaca tggggatcag caatcgcgca tatgaaatca cgccatgtag 13140

tgtattgacc gattccttgc ggtccgaatg ggccgaaccc gctcgtctgg ctaagatcgg 13200

ccgcagcgat cgcatccata gcctccgcga ccggttgtag aacagcgggc agttcggttt 13260

caggcaggtc ttgcaacgtg acaccctgtg cacggcggga gatgcaatag gtcaggctct 13320

cgctaaactc cccaatgtca agcacttccg gaatcgggag cgcggccgat gcaaagtgcc 13380

gataaacata acgatctttg tagaaaccat cggcgcagct atttacccgc aggacatatc 13440

cacgccctcc tacatcgaag ctgaaagcac gagattcttc gccctccgag agctgcatca 13500

ggtcggagac gctgtcgaac ttttcgatca gaaacttctc gacagacgtc gcggtgagtt 13560

caggcttttt catatctcat tgccccccgg gatctgcgaa agctcgagag agatagattt 13620

gtagagagag actggtgatt tcagcgtgtc ctctccaaat gaaatgaact tccttatata 13680

gaggaaggtc ttgcgaagga tagtgggatt gtgcgtcatc ccttacgtca gtggagatat 13740

cacatcaatc cacttgcttt gaagacgtgg ttggaacgtc ttctttttcc acgatgctcc 13800

tcgtgggtgg gggtccatct ttgggaccac tgtcggcaga ggcatcttga acgatagcct 13860

ttcctttatc gcaatgatgg catttgtagg tgccaccttc cttttctact gtccttttga 13920

tgaagtgaca gatagctggg caatggaatc cgaggaggtt tcccgatatt accctttgtt 13980

gaaaagtctc aatagccctt tggtcttctg agactgtatc tttgatattc ttggagtaga 14040

cgagagtgtc gtgctccacc atgttatcac atcaatccac ttgctttgaa gacgtggttg 14100

gaacgtcttc tttttccacg atgctcctcg tgggtggggg tccatctttg ggaccactgt 14160

cggcagaggc atcttgaacg atagcctttc ctttatcgca atgatggcat ttgtaggtgc 14220

caccttcctt ttctactgtc cttttgatga agtgacagat agctgggcaa tggaatccga 14280

ggaggtttcc cgatattacc ctttgttgaa aagtctcaat agccctttgg tcttctgaga 14340

ctgtatcttt gatattcttg gagtagacga gagtgtcgtg ctccaccatg ttggcaagct 14400

gctctagcca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt aatgcagctg 14460

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gctcactcat taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg 14580

aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt acg 14633

<210> 19

<211> 1215

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

atggaggcgc cgccggggcc ggagcccatg gagctggacg cgccaccgcc ccccgccgcc 60

gtggcggcgg cggcggcgac cgccggcatc agcgagaaga agaaggagga gggcgggggc 120

gacgccgtga cgggtcacat catctccacc accatcggcg gcaagaacgg cgagccgaag 180

cggacaatta gttatatggc ggagcgagtt gtaggaactg gttctttcgg gattgtgttc 240

caggctaagt gcttggagac gggggaaacg gtggccatca agaaggtgtt gcaggaccgg 300

cgttacaaga accgtgaact gcagcttatg cgcgcaatgg aacaccccaa tgtcatctgc 360

ctgaagcact gcttcttctc aaccacaagc agggatgagc tgttcctgaa tcttgttatg 420

gagtacgtcc ctgagacact ctaccgtgtg ctcaagcact acagcaatgc taaccagcgg 480

atgccattga tctatgtgaa gctttacatc tatcagcttt tcagagggtt agcttatatt 540

catactgttc caggagtctg ccacagggat gtgaaaccac aaaatgtttt ggttgatcct 600

ctcactcatc aagtcaagct atgtgacttt ggaagtgcaa aggttctggt tcctggtgaa 660

ccgaacatat catacatttg ctctcgctat tatcgtgctc ctgagctcat atttggtgca 720

accgagtata caacttcaat tgacatatgg tcagctggat gcgttcttgc agagttactt 780

cttggtcagc cactgtttcc tggagagagt gctgttgacc agctagtaga gataatcaag 840

gttcttggta ctccaacccg tgaggaaata cgatgcatga accccaacta tactgagttc 900

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gaagccatag accttgcttc ccgtcttctc caatattcac caagtctacg ctgcactgct 1020

cttgacgcat gtgcacattc cttctttgat gagctacgag agcccaatgc acgcctgcca 1080

aatggtcgtc cattccctcc tctgttcaac ttcaagcatg aactagccag cgcctctcca 1140

gaactcatcc acaggctcat accggatcat atcagacggc aacatggcct caactttgcg 1200

catgctggga gctaa 1215

<210> 20

<211> 1209

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

atggaccagc cggcgccggc gccggagccg atgctgctcg acgcgcagcc gcccgccgcc 60

gtcgcctgcg acaagaagca gcaggagggg gaggcgccgt acgcggaggg gaatgacgcg 120

gtgaccgggc acatcatctc caccaccatc gggggcaaga acggcgagcc caagaggaca 180

attagctaca tggcggagcg cgttgtgggc actggttctt tcggtatcgt ctttcaggct 240

aaatgcttgg agacaggaga gactgttgcc attaagaagg tattgcagga ccgacggtac 300

aagaaccgtg agcttcagct tatgcgcgcc atggaccacc ccaatgtcat ctccctgaag 360

cattgcttct tctcaaccac aagtagggat gagctgttcc tcaatcttgt catggaatat 420

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cttatctacg tcaagcttta catgtatcag ttatttaggg ggcttgcgta cattcatact 540

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tatactacat caatagatat atggtcagct gggtgtgttc ttgcagagct actccttggt 780

cagccattgt ttccagggga gagtgcagtc gatcagcttg tagagataat taaggttctt 840

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gcatgtgcac atcctttctt tgatgagctg cgagagccga atgcacgctt gccaaacgga 1080

cgtccatttc caccactatt caacttcaaa cacgaactag caaattcttc tcaagagctc 1140

atcagcaggc tcataccaga acatgttcga cggcaagcta cccacaactt cttcaatact 1200

gggagctaa 1209

<210> 21

<211> 1206

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

atggccacgc tgccgggcgg gccccacccc accggaggcg gcgccgcggc ggacccgatg 60

caggtcgacc agccgcgctc cgccgcggcc gccgcagcgg tcgcccccgc cggtgaaaag 120

cacggtgctt ctcttatgga agggagtgat cctgtcaccg gccacataat ctccacaacg 180

attggaggga agaatggaga acctaaaagg acgattagct acatggcaga acgagttgtg 240

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cgtgctccag aactgatatt tggggcaacc gaatacacga catcaattga tatatggtca 780

gctgggtgtg ttcttgctga gttgctcctt ggccagcctc tctttcctgg tgaaagtgca 840

gtggatcagc ttgtcgagat tataaaggtt cttggtactc caacacgtga ggaaatccgc 900

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aagattttcc acaagcggat gcctccagaa gcaattgacc ttgcatcacg tcttctccag 1020

tatgcaccaa atctacgatg cactgccctc gaagcatgtg cacattcatt ctttgatgaa 1080

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cggtga 1206

<210> 22

<211> 1212

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

atggccgcga tgccaggtgg gcccgacctt gccggggccg gtggcgccgt cgccgtcgcc 60

gtcgacgcga tgcaggtcga cgacccgccg cgtgcgtccg ccgaggagaa gcatggtccc 120

actataatgg gaggaaatga tccagtcaca ggtcatataa tttcaactac tattggaggg 180

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gttcttgctg agctgcttct tggtcaacct ctgtttcctg gtgaaagtgc agtggaccag 840

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cccaattaca cagaattcaa atttccgcag ataaaagcat gcccatggca caagatcttc 960

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ccacatgcaa aactgccaaa tggccgtccg tttccgcctc tgttcaactt taagcaagaa 1140

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tcaggatttt aa 1212

<210> 23

<211> 18857

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

aattcgagct cggtaccgag gatcctctag actcgaggat tatgtggaaa aaaagcaccg 60

actcggtgcc actttttcaa gttgataacg gactagcctt attttaactt gctatttcta 120

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atcagctttg atctatgtgg atagccgagg tggtactaat actagtcttt gttgtcgtcc 240

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tttttcaagt tgataacgga ctagccttat tttaacttgc tatttctagc tctaaaacta 660

aagcattgtt tcttctcttg ccacggatca tctgcacaac tcttttaaat cagctttgat 720

ctatgtggat agccgaggtg gtactaatac tagtctttgt tgtcgtccaa ttgcgtaatg 780

ggccggccca tactgcaata catgtcctga aaggcttcat ggcccactac gaaatgcttt 840

tctcctacag tttatcttac ttcttcacat cacgtggttt ccgacgtacc cagtgttccc 900

ggcttccagc atttgctggt agcaccagta gaagacgcct gtcttgtgct atggtccctg 960

actgcacatc tgattcctcc aagatccatg catgcctgat aactttaagt tgcttcagaa 1020

gaactttaag tgatctgttc gtatgtttaa agattcctta atcgtcgacg ctagcagatc 1080

ctctagactc gaggattatg tggaaaaaaa gcaccgactc ggtgccactt tttcaagttg 1140

ataacggact agccttattt taacttgcta tttctagctc taaaacggag tttgccacag 1200

ggatgttgcc acggatcatc tgcacaactc ttttaaatca gctttgatct atgtggatag 1260

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ctgcaataca tgtcctgaaa ggcttcatgg cccactacga aatgcttttc tcctacagtt 1380

tatcttactt cttcacatca cgtggtttcc gacgtaccca gtgttcccgg cttccagcat 1440

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attcctccaa gatccatgca tgcctgataa ctttaagttg cttcagaaga actttaagtg 1560

atctgttcgt atgtttaaag attccttaat cgtcgacgct agcagatcct ctagactcga 1620

ggattatgtg gaaaaaaagc accgactcgg tgccactttt tcaagttgat aacggactag 1680

ccttatttta acttgctatt tctagctcta aaacgagtca ctgtatcgtg tgtttgccac 1740

ggatcatctg cacaactctt ttaaatcagc tttgatctat gtggatagcc gaggtggtac 1800

taatactagt ctttgttgtc gtccaattgc gtaatgggcc ggcccatact gcaatacatg 1860

tcctgaaagg cttcatggcc cactacgaaa tgcttttctc ctacagttta tcttacttct 1920

tcacatcacg tggtttccga cgtacccagt gttcccggct tccagcattt gctggtagca 1980

ccagtagaag acgcctgtct tgtgctatgg tccctgactg cacatctgat tcctccaaga 2040

tccatgcatg cctgataact ttaagttgct tcagaagaac tttaagtgat ctgttcgtat 2100

gtttaaagat tccttaatcg tcgacgctag cagatcctct agactcgagg attatgtgga 2160

aaaaaagcac cgactcggtg ccactttttc aagttgataa cggactagcc ttattttaac 2220

ttgctatttc tagctctaaa acgtggttgg cattgctgta gttgccacgg atcatctgca 2280

caactctttt aaatcagctt tgatctatgt ggatagccga ggtggtacta atactagtct 2340

ttgttgtcgt ccaattgcgt aatgggccgg cccatactgc aatacatgtc ctgaaaggct 2400

tcatggccca ctacgaaatg cttttctcct acagtttatc ttacttcttc acatcacgtg 2460

gtttccgacg tacccagtgt tcccggcttc cagcatttgc tggtagcacc agtagaagac 2520

gcctgtcttg tgctatggtc cctgactgca catctgattc ctccaagatc catgcatgcc 2580

tgataacttt aagttgcttc agaagaactt taagtgatct gttcgtatgt ttaaagattc 2640

cttaatcgtc gacgctagca gatcctctag actcgaggat tatgtggaaa aaaagcaccg 2700

actcggtgcc actttttcaa gttgataacg gactagcctt attttaactt gctatttcta 2760

gctctaaaac atgtcatctc cctgaagcat tgccacggat catctgcaca actcttttaa 2820

atcagctttg atctatgtgg atagccgagg tggtactaat actagtcttt gttgtcgtcc 2880

aattgcgtaa tgggccggcc catactgcaa tacatgtcct gaaaggcttc atggcccact 2940

acgaaatgct tttctcctac agtttatctt acttcttcac atcacgtggt ttccgacgta 3000

cccagtgttc ccggcttcca gcatttgctg gtagcaccag tagaagacgc ctgtcttgtg 3060

ctatggtccc tgactgcaca tctgattcct ccaagatcca tgcatgcctg ataactttaa 3120

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cgctagcaga tcctctagac tcgaggatta tgtggaaaaa aagcaccgac tcggtgccac 3240

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ctatgtggat agccgaggtg gtactaatac tagtctttgt tgtcgtccaa ttgcgtaatg 3420

ggccggccca tactgcaata catgtcctga aaggcttcat ggcccactac gaaatgcttt 3480

tctcctacag tttatcttac ttcttcacat cacgtggttt ccgacgtacc cagtgttccc 3540

ggcttccagc atttgctggt agcaccagta gaagacgcct gtcttgtgct atggtccctg 3600

actgcacatc tgattcctcc aagatccatg catgcctgat aactttaagt tgcttcagaa 3660

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ataacggact agccttattt taacttgcta tttctagctc taaaacgaga cactctaccg 3840

tgtgcttgcc acggatcatc tgcacaactc ttttaaatca gctttgatct atgtggatag 3900

ccgaggtggt actaatacta gtctttgttg tcgtccaatt gcgtaatggg ccggcccata 3960

ctgcaataca tgtcctgaaa ggcttcatgg cccactacga aatgcttttc tcctacagtt 4020

tatcttactt cttcacatca cgtggtttcc gacgtaccca gtgttcccgg cttccagcat 4080

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attcctccaa gatccatgca tgcctgataa ctttaagttg cttcagaaga actttaagtg 4200

atctgttcgt atgtttaaag attccttaat cgtcgacgct agcagatccg tacccctact 4260

ccaaaaatgt caaagataca gtctcagaag accaaagggc tattgagact tttcaacaaa 4320

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ggacagtaga aaaggaaggt ggctcctaca aatgccatca ttgcgataaa ggaaaggcta 4440

tcattcaaga tgcctctgcc gacagtggtc ccaaagatgg acccccaccc acgaggagca 4500

tcgtggaaaa agaagacgtt ccaaccacgt cttcaaagca agtggattga tgtgacatct 4560

ccactgacgt aagggatgac gcacaatccc acccctactc caaaaatgtc aaagatacag 4620

tctcagaaga ccaaagggct attgagactt ttcaacaaag ggtaatttcg ggaaacctcc 4680

tcggattcca ttgcccagct atctgtcact tcatcgaaag gacagtagaa aaggaaggtg 4740

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acagtggtcc caaagatgga cccccaccca cgaggagcat cgtggaaaaa gaagacgttc 4860

caaccacgtc ttcaaagcaa gtggattgat gtgacatctc cactgacgta agggatgacg 4920

cacaatccca ctatccttcg caagaccctt cctctatata aggaagttca tttcatttgg 4980

agaggacagc ccaagctaga tccatggccc ctaagaagaa gagaaaggtc ggtattcacg 5040

gcgttcctgc ggcgatggac aagaagtata gtattggtct ggacattggg acgaattccg 5100

ttggctgggc cgtgatcacc gatgagtaca aggtcccttc caagaagttt aaggttctgg 5160

ggaacaccga tcggcacagc atcaagaaga atctcattgg agccctcctg ttcgactcag 5220

gcgagaccgc cgaagcaaca aggctcaaga gaaccgcaag gagacggtat acaagaagga 5280

agaataggat ctgctacctg caggagattt tcagcaacga aatggcgaag gtggacgatt 5340

cgttctttca tagattggag gagagtttcc tcgtcgagga agataagaag cacgagaggc 5400

atcctatctt tggcaacatt gtcgacgagg ttgcctatca cgaaaagtac cccacaatct 5460

atcatctgcg gaagaagctt gtggactcga ctgataaggc ggaccttaga ttgatctacc 5520

tcgctctggc acacatgatt aagttcaggg gccattttct gatcgagggg gatcttaacc 5580

cggacaatag cgatgtggac aagttgttca tccagctcgt ccaaacctac aatcagctct 5640

ttgaggaaaa cccaattaat gcttcaggcg tcgacgccaa ggcgatcctg tctgcacgcc 5700

tttcaaagtc tcgccggctt gagaacttga tcgctcaact cccgggcgaa aagaagaacg 5760

gcttgttcgg gaatctcatt gcactttcgt tggggctcac accaaacttc aagagtaatt 5820

ttgatctcgc tgaggacgca aagctgcagc tttccaagga cacttatgac gatgacctgg 5880

ataacctttt ggcccaaatc ggcgatcagt acgcggactt gttcctcgcc gcgaagaatt 5940

tgtcggacgc gatcctcctg agtgatattc tccgcgtgaa caccgagatt acaaaggccc 6000

cgctctcggc gagtatgatc aagcgctatg acgagcacca tcaggatctg acccttttga 6060

aggctttggt ccggcagcaa ctcccagaga agtacaagga aatcttcttt gatcaatcca 6120

agaacggcta cgctggttat attgacggcg gggcatcgca ggaggaattc tacaagttta 6180

tcaagccaat tctggagaag atggatggca cagaggaact cctggtgaag ctcaataggg 6240

aggacctttt gcggaagcaa agaactttcg ataacggcag catccctcac cagattcatc 6300

tcggggagct gcacgccatc ctgagaaggc aggaagactt ctaccccttt cttaaggata 6360

accgggagaa gatcgaaaag attctgacgt tcagaattcc gtactatgtc ggaccactcg 6420

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ggaacttcga ggaagtggtc gataagggcg cttccgcaca gagcttcatt gagcgcatga 6540

caaattttga caagaacctg cctaatgaga aggtccttcc caagcattcc ctcctgtacg 6600

agtatttcac tgtttataac gaactcacga aggtgaagta tgtgaccgag ggaatgcgca 6660

agcccgcctt cctgagcggc gagcaaaaga aggcgatcgt ggaccttttg tttaagacca 6720

atcggaaggt cacagttaag cagctcaagg aggactactt caagaagatt gaatgcttcg 6780

attccgttga gatcagcggc gtggaagaca ggtttaacgc gtcactgggg acttaccacg 6840

atctcctgaa gatcattaag gataaggact tcttggacaa cgaggaaaat gaggatatcc 6900

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tgaagacgta tgcccatctc ttcgatgaca aggttatgaa gcagctcaag agaagaagat 7020

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tgattcacga tgactcactt actttcaagg aggatatcca gaaggctcaa gtgtcgggac 7200

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actcgaggga gcgcatgaag cgcatcgagg aaggcattaa ggagctgggg agtcagatcc 7440

ttaaggagca cccggtggaa aacacgcagt tgcaaaatga gaagctctat ctgtactatc 7500

tgcaaaatgg cagggatatg tatgtggacc aggagttgga tattaaccgc ctctcggatt 7560

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ttctcaccag gtccgacaag aaccgcggga agtccgataa tgtgcccagc gaggaagtcg 7680

ttaagaagat gaagaactac tggaggcaac ttttgaatgc caagttgatc acacagagga 7740

agtttgataa cctcactaag gccgagcgcg gaggtctcag cgaactggac aaggcgggct 7800

tcattaagcg gcaactggtt gagactagac agatcacgaa gcacgtggcg cagattctcg 7860

attcacgcat gaacacgaag tacgatgaga atgacaagct gatccgggaa gtgaaggtca 7920

tcaccttgaa gtcaaagctc gtttctgact tcaggaagga tttccaattt tataaggtgc 7980

gcgagatcaa caattatcac catgctcatg acgcatacct caacgctgtg gtcggaacag 8040

cattgattaa gaagtacccg aagctcgagt ccgaattcgt gtacggtgac tataaggttt 8100

acgatgtgcg caagatgatc gccaagtcag agcaggaaat tggcaaggcc actgcgaagt 8160

atttctttta ctctaacatt atgaatttct ttaagactga gatcacgctg gctaatggcg 8220

aaatccggaa gagaccactt attgagacca acggcgagac aggggaaatc gtgtgggaca 8280

aggggaggga tttcgccaca gtccgcaagg ttctctctat gcctcaagtg aatattgtca 8340

agaagactga agtccagacg ggcgggttct caaaggaatc tattctgccc aagcggaact 8400

cggataagct tatcgccaga aagaaggact gggacccgaa gaagtatgga ggtttcgact 8460

caccaacggt ggcttactct gtcctggttg tggcaaaggt ggagaaggga aagtcaaaga 8520

agctcaagtc tgtcaaggag ctcctgggta tcaccattat ggagaggtcc agcttcgaaa 8580

agaatccgat cgattttctc gaggcgaagg gatataagga agtgaagaag gacctgatca 8640

ttaagcttcc aaagtacagt cttttcgagt tggaaaacgg caggaagcgc atgttggctt 8700

ccgcaggaga gctccagaag ggtaacgagc ttgctttgcc gtccaagtat gtgaacttcc 8760

tctatctggc atcccactac gagaagctca agggcagccc agaggataac gaacagaagc 8820

aactgtttgt ggagcaacac aagcattatc ttgacgagat cattgaacag atttcggagt 8880

tcagtaagcg cgtcatcctc gccgacgcga atttggataa ggttctctca gcctacaaca 8940

agcaccggga caagcctatc agagagcagg cggaaaatat cattcatctc ttcaccctga 9000

caaaccttgg ggctcccgct gcattcaagt attttgacac tacgattgat cggaagagat 9060

acacttctac gaaggaggtg ctggatgcaa cccttatcca ccaatcgatt actggcctct 9120

acgagacgcg gatcgacttg agtcagctcg ggggggataa gagaccagcg gcaaccaaga 9180

aggcaggaca agcgaagaag aagaagtagc aattcggtac gctgaaatca ccagtctctc 9240

tctacaaatc tatctctctc tattttctcc ataaataatg tgtgagtagt ttcccgataa 9300

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atgtatttgt atttgtaaaa tacttctatc aataaaattt ctaattccta aaaccaaaat 9420

ccagtactaa aatccagatc tcctaaagtc cctatagatc tttgtcgtga atataaacca 9480

gacacgagac gactaaacct ggagcccaga cgccgttcga agctagaagt accgcttagg 9540

caggaggccg ttagggaaaa gatgctaagg cagggttggt tacgttgact cccccgtagg 9600

tttggtttaa atatgatgaa gtggacggaa ggaaggagga agacaaggaa ggataaggtt 9660

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ttaagaaata atccgcataa gcccccgctt aaaaattggt atcagagcca tgaataggtc 9840

tatgaccaaa actcaagagg ataaaacctc accaaaatac gaaagagttc ttaactctaa 9900

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tggccgtcgt tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg cgttacccaa cttaatcgcc 10020

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cttcccaaca gttgcgcagc ctgaatggcg aatgctagag cagcttgagc ttggatcaga 10140

ttgtcgtttc ccgccttcag tttaaactat cagtgtttga caggatatat tggcgggtaa 10200

acctaagaga aaagagcgtt tattagaata acggatattt aaaagggcgt gaaaaggttt 10260

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ccggagacat tacgccatga acaagagcgc cgccgctggc ctgctgggct atgcccgcgt 10560

cagcaccgac gaccaggact tgaccaacca acgggccgaa ctgcacgcgg ccggctgcac 10620

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gatcgcgcac gcccgcgagc tgatcgacca ggaaggccgc accgtgaaag aggcggctgc 11040

actgcttggc gtgcatcgct cgaccctgta ccgcgcactt gagcgcagcg aggaagtgac 11100

gcccaccgag gccaggcggc gcggtgcctt ccgtgaggac gcattgaccg aggccgacgc 11160

cctggcggcc gccgagaatg aacgccaaga ggaacaagca tgaaaccgca ccaggacggc 11220

caggacgaac cgtttttcat taccgaagag atcgaggcgg agatgatcgc ggccgggtac 11280

gtgttcgagc cgcccgcgca cgtctcaacc gtgcggctgc atgaaatcct ggccggtttg 11340

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cgtctaaaaa ggtgatgtgt atttgagtaa aacagcttgc gtcatgcggt cgctgcgtat 11460

atgatgcgat gagtaaataa acaaatacgc aaggggaacg catgaaggtt atcgctgtac 11520

ttaaccagaa aggcgggtca ggcaagacga ccatcgcaac ccatctagcc cgcgccctgc 11580

aactcgccgg ggccgatgtt ctgttagtcg attccgatcc ccagggcagt gcccgcgatt 11640

gggcggccgt gcgggaagat caaccgctaa ccgttgtcgg catcgaccgc ccgacgattg 11700

accgcgacgt gaaggccatc ggccggcgcg acttcgtagt gatcgacgga gcgccccagg 11760

cggcggactt ggctgtgtcc gcgatcaagg cagccgactt cgtgctgatt ccggtgcagc 11820

caagccctta cgacatatgg gccaccgccg acctggtgga gctggttaag cagcgcattg 11880

aggtcacgga tggaaggcta caagcggcct ttgtcgtgtc gcgggcgatc aaaggcacgc 11940

gcatcggcgg tgaggttgcc gaggcgctgg ccgggtacga gctgcccatt cttgagtccc 12000

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cagaacccga gggcgacgct gcccgcgagg tccaggcgct ggccgctgaa attaaatcaa 12120

aactcatttg agttaatgag gtaaagagaa aatgagcaaa agcacaaaca cgctaagtgc 12180

cggccgtccg agcgcacgca gcagcaaggc tgcaacgttg gccagcctgg cagacacgcc 12240

agccatgaag cgggtcaact ttcagttgcc ggcggaggat cacaccaagc tgaagatgta 12300

cgcggtacgc caaggcaaga ccattaccga gctgctatct gaatacatcg cgcagctacc 12360

agagtaaatg agcaaatgaa taaatgagta gatgaatttt agcggctaaa ggaggcggca 12420

tggaaaatca agaacaacca ggcaccgacg ccgtggaatg ccccatgtgt ggaggaacgg 12480

gcggttggcc aggcgtaagc ggctgggttg tctgccggcc ctgcaatggc actggaaccc 12540

ccaagcccga ggaatcggcg tgacggtcgc aaaccatccg gcccggtaca aatcggcgcg 12600

gcgctgggtg atgacctggt ggagaagttg aaggccgcgc aggccgccca gcggcaacgc 12660

atcgaggcag aagcacgccc cggtgaatcg tggcaagcgg ccgctgatcg aatccgcaaa 12720

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gagcaaccag attttttcgt tccgatgctc tatgacgtgg gcacccgcga tagtcgcagc 12840

atcatggacg tggccgtttt ccgtctgtcg aagcgtgacc gacgagctgg cgaggtgatc 12900

cgctacgagc ttccagacgg gcacgtagag gtttccgcag ggccggccgg catggccagt 12960

gtgtgggatt acgacctggt actgatggcg gtttcccatc taaccgaatc catgaaccga 13020

taccgggaag ggaagggaga caagcccggc cgcgtgttcc gtccacacgt tgcggacgta 13080

ctcaagttct gccggcgagc cgatggcgga aagcagaaag acgacctggt agaaacctgc 13140

attcggttaa acaccacgca cgttgccatg cagcgtacga agaaggccaa gaacggccgc 13200

ctggtgacgg tatccgaggg tgaagccttg attagccgct acaagatcgt aaagagcgaa 13260

accgggcggc cggagtacat cgagatcgag ctagctgatt ggatgtaccg cgagatcaca 13320

gaaggcaaga acccggacgt gctgacggtt caccccgatt actttttgat cgatcccggc 13380

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ttgttcaaga cgatctacga acgcagtggc agcgccggag agttcaagaa gttctgtttc 13500

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gggcaggctg gcccgatcct agtcatgcgc taccgcaacc tgatcgaggg cgaagcatcc 13620

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cgaaaaggtc tctttcctgt ggatagcacg tacattggga acccaaagcc gtacattggg 13740

aaccggaacc cgtacattgg gaacccaaag ccgtacattg ggaaccggtc acacatgtaa 13800

gtgactgata taaaagagaa aaaaggcgat ttttccgcct aaaactcttt aaaacttatt 13860

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ctgcaaaaag cgcctaccct tcggtcgctg cgctccctac gccccgccgc ttcgcgtcgg 13980

cctatcgcgg ccgctggccg ctcaaaaatg gctggcctac ggccaggcaa tctaccaggg 14040

cgcggacaag ccgcgccgtc gccactcgac cgccggcgcc cacatcaagg caccctgcct 14100

cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac 14160

agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt 14220

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cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata 14340

ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgct cttccgcttc ctcgctcact 14400

gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta 14460

atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag 14520

caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc 14580

cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta 14640

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ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc 14760

tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac 14820

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ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg 14940

aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga 15000

aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt 15060

agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag 15120

cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct 15180

gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgcattc taggtactaa 15240

aacaattcat ccagtaaaat ataatatttt attttctccc aatcaggctt gatccccagt 15300

aagtcaaaaa atagctcgac atactgttct tccccgatat cctccctgat cgaccggacg 15360

cagaaggcaa tgtcatacca cttgtccgcc ctgccgcttc tcccaagatc aataaagcca 15420

cttactttgc catctttcac aaagatgttg ctgtctccca ggtcgccgtg ggaaaagaca 15480

agttcctctt cgggcttttc cgtctttaaa aaatcataca gctcgcgcgg atctttaaat 15540

ggagtgtctt cttcccagtt ttcgcaatcc acatcggcca gatcgttatt cagtaagtaa 15600

tccaattcgg ctaagcggct gtctaagcta ttcgtatagg gacaatccga tatgtcgatg 15660

gagtgaaaga gcctgatgca ctccgcatac agctcgataa tcttttcagg gctttgttca 15720

tcttcatact cttccgagca aaggacgcca tcggcctcac tcatgagcag attgctccag 15780

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atcatgtcct tttcccgttc cacatcatag gtggtccctt tataccggct gtccgtcatt 15900

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tccgtatctt ttacgcagcg gtatttttcg atcagttttt tcaattccgg tgatattctc 16020

attttagcca tttattattt ccttcctctt ttctacagta tttaaagata ccccaagaag 16080

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agaaaacagc tttttcaaag ttgttttcaa agttggcgta taacatagta tcgacggagc 16200

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tagcatcggt aacatgagca aagtctgccg ccttacaacg gctctcccgc tgacgccgtc 16380

ccggactgat gggctgcctg tatcgagtgg tgattttgtg ccgagctgcc ggtcggggag 16440

ctgttggctg gctggtggca ggatatattg tggtgtaaac aaattgacgc ttagacaact 16500

taataacaca ttgcggacgt ttttaatgta ctgaattaac gccgaattaa ttcgggggat 16560

ctggatttta gtactggatt ttggttttag gaattagaaa ttttattgat agaagtattt 16620

tacaaataca aatacatact aagggtttct tatatgctca acacatgagc gaaaccctat 16680

aggaacccta attcccttat ctgggaacta ctcacacatt attatggaga aactcgagct 16740

tgtcgatcga cagatccggt cggcatctac tctatttctt tgccctcgga cgagtgctgg 16800

ggcgtcggtt tccactatcg gcgagtactt ctacacagcc atcggtccag acggccgcgc 16860

ttctgcgggc gatttgtgta cgcccgacag tcccggctcc ggatcggacg attgcgtcgc 16920

atcgaccctg cgcccaagct gcatcatcga aattgccgtc aaccaagctc tgatagagtt 16980

ggtcaagacc aatgcggagc atatacgccc ggagtcgtgg cgatcctgca agctccggat 17040

gcctccgctc gaagtagcgc gtctgctgct ccatacaagc caaccacggc ctccagaaga 17100

agatgttggc gacctcgtat tgggaatccc cgaacatcgc ctcgctccag tcaatgaccg 17160

ctgttatgcg gccattgtcc gtcaggacat tgttggagcc gaaatccgcg tgcacgaggt 17220

gccggacttc ggggcagtcc tcggcccaaa gcatcagctc atcgagagcc tgcgcgacgg 17280

acgcactgac ggtgtcgtcc atcacagttt gccagtgata cacatgggga tcagcaatcg 17340

cgcatatgaa atcacgccat gtagtgtatt gaccgattcc ttgcggtccg aatgggccga 17400

acccgctcgt ctggctaaga tcggccgcag cgatcgcatc catagcctcc gcgaccggtt 17460

gtagaacagc gggcagttcg gtttcaggca ggtcttgcaa cgtgacaccc tgtgcacggc 17520

gggagatgca ataggtcagg ctctcgctaa actccccaat gtcaagcact tccggaatcg 17580

ggagcgcggc cgatgcaaag tgccgataaa cataacgatc tttgtagaaa ccatcggcgc 17640

agctatttac ccgcaggaca tatccacgcc ctcctacatc gaagctgaaa gcacgagatt 17700

cttcgccctc cgagagctgc atcaggtcgg agacgctgtc gaacttttcg atcagaaact 17760

tctcgacaga cgtcgcggtg agttcaggct ttttcatatc tcattgcccc ccgggatctg 17820

cgaaagctcg agagagatag atttgtagag agagactggt gatttcagcg tgtcctctcc 17880

aaatgaaatg aacttcctta tatagaggaa ggtcttgcga aggatagtgg gattgtgcgt 17940

catcccttac gtcagtggag atatcacatc aatccacttg ctttgaagac gtggttggaa 18000

cgtcttcttt ttccacgatg ctcctcgtgg gtgggggtcc atctttggga ccactgtcgg 18060

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ccacttgctt tgaagacgtg gttggaacgt cttctttttc cacgatgctc ctcgtgggtg 18360

ggggtccatc tttgggacca ctgtcggcag aggcatcttg aacgatagcc tttcctttat 18420

cgcaatgatg gcatttgtag gtgccacctt ccttttctac tgtccttttg atgaagtgac 18480

agatagctgg gcaatggaat ccgaggaggt ttcccgatat taccctttgt tgaaaagtct 18540

caatagccct ttggtcttct gagactgtat ctttgatatt cttggagtag acgagagtgt 18600

cgtgctccac catgttggca agctgctcta gccaatacgc aaaccgcctc tccccgcgcg 18660

ttggccgatt cattaatgca gctggcacga caggtttccc gactggaaag cgggcagtga 18720

gcgcaacgca attaatgtga gttagctcac tcattaggca ccccaggctt tacactttat 18780

gcttccggct cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacag 18840

ctatgaccat gattacg 18857

Claims (5)

1.一种提高水稻抗旱性的方法，其特征在于，利用基因工程手段，使水稻基因GSK1和GSK2，或水稻基因GSK1、GSK2和GSK3发生突变，使得该基因功能缺失，从而提高水稻的抗旱性；

其中，水稻基因GSK1、GSK2、GSK3的CDS序列分别如SEQ ID NO:19-21所示。

2.基于CRISPR-Cas9系统的水稻多基因编辑载体在提高水稻抗旱性中的应用；

所述基于CRISPR-Cas9系统的水稻多基因编辑载体是基于CRISPR-Cas9系统的gRNA表达载体，所述载体靶向水稻基因GSK1和GSK2，或靶向水稻基因GSK1、GSK2和GSK3进行编辑，使水稻基因GSK1和GSK2，或水稻基因GSK1、GSK2和GSK3的功能缺失；

其中，水稻基因GSK1、GSK2、GSK3的CDS序列分别如SEQ ID NO:19-21所示。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，gRNA作用位点的核酸序列如下：

GSK1-sgRNA1：5′-CCTGAGACACTCTACCGTGTGCT-3′

GSK1-sgRNA2：5′-ACTACAGCAATGCTAACCAGCGG-3′

GSK2-sgRNA1：5′-CCAATGTCATCTCCCTGAAGCAT-3′

GSK2-sgRNA2：5′-ACTACAGCAATGCCAACCACCGG-3′

GSK3-sgRNA1：5′-CCTGAGTCACTGTATCGTGTGTT-3′

GSK3-sgRNA2：5′-CCTGGAGTTTGCCACAGGGATGT-3′。

4.多基因编辑提高水稻抗旱性的方法，其特征在于，将基于CRISPR-Cas9系统的水稻多基因编辑载体导入水稻中，从转基因植株中筛选出抗旱性提高的水稻后代；

所述基于CRISPR-Cas9系统的水稻多基因编辑载体是基于CRISPR-Cas9系统的gRNA表达载体，所述载体靶向水稻基因GSK1和GSK2，或靶向水稻基因GSK1、GSK2和GSK3进行编辑，使水稻基因GSK1和GSK2，或水稻基因GSK1、GSK2和GSK3的功能缺失；

其中，水稻基因GSK1、GSK2、GSK3的CDS序列分别如SEQ ID NO:19-21所示。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，用于检测转基因植株的引物如下：

GSK1-F:5′-gcgatttctcatgcgatttt-3′

GSK1-R:5′-accagaacctttgcacttcc-3′

GSK2-F:5′-ggtgctcatttttggtggtt-3′

GSK2-R:5′-agggtggaaaaggccaatac-3′

GSK3-F:5′-gtgggaactggatcatttgg-3′

GSK3-R:5′-ccctcttgaaaaccagaaagaa-3′。

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