CN112011471B - 酿制柠檬风味啤酒的酵母菌株、其制备方法及啤酒酿制方法 - Google Patents

Abstract

一种酿制柠檬风味啤酒的酵母菌株、其制备方法及啤酒酿制方法，该酵母菌株内具有外源转入的表达橙花基焦磷酸合酶和柠檬烯合成酶的通路。本发明在啤酒酵母菌株中引入柠檬烯生物合成路径，首次获得无添加可酿造独特风味啤酒，实现酿酒酵母的稳定表达，突破了啤酒酵母难以改造的技术瓶颈，引入更多可改变性，从而获更多种类、更加新颖的啤酒酵母。本发明还可避免添加剂的使用，工业工艺上更加简化、节省，对于环境更友好。

Description

酿制柠檬风味啤酒的酵母菌株、其制备方法及啤酒酿制方法

技术领域

本发明涉及啤酒酿制技术领域，具体涉及一种酿制柠檬风味啤酒的酵母菌株、其制备方法及啤酒酿制方法。

背景技术

啤酒在全世界范围都十分受欢迎，2017年我国的啤酒年产量达到5000万吨。啤酒的质量与啤酒酵母菌种和原料息息相关。啤酒酵母是啤酒工业的灵魂，它的优劣直接关系着啤酒质量的高低，在生产中选育优良酵母是啤酒企业十分重要的工作。啤酒酵母的选育方法有分离纯化、物理诱变育种、化学诱变育种、杂交与融合育种和基因工程育种等。在自然界中，酵母菌分布广泛，优良的啤酒酵母可以从不同的环境如陆地或海洋中分离筛选获得；物理、化学诱变育种通常为不定向改变，获得优良啤酒酵母菌株的工序流程较为复杂；杂交与融合育种为较常用的育种方法，杂交与融合育种菌株仍具有双亲优点及性状，杂交种通常具有生活力强、适应性广，有较强的抗逆力和竞争力等特性。基因工程育种可为育种菌株定向引入新特性，因此可在各个方面对啤酒菌株进行提升，如提高各种环境因素的耐受性，显著提高发酵水平，优化啤酒风味。

目前市面上对于啤酒酵母的优化多从口感、泡沫、酒精度等方面进行，对于啤酒市场逐渐趋向于年轻化及年轻人对精酿、特质啤酒的需求未有特别多的涉及。现在啤酒酵母的改造还是以将不同种属的酵母进行融合，经过测试后获得新酵母为主，因此现有技术目标性不明确，限制了啤酒酵母的改造空间。对特殊啤酒的酿造，目前还是多以酿造完成后添加为主，这样的方法增加了后续工艺的复杂度，提高了操作环境的要求。施塔尔等人将LTP1基因转入啤酒酵母以解决因小麦质量不好而导致的泡沫较少的问题。但是目前仍缺少通过基因工程方法改变啤酒风味的技术。

发明内容

本申请提供一种酿制柠檬风味啤酒的酵母菌株、其制备方法及啤酒酿制方法，首次在啤酒酿造工艺上结合合成生物学，让啤酒酵母可以自产独特风味，获得风味啤酒。

根据第一方面，一种实施例中提供一种酿制柠檬风味啤酒的酵母菌株，该酵母菌株内具有外源转入的表达橙花基焦磷酸合酶和柠檬烯合成酶的通路，以及所述酵母菌株经培养直接合成柠檬烯。

在优选实施例中，将上述表达橙花基焦磷酸合酶和柠檬烯合成酶的通路整合到酿酒酵母的Trp位点。

在优选实施例中，通过同源重组方式将上述表达橙花基焦磷酸合酶和柠檬烯合成酶的通路整合到酿酒酵母的Trp位点。

在优选实施例中，上述通路中橙花基焦磷酸合酶基因序列如SEQ ID NO：6所示。

在优选实施例中，上述通路中柠檬烯合成酶基因序列如SEQ ID NO：5所示。

在优选实施例中，上述通路中表达橙花基焦磷酸合酶和柠檬烯合成酶的启动子是TDH3p，其序列如SEQ ID NO：1所示。

在优选实施例中，上述通路中表达橙花基焦磷酸合酶和柠檬烯合成酶的终止子是ADH1t，其序列如SEQ ID NO：2所示。

根据第二方面，一种实施例中提供一种制备第一方面的酵母菌株的方法，包括如下步骤：

(1)构建橙花基焦磷酸合酶和柠檬烯合成酶的表达通路，上述通路上表达橙花基焦磷酸合酶和柠檬烯合成酶的元件串联在一起；

(2)将上述表达通路转化酿酒酵母，使上述表达通路整合到上述酿酒酵母的染色体上，从而形成稳定表达橙花基焦磷酸合酶和柠檬烯合成酶的整合酿酒酵母；

(3)从酿酒酵母分孢出的酵母单倍体，将该单倍体与上述整合酿酒酵母进行融合，得到上述酵母菌株。

在优选实施例中，上述通路上的元件包括依次按顺序串联在一起的启动子TDH3p、橙花基焦磷酸合酶基因、柠檬烯合成酶基因和终止子ADH1t。

在优选实施例中，上述表达通路整合到上述酿酒酵母的染色体的Trp位点上。

需要说明的是，发明人经过多次实验发现，步骤(2)获得的整合酿酒酵母并不具备啤酒酿造的特性，无法用于商业化的啤酒生产。原因为：在啤酒酿造时，工艺流程对酿酒酵母菌株自身的要求很高，例如要求菌株环境敏感度、静置发酵能力等等都与酿酒工艺要求相符，因此，发明人通过将整合酿酒酵母与商业化啤酒酵母进行融合，从而使融合菌株获得啤酒酿造特性，可用于商业化的啤酒生产。

在优选实施例中，上述步骤(1)具体包括如下步骤：

(a)元件重组载体构建：将启动子元件、终止子元件、橙花基焦磷酸合酶基因元件和柠檬烯合成酶基因元件分别连入各自的载体，获得各元件的重组载体；

(b)表达重组载体构建：将表达载体、启动子元件和终止子元件的重组载体，与橙花基焦磷酸合酶基因元件的重组载体进行golden-Gate组装，获得橙花基焦磷酸合酶基因元件的表达重组载体；以及

将表达载体、启动子元件和终止子元件的重组载体，与柠檬烯合成酶基因元件的重组载体进行golden-Gate组装，获得柠檬烯合成酶基因元件的表达重组载体；

(c)路径重组载体构建：将上述表达重组载体与骨架载体进行golden-Gate组装，获得橙花基焦磷酸合酶和柠檬烯合成酶的表达元件串联在一起的路径重组载体；

(d)上、下游片段扩增：通过重叠延伸PCR，将酿酒酵母染色体的整合位点上游区域、缺陷标签序列及上述启动子元件拼接成上游片段，将上述终止子元件、上述整合位点下游区域拼接成下游片段，上述上游片段、上述下游片段和路径重组片段共同构成上述表达通路，其中上述路径重组片段是由上述路径重组载体经酶切得到的包含橙花基焦磷酸合酶和柠檬烯合成酶基因及它们的上游启动子和下游终止子的片段。

在优选实施例中，上述步骤(1)具体包括如下步骤：

(a)元件重组载体构建：将启动子TDH3p连入HcKan-P载体获得TDH3p-HcKan-P，将终止子ADH1t连入HcKan-T载体获得ADH1t-HcKan-T，将橙花基焦磷酸合酶和柠檬烯合成酶的基因分别连入HcKan-O载体获得NDPS-HcKan-O和LS-HcKan-O；

(b)表达重组载体构建：将TDH3p-HcKan-P、NDPS-HcKan-O和ADH1t-HcKan-T，与POT载体进行golden-Gate组装，获得橙花基焦磷酸合酶的POT表达重组载体；以及将TDH3p-HcKan-P、LS-HcKan-O和ADH1t-HcKan-T，与POT载体进行golden-Gate组装，获得柠檬烯合成酶的POT表达重组载体；

(c)路径重组载体构建：将橙花基焦磷酸合酶和柠檬烯合成酶的POT表达重组载体，与骨架载体进行golden-Gate组装，获得橙花基焦磷酸合酶和柠檬烯合成酶的表达元件串联在一起的路径重组载体；

(d)上、下游片段扩增：通过重叠延伸PCR，将酿酒酵母染色体的Trp位点上游区域、URA3标签及启动子TDH3p拼接成第一片段，将终止子ADH1t、Trp位点下游区域拼接成第二片段，上述第一片段、上述第二片段和路径重组片段共同构成上述表达通路，其中上述路径重组片段是由上述路径重组载体经BsmBI限制酶酶切得到的包含橙花基焦磷酸合酶和柠檬烯合成酶基因及它们的上游启动子和下游终止子的片段。

在优选实施例中，上述启动子TDH3p的序列如SEQ ID NO：1所示；

上述终止子ADH1t的序列如SEQ ID NO：2所示；

上述橙花基焦磷酸合酶的基因序列如SEQ ID NO：6所示；

上述柠檬烯合成酶的基因序列如SEQ ID NO：5所示；

上述URA3标签的序列如SEQ ID NO：13所示。

根据第三方面，一种酿制柠檬风味啤酒的方法，该方法包括：采用第一方面的酵母菌株作为酿酒酵母进行啤酒酿制。

根据第四方面，一株酿制柠檬风味啤酒的酵母菌株，其特征在于，上述酵母菌株是Saccharomyces cerevisiae SEy935，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：M2019022。

本发明在啤酒酵母菌株中引入柠檬烯生物合成路径，首次获得无添加可酿造独特风味啤酒。在柠檬烯的合成步骤中，引入中间体NPP的橙花基焦磷酸合酶(NDPS)，实验结果表明确实提高了柠檬烯的合成量。

在优选实施例中，选择酵母内源最强启动子TDH3p和终止子ADH1t，与经过密码子优化的橙花基焦磷酸合酶(NDPS)基因和柠檬烯合成酶(LS)基因拼接并串联成表达通路，并用Trp位点上下游同源臂转化整合到酿酒酵母的Trp位点，实现酿酒酵母的稳定表达，使酵母获得合成柠檬烯的能力，然后将具有柠檬烯合成能力的单倍体酵母与啤酒酵母单倍体杂交，获得可发酵柠檬口味啤酒的酵母菌株。

本发明突破啤酒酵母难以改造的技术瓶颈，引入更多可改变性，从而获更多种类、更加新颖的啤酒酵母。本发明还可避免添加剂的使用，工业工艺上更加简化、节省，对于环境更友好。

生物样品保藏信息：

本发明的Saccharomyces cerevisiae SEy935，分类命名为Saccharomycescerevisiae，菌株名称为SEy935，已于2019年1月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，中心简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学，邮编：430072，菌种保藏号为CCTCC NO：M2019022。

附图说明

图1为本发明实施例中酵母菌株中柠檬烯合成路径示意图；

图2为本发明实施例中柠檬烯合成通路构建策略示意图；

图3为本发明实施例中柠檬烯合成通路构建示意图；

图4为本发明实施例中柠檬烯基因组整合构建示意图；

图5为本发明实施例中柠檬烯啤酒酵母融合菌株基因型及倍型验证图；

图6为本发明实施例中不同实验组和对照组的柠檬烯合成量结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他材料、方法所替代。

另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。

本发明设计了酿酒酵母菌株中柠檬烯合成通路，如图1所示。在培养基中外源添加葡萄糖作为碳源，经过酿酒酵母内源的甲羟戊酸途径可产生乙酰辅酶A，进一步在体内一系列酶催化下生成异戊烯基焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate，IPP)和二甲基丙烯焦磷酸(dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP)，二者在酿酒酵母体内酶催化下又生成牦牛儿基焦磷酸(geranyl diphosphate，GPP)，发明人调研发现IPP和DMAPP在外源引入新酶橙花基焦磷酸合酶(neryl diphosphate synthase，NDPS)作用下可生成GPP的同分异构体橙花基焦磷酸(neryl diphosphate，NPP)，而且GPP和NPP都可以经过外源引入的新酶柠檬烯合成酶(limonene synthases，LS)催化生成目标化合物柠檬烯。在图1所示的通路中，NDPS的引入可以增加柠檬烯合成前体的种类和通量。图中，酵母里面的是发生在细胞内的反应过程，酵母外面的是胞外过程，如外源添加的碳源(葡萄糖)，或合成后分泌到培养液中的柠檬烯。

为了实现图1中的柠檬烯合成通路，本发明设计了如下技术方案：

选择酵母内源强启动子TDH3p，搭配引入中间体NPP(二氢叶酸二磷酸)的合成酶提高产量，相关酶序列进行密码子优化或按相应规则截短序列后，构建柠檬烯表达体外通路(pathway)，用BsmBI酶切后获得柠檬烯表达通路元件，搭配选定的整合位点Trp上下游区域，HoL和HoR，及URA3标签，将通路元件、HoL、HoR和URA3标签通过醋酸锂转化法转化酿酒酵母获得整合酿酒酵母，实现酵母的柠檬烯异源表达。

酿酒用啤酒酵母在产孢培养基上培养一周后，挑取一点用裂解酶裂解后进行分孢，分出孢子用配型验证引物验证为单倍体后与获得的整合酿酒酵母进行融合，融合后挑出单菌落用配型验证引物验证杂合成功，获得柠檬风味啤酒酵母。

以下通过实施例详细说明本发明的技术方案，应当理解，实施例仅是示例性的，不能理解为对本发明保护范围的限制。

实施例1酿制柠檬风味啤酒的酵母菌株的构建

1.HcKan重组载体构建

如图2所示，将PCR获得的TDH3p启动子(Promoter)(SEQ ID NO：1)和ADH1t终止子(Terminator)(SEQ ID NO：2)用BsaI限制酶和T4 DNA连接酶(Ligase)进行golden-Gate组装分别连接到HcKan-P(SEQ ID NO：3)和HcKan-T载体(SEQ ID NO：4)，得到TDH3p-HcKan-P和ADH1t-HcKan-T重组载体；合成密码子优化后(按照双精氨酸保守域截短(RR))的柠檬烯合成酶(SEQ ID NO：5)和橙花基焦磷酸合酶(SEQ ID NO：6)片段，用BsaI限制酶和T4 DNA连接酶(Ligase)进行golden-Gate组装分别连接到HcKan-O载体(SEQ ID NO：7)，得到NDPS-HcKan-O和LS-HcKan-O重组载体。构建好的重组载体进行酶切、测序验证，并选取正确克隆。

其中，启动子TDH3p和终止子ADH1t的PCR模板都是BY4741酵母菌株基因组DNA。PCR反应条件为：5X Q5反应缓冲液:10μL，5X GC增强剂(Enhancer)(Phusion):10μL，dNTP:4μL，Q5 DNA聚合酶:1μL，模板:1μL，引物F：2μL，引物R：2μL，ddH2O：20μL。

引物F与R序列如下：

TDH3p-F：AGCGTGGGTCTCaGGCTTCATTATCAATACTGCCATTTC(SEQ ID NO：8)；

TDH3p-R：GTGCTGGGTCTCgCATCTTTGTTTGTTTATGTGTGTTTATTCG(SEQ ID NO：9)；

ADH1t-F：AGCGTGGGTCTCaTAGCCGAATTTCTTATGATTTATGAT(SEQ ID NO：10)；

ADH1-R：GTGCTGGGTCTCgGAGGCCGGTAGAGGTGTGG(SEQ ID NO：11)。

golden-Gate组装的具体体系为：10×T4 DNA连接酶缓冲液(NEB)1μL，100×BSA0.1μL，BsaI(NEB)0.2μL，HcKan载体100ng，T4 DNA连接酶(NEB)0.1μL，补加ddH₂O至10μL，37℃反应60min，50℃反应15min，80℃反应15min，12℃保存。

2.POT重组载体构建

如图2所示，将TDH3p-HcKan-P、LS-HcKan-O和ADH1t-HcKan-T，以及TDH3p-HcKan-P、NDPS-HcKan-O和ADH1t-HcKan-T，采用golden-Gate组装进行拼接。具体的体系为如下体系(1)和(2)：

体系(1)：10×T4 DNA连接酶缓冲液(NEB)1μL，100×BSA 0.1μL，BsmBI限制酶(NEB)0.5μL，POT2载体(SEQ ID NO：12)200ng，TDH3p-HcKan-P重组载体200ng、LS-HcKan-O重组载体400ng和ADH1t-HcKan-T重组载体200ng，补加ddH₂O至10μL。

体系(2)：10×T4 DNA连接酶缓冲液(NEB)1μL，100×BSA 0.1μL，BsmBI限制酶(NEB)0.5μL，POT2载体(SEQ ID NO：12)200ng，TDH3p-HcKan-P重组载体200ng、NDPS-HcKan-O重组载体400ng和ADH1t-HcKan-T重组载体200ng，补加ddH₂O至10μL。

上述反应体系，在55℃反应60min，然后分别加入T4 DNA连接酶(NEB)0.5μL，25℃反应60min，50℃反应15min，80℃反应15min，12℃保存。将连接液转化DH5α大肠杆菌，挑取单克隆进行酶切、测序验证，并选取正确克隆。

3.通路拼接

如图3所示，按照通路构建的需求，将含有所需基因(LS和NDPS)的POT载体采用golden-Gate组装进行拼接，具体的体系为：10×T4 DNA连接酶缓冲液(NEB)2μL，100×BSA0.2μL，BsaI限制酶(NEB)1μL，含有所需基因(LS和NDPS)的POT2载体每种200ng，T4 DNA连接酶(NEB)1μL，商业化骨架载体pRS416100ng，补加ddH₂O至20μL，37℃反应2min，16℃反应5min，50个循环，50℃反应5min，80℃反应5min，12℃保存。连接液转化DH5α大肠杆菌，挑取单克隆进行酶切验证。

4.测序分析

挑选酶切正确的质粒进行测序，分析、获得带有正确组装序列的质粒备用。

5.同源臂获得

如图4所示，用重叠延伸PCR(OE-PCR)将Trp位点上游335bp、URA3标签(SEQ ID NO：13)及TDH3p启动子拼接成一个完整片段，标记为HoL(图4A)；同样用OE-PCR将ADH1t终止子、Trp位点下游340bp拼接成一个完整片段，标记为HoR(图4C)。

6.酵母转化

将野生型酿酒酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae BY4741)接种到3ml液体YPD培养基中，30℃过夜培养；第二天测量OD₆₀₀值并以OD值为0.1的终浓度转接到含有50ml液体YPD培养基的三角瓶中继续培养，待OD₆₀₀达到0.6-0.8范围内，约5h。收集菌体，3000rpm，离心5min，去上清。沉淀用30-50ml无菌的去离子水悬浮，3000rpm，离心5min，去上清；沉淀再用20ml 100mM LiAc悬浮，3000rpm，离心5min，去上清，最终以终浓度为10 OD/ml的100mMLiAc悬浮酵母菌体，将酵母细胞的悬浮液分装到1.5ml的离心管中，每管分装100μL，用于转化一个质粒，即一个反应，制备好的感受态细胞应立即使用。

如图4所示，将HoL(图4A)，通路片段，即上述步骤4得到的通路拼接质粒，通过BsmBI酶切获得的DNA片段(图4B)，HoR(图4C)按等摩尔比加入制备好的100μL酵母感受态细胞中，加入25μL热变性后的ssDNA(鲑鱼精单链DNA)，41μL1M LiAc和312μL50％PEG3350，吹打混匀，于30℃温浴30min，加入50μL DMSO，轻摇混匀，42℃温浴15min，最后，3000rpm，离心2min，去上清，加入1mL5mM CaCl₂，吹吸混匀，3000rpm，离心1min，加入100μL5mM CaCl₂，混匀后取出适量涂布尿嘧啶(URA)营养缺陷型固体培养基进行培养，由于转入URA标记基因，因此整合成功的菌株可以在URA缺陷型培养基中生长。然后，对获得的阳性菌株在不含TRP的培养基上进一步进行验证，由于整合后的菌株TRP基因不完整，无法表达TRP，因此如果URA筛选的阳性菌株无法在不含TRP的培养基上生长，则此类菌株即为整合成功的菌株。挑取获得的单克隆用特异性验证引物进行PCR验证，同时把PCR产物进行测序验证，保存验证正确菌株，即整合酿酒酵母。

其中，特异性验证引物序列如下：

MAT座位1：AGTCACATCAAGATCGTTTATGG(SEQ ID NO：14)；

MATα座位2：GCACGGAATATGGGACTACTTCG(SEQ ID NO：15)；

MATa座位2：ACTCCACTTCAAGTAAGAGTTTG(SEQ ID NO：16)。

7.拆分孢子

将啤酒酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae，商品名为windsor)接种到3mL液体YPD培养基中，30℃过夜培养；第二天测量OD₆₀₀值并以OD值为0.1的浓度转接到含有50mL液体YPD培养基的三角瓶中继续培养，待OD₆₀₀到1左右。取出菌液，3000rpm，离心2min，去上清。沉淀用1mL无菌的去离子水重悬，3000rpm，离心2min，去上清。沉淀用100μL无菌去离子水悬浮，涂布到产孢培养基上。30℃培养1周，用无菌的吸头挑取一点菌体，悬浮到滴有1滴水的载玻片上，再轻轻盖上盖玻片，在目镜10×，物镜40×下观察产孢概率。当产孢率大于10％即可用无菌的接种环在产孢培养基上刮取一环的菌体，重新悬浮到装有100μL无菌的去离子水的无菌EP管中，加入1μL 100酵母裂解酶(Tzymolyase)，37℃裂解25min，把裂解菌液滴到固体YPD培养基上，在显微镜下挑取同一四分体下的孢子。30℃培养3天，存活的孢子用配型验证引物进行单倍体验证，并保存正确单倍体。

8.融合酵母

将啤酒酵母单倍体和整合酿酒酵母分别接种到3mL液体YPD培养基中，30℃过夜培养，第二天将两种菌液混合，30℃培养一天后取出一点混合培养液涂布到固体YPD培养基，30℃培养3天，挑取固体培养基上较大的克隆，用配型验证引物验证融合，并保存融合成功菌株。

验证融合过程中使用的引物包括：用于验证a型和α型的特异性引物序列SEQ IDNO：14至16；以及用于验证NDPS基因的引物和用于验证tLS_Cl基因的引物，分别如下所示：

NDPS-seq-F：CTACAACAGAATACGAGCATC(SEQ ID NO：17)；

NDPS-seq-R：CGAACCTCCTATGTCTTTG(SEQ ID NO：18)；

tLS_Cl-seq-F：GGAGTTACCATTGCAC(SEQ ID NO：19)；

tLS_Cl-seq-R：TCGGCTAGCCTTTTGTCCCTGGTGAG(SEQ ID NO：20)。

结果如图5所示，4741菌株为a型，4742菌株为α型，融合后的菌株既含有a型条带也含有α型条带，因此可以表明是一个二倍体菌株，且该菌株中含有柠檬烯合成的两个基因tLS_Cl和DNPS。

9.柠檬烯合成量检测

图6示出了本发明实施例中引入橙花基焦磷酸合酶的酿酒酵母中，柠檬烯合成量明显提高。

如图6所示，对获得的酵母菌株进行摇瓶发酵，气相色谱-质谱联用(GC-MS)检测不同菌株的柠檬烯合成量，纵坐标为柠檬烯浓度，横坐标为菌株基因型。只含有tLS_Cl基因(tLS_Cl-POT)的菌株，其柠檬烯合成前体只有GPP，检测到柠檬烯产量为0.32±0.03ppm；而含有空载体(POT)的对照菌无柠檬烯合成。同时含有NADP和tLS_Cl基因(NDPS-tLS_Cl-pRS416)的菌株，其柠檬烯合成前体是GPP和NPP，检测到柠檬烯产量为0.6±0.16ppm，而含有空载体(pRS416)的对照菌几乎无柠檬烯合成。因此选择NADP和tLS_Cl两种基因进行基因组整合菌株构建，能够明显提高柠檬烯合成量。

实施例2柠檬风味啤酒的酿制

1、前期准备：麦芽经粉碎后加入罐体中煮沸1h糖化，然后加入啤酒花煮沸10min，冷却后加入啤酒发酵罐待发酵。

2、菌株活化：融合酿酒酵母菌在YPD中接菌过夜活化，然后转接大体积YPD培养基中培养30h达到对数生长后期，离心收获50g干重菌体作为种子，接入啤酒发酵液中活化30min，然后倒入啤酒发酵罐中，进入发酵工艺。

3、啤酒发酵：啤酒发酵罐20℃通气发酵7天，然后排空发酵罐底部酵母，降低温度到12℃继续发酵7天，然后再排空发酵罐底物残余酵母，降低温度至4℃发酵至第21天，即可获得柠檬风味的成品啤酒。

以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳华大生命科学研究院

<120> 酿制柠檬风味啤酒的酵母菌株、其制备方法及啤酒酿制方法

<130> 19I27800

<160> 20

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 667

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tcattatcaa tactgccatt tcaaagaata cgtaaataat taatagtagt gattttccta 60

actttattta gtcaaaaaat tagcctttta attctgctgt aacccgtaca tgcccaaaat 120

agggggcggg ttacacagaa tatataacat cgtaggtgtc tgggtgaaca gtttattcct 180

ggcatccact aaatataatg gagcccgctt tttaagctgg catccagaaa aaaaaagaat 240

cccagcacca aaatattgtt ttcttcacca accatcagtt cataggtcca ttctcttagc 300

gcaactacag agaacagggg cacaaacagg caaaaaacgg gcacaacctc aatggagtga 360

tgcaacctgc ctggagtaaa tgatgacaca aggcaattga cccacgcatg tatctatctc 420

attttcttac accttctatt accttctgct ctctctgatt tggaaaaagc tgaaaaaaaa 480

ggttgaaacc agttccctga aattattccc ctacttgact aataagtata taaagacggt 540

aggtattgat tgtaattctg taaatctatt tcttaaactt cttaaattct acttttatag 600

ttagtctttt ttttagtttt aaaacaccaa gaacttagtt tcgaataaac acacataaac 660

aaacaaa 667

<210> 2

<211> 187

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgaatttctt atgatttatg atttttatta ttaaataagt tataaaaaaa ataagtgtat 60

acaaatttta aagtgactct taggttttaa aacgaaaatt cttattcttg agtaactctt 120

tcctgtaggt caggttgctt tctcaggtat agcatgaggt cgctcttatt gaccacacct 180

ctaccgg 187

<210> 3

<211> 2872

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aagaaaggcc cacccgtgaa ggtgagccag tgagttgatt gcagtccagt tacgctggag 60

tccgtctcgg gctagagacc gaattcgcgg ccgcttctag agcaatacgc aaaccgcctc 120

tccccgcgcg ttggccgatt cattaatgca gctggcacga caggtttccc gactggaaag 180

cgggcagtga gcgcaacgca attaatgtga gttagctcac tcattaggca ccccaggctt 240

tacactttat gcttccggct cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca 300

catactagag aaagaggaga aatactagat ggcttcctcc gaagacgtta tcaaagagtt 360

catgcgtttc aaagttcgta tggaaggttc cgttaacggt cacgagttcg aaatcgaagg 420

tgaaggtgaa ggtcgtccgt acgaaggtac ccagaccgct aaactgaaag ttaccaaagg 480

tggtccgctg ccgttcgctt gggacatcct gtccccgcag ttccagtacg gttccaaagc 540

ttacgttaaa cacccggctg acatcccgga ctacctgaaa ctgtccttcc cggaaggttt 600

caaatgggaa cgtgttatga acttcgaaga cggtggtgtt gttaccgtta cccaggactc 660

ctccctgcaa gacggtgagt tcatctacaa agttaaactg cgtggtacca acttcccgtc 720

cgacggtccg gttatgcaga aaaaaaccat gggttgggaa gcttccaccg aacgtatgta 780

cccggaagac ggtgctctga aaggtgaaat caaaatgcgt ctgaaactga aagacggtgg 840

tcactacgac gctgaagtta aaaccaccta catggctaaa aaaccggttc agctgccggg 900

tgcttacaaa accgacatca aactggacat cacctcccac aacgaagact acaccatcgt 960

tgaacagtac gaacgtgctg aaggtcgtca ctccaccggt gcttaataac gctgatagtg 1020

ctagtgtaga tcgctactag agccaggcat caaataaaac gaaaggctca gtcgaaagac 1080

tgggcctttc gttttatctg ttgtttgtcg gtgaacgctc tctactagag tcacactggc 1140

tcaccttcgg gtgggccttt ctgcgtttat atactagtag cggccgctgc agggtctctg 1200

atgcgagacg actgaccatt taaatcatac ctgacctcca tagcagaaag tcaaaagcct 1260

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ataagatcac taccgggcgt attttttgag ttatcgagat tttcaggagc taaggaagct 1380

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gatgctgatt tatatgggta taaatgggct cgcgataatg tcgggcaatc aggtgcgaca 1500

atctatcgat tgtatgggaa gcccgatgcg ccagagttgt ttctgaaaca tggcaaaggt 1560

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tcacttgata accttatttt tgacgagggg aaattaatag gttgtattga tgttggacga 2040

gtcggaatcg cagaccgata ccaggatctt gccatcctat ggaactgcct cggtgagttt 2100

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<210> 4

<211> 2872

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aagaaaggcc cacccgtgaa ggtgagccag tgagttgatt gcagtccagt tacgctggag 60

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ttacgttaaa cacccggctg acatcccgga ctacctgaaa ctgtccttcc cggaaggttt 600

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ctccctgcaa gacggtgagt tcatctacaa agttaaactg cgtggtacca acttcccgtc 720

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cccggaagac ggtgctctga aaggtgaaat caaaatgcgt ctgaaactga aagacggtgg 840

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aaaatgagcc atattcaacg ggaaacgtct tgctcgaggc cgcgattaaa ttccaacatg 1440

gatgctgatt tatatgggta taaatgggct cgcgataatg tcgggcaatc aggtgcgaca 1500

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tctccttcat tacagaaacg gctttttcaa aaatatggta ttgataatcc tgatatgaat 2160

aaattgcagt ttcacttgat gctcgatgag tttttctaat gagggcccaa atgtaatcac 2220

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cctgacgagc atcacaaaaa tcgatgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta 2340

taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg 2400

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gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac 2580

ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg 2640

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agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta cctcggaaaa agagttggta 2760

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agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gattttctac cg 2872

<210> 5

<211> 1665

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgagaaggt cagcgaacta ccagcctagc atttgggacc atgatttctt acagtccctt 60

aatagcaatt acaccgatga ggcatataaa aggagggctg aagaattacg tggcaaagtg 120

aagattgcca ttaaggatgt tatcgagcca ttggatcagc ttgagcttat cgacaacctg 180

cagaggctag gattagccca taggtttgag actgagatca ggaacatttt aaataatata 240

tacaataaca ataaggatta caattggagg aaagaaaact tatacgccac ctcactggaa 300

ttccgtcttc tgaggcagca tggttatcct gtcagccaag aagtgttcaa tggatttaag 360

gacgaccagg gcggattcat atgtgacgat ttcaaaggta ttctttcact tcatgaggca 420

agctattata gcttggaagg ggagtcaatt atggaagagg cgtggcagtt cacttccaag 480

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ttcatccata tctatgagag gcgtgaagac aaaaaccacc tattgctgga gctagcgaaa 660

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<210> 6

<211> 909

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgtcatctc ttgttttaca gtgctggaaa ctaagttccc cgagtctaat tctacaacag 60

aatacgagca tctcaatggg ggcctttaag gggatccaca agctgcaaat cccgaatagc 120

ccccttacgg taagcgcaag agggctgaac aaaatatctt gctccctaaa tttacaaacg 180

gaaaaattat gttacgagga caacgacaat gacttagatg aagaactaat gcctaagcac 240

attgcgctta tcatggatgg gaacagaaga tgggcaaaag ataagggact agaggtttat 300

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catacctac 909

<210> 7

<211> 2872

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aagaaaggcc cacccgtgaa ggtgagccag tgagttgatt gcagtccagt tacgctggag 60

tccgtctcgg atgagagacc gaattcgcgg ccgcttctag agcaatacgc aaaccgcctc 120

tccccgcgcg ttggccgatt cattaatgca gctggcacga caggtttccc gactggaaag 180

cgggcagtga gcgcaacgca attaatgtga gttagctcac tcattaggca ccccaggctt 240

tacactttat gcttccggct cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca 300

catactagag aaagaggaga aatactagat ggcttcctcc gaagacgtta tcaaagagtt 360

catgcgtttc aaagttcgta tggaaggttc cgttaacggt cacgagttcg aaatcgaagg 420

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tggtccgctg ccgttcgctt gggacatcct gtccccgcag ttccagtacg gttccaaagc 540

ttacgttaaa cacccggctg acatcccgga ctacctgaaa ctgtccttcc cggaaggttt 600

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ctccctgcaa gacggtgagt tcatctacaa agttaaactg cgtggtacca acttcccgtc 720

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ctagtgtaga tcgctactag agccaggcat caaataaaac gaaaggctca gtcgaaagac 1080

tgggcctttc gttttatctg ttgtttgtcg gtgaacgctc tctactagag tcacactggc 1140

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agccgagacg actgaccatt taaatcatac ctgacctcca tagcagaaag tcaaaagcct 1260

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ataagatcac taccgggcgt attttttgag ttatcgagat tttcaggagc taaggaagct 1380

aaaatgagcc atattcaacg ggaaacgtct tgctcgaggc cgcgattaaa ttccaacatg 1440

gatgctgatt tatatgggta taaatgggct cgcgataatg tcgggcaatc aggtgcgaca 1500

atctatcgat tgtatgggaa gcccgatgcg ccagagttgt ttctgaaaca tggcaaaggt 1560

agcgttgcca atgatgttac agatgagatg gtcaggctaa actggctgac ggaatttatg 1620

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ctggctcacc ttcgggtggg cctttctgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc 2280

cctgacgagc atcacaaaaa tcgatgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta 2340

taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg 2400

ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc 2460

tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac 2520

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agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gattttctac cg 2872

<210> 8

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

agcgtgggtc tcaggcttca ttatcaatac tgccatttc 39

<210> 9

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gtgctgggtc tcgcatcttt gtttgtttat gtgtgtttat tcg 43

<210> 10

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

agcgtgggtc tcatagccga atttcttatg atttatgat 39

<210> 11

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gtgctgggtc tcggaggccg gtagaggtgt gg 32

<210> 12

<211> 5987

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

agggcctcgt gatacgccta tttttatagg ttaatgtcat gataataatg gtttcttagg 60

acggatcgct tgcctgtaac ttacacgcgc ctcgtatctt ttaatgatgg aataatttgg 120

gaatttactc tgtgtttatt tatttttatg ttttgtattt ggattttaga aagtaaataa 180

agaaggtaga agagttacgg aatgaagaaa aaaaaataaa caaaggttta aaaaatttca 240

acaaaaagcg tactttacat atatatttat tagacaagaa aagcagatta aatagatata 300

cattcgatta acgataagta aaatgtaaaa tcacaggatt ttcgtgtgtg gtcttctaca 360

cagacaagat gaaacaattc ggcattaata cctgagagca ggaagagcaa gataaaaggt 420

agtatttgtt ggcgatcccc ctagagtctt ttacatcttc ggaaaacaaa aactattttt 480

tctttaattt ctttttttac tttctatttt taatttatat atttatatta aaaaatttaa 540

attataatta tttttatagc acgtgatgaa aaggacccag gtggcacttt tcggggaaat 600

gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg 660

agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa 720

catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac 780

ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac 840

atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt 900

ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc 960

gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca 1020

ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc 1080

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gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa 1200

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ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg 1380

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ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct 1680

taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct 1740

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gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc 1860

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gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag 2040

gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc 2100

tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg 2160

agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag 2220

cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt 2280

gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac 2340

gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg 2400

ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc 2460

cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata 2520

cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt 2580

cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttacct cactcattag 2640

gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcctatgt tgtgtggaat tgtgagcgga 2700

taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg ccaagcgcgc aattaaccct 2760

cactaaaggg aacaaaagct ggagctccac cgcggtggcg gccgcgaatt ccccgggtct 2820

agaggtctcg gttggcagtg actcggtctc tacctggcta gagacggcaa tacgcaaacc 2880

gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg 2940

gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca 3000

ggctttacac tttatgcttc cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt 3060

tcacacatac tagagaaaga ggagaaatac tagatggctt cctccgaaga cgttatcaaa 3120

gagttcatgc gtttcaaagt tcgtatggaa ggttccgtta acggtcacga gttcgaaatc 3180

gaaggtgaag gtgaaggtcg tccgtacgaa ggtacccaga ccgctaaact gaaagttacc 3240

aaaggtggtc cgctgccgtt cgcttgggac atcctgtccc cgcagttcca gtacggttcc 3300

aaagcttacg ttaaacaccc ggctgacatc ccggactacc tgaaactgtc cttcccggaa 3360

ggtttcaaat gggaacgtgt tatgaacttc gaagacggtg gtgttgttac cgttacccag 3420

gactcctccc tgcaagacgg tgagttcatc tacaaagtta aactgcgtgg taccaacttc 3480

ccgtccgacg gtccggttat gcagaaaaaa accatgggtt gggaagcttc caccgaacgt 3540

atgtacccgg aagacggtgc tctgaaaggt gaaatcaaaa tgcgtctgaa actgaaagac 3600

ggtggtcact acgacgctga agttaaaacc acctacatgg ctaaaaaacc ggttcagctg 3660

ccgggtgctt acaaaaccga catcaaactg gacatcacct cccacaacga agactacacc 3720

atcgttgaac agtacgaacg tgctgaaggt cgtcactcca ccggtgctta ataacgctga 3780

tagtgctagt gtagatcgct actagagcca ggcatcaaat aaaacgaaag gctcagtcga 3840

aagactgggc ctttcgtttt atctgttgtt tgtcggtgaa cgctctctac tagagcgtct 3900

cacctcaggc agagacccaa gacactgcgg atcgagacca ctagtaccgg tctgcagctc 3960

gagggggggc ccggtaccca attcgcccta tagtgagtcg tattacgcgc gctcactggc 4020

cgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc 4080

agcacatccc cctttcgcca gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc 4140

ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg gcgcgacgcg ccctgtagcg gcgcattaag 4200

cgcggcgggt gtggtggtta cgcgcagcgt gaccgctaca cttgccagcg ccctagcgcc 4260

cgctcctttc gctttcttcc cttcctttct cgccacgttc gccggctttc cccgtcaagc 4320

tctaaatcgg gggctccctt tagggttccg atttagtgct ttacggcacc tcgaccccaa 4380

aaaacttgat tagggtgatg gttcacgtag tgggccatcg ccctgataga cggtttttcg 4440

ccctttgacg ttggagtcca cgttctttaa tagtggactc ttgttccaaa ctggaacaac 4500

actcaaccct atctcggtct attcttttga tttataaggg attttgccga tttcggccta 4560

ttggttaaaa aatgagctga tttaacaaaa atttaacgcg aattttaaca aaatattaac 4620

gtttacaatt tcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc 4680

atagggtaat aactgatata attaaattga agctctaatt tgtgagttta gtatacatgc 4740

atttacttat aatacagttt tttagttttg ctggccgcat cttctcaaat atgcttccca 4800

gcctgctttt ctgtaacgtt caccctctac cttagcatcc cttccctttg caaatagtcc 4860

tcttccaaca ataataatgt cagatcctgt agacaccaca tcatccacgg ttctatactg 4920

ttgacccaat gcgtcaccct tgtcatctaa acccacaccg ggtgtcataa tcaaccaatc 4980

gtaaccttca tctcttccac ccatgtctct ttgagcaata aagccgataa caaaatcttt 5040

gtcgctcttc gcaatgtcaa cagtaccctt agtatattct ccagtagata gggagccctt 5100

gcatgacaat tctgctaaca tcaaaaggcc tctaggttcc tttgttactt cttctgccgc 5160

ctgcttcaaa ccgctaacaa tacctgggcc caccacaccg tgtgcattcg taatgtctgc 5220

ccattctgct attctgtata cacccgcaga gtactgcaat ttgactgtat taccaatgtc 5280

agcaaatttt ctgtcttcga agagtaaaaa attgtacttg gcggataatg cctttagcgg 5340

cttaactgtg ccctccatgg aaaaatcagt caagatatcc acatgtgttt ttagtaaaca 5400

aattttggga cctaatgctt caactaactc cagtaattcc ttggtggtac gaacatccaa 5460

tgaagcacac aagtttgttt gcttttcgtg catgatatta aatagcttgg cagcaacagg 5520

actaggatga gtagcagcac gttccttata tgtagctttc gacatgattt atcttcgttt 5580

cctgcaggtt tttgttctgt gcagttgggt taagaatact gggcaatttc atgtttcttc 5640

aacactacat atgcgtatat ataccaatct aagtctgtgc tccttccttc gttcttcctt 5700

ctgttcggag attaccgaat caaaaaaatt tcaaagaaac cgaaatcaaa aaaaagaata 5760

aaaaaaaaat gatgaattga attgaaaagc tgtggtatgg tgcactctca gtacaatctg 5820

ctctgatgcc gcatagttaa gccagccccg acacccgcca acacccgctg acgcgccctg 5880

acgggcttgt ctgctcccgg catccgctta cagacaagct gtgacaatct ccgggagctg 5940

catgtgtcag aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg agattaa 5987

<210> 13

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<212> DNA

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ttagttttgc tggccgcatc ttctcaaata tgcttcccag cctgcttttc tgtaacgttc 60

accctctacc ttagcatccc ttccctttgc aaatagtcct cttccaacaa taataatgtc 120

agatcctgta gacaccacat catccacggt tctatactgt tgacccaatg cgtcaccctt 180

gtcatctaaa cccacaccgg gtgtcataat caaccaatcg taaccttcat ctcttccacc 240

catgtctctt tgagcaataa agccgataac aaaatctttg tcgctcttcg caatgtcaac 300

agtaccctta gtatattctc cagtagatag ggagcccttg catgacaatt ctgctaacat 360

caaaaggcct ctaggttcct ttgttacttc ttctgccgcc tgcttcaaac cgctaacaat 420

acctgggccc accacaccgt gtgcattcgt aatgtctgcc cattctgcta ttctgtatac 480

acccgcagag tactgcaatt tgactgtatt accaatgtca gcaaattttc tgtcttcgaa 540

gagtaaaaaa ttgtacttgg cggataatgc ctttagcggc ttaactgtgc cctccatgga 600

aaaatcagtc aagatatcca catgtgtttt tagtaaacaa attttgggac ctaatgcttc 660

aactaactcc agtaattcct tggtggtacg aacatccaat gaagcacaca agtttgtttg 720

cttttcgtgc atgatattaa atagcttggc agcaacagga ctaggatgag tagcagcacg 780

ttccttatat gtagctttcg acatgattta tcttcgtttc ctgcaggttt ttgttctgtg 840

cagttgggtt aagaatactg ggcaatttca tgtttcttca acactacata tgcgtatata 900

taccaatcta agtctgtgct ccttccttcg ttcttccttc tgttcggaga ttaccgaatc 960

aaaaaaattt caaagaaacc gaaatcaaaa aaaagaataa aaaaaaaatg atgaattgaa 1020

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agtcacatca agatcgttta tgg 23

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gcacggaata tgggactact tcg 23

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actccacttc aagtaagagt ttg 23

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ctacaacaga atacgagcat c 21

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cgaacctcct atgtctttg 19

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ggagttacca ttgcac 16

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<213> 人工序列

<400> 20

tcggctagcc ttttgtccct ggtgag 26

Claims (2)

1.一种酿制柠檬风味啤酒的酵母菌株，其特征在于，所述酵母菌株是Saccharomyces cerevisiae SEy935，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2019022。

2.一种酿制柠檬风味啤酒的方法，其特征在于，所述方法包括：采用权利要求1所述的酵母菌株作为酿酒酵母进行啤酒酿制。

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