CN102311954B

CN102311954B - 转基因番木瓜55-1转化事件特异性pcr检测方法

Info

Publication number: CN102311954B
Application number: CN 201110316550
Authority: CN
Inventors: 王恒波; 陈平华; 郭晋隆; 许莉萍; 张华�; 高三基; 陈如凯
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2011-10-18
Filing date: 2011-10-18
Publication date: 2013-02-27
Anticipated expiration: 2031-10-18
Also published as: CN102311954A

Abstract

本发明提供了一种转基因番木瓜55-1转化事件特异性PCR检测方法，首先涉及一种转基因番木瓜55-1转化事件外源插入载体旁侧DNA片段，其碱基序列如SEQ.NO.1所示，由来源于番木瓜基因组序列的第1至1432碱基和来源于外源载体序列的第1433至3780个碱基共同组成。根据SEQNO.1所示的序列设计特异性引物，对待测样品DNA进行扩增，若扩增获得目的片段，则待测样品含有转基因番木瓜55-1转化事件来源的成分。本发明能够利用普通的PCR仪器、试剂快速准确鉴别出转基因番木瓜55-1，适用于对转基因番木瓜55-1（包括杂种F1代和后代）及其衍生产品进行检测、监测和标识制度管理。

Description

转基因番木瓜55-1转化事件特异性PCR检测方法

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及一种检测转基因番木瓜55-1转化事件定性PCR检测方法及其衍生产品的转化事件特异性序列。

背景技术

番木瓜环斑花叶病毒(papaya ringspot virus，PRSV)是为害番木瓜的世界性毁灭病害，一旦受到侵染，便无法防治，包括清除病株、迁移检疫控制植株、应用杀虫剂防治昆虫传播病毒等措施均不能有效地控制。20世纪90年代初夏威夷大学的Fitch等将PRSV一种温和突变体编码的衣壳蛋白(Coat protein，CP)基因转入番木瓜，获得抗PRSV的转基因植株SunUp，并培养出其F1杂交品种Rainbow，并于1997年经美国FDA组织批准进人商品化生产，番木瓜是第一个被批准进入商业化生产的转基因抗病植物，在美国广泛种植。

目前在我国商业化生产的转基因番木瓜，仅有华南农业大学李华平教授选育的高抗病毒的转基因番木瓜“华农一号”，已于2006年获得农业部授权环境安全证书，并在广东省广泛种植。随着全世界转基因番木瓜研究和实验的广泛进行，转基因番木瓜及其产品的非法生产和销售活动事件频频发生，其中绿色和平在2008年、2009年、2010年都发现我国市场上销售的国产木瓜部分均为转基因木瓜，随后发现转基因番木瓜“华农一号”的生产超出了农业部唯一允许的广东省，已经在海南非法种植。为了切实监督市场上可能存在的转基因番木瓜，维护我国消费者的知情权和选择权，加强我国转基因产品标识制度实行。目前“华农一号”番木瓜的转化事件特异性PCR检测方法已经有报道出现，而商业化最早、流通最广的转基因番木瓜55-1未见有转化事件特异性PCR检测方法的报道。

由于PCR法能够高效的扩增低拷贝数的外源DNA，是核酸现行首选的检测方法。针对PCR方法又分为筛选检测、基因特异性检测、结构特异性检测、转化体特异性检测。一、筛选检测，以转基因通用的外源基因启动子和终止子为靶序列；二、基因特异性检测，由于很多转基因载体使用相同外源基因，比如：抗除草剂基因EPSPS、PAT、BAR分别转入大豆、玉米、烟草、小麦、油菜等不同的作物中；三、结构特异性检测，是利用外源转入基因原件之间的边界序列特征，能够有效鉴定类似基因元件的不同载体序列，而且基因元件序列容易获得，引物设计方便；四、事件特异性检测，是以转基因元件之间，其中转化事件特异性检测是以外源基因与植物基因组相连接区域为检测对象，这样连接区域对不同转基因株系都是特异的，并且在基因组上是单拷贝，因此该类检测方法具有高度的特异性。目前已经建立转化体特异性检测方法的转基因转化体包括MON810、MON863、NK603、T25、TC1507、Bt11、Bt176、GA21、MON513、MON1445。

经过对现有专利和其他文献查阅，尚未发现任何关于转基因番木瓜55-1转化事件外源插入载体序列及旁侧序列，也未有此转化事件特异性定性PCR检测的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种转基因番木瓜55-1转化事件特异性PCR检测方法。该PCR方法能够利用普通的PCR仪器、试剂快速准确鉴别出转基因番木瓜55-1。

本发明首先提供了一种转基因番木瓜55-1转化事件外源插入载体旁侧DNA片段，其碱基序列如SEQ.NO.1所示，由来源于番木瓜基因组序列的第1至1432碱基和来源于外源载体序列的第1433至3780个碱基共同组成。

本发明还提供了一种转基因番木瓜55-1转化事件特异性PCR检测方法，所述方法是根据SEQ NO.1所示的序列（番木瓜Carica papaya L.papaya, pawpaw, tree melon ）设计特异性引物，PCR反应中的正向引物依据SEQ NO.1中1-1432个碱基序列设计，反向引物依据SEQ NO.1中1433-3780个碱基序列设计，对待测样品DNA进行扩增，若扩增获得目的片段，则待测样品含有转基因番木瓜55-1转化事件来源的成分；若扩增未获得目的片段，则待测样品不含有转基因番木瓜55-1转化事件来源的成分。

所述特异性引物如下：

55-1-F:5’- ACAATCCCTTCTGTCGTGTA-3’

55-1-R:5’- TCCATAGTTGCCTGACTCCC-3’，

所述目的片段长度为 275 bp。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1. 本发明首次公布转基因番木瓜55-1转化事件外源插入基因组位点的旁侧序列信息；

2. 本发明首次确认转基因番木瓜55-1转化事件插入位点的旁侧序列总不同碱基的来源，确定了外源载体序列和番木瓜基因组序列的结合位点；

3. 利用本发明发现的序列特征，建立转基因番木瓜55-1转化事件特异性定性PCR检测方法；

4. 本发明适用于对转基因番木瓜55-1（包括杂种F1代和后代）及其衍生产品进行检测、监测和标识制度管理。

附图说明

图1 为转基因番木瓜55-1转化事件插入载体的T-DNA区域结构图；

图2为转基因番木瓜55-1转化事件特异性检测电泳图；

其中M-Marker DL100bp，泳道1：转基因番木瓜“华农一号”；泳道2：转基因番木瓜16-0-1；泳道3：转基因玉米Bt11；泳道4：转基因玉米Tc1507；泳道5：转基因玉米MON810；泳道6：转基因玉米MON863；泳道7：转基因玉米T25；泳道8：转基因大豆A5547-127；泳道9：转基因大豆A2704-12；泳道10：科丰6号；泳道11：T55-1水稻；12：阴性对照为非转基因番木瓜；13：提取空白对照；14：环境空白对照。

图3 转基因番木瓜55-1转化事件PCR灵敏度检测电泳图；

其中M-Marker DL100bp，泳道1-2、泳道3-4、泳道5-6、泳道7-8、泳道9-10、泳道11-12，分别为转基因番木瓜55-1 的DNA与非转基因番木瓜DNA溶液按照不同比例混合配成DNA质量分数为20%、5%、1%、0.5%、0.1%的样品。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，这些试试例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。

实施例1

转基因番木瓜55-1转化事件外源插入旁侧序列克隆

1 实验材料

1.1植物材料

转基因抗病毒番木瓜55-1、转基因番木瓜“华农一号”、转基因番木瓜16-0-1、非转基因番木瓜红妃2号，本实验室保存，其余转基因大豆、玉米、水稻等标准品来源于农业部科技发展中心。

1.2 酶与试剂

分子生物学试剂，如 dNTPs、Taq DNA聚合酶、10×PCR Buffer、Genome Walker Universal Kit购自Takara大连宝生物公司。PCR产物纯化试剂盒和PCR产物克隆试剂盒购自上海生工生物工程有限公司。引物合成和克隆测序有南京金斯瑞生物科技有限公司完成。其余生化试剂均为国产分析纯。

1.3 实验仪器

PCR扩增仪5333：德国Eppendorf公司，核酸电泳仪DYY-8C：北京六一仪器厂，凝胶成像系统Gel Doc XR：BIO-Rad生产。

2 实验方法和过程

2.1 基因组DNA提取

基因组DNA提取按照国家标准GB/T 19495.3-2004转基因产品检测核酸提取纯化方法。

2.2基因组DNA浓度和纯度的检测

取2.0μL DNA用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，并用生物型分光光度计测定DNA浓度和纯度，将其用TE稀释到终浓度为 100 ng/μL，-20℃保存备用。

2.3 转基因番木瓜55-1旁侧序列获得

Genome Walking 也是一种扩增已知序列旁侧未知区域序列的方法，主要步骤为基因组DNA酶切、与接头连接、进行三次巢式PCR扩增等。本实施例采用Genome Walking的方法获得了转基因番木瓜55-1转化事件特异性序列。具体步骤参照Genome Walker Universal Kit试剂盒说明书，本实施例进行了部分改进，主要操作步骤如下：

2.3.1基因组DNA酶切

分别用Dra, PvuⅡ, StuⅠ, EcoRV, ScaⅠ和SmaⅠ酶切55-1基因组DNA，标记为DL1～DL6。酶切体系为：基因组DNA, 25 μL；10×Buffer, 5 μL；内切酶，5 μL；ddH₂0为15 μL；总体积为 50 μL。37℃水浴5 h,取出离心管，低速离心10 s ，继续水浴过夜。然后各取3 μL进行琼脂糖凝胶电泳，检测酶切是否完全。

2.3.2 胶回收产物纯化

按照胶回收试剂盒说明书纯化酶切产物。

2.3.3 连接

连接反应体系：纯化的酶切产物，6 μL；接头，2 μL；10×连接Buffer，2 μL；T4DNA连接酶，0.5 μL；ddH₂0，9.5 μL；总体积为 20 μL。混合反应液16℃连接过夜，然后70℃变性15 min。

2.4 PCR扩增

根据Genome Walker Universal Kit试剂盒说明书合成如下引物序列：SP1-5’-TGGCGGTAACAAGAAAGGGA-3’, SP2-5’-AACTGCATCAGCCGATTATC-3’, SP3-5’-TAATGTTCTGCGACGCTCAC-3’。以连接混合液为模板，利用试剂盒提供的引物AP1分别和SP1、SP2、SP3进行三轮PCR扩增，其余PCR反应体系组分见表1。

表1 PCR反应体系

Figure 2011103165500100002DEST_PATH_IMAGE002

PCR扩增的程序见表2。

表2 PCR扩增的程序

Figure 2011103165500100002DEST_PATH_IMAGE004

2.5 PCR产物序列分析与测定

将PCR扩增产物在0.8%的琼脂糖凝胶上进行电泳，切胶回收，采用PCR产物纯化试剂盒回收目的片段，连接到pMD18-T，然后送南京金色瑞生物科技有限公司测序。利用NCBI提供的Blast软件，进行序列比对分析不同部分序列的来源，从而判定基因组和外源载体的结合位点。将获得的3780bp序列比对分析，其中1-1432bp为基因组序列，其余为外源载体序列。

实施例2

转基因番木瓜55-1转化事件外源插入旁侧序列的品系特异性定性PCR检测

1 实验材料

1.1植物材料

转基因抗病毒番木瓜55-1、转基因番木瓜“华农一号”、转基因番木瓜16-0-1、非转基因番木瓜，为本实验室保存。其余转基因大豆、玉米、水稻等标准品来源于农业部。

1.2 酶与试剂

分子生物学试剂，如 dNTPs、Taq DNA聚合酶、10×PCR Buffer、Genome Walker Universal Kit购自Takara大连宝生物公司；PCR产物纯化试剂盒和PCR产物克隆试剂盒购自上海生工生物工程有限公司；引物合成和克隆测序有南京金斯瑞生物科技有限公司完成；其余生化试剂均为国产分析纯。

1.3 实验仪器

2 实验方法和过程

2.1 基因组DNA提取和浓度及纯度的检测

见实施例1中2.1 、2.2基因组DNA提取与检测。

2.2 转基因番木瓜55-1转化事件特异性检测

根据实施例1中测定的序列，分别在番木瓜基因组和外源载体部分设计引物，引物序列如下：55-1-F:5’- ACAATCCCTTCTGTCGTGTA-3’55-1-R:5’- TCCATAGTTGCCTGACTCCC-3’，目的片段为 275bp。分别提取转基因番木瓜“华农一号”、转基因番木瓜16-0-1、转基因玉米Bt11、转基因玉米Tc1507、转基因玉米MON810、转基因玉米MON863、转基因玉米T25、转基因大豆A5547-127、转基因大豆A2704-12、科丰6号、T55-1水稻为测试对象，涵盖玉米、番木瓜、水稻、大豆等转基因作物。分别利用引物对55-1-F/55-1-R进行PCR扩增。定性PCR反应体系25 μL：10×PCR Buffer (含Mg²⁺) 2.5 μL，dNTP (10 mmol/L) 0.5 μL，引物5 umol/L 各1 μL，ExTaq酶0.125 μL，模板DNA (100 ng) 1 μL，加灭菌双蒸水18.875 μL。扩增程序: 95℃ 5 min；95℃ 30 s，56℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；最后72 ℃延伸7 min后，4 ℃保存备用，电泳时加入6×Loading buffer 1 μL，取6 μL扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。

2.3 转基因番木瓜55-1转化事件PCR灵敏度检测

将转基因番木瓜55-1 的DNA与非转基因番木瓜DNA溶液(100 ng/μL)按照不同比例混合配成DNA质量分数为20%、5%、1%、0.5%的样品，按照步骤2.2的PCR反应体系及程序进行定性PCR扩增。

3 结果

3.1转基因番木瓜55-1转化事件特异性检测

高度特异性是检测转化事件必须具备的基本特性，为了建立55-1引物对检测方法的特异性，本实施例选择了多种不同转基因植物品系，转基因番木瓜16-0-1、转基因番木瓜“华农一号”、转基因玉米Bt11、转基因玉米Tc1507、转基因玉米MON810、转基因玉米MON863、转基因玉米T25、转基因大豆A5547-127、转基因大豆A2704-12、科丰6号、T55-1水稻为测试对象，涵盖玉米、番木瓜、水稻、大豆等作物。所用供试的转基因生物材料按照优化后的退火温度56℃进行进行定性PCR扩增，特异性测试结果如图2所示，仅从转基因番木瓜55-1品系检测出了 275 bp的目的片段，其他参试材料均未扩增出任何片段，结果表明建立的55-1转化事件检测方法具有高度特异性和准确性。

3.2 转基因番木瓜55-1转化事件特异性检测

将转基因番木瓜55-1 的DNA与非转基因番木瓜DNA溶液(100 ng/μL)按照不同比例混合配成55-1 DNA相对含量为20%、5%、1%、0.5%（质量比）的样品，按照优化后的退火温度56℃进行定性PCR扩增(图3)，从图3可知，当DNA含量为0.5%时，特异性引物对仍然能分别检测出275 bp的目的条带，说明转基因番木瓜品系特异性引物55-1最低检测极限(灵敏度)可以达到0.5%，比欧盟转基因产品最低标识阈值(0.9%)，高出近2倍。

<110> 福建农林大学

<120> 一种转基因番木瓜55-1转化事件特异性PCR检测方法

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 3780

<212> DNA

<213> 番木瓜（Carica papaya L.）

<400> 1

taaggttaag taaaggggca caaggtaagg gatttgtccg gggcttttta tccccattcg 60

acttttttcc cattcatgta gcataaatca gtagggagat ttacatccct tgtttgctct 120

ttccagtatt ttccgtatca aagaaattag gaatagagaa tctatatcaa agaaaggtct 180

aactctttgg tctcaattgt tatttgattt gaaacattgt ggtcagtaac gtaagattgg 240

tgaattcgtt gaaaatacgg aaagagaggg attcgaaccc tcggtaaaca aaagcctaca 300

tagcagttcc aatgctacac cttaaaccac tcggccatct ctcctacata atgattatga 360

ctgagcacct gggtgaatag cgagttattc atattttttt ttagactata tttaatggat 420

acctttagct cataattcta tttagactct aattctaatt ccatttccat aagaattcta 480

aaattccttt ccggttttac atccctcaac aacaacccct taccccgtag atctattaca 540

aacaccccgc gcatctatta caaattcata aatcatttca gggattttta tttttttttt 600

tttattattt tatttgcaat ttgattgtct agtgtatacc cgctatgcac aaaagaaaag 660

acaaaacaaa aacgggcggt ttttctattt tcatcataga acaattcttc gattattttt 720

cctctttgga tcataattta atcaaaactt ttcgaattat cctaatctcc aatctatgct 780

aaaatctatc ctaatctaat tctttgattc ttcaacttcg atgaaatcga agtagttact 840

ttcagtctta tactaatata ctcaaaaatt agtaataaat tttgatgaaa tcgaattgga 900

ttcaaaccaa tatttcttat ttttgattga ttttgattcc tgtcaaaaaa aaaattgaag 960

tagaaggttt ttttttcatt ttcatgagtc ggcgctttta tgttaattcg tactgtacaa 1020

ttcctttgtt tgtgggatca ttttctcaca agaggtaatg aaaagagtta tggaatggat 1080

tactacctat gcctagatcg cgtataaatg gaaattttat tgataaaacc ttttcaattg 1140

tggccaatat cttattacga ataattccga caacctcggg agaaaaagag gcatttacct 1200

attacagaga tggtgcgatt tgattttgat tatcattatt tttttttttc tttatttacc 1260

gctccccgtc ttaggaatag gaaaaagaca tatgattcgg ggtataaaga aaaaagatta 1320

ttgaaataaa tctacgcttc ttgaaggtga agtttataat ataaataaaa caatcccttc 1380

tgtcgtgtat ccacgattaa tgcagcctta gatgcttcaa gaaaagagtc ttctagcttc 1440

ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc 1500

ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg 1560

cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac 1620

gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc 1680

actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt 1740

aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac 1800

caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa 1860

aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc 1920

accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt 1980

aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgttctt ctagtgtagc cgtagttagg 2040

ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc 2100

agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt 2160

accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga 2220

gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct 2280

tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg 2340

cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca 2400

cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa 2460

cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt 2520

ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 2580

taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 2640

gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatggtg 2700

cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc cagtatacac tccgctatcg 2760

ctacgtgact gggtcatggc tgcgccccga cacccgccaa cacccgctga cgcgccctga 2820

cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac agacaagctg tgaccgtctc cgggagctgc 2880

atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga ggcagcagat ccccaattcc 2940

cgatctagta acatagatga caccgcgcgc gataatttat cctagtttgc gcgctatatt 3000

ttgttttcta tcgcgtatta aatgtataat tgcgggactc taatcataaa aacccatctc 3060

ataaataacg tcatgcatta catgttaatt attacatgct taacgtaatt caacagaaat 3120

tatatgataa tcatcgcaag accggcaaca ggattcaatc ttaagaaact ttattgccaa 3180

atgtttgaac gatcggggaa attcgagctc ggtagcaatt cccgaggctg tagccgacga 3240

tggtgcgcca ggagagttgt tgattcattg tttgcctccc tgctgcggtt tttcaccgaa 3300

gttcatgcca gtccagcgtt tttgcagcag aaaagccgcc gacttcggtt tgcggtcgcg 3360

agtgaagatc cctttcttgt taccgccaac gcgcaatatg ccttgcgagg tcgcaaaatc 3420

ggcgaaattc catacctgtt caccgacgac ggcgctgacg cgatcaaaga cgcggtgata 3480

catatccagc catgcacact gatactcttc actccacatg tcggtgtaca ttgagtgcag 3540

cccggctaac gtatccacgc cgtattcggt gatgataatc ggctgatgca gtttctcctg 3600

ccaggccaga agttcttttt ccagtacctt ctctgccgtt tccaaatcgc cgctttggac 3660

ataccatccg taataacggt tcaggcacag cacatcaaag agatcgctga tggtatcggt 3720

gtgagcgtcg cagaacatta cattgacgca ggtgatcgga cgcgtcgggt cgagtttacg 3780

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

acaatccctt ctgtcgtgta 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tccatagttg cctgactccc 20

Claims

1.一种转基因番木瓜55-1转化事件特异性PCR检测引物，其特征在于：

所述引物如下：

55-1-F:5’- ACAATCCCTTCTGTCGTGTA-3’

55-1-R:5’- TCCATAGTTGCCTGACTCCC-3’；

所述引物是根据SEQ NO.1所示的序列设计的特异性引物，PCR反应中的正向引物依据SEQ NO.1中1-1432个碱基序列设计，反向引物依据SEQ NO.1中1433-3780个碱基序列设计。